Fluctuatietest: Worden mutaties geïnduceerd door selectie of al eerder aanwezig?

Fluctuatietest: Worden mutaties geïnduceerd door selectie of al eerder aanwezig? Contact: Luc Leyns (Vrije Universiteit Brussel) lleyns@vub.ac.be Door de VOB-redactie ingekorte versie van 11/2016 1. Inleiding Wanneer een populatie van bacteriën blootgesteld wordt aan een agens dat de meeste bacteriën doodt, bijvoorbeeld een antibioticum, neemt men meestal waar dat een kleine fractie van de populatie deze selectie overleeft. Dit zijn varianten die resistent geworden zijn tegen het antibioticum. Origineel werden er twee hypothesen voorgesteld om de oorsprong van deze resistente varianten te verklaren. Volgens de adaptatiehypothese kan iedere cel er, met een gelijke en lage waarschijnlijkheid, door het antibioticum toe aangezet worden om zich te adapteren, zodat de cel kan overleven in aanwezigheid van het antibioticum. Deze adaptatie wordt dan overgedragen op de nakomelingen. Volgens de spontane mutatiehypothese kan elke cel met een lage waarschijnlijkheid muteren van gevoeligheid naar resistentie. De aanwezigheid van het antibioticum is hiervoor niet nodig. Deze hypothesen worden hier experimenteel onderzocht door de variantie te vergelijken tussen i. het aantal resistente kolonies die men verkrijgt wanneer stalen uit verschillende culturen worden uitgeplaat op petrischalen met de variantie van ii. het aantal resistente kolonies bij uitplaten van stalen uit dezelfde cultuur. Figuur 1. Adaptatiehypothese (Directed Mutation Model). De resistente cellen (in rood) hebben zich aangepast als reactie op het toegevoegde antibioticum (de gestippelde rode lijn). Figuur 2. Spontante mutatie hypothese. De resistente cellen (in rood) hebben zich vóór het toevoegen van het antibioticum (de gestippelde rode lijn) spontaan aangepast. 1

2.De fluctuatietest In 1943 beschreven Luria en Delbrück (S. Luria & M. Delbrück, 1943, Genetics 28: 491-51) een elegante test, de fluctuatietest, om een onderscheid te maken tussen deze twee hypotheses. Bacteriën reproduceren zich door aseksuele splitsing. Hierdoor kunnen we de groei van bacteriële populatie als een vertakking voorstellen, waar de takken van de moedercellen verbonden zijn aan de dochtercellen (zoals in figuur 1 en 2). Luria en Delbrück realiseerden zich dat er belangrijke informatie kon gehaald worden uit een experiment als verschillende (kopieën van) bacteriële culturen simultaan werden gebruikt. Volgens de adaptatiehypothese is de bacteriële populatie homogeen gevoelig vóór deze met het antibioticum in contact komt. De waarschijnlijkheid dat een cel bij contact met het antibioticum resistent wordt is voor elke cel gelijk. Deze hypothese voorspelt dus geen grote verschillen tussen de aantallen resistente bacteriën in verschillende culturen. Volgens de spontane mutatiehypothese is de populatie echter niet homogeen, vermits de mutatie naar resistentie tijdens de groei van de cultuur in elke cel met een lage waarschijnlijkheid kan optreden. Het aantal resistente bacteriën in een cultuur hangt er dus van af of de eerste mutatie naar resistentie vroeg of laat optreedt tijdens de groei van de cultuur. Daarom zijn er grotere verschillen tussen de aantallen resistente mutanten in verschillende gelijktijdig gegroeide culturen dan tussen stalen genomen uit dezelfde cultuur. 3. Doel van het practicum Deze hypothesen kunnen experimenteel onderzocht worden door de variantie te vergelijken tussen i. het aantal resistente kolonies die men verkrijgt wanneer stalen uit verschillende culturen worden uitgeplaat met de variantie van ii. het aantal resistente kolonies bij uitplaten van stalen uit eenzelfde cultuur. De spontane mutatie hypothese voorspelt een grotere spreiding van het aantal resistente kolonies dan de adaptatiehypothese. Dit kan nagegaan worden door berekening van de variantie aan de hand van de formule: Variantie = Σ(x μ) 2 / n - 1 waarin: x = waargenomen aantal resistente mutanten in elk staal μ = gemiddeld aantal resistente mutanten in de 10 stalen n = aantal stalen Tijdens dit practicum ontvangen de leerlingen 10 kopieën van een kolonie E. coli, opgegroeid in de afwezigheid van een antibioticum. Zij zullen deze populaties uitplaten op agar-platen waaraan het antibioticum rifampicine is toegevoegd. Enkel rifampicine- resistente cellen (rifr) zullen kolonies vormen op de agar-platen. Aan de hand van het aantal gevormde kolonies zullen de leerlingen de variantie bepalen om zo een onderscheid te maken tussen de adaptatiehypothese of de spontane mutatie hypothese. 2

4. Experimenten (uit te voeren door de lln.) De handen moeten goed gewassen worden vóór en na het experimentele werk! Handschoenen zijn niet nodig maar het dragen van een labojas is aangeraden. 4.1. Dag 1 Taak 1: Maken van spreader Zie video "Making Spreader" De spreader kan gemaakt worden door de leerlingen, indien bunsenbranders beschikbaar zijn. Het is aangeraden een paar spreaders te laten maken per experimentele groep, ze breken tamelijk snel. Start met pasteurpipetten met een lange tip. Ze moeten niet steriel zijn. Het eindresultaat is een soort glazen driehoek met een handvat. Bekijk de video. Het vraagt wat oefening om succesvol te zijn (genoeg pipetten moeten voorzien worden). Een pincet om het glas vast te houden kan zeker helpen. Altijd enkele minuten laten afkoelen. Nooit het glas aanraken met het hand! De spreader wordt gebruikt om de bacteriën te spreiden op de petrischaal. Voor iedere spreiding moet hij gesteriliseerd worden om de bacteriën van het vorige staal te doden. Dit wordt best gedaan door de spreader te gedurende enkele seconden te dompelen in ethanol (minstens 70%) en dan de ethanol te laten verdampen (bv. door de spreader in de lucht te laten drogen voor 30 seconden). Gebruik NOOIT een vlam dichtbij. Taak 2: Uitplaten bacteriën. Zie video "Plating" Per groep ontvangen jullie 10 culturen van 2 ml. Deze zijn bekomen door een overnachtcultuur van E. coli (stam CSH117). Jullie ontvangen ook 20 LB Rif100 petrischalen met kweekmedium (LB voeding, agar en 100 mg/l van het antibioticum rifampicine). Extra materiaal: 12 steriele pasteurpipetten en een pipetteerballon. a) Plaat van elke cultuur: 6 druppels (of 180 μl) uit op één LB Rif100 plaat (tip: vergeet niet de platen te labelen met een stift schrijf alleen op de bodem van de plaat, nooit op het deksel). b) Plaat van eenzelfde cultuur: 6 druppels (of 180 μl) uit op 10 LB Rif100 platen. c) Incubeer de platen overnacht bij 37 C of 2 tot 3 dagen op kamertemperatuur (tip: incubeer de platen ondersteboven om condensatie op het deksel te vermijden). d) Bewaar de platen in een frigo (tip: ook ondersteboven). 3

4.2. Dag 2 Zie video "Counting Colonies" a) Tel het aantal kolonies op elke plaat. Tel alle zichtbare kolonies zonder rekening te houden met hun afmetingen (zie video tip: neem je platen een uurtje ervoor uit de frigo tegen de condensatie). b) Bereken de variantie van het aantal kolonies op de LBRif100 medium verkregen na uitplaten van een staal van elke cultuur. c) Bereken de variantie van het aantal kolonies op de LBRif100 medium verkregen na uitplaten van tien stalen uit eenzelfde cultuur. d) Vergelijk de verkregen waarden. Stemmen deze gegevens best overeen met de adaptatiehypothese of de spontane mutatie hypothese? Verklaar uw antwoord. 4

Bioveiligheid Goede laboratoriumpraktijken Draag een labojas. Eten en drinken zijn niet toegestaan in het laboratorium. Ontsmet onmiddellijk het oppervlak waarop het materiaal, hier bacteriën, werd gemorst met 70% ethanol of bleekmiddel. Was daarna je handen. Met de mond pipetteren is verboden. Gebruik altijd een pipetteerballon of andere mechanische pipet. Gebruikte materialen worden ontsmet vóór het wassen en deze opnieuw te gebruiken. Inactiveer het biologisch afval (zie hieronder). Was uw handen na het experiment en voor het verlaten van het laboratorium. Werken met Escherichia coli Genetisch gemodificeerde E. coli K12 stam is een verzwakte laboratoriumstam die ten opzichte van de wildtype E. coli stam biologisch ingeperkt is en niet langer pathogeen is. In dit geval is een eenvoudig laboratorium met basisvoorzieningen voldoende. Vanzelfsprekend moeten de werkoppervlakken goed ontsmet kunnen worden. Open handelingen met E. coli kunnen op een gewone labotafel gebeuren, mits de vorming van aerosolen geminimaliseerd wordt. Afval verwerking Alle vaste materialen (voedingsbodems) en alle vloeistoffen die gemodificeerde E. coli bevatten en alle met E. coli besmette materialen dienen geïnactiveerd of ontsmet te worden. Er mogen geen levende E. coli in het huishoudelijk afval terechtkomen. Vloeistoffen dienen geautoclaveerd te worden voordat ze door de gootsteen verdwijnen. Een alternatief is inactiveren met hypochloriet. Het is aangeraden om hypochloriet (gewone bleekwater) toe te voegen aan vloeibaar afval (bv. ongeveer 25% van de te ontsmetten vloeistof) en op de gebruikte petrischaal (bv. 5 ml per plaat). Laat dit incuberen voor 30 min. Giet de vloeistoffen in de gootsteen (met lopend water) weg en plaats het vaste afval in een dubbele afvalzak (afvalzak in afvalzak). Let op: het stinkt! 5

Voorbeeld van resultaten en van de berekeningen. Resultaten van 10 verschillende buizen Buis 10 9 Buis 9 29 Buis 8 21 Buis 7 31 Buis 6 7 Buis 5 9 Buis 4 10 Buis 3 18 Buis 2 21 Buis 1 23 Gemiddelde 17,8 Variantie 75,51 Resultaten van 10 plating uit hetzelfde buis (N 5) Kopij J 8 Kopij I 11 Kopij H 5 Kopij G 15 Kopij F 14 Kopij E 10 Kopij D 11 Kopij C 13 Kopij B 14 Kopij A 9 Gemiddelde 11,0 Variantie 9,78 6

Materiaal dat op voorhand dient gemaakt / bereid te worden. Dit dient te gebeuren door de leerkracht (eventueel met de hulp van enkele leerlingen, mits supervisie). Deze technieken zijn aangepast voor labo's met weinig uitrusting. Ze volgen dus niet altijd de beste laboratoriumpraktijken/ -regels (bv. in verband met sterilisatie), maar in deze situatie ze zijn goed genoeg. Indien er beter materiaal beschikbaar is (autoclaaf, roerder, 37 incubator, regelbare micropipetten, enz.), liefst deze gebruiken. Minimale benodigde uitrusting: - een kookpan, liefst een snelkookpan om medium te koken en te steriliseren. - een oven om glaswerk te steriliseren. Koken en steriliseren kunnen op een gewoon fornuis (bv. thuis) gebeuren. Er is geen risico om iets te contamineren. - bunsenbranders. Bereiding LB medium (vloeibaar kweekmedium) Reken ongeveer 25 ml per experimentele groep (van bv. 2 leerlingen per groep) plus 25 ml extra voor het voorbereidend werk. Bereid het gewenste volume van LB medium door 20 gr LB broth poeder toe te voegen aan 1 liter water. Gebruik liefst een labofles, indien niet mogelijk: een erlenmeyer. Meng zeer goed tot er geen klonters meer zijn (gebruik een spatel). Plaats aluminiumfolie op het deksel van de fles of op de hals van de erlenmeyer. Steriliseer het medium onmiddellijk (zie verder). Eens terug op kamertemperatuur kan alles in een frigo bewaard worden (voor een paar dagen tot een paar maanden afhankelijk van de kook/sterilisatie techniek). Bereiding LB met agar (voor Petri platen) Zie video "Bain-Marie" Zie video "Making LB-Agar plates" In theorie is 1 petrischaal (10 tot 15 ml) genoeg maar bereid liefst meer voor, bv. 50 ml. Bereid het gewenste volume (hier 50 ml) van LB-Agar medium door 1 gr LB broth poeder en 0,75 gr van agar (1,5% finale concentratie) toe te voegen aan 50 ml water. Gebruik liefst een labofles, indien niet mogelijk, een erlenmeyer. Meng zeer goed tot er geen klonters meer zijn. Plaats aluminiumfolie op het deksel van de fles of op de hals van de erlenmeyer. Steriliseer het medium onmiddellijk (zie verder). 7

Laat het afkoelen totdat je de fles met je handen kan aanraken/vastnemen (bijna te warm, vandaar de handschoenen, maar niet kokend). Let op, laat afkoelen op een onderzetter, niet op een koude oppervlakte. Meng voorzichtig door de fles licht te draaien ("swirling") Neem het deksel/de aluminiumfolie weg en giet in een petrischaal totdat de volledige oppervlakte bedekt is. Plaats het deksel terug en ga verder met de andere petrischalen. Onmiddellijk daarna, giet (liefst warm) water in je fles vóórdat de resterende agar stolt in de fles. Indien dit toch gebeurt, kun je de agar losschrapen met een spatel en alles goed spoelen met kokend water. Bereiding rifampicine stockoplossing van 50mg/mL Gebruik labo handschoenen voor deze handeling. Indien mogelijk, werk in een trekkast. DMSO heeft een lage toxiciteit maar wordt snel opgenomen door de huid. Laat leerlingen dit deel niet doen. Maak een stock van 50mg/mL in een buis/flesje dat goed dicht kan; bv. verdun 300 mg van rifampicine in 6 ml DMSO (dimethylsulfoxide). Je bekomt een rode oplossing. Deze stock is 500x geconcentreerd, 1 ml is dus goed voor 500 ml LB met agar + rifampicine. Bescherm de stockoplodding tegen het licht met aluminiumfolie en bewaar ze in de frigo. Maak jaarlijks een nieuwe stock. Bereiding petriplaten LB met agar + rifampicine (Petriplaten Rif100) Zie video "Bain-Marie" Zie video "Making LB-Agar plates" Zie video "Marking Plates" 20 Rif100 platen zijn nodig per experimentele groep (van bv. 2 leerlingen per groep), dus ongeveer 200 à 300 ml per groep. Bereid het gewenste volume van LB-Agar medium door 20 gr LB broth poeder en 15 gr agar toe te voegen aan 1 L water. Gebruik liefst laboflessen; indien niet mogelijk gebruik erlenmeyers. Meng zeer goed tot er geen klonters meer zijn. Plaats aluminiumfolie op het deksel van de fles of op de hals van de erlenmeyer Steriliseer het medium onmiddellijk (zie verder). Laat afkoelen tot je de fles met je handen kan aanraken/vastnemen (bijna te warm, vandaar de handschoenen, maar niet kokend). Let op, laat afkoelen op een onderzetter, niet op een koude oppervlakte. Pas dan 2 ml van de rifampicine-stock per 1 L LB-Agar toevoegen finale concentratie van rifampicine is dus 100 mg/l Meng goed maar voorzichtig door draaiende bewegingen. Neem het deksel/de aluminiumfolie weg en giet in een petrischaal totdat de volledige oppervlakte bedekt is. Plaats het deksel terug en ga verder met de andere platen. 8

Onmiddellijk daarna, giet (liefst warm) water in je fles vóórdat de resterende agar stolt in de fles. Indien dit toch gebeurt, kun je de agar loschrapen met een spatel en alles goed spoelen met kokende water. Let op: markeer de Rif100 platen (bv. met een zwarte streep op de zijkant). Sterilisatie van media Zie video "Bain-Marie" LB en LB-Agar kunnen gesteriliseerd worden in een snelkookpan of au bain-marie. In geval van nood in een microgolfoven. Om te starten, de poeders goed mengen met water. Let op: de agar zal niet oplossen. Tip: vul de flessen/ erlenmeyers niet te vol (tot 80% van de volume). Tip: draai de fles NIET volledig dicht voor de sterilisatie, draai het deksel een kwart terug. Na sterilisatie en na afkoeling kun je het deksel volledig dichtdraaien. Tip: plaats een stuk aluminiumfolie op de fles/erlenmeyer BEHALVE voor in de microgolf. De beste methode is; laten koken gedurende 20 minuten in een snelkookpan (start teller eens onder druk). Dan laten afkoelen op een onderzetter tot het recipiënt nog warm is (ongeveer 60 ) maar zeker niet kokend. De agar moet nu opgelost zijn. Het alternatief (maar minder goed) is de flessen/erlenmeyers au bain-marie te verwarmen en te laten koken gedurende 20 minuten (start teller bij het koken van het water). Meng af en toe zeer voorzichtig tijdens het koken. Dan laten afkoelen op een onderzetter tot het recipiënt nog warm is (ongeveer 60 ) maar zeker niet kokend. De agar moet nu opgelost zijn. De microgolfoven kan ook gebruikt worden (minst goede alternatief), in het bijzonder om kleine hoeveelheden voor te bereiden. Let op, de fles mag niet meer dan 50% gevuld worden. Zet de fles in de oven en kijk goed. Wanneer de eerste luchtbellen zichtbaar zijn, stop de microgolf, en "swirl" voorzichtig met de fles (altijd met handschoenen aan). Start de microgolf weer en herhaal de handeling 3-4 keer tot je geen onopgelost agar meer ziet (lijkt op kleine heldere balletjes). Let op: wees zeer voorzichtig met agar, dit schuimt zeer vlug en loopt snel over. Bovendien zal de LB met agar super heet zijn. Sterilisatie van glaswerk Zie video "Oven sterilisation" Glaswerk om het LB medium te behandelen zoals gegradueerde pipetten, pasteurpipetten en cultuurbuizen kunnen gesteriliseerd worden in een gewone oven. Eerst dek je glaswerk af/toe met aluminiumfolie. Gebruik een klein stuk aluminiumfolie op elke cultuurbuis als dekseltje. Indien mogelijk steriliseer de buizen in metalen rekken. Laat vervolgens gedurende 1 uur koken op 180 (start teller eens op temperatuur). Laat daarna afkoelen. 9

Voor het voorbereidende werk is er nood aan een 5-tal gegradueerde pipetten (bv. van 10 ml); een 3-tal pasteurpipetten, een 5-tal cultuurbuizen en een kleine erlenmeyer (min 30 ml).. Per experimentele groep is er nood aan 10 cultuurbuizen en een 12-tal pasteurpipetten. Alle buizen en erlenmeyers moeten een klein aluminiumfolie dekseltje hebben. Het is best de pasteurpipetten per 12 in een pakket te plaatsen voor sterilisatie zodat een pakket kan gegeven worden aan ieder experimentele groep. Het is ook mogelijk alles in gesteriliseerd plastic te kopen. Maken van bacterie "spreader" Zie video "Making Spreader" De spreader kan gemaakt worden door de leerlingen, indien bunsenbranders beschikbaar zijn. Het is aangeraden een paar spreaders te laten maken per experimentele groep, ze breken tamelijk snel. Start met pasteurpipetten met een lange tip. Ze moeten niet steriel zijn. Het eindresultaat is een soort glazen driehoek met een handvat. Bekijk de video. Het vraagt wat oefening om succesvol te zijn (genoeg pipetten moeten voorzien worden). Een pincet om het glas vast te houden kan zeker helpen. Altijd enkele minuten laten afkoelen. Nooit het glas aanraken met de hand! Plastieken alternatieven kunnen gekocht worden. De spreader wordt gebruikt om de bacteriën te spreiden op de petrischaal. Voor ieder spreiding moet het gesteriliseerd worden om de bacteriën van het vorige staal te doden. Dit wordt best gedaan door de spreader gedurende enkele seconden te dompelen in ethanol (minstens 70%) en dan de ethanol te laten verdampen (bv. door de spreader in de lucht te laten drogen voor 30 seconden). Gebruik NOOIT een vlam dichtbij. Maken en gebruik van een entnaald Zie video "Making Inoculator" De entnaald wordt gebruikt om een klein beetje van de bacteriële stock (bacteriën bewaard in glycerol in de frigo) op te pikken en te spreiden op een LB-agar plaat. Steek de tip van een pasteurpipet in het vuur van een bunsenbrander tot de opening dichtgloeit. Voor het gebruik van de entnaald, houd de punt (2-3 cm) enkele seconden in de vlam van een bunsenbrander. Laat ongeveer 15 seconden afkoelen en prik eerst in de LB-agar (om nog af te koelen).steek de naald daarna nog een keer in de bacteriële stock en strijk op de LB plaat in zigzag patroon. Incubeer de plaat ondersteboven tot kolonies zichtbaar zijn. 10

Aanmaken van petrischalen Zie video "Making LB-Agar plates" Giet 10 tot 15 ml van het agar-medium in een petrischaal. Het moet ongeveer een 5-7 mm dikke laag vormen. Plaats het deksel terug en laat de agar stollen. Eens de platen gestold zijn, zet ze ondersteboven om de condensatie te verminderen. Stapel de platen en bewaar ze in een frigo (eventueel in de plastic zak van de petrischalen). Vergeet niet de platen te markeren, ofwel individueel op de onderkant deel of door een streep te trekken op de zijkant van elke plaat de stapel. Neem de platen een uur voor gebruik uit de frigo om condensatie op de buitenkant te vermijden. Indien er waterdruppels op de binnenkant van het deksel zijn, drogen met een kleenex. Incubatie van bacteriën De beste incubatietemperatuur is 37 C. Indien geen 37 incubator beschikbaar, incubeer op een warme plek. Let op, niet rechtstreeks op de radiator, dit is te warm. Vermijd ook direct zonlicht. Op 37 is een overnacht-incubatie genoeg, op "kamertemperatuur" duurt dit 2 tot 3 dagen. Om condensatie in de petrischalen te vermijden incubeer je ze ondersteboven. Voor de incubatie in de cultuurbuizen, is het aangeraden deze te laten schudden tijdens de incubatie om beter zuurstof te incorporeren. Indien geen "schudder" beschikbaar is, schud ze af en toe manueel. Voor glazen buizen, gebruik een klein stuk aluminiumfolie als deksel. Voor gekocht plastieken buizen is het aangeraden om het deksel niet vast te zetten (laat het wat los), om zo zuurstofgas binnen te laten. Bereiding van startculturen. Zie video "Starting the culture" Zie video "Serial Dilutions" Zie video "Seeding tubes" Iedere experimentele groep (2 lln.) zal 10 cultuurbuizen met gekweekte E. coli krijgen. Deze moeten voorzichtig bereid worden. 1) Neemt de bacteriële stock (bacteriën in een glycerol stock) uit de frigo. Met de entnaald strijk je de bacterie op een LB-Agar plaat (zonder antibioticum). Zet je stock in de frigo voor volgende keer. Incubeer de plaat tot je kolonies kan zien. Je kan deze plaat in de frigo bewaren tot 3 weken. 2) Bereid een cultuurbuis met 2 ml LB (geen antibioticum). Met de entnaald raak je een kolonie aan en dan steek je ze in de LB in de cultuurbuis. Schud en neem de entnaald uit. Incubeer (het moet volledig troebel worden). Bewaar in de frigo (max. 1 week). 11

3) Maak een 10-5 verdunning in een finaal volume van 30 ml LB. Om dit te doen, bereid je 2 cultuurbuizen met 6mL LB + een erlenmeyer met 27 ml LB. Neem een beetje van de gekweekte cultuur uit stap 2 met een pasteurpipet en doe 2 druppels (of 60 μl met een micropipet) in een cultuurbuis met 6mL LB. Meng zeer goed (bv. met een andere pasteurpipet). Het preparaat is nu 100 keer verdund Herhaal deze stap in eennieuwe cultuurbuis met 6 ml LB. Ook dit is 100 keer verdund. Neem 3 ml van deze laatste verdunning en doe ze in de erlenmeyer met 27 ml LB. Meng heel goed. 4) Bereid 10 cultuurbuizen (per experimentele groep) met elk 2 ml LB. Voeg 4 druppels (of 120 microliters) van de 30 ml verdunde stock aan elk van deze cultuurbuizen toe. Incubeer de cultuurbuizen. Bewaar ze in de frigo (max 1 week) tot gebruik in het practicum. Voor gebruik de cultuurbuizen schudden om de bacteriën in suspensie te brengen. 12

Overzicht verbruiksmateriaal Met als voorbeeld, prijzen van Fisher Scientific, een labo leverancier (www.fishersci.be) Prijs (BTW incl.) en naam bij Fisher Scientific LB broth in poeder (LB is een mengsels van gist extract, proteïnen Fisher BioReagents Microbiology en zout die de bacteriën gebruiken als voedsel en energiebron). Media: LB Broth 500g 55 Kostprijs voor een klas van 24 lln (12 groepen) 3 L = 60g = 6,6 Agar Rifampicine: is een antibioticum dat normaal wordt gebruikt tegen tuberculose, lepra, brucellose. Het wordt hier gebruikt omdat resistentie hiertegen gemakkelijk te verkrijgen is in de bacteriestam CSH117. Het kan besteld worden bij labo leveranciers of eventueel gekocht bij de apotheker (commerciële naam: Rifadine 100 harde caps van 150mg kosten ongeveer 32 - voorschrift vereist) DMSO (dimethylsulfoxide) om Rifampicine op te lossen als stock oplossing. Dit is een organische solvent met lage toxiciteit. Het wordt wel snel opgenomen door de huid en daarom zijn handschoenen verplicht om DMSO te manipuleren. Fisher BioReagents Powdered Agar 500g 65 Rifampicin, Fisher BioReagents 1g 78 Dimethyl Sulfoxide, Fisher BioReagents - 100 ml 18 2,5 L = 37,5 g = 4,9 2,5 L 250mg = 19,5 5 ml = 0,9 Pasteurpipetten Fisherbrand Pasteur pipetten 230 mm lengte Petrischalen 1000 stukken 65 Fisherbrand Lage drievoudig geventileerde petrischalen, kunststof 600 stukken en subpack van 20 92 180 pipetten = 12 (eventueel herbruikbaar) 250 platen = 38 (eventueel herbruikbaar maar liefst niet) Totaal verbruik kost voor een klas van 24 leerlingen (12 experimentele groepen) is ongeveer 83 (3,5 /lln). 15

Herbruikbaar materiaal (te kopen of al aanwezig) Eenmalige kosten Prijs (BTW inb) en naam bij Fisher Scientific Pippetteerballon Fisherbrand Spenen voor pasteur pipet, latex 1 ml - 20 stukken 23 Cultuurbuizen Rek voor buizen (in plastiek niet voor de oven!) Erlenmeyer 50 ml Fisherbrand Reageerbuisje van natronkalkglas, gemiddelde wanddikte, zonder rand 75 mm lengte 100 stukken 16 Fisherbrand Fiberglass Reinforced Polyoxymethylene Half-Size Test Tube Racks (voor 36 buizen - 104 x 104 x 59 mm) 14,50 /stuk Fisherbrand Erlenmeyerkolven van borosilicaatglas met smalle hals, met schaalverdeling, met gietrand en etiketvakje 50 ml 43 /10 stukken Erlenmeyer 1 L Fisherbrand Erlenmeyerkolven van borosilicaatglas met smalle hals, met schaalverdeling, met gietrand en etiketvakje 1000 ml 93 /10 stukken Handschoenen (oven en autoclaaf) Bel-Art Autoclaafhandschoenen katoen/badstof 1 paar 40,5 Bacteriestam CSH117 van E. coli De bacteriestam kan per post verstuurd worden door L. Leyns (Vrije Universiteit Brussel) - lleyns@vub.ac.be 16