Cursus HPLC Deel 1 Cursus HPLC 1
Inleiding HPLC FPLC CE GLC = High Performance Liquid Chromatografie = Fast Proteine Liquid Chromatografie = Capillaire Electroforese (scheiding van componenten m.b.v. spanningsverschil) = Gas Liquid Chromatografie Cursus HPLC 2
Welke techniek? HPLC FPLC CE GLC : Componenten met een hoog kookpunt : Eiwitten : Componenten met een hoog kookpunt die polair zijn : Componenten met een relatief laag kookpunt Cursus HPLC 3
Chromatografische werkgebieden SEC FPLC GC HPLC M 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 10 5 10 6 Cursus HPLC 4
HPLC-verbindingen Algemeen Alle verbindingen die oplosbaar zijn en niet vluchtig Speciale verbindingen zoals: macromoleculen ionogene en of zeer polaire verbindingen onstabiele natuurlijke verbindingen explosieven Cursus HPLC 5
Schematische weergave van chromatografie Monster Scheiding componenten Detectie componenten Registreren en verwerken van gegevens Cursus HPLC 6
Opbouw van een HPLC systeem Reservoir Pomp Injector Kolom Detector Recorder Dataverwerking Cursus HPLC 7
Theorie chromatografie Absorptie-isotherm van de stoffen A en B bij dezelfde temperatuur Adsorptie-isotherm van de stoffen A en B bij dezelfde temperatuur Cursus HPLC 8
Principe Chromatografische scheiding K = verdelingscoëfficiënt K = C s f C mf C sf = concentratie stationaire fase C mf = concentratie mobiele fase Cursus HPLC 9
Principe Chromatografische scheiding vloeistofstroom Opbrengen Mengsel m.f. s.f. Na eerste scheiding m.f. s.f. Cursus HPLC 10
Principe Chromatografische scheiding vloeistofstroom Een schijfje opgeschoven m.f. s.f. Na tweede scheiding m.f. s.f. Cursus HPLC 11
Principe Chromatografische scheiding vloeistofstroom Een schijfje opgeschoven m.f. s.f. Na derde scheiding m.f. s.f. K = 0,5 K = 2 Cursus HPLC 12
Retentie / Retentiefactor (capaciteitsverhouding) Retentie Onvertraagde en vertraagde component Cursus HPLC 13
Retentie / Retentiefactor (capaciteitsverhouding) Retentiefactor (Capaciteitsfactor / capaciteitsverhouding) k = t R - t 0 t 0 Cursus HPLC 14
Selectiviteit Cursus HPLC 15
Gauss curve Cursus HPLC 16
Schotelgetal Theoretisch schotelgetal N th = 2 t 5,545* r w0,5 t r = retentietijd van een component W 0,5 = piekbreedte op halve hoogte HETP = L N th Cursus HPLC 17
Schotelgetal Piekbreedte als functie van HETP Cursus HPLC 18
Schotelhoogtevergelijking ( H/u curve ) Piekverbreding door 3 oorzaken: 1. Eddy diffusie A term 2. Longitudinale diffusie B term 3. Stofoverdrachtsterm C term Cursus HPLC 19
Schotelhoogtevergelijking A term : Eddy diffusie Cursus HPLC 20
Schotelhoogtevergelijking B term : Longitudinale diffusue Variabelen: - Lineaire stroomsnelheid van de mobiele fase - Diffusiecoëfficiënt in de mobiele fase Cursus HPLC 21
Schotelhoogtevergelijking C term : Stofoverdrachtsterm Weerstand tegen massatransport in de mobiele fase (mobiele fase) Cursus HPLC 22
Schotelhoogtevergelijking Weerstand tegen massatransport C s Variabelen C s - term retentiefactor hoeveelheid stationaire fase deeltjesgrootte diffusiecoëfficiënt temperatuur Cursus HPLC 23
Schotelhoogtevergelijking Weerstand tegen massatransport C s Variabelen C m - term deeltjesgrootte lineaire stroomsnelheid mobiele fase diffusiecoëfficiënt in de mobiele fase porositeit viscositeit van de mobiele fase retentiefactor temperatuur Cursus HPLC 24
Schotelhoogtevergelijking H = A + B U n + C. u + C. u m s A term : afhankelijk van deeltjesgrootte en stapelingsfactor B term : Moleculaire diffusie Diffusie van componenten B term is verwaarloosbaar bij HPLC C term : Deze term wordt vereenvoudigd weergegeven als C.u n Schotelhoogtevergelijking : H = A + C. u n Cursus HPLC 25
Schotelhoogtevergelijking De H/u curve ziet er dan als volgt uit: u optimaal Werkzame u = ca. 5-10 u optimaal Cursus HPLC 26
Schotelhoogtevergelijking Schotelhoogte tegen deeltjesgrootte Streven naar een minimale H. A term verlagen: Kleine deeltjes Betere stapeling C term verlagen: Kleinere deeltjes Afname diffusie-afstanden toename diffusie-oppervlak Cursus HPLC 27
Schotelhoogtevergelijking Invloed van deeltjesgrootte op H/u curve. 2 effecten: a. Algehele verlaging door A-term b. Richtingscoëfficiënt kleiner door C-term Cursus HPLC 28
Instrumentele bijdrage tot piekverbreding 2 tot = 2 kol + ( 2 inj + 2 det + 2 verb) 2 tot = totale piekverbreding 2 kol = kolom 2 inj = injector 2 det = detector 2 verb = verbindingen tussen onderdelen Cursus HPLC 29
Resolutievergelijking 1 1 k R = N s 4 k + 1 th Resolutie [R s ] hangt af van: - : Selectiviteitsfactor - k : Retentiefactor - N th : Theoretisch schotelgetal Cursus HPLC 30
Resolutie en scheiding R s = t R (2) t (1) 0,85( w (1) + w 0,5 R 0,5 (2)) Overlap van pieken in % 2 0,3 Rs 1,0 1,5 Cursus HPLC 31
Retentie vs efficientie Cursus HPLC 32
Selectiviteit vs efficiëntie Cursus HPLC 33
Selectiviteit vs retentie Cursus HPLC 34
Asymmetriefactor A s = b a Cursus HPLC 35
Cursus HPLC 36
Mobiele fase Eisen aan eluentia - Geschikt voor de detector : UV cut off lage geleidbaarheid brekingsindex - zuiver : verhoging basislijn - veiligheid : niet giftig, brandbaar - stofdeeltjes vrij : verstopping kolom - geen opgeloste gassen : storing detector O 2 /N 2 kan in UV gebied absorberende complexen geven Cursus HPLC 37
Mobiele fase Eisen aan eluentia Stofdeeltje vrij : Filters in HPLC-syteem toevoegen van stoffen aan eluens ter voorkoming algengroei Cursus HPLC 38
Mobiele fase Eisen aan eluentia Methode ontgassing : Reflux / uitkoken Ultrasoon He doorleiden Vacuüm membraam filtratie (online) Degasser 7 ml Solenoid valve Cursus HPLC 39 3
Mobiele fase Voordeel He doorleiding : simpel effectief Cursus HPLC 40
Mobiele fase Effect van 2 methoden van ontgassen op de druk fluctuaties Cursus HPLC 41
Afhanklijk van : Keuze eluentia: 1.stationaire fase 2. te scheiden componenten 3. detectie systeem 4. viscositeit 5. cut-off Oplosmiddel brekingsindex Viscositeit kookpunt Polariteit Elutiesterkte cp C P Fluoralkanen 1,27-1,29 0,4-2,6 50-174 <-2-0,25 Cyclohexaan 1,423 0,90 81 0,04-0,2 n-hexaan 1,372 0,30 69 0,1 0,01 1-Chloorbutaan 1,400 0,42 78 1,0 0,26 Tetrachloorkoolstof 1,457 0,90 77 1,6 0,18 i-propyl ether 1,365 0,38 68 2,4 0,28 Toluenen 1,494 0,55 110 2,4 0,29 Diethylether 1,350 0,24 35 2,8 0,38 Tetrahydrofuraan 1,405 0,46 66 4,0 0,57 Chloroform 1,443 0,53 61 4,1 0,4 Ethanol 1,359 1,08 78 4,3 0,88 Ethylacetaat 1,378 0,43 77 4,4 0,58 Dioxane 1,420 1,20 101 4,8 0,56 Methanol 1,326 0,54 65 5,1 0,95 Acetonitril 1,341 0,34 82 5,8 0,65 Nitromethaan 1,380 0,61 101 6,0 0,64 Ethyleenglycol 1,431 16,50 182 6,9 1,11 Water 1,333 0,89 100 10,2 groot Cursus HPLC 42
Keuze eluentia: Meest gebruikt zijn mengsels van: Methanol Acetonitril Tetrahydrofuraan Water Bufferoplossing Cursus HPLC 43
Pompen Eisen aan een pompsysteem: Hoge druk ( 450 bar ) Chemisch inert tegen eluentia en componenten Gemakkelijke bediening Klein dood volume Flow reproduceerbaarheid Ruisvrije regelbare vloeistofstroom Constante flow wordt het meest gebruikt Cursus HPLC 44
Pompen Plunjerpomp = meest gebruikt Cursus HPLC 45
Pompen Plunjerpomp = meest gebruikt Cursus HPLC 46
Pompen Plunjerpomp heeft pulserende vloeistofstroom gevolg: Instabiele basislijn Verkorting levensduur kolom Voorkoming pulsatie: Bourdonveer + capillair 2 kopspomp: 1 e kop zuigt 2 e kop perst Elektronische demping Cursus HPLC 47
Pompen 2 kops pomp Cursus HPLC 48
Pompen 2 kops pomp met parallelle vloeistofverplaatsing Cursus HPLC 49
Pompen 2 kops pomp met seriële vloeistofverplaatsing Cursus HPLC 50
Relatie druk, debiet, viscositeit en lengte u = kp. p. L u = lineaire snelheid Kp = permeabiliteit p = drukval over de kolom = viscositeit eluens L = lengte kolom Cursus HPLC 51
Relatie druk, debiet, viscositeit en lengte Kp = dp 2 Dp = deeltjesgrootte (SiO 2 ) = ca. 1000 Kp hangt af van : stapeling grootte vorm p = u.. L Kp Mengsels van oplosmiddelen vertonen vaak een hoger viscositeit dan oplosmiddelen afzonderlijk. Cursus HPLC 52
Vormen van elutie. Meeste analyses gebeuren isocratisch. Gradiënt elutie. Voordelen : Nadelen : Goede scheiding in een korte tijd HPLC duurder Verkorting levensduur kolom Eluens kan niet teruggepompt worden Kleinere reproduceerbaarheid Verhoging viscositeit verhoging druk Cursus HPLC 53
Vormen van elutie. Lage druk gradiënt : 1 pomp + klep + besturingsunit Cursus HPLC 54
Vormen van elutie. Hoge druk gradiënt : 2 pompen + besturingsunit Cursus HPLC 55
Voorbeeld van een isocratische elutie Cursus HPLC 56
Voorbeeld van een gradiëntelutie. Cursus HPLC 57