Geschiedenis Opkomst en teloorgang van technieken in de pathologie Jan G. van den Tweel en Paul J. van Diest Al meer dan 150 jaar is de hematoxyline-kleuring de meest constante techniek in de histopathologische diagnostiek van de patholoog. Met latere aanvullende kleuringen bepaalde deze lang de kennis op cellulair niveau. De transmissie-elektronenmicroscoop voegde daar een ultrastructurele dimensie aan toe en die methode is gedurende vele decennia in het midden van de 20e eeuw een belangrijk diagnosticum geweest. Enzymhistochemie en morfometrie kwamen en gingen voor het grootste deel weer, ongeveer tegelijk met de elektronenmicroscopie, doordat zij ingehaald werden door immuunhistochemie en moleculaire diagnostiek. Deze zullen op hun beurt concurrentie krijgen van onder andere proteomics en andere vormen van genomics. Ook ziet het er naar uit dat het vertrouwde lichtmicroscoop het zal afleggen tegen de zich snel ontwikkelende digitale microscopie, waarmee zelfs diagnostiek op afstand mogelijk is. Zo blijft pathologie een specialisme in beweging. Universitair Medisch Centrum Utrecht, afd. Pathologie, Utrecht. Prof.dr. J.G. van den Tweel en prof.dr. P.J. van Diest, pathologen. Contactpersoon: prof.dr. J.G. van den Tweel (j.vandentweel@umcutrecht.nl). De geschiedenis van de pathologie is zo oud als die van de geneeskunde. Gestoeld op de anatomie van de grote middeleeuwse anatomen en de pathologische anatomie van coryfeeën als Bonet en Morgagni, ontwikkelden zich in de eerste helft van de 19e eeuw de macroscopische, en daarna de microscopische pathologie. 1 Wanneer men reflecteert over de opkomst en teloorgang van diagnostische technieken in de pathologie, is het opvallend dat één van de belangrijkste diagnostische methoden van 150 jaar geleden, de kleuring met hematoxyline, dat vanaf ongeveer 1600 in de handel kwam en die rond 1850 door Heinrich von Waldeyer werd geïntroduceerd in de celbiologie, nog steeds een centrale positie inneemt in de hedendaagse werkzaamheden van de patholoog. 2 Zeker, de coupes worden nu met betere messen gesneden, de apparatuur om de coupes te kleuren en af te plakken is nu volledig automatisch, het aantal kleuringen is uitgebreid en de microscopen zijn veel beter, maar nog steeds is een met hematoxyline en al snel ook met eosine gekleurde coupe het hulpmiddel waarmee het gros van alle diagnosen kan worden gesteld. Het grote verschil met voorheen is dat nu met behulp van verfijnde kleurtechnieken niet alleen cellen en hun organellen, maar ook moleculaire structuren zoals het specifieke cytoskelet en specifieke receptoren kunnen worden gevisualiseerd en gekarakteriseerd en zodoende cellen ook functioneel kunnen worden beschreven. De kleuringen De belangrijkste ontwikkelingen in de afgelopen 150 jaar hebben dan ook betrekking op de technieken die de basis hebben gelegd voor de steeds nauwkeurigere karakterisering van cellen en weefsels. In eerste instantie probeerden NED TIJDSCHR GENEESKD. 2011;155:A2965 1
onze voorgangers dat te bereiken door de ontwikkeling van nieuwe kleuringen. Zo ontwikkelde men vooral in de 19e eeuw, vaak geholpen door een flinke dosis serendipiditeit, onder andere kleuringen voor slijm, koolhydraten, ijzer, melanine, elastine, spierweefsel, bindweefsel en voor diverse zenuwcelcomponenten. De nu nog veel gebruikte periodic acid Schiff (PAS)-kleuring voor mucopolysacchariden dateert overigens pas uit 1948. Elektronenmicroscopie Toen men zo in staat was cellen en weefsels lichtmicroscopisch steeds nauwkeuriger te beschrijven, was een noodzakelijke volgende stap de opheldering van de submicroscopische structuur ervan. De techniek, voor het eerst toegepast in 1931 door de ontwerper Ernst Ruska, die deze nieuwe dimensie toevoegde, was de transmissieelektronenmicroscopie (http://en.wikipedia.org/wiki/ Electron_microscope#History_2). Met behulp van dit instrument konden de beperkingen die de golflengten van het zichtbare licht met zich meebrachten, worden overkomen en werd de ultrastructuur van de cel voor het oog toegankelijk. Men zag de subcellulaire structuren die specifiek zijn voor verschillende celtypes, maar ook de structuren die de cellen met elkaar verbinden, waardoor de celmembranen en hun contacten nauwkeurig konden worden gedocumenteerd. Dit opende de weg voor een nog nauwkeuriger classificatie van cellen in fysiologische en pathologische situaties. Met vergrotingen tot 10 6 is het elektronenmicroscoop dan ook van het midden van de vorige eeuw tot de jaren 80 een belangrijk diagnostisch hulpmiddel geweest bij de diagnostiek van slecht gedifferentieerde tumoren, maligne lymfomen, spierziekten en glomerulaire afwijkingen. Door ontwikkelingen in de enzym- en immuunhistochemie, die hierna worden beschreven, wordt elektronenmicroscopisch onderzoek momenteel nog slechts bij uitzondering in de diagnostiek gebruikt, met name bij spier- en nierziekten. Enzymhistochemie De hiervoor beschreven ontwikkelingen speelden zich vooral af op het niveau van de microscopische anatomie. Verdere vooruitgang zou moeten komen van het identificeren van specifieke cellulaire moleculen. Dit proces werd gestimuleerd door de ontwikkelingen op het gebied van de biochemie en de immunologie, die in ongeveer dezelfde periode voor een tweede golf van diagnostische doorbraken hebben gezorgd. De toenemende kennis van de biochemische functies, waaronder die van orgaanspecifieke enzymen, maakte het onderzoekers in de jaren 60 van de vorige eeuw mogelijk op zoek te gaan naar specifieke kleurmethodes voor deze structuren. Zo werd de enzymhistochemie ontwikkeld waarbij men enzymen specifiek aankleurde in microscopische preparaten middels specifieke chromogene substraten. 3 Zo hoopte men onder andere tumoren van diverse origine maar met identieke morfologische eigenschappen, bijvoorbeeld de adenocarcinomen, van elkaar te kunnen onderscheiden. Echter deze verwachtingen konden later niet worden waargemaakt. De diagnostische mogelijkheden van de elektronenmicroscopie (en later de scanning-elektronenmicroscopie), alsmede die van de enzymhistochemie leidden in de jaren 60 tot euforie in de pathologenwereld. Ter gelegenheid van het 50-jarig bestaan van de Nederlandse Vereniging voor Pathologie in 1970 stipuleerde de toenmalige Leidse hoogleraar Van Rijssel in een feestrede dat in het jaar 2000 varianten op het elektronenmicroscoop en de enzymhistochemie de diagnostiek zouden domineren. Slechts weinigen onder de aanwezigen waren dat niet met hem eens. Andere ontwikkelingen in de jaren 80 werden gestimuleerd door de introductie van de personal computer : de morfometrie en de digitale beeldanalyse. De Nederlander prof. Jan Baak stond hierbij aan de wieg. Aanvankelijk waren deze methoden veelbelovend, maar ze hebben niet tot de doorbraak in de morfologische diagnostiek geleid die ervan werd verwacht, deels doordat de technieken vaak te onpraktisch en te weinig biologisch onderbouwd waren. Immuunhistochemie Voordat de enzymhistochemie en de kwantitatieve pathologie een echte kans kregen werden ze ingehaald door de immuunhistochemie (http://en.wikipedia.org/ wiki/immunohistochemistry). Deze techniek is krachtig gestimuleerd door de ontdekking in de jaren 70 van de bereiding van polyklonale en later monoklonale antistoffen via de hybridomatechnologie (http://en.wikipedia. org/wiki/monoclonal_antibodies), waarmee men antistoffen kon maken tegen bijna ieder gewenst molecuul. Het was slechts een kwestie van tijd voordat er een breed scala van monoklonale antistoffen beschikbaar was tegen een grote diversiteit van cytoskelet-eiwitten, enzymen, hormonen, celmembraanstructuren en CD-antigenen. Deze laatste zijn van groot belang bij de diagnostiek van hematologische maligniteiten. 4 Momenteel kunnen met behulp van de immunohistochemie nagenoeg alle tumoren op bekende kenmerken worden onderscheiden en kan vaak ook nog een uitspraak worden gedaan over de aan- of afwezigheid van celmembraanmoleculen of intracellulaire moleculen die gerelateerd zijn aan prognose of die de reactie op therapie voorspellen zoals de oestrogeen- en HER2-receptoren bij mammacarcinomen (figuur 1). 2 NED TIJDSCHR GENEESKD. 2011;155:A2965
Moleculaire pathologie De ontwikkelingen houden hier niet op. Daar waar het oog ons in de steek laat, is het sinds de jaren 90 mogelijk om met behulp van geschikte probes kenmerkende onderdelen van het DNA en RNA te amplificeren en zichtbaar te maken op weefselcoupes dan wel in oplossing. Op deze wijze kunnen micro-organismen (bacteriën, virussen) worden getypeerd en kunnen daarnaast ook allerlei genetische veranderingen, zoals mutaties, amplificaties, deleties en translocaties in cellen, dan wel klonaliteit, worden aangetoond (http://en.wikipedia.org/ wiki/sequencing). Recentere technieken kunnen epigenetische modificaties aan het licht brengen zoals hypermethylering van gen-promotoren, alsmede de regulerende micro-rna s. Steeds belangrijker wordt de trend om deze technieken niet te beperken tot één gen of eiwit, maar het genoom grootschalig te analyseren ( genomics ). Goede voorbeelden hiervan zijn de verschillende genexpressieprofielen voor het mammacarcinoom die met microarray-technieken zijn ontwikkeld. Veelbelovend, maar nog nauwelijks praktisch toepasbaar, lijkt de grootschalige analyse van eiwitexpressie ( proteomics ). Verwacht wordt echter wel dat genoombrede sequencingtechnieken snel hun intrede zullen doen in de kliniek. Van moleculair weer naar histomorfologie Een belangrijk gevolg van bovenstaande ontwikkelingen is dat de patholoog door de opgedane ervaringen met deze technieken, steeds beter in staat is om vervolgens de betrokken processen ook in preparaten met een routine-hekleuring te herkennen.. Dit geldt bijvoorbeeld voor de diagnostiek van lymfomen. Uitgebreid immuunhistologisch onderzoek is daarbij vaak niet meer nodig omdat we inmiddels weten dat een bepaald immuunpatroon karakteristiek blijkt voor bepaalde morfologische ken- a b c d FIGUUR 1 Histologische beelden van een mammacarcinoom met (a) immuunhistochemisch positieve oestrogeenreceptor in de kernen van de cellen (bruin; hematoxyline-tegenkleuring); (b) amplificatie van de oestrogeenreceptor aangetoond met fluorescentie-in-situhybridisatie (in groen; in rood als controle de probe voor het centromeer van chromosoom 6); (c) immuunhistochemisch aangetoonde overexpressie van het humane epidermale groeifactor (HER)2-eiwit (membraanaankleuring); (d) HER2-genamplificatie aangetoond met chromogene in-situhybridisatie (in de celkernen). NED TIJDSCHR GENEESKD. 2011;155:A2965 3
PERSPEC TI EF merken die ook met een routinekleuring zichtbaar zijn. Een folliculair lymfoom is daarvan een goed voorbeeld. Hetzelfde geldt voor het hodgkin-lymfoom en voor het grootcellig B-cellymfoom, dat vroeger vaak als ongedifferentieerd carcinoom werd gediagnosticeerd, maar dat nu morfologisch meestal al goed herkenbaar is. Ook kunnen immuunhistochemische technieken de moleculaire technieken vervangen, als de relevante elementen die door de moleculaire technieken bekend zijn geworden immuunhistochemisch kunnen worden aangekleurd, dit gebeurt bijvoorbeeld bij de virus diagnostiek. Van vriescoupe naar naaldiopt Los van deze genoemde ontwikkelingen is de peroperatieve vriescoupe voor sneldiagnostiek op haar retour. Preoperatief punctiecytologisch onderzoek en vooral onderzoek van naaldbiopten hebben die plaats ingenomen. Wel wordt de vriescoupe nog gebruikt voor de peroperatieve beoordeling van resectieranden en voor sneldiagnostiek van onverwachte operatieve bevindingen waarvan de diagnose het beloop van de operatie kan beïnvloeden. FIGUUR 2 Links een digitale coupescanner waar 120 fysieke weefselpreparaten tegelijk in kunnen om gescand te worden. Het computerscherm laat de coupe zien tijdens het scanproces. De computer rechts bevat een geheugen van 10 terabyte (1 TB = 1012 B) om alle digitale informatie te kunnen opslaan. FIGUUR 3 Het digitale beeldscherm van de patholoog. Links in beeld 2 digitale virtuele coupes van een basaalcelcarcinoom, waarvan de onderste is aangeklikt. Rechtsboven zijn de 4 betreffende preparaten te zien, met in de 3e een kadertje, dat eronder schermvullend wordt weergegeven. De sterke vergroting rechtsonder geeft het gebied weer waar de cursor zich bevindt (cursor hier niet zichtbaar). Linksboven is bovendien een verticale maatschuif zichtbaar met de zoomfactor en de weefselvergroting. 4 NED TIJDSCHR GENEESKD. 2011;155:A2965
Cytologie Al dan niet op geleide van beeldvormende technieken, heeft cytologisch onderzoek daarentegen haar positie in de diagnostiek geconsolideerd. Naast de klassieke punctie- en uitstrijkcytologie kunnen nu door beeldgeleiding ook diep gelegen processen, die voorheen via een chirurgische ingreep moesten worden benaderd, relatief eenvoudig cytologisch worden gediagnosticeerd. Wat staat ons nog te wachten? Het lichtmicroscoop verdwijnt Kijkend naar de toekomst dient een volgende revolutie zich reeds aan. Een stabiele factor in de histologie was in de afgelopen 200 jaar het microscoop. Het ziet er naar uit dat ook dit instrument zijn langste tijd heeft gehad door de opkomst van de digitale microscopie. Hierbij worden fysieke weefselcoupes door een scanningmicroscoop digitaal vertaald ( virtuele coupes ), in grote databestanden opgeslagen en gekoppeld worden aan de patiëntbestanden (figuur 2). Nu reeds is het een realiteit dat een patholoog in ons laboratorium geen oude coupes van een patiënt uit het archief hoeft te halen om een eerdere diagnose te verifiëren. Hij of zij kan nu eenvoudig op het beeldscherm de aan het verslag gekoppelde virtuele coupes ophalen en ze, net zoals gebeurt bij Google Earth, vergroten tot een niveau waarop een beoordeling mogelijk is (figuur 3). Diagnostiek op afstand Hierdoor wordt digitale diagnostiek op afstand een realiteit. Interessant is dat ook digitale beeldanalysetechnieken een revival doormaken doordat ze gemakkelijk toegepast kunnen worden op deze virtuele coupes voor bijvoorbeeld objectief meten van expressie van hormoonreceptoren. Verder worden nu reeds op de meeste medische faculteiten de microscopische practica digitaal gegeven; de microscopen zijn daar al uit het beeld verdwenen. Conclusie Is dit het einde van de ontwikkelingen? Zeker niet. De pathologische diagnostiek heeft zich bewogen van orgaan naar weefsel naar cel en tenslotte naar subcellulair niveau, steeds meeliftend op de golven van de wetenschappelijke ontwikkelingen. Die zijn nog lang niet aan hun eind. Komt er een nanopathologie? Zeker is dat wij, evenmin als onze voorgangers, een idee kunnen hebben van de ontwikkelingen op de langere termijn omdat die bepaald zullen worden door nieuwe ontdekkingen en ontwikkelingen waar we nu nog geen weet van hebben. Zo zal de pathologie immer een uitdagend en dynamisch vak blijven in het hart van de cel- en weefseldiagnostiek. Belangenconflict: Van Diest ontving via zijn instituut gelden van Philips voor adviezen, van onder meer KWF Kankerbestrijding, de Nederlandse Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (NWO) en de Center for Translational Molecular Medicine (CTMM) voor onderzoek, en van Roche voor lezingen. Financiële ondersteuning voor dit artikel: geen gemeld. Aanvaard op 23 februari 2011 Citeer als: Ned Tijdschr Geneeskd. 2011;155:A2965 > Meer op www.ntvg.nl/perspectief Literatuur 1 Van den Tweel JG, Taylor CR. A brief history of pathology: Preface to a forthcoming series that highlights milestones in the evolution of pathology as a discipline. Virchows Arch. 2010;457:3-10. 2 Titford The long history of hematoxylin. Biotech Histochem. 2005;80:73-8. 3 Goessner W. A brief history of the society for histochemistry. Histochem Cell Biol. 2002;118:91-4. 4 Kluin P, Schuuring E. Molecular cytogenetics of lymphoma: where do we stand in 2010? Histopathology. 2011;58:128-44. NED TIJDSCHR GENEESKD. 2011;155:A2965 5