11/11/13 Ontwikkeling van sneldiagnos0ek m.b.v indicator- organismen voor het aantonen van anastomose lekkage na darmopera0es Claudia Orelio, PhD Lectoraat Innova9eve Moleculaire Diagnos9ek Hogeschool Leiden Anastomose van de darm Anastomose = verbinding tussen twee structuren Colorectale anastomose: bij pa9ënten bij wie een stuk darm verwijderd wordt: Darmtumoren colitus ulcerosa/ Morbus Crohn (ziekte van Crohn) 1
Anastomose; problemen die kunnen optreden In ca 3-19% van de pa9enten treedt na de opera9e naadlekkage op ( colorectal anastomosis leakage ; CAL) naadlekkage=> darm- bacteriën/ feces in de buikholte Mortaliteit/Morbiliteit als gevolg van CAL en bijkomende infec9es/complica9es kan oplopen tot 15% Peritoni9s Sepsis Abces- vorming in buikholte Huidige diagnos9ek van AL 48 hr Monitoren pa9ent Analyse drainvocht m.b.v. microbiologische technieken Iden9fica9e (Vitek); Klinische symtomen (o.a. koorts) 24uur Bloedwaarden (o.a. ontstekingsmediatoren) Aanvullend CT/ radiologisch onderzoek =>diagnose van AL kan dus pas na 72 uur worden vastgesteld 2
Is sneldiagnos9ek mogelijk? Monitoring drainagevocht op de aanwezigheid van indicator organismen/ biomarkers met moleculaire technieken levert een 9jdsbesparing op. Er kan sneller medisch ingegrepen worden in geval van AL. Tijdsbesparing van de diagnos9ek zorgt voor een betere prognose voor de pa9ënt en een lager risico op mor9liteit/ morbiliteit Biomarkers/ indicator- organismen: darmbacteriën (E.Coli, E.Faecalis) Moleculaire diagnos9ek qpcr analyse voor de aanwezigheid darmbacteriën E.coli en E.faecalis in drainvocht 1-5 dagen na opera9e Voordelen moleculaire diagnos9ek: Sneller (uitslag in enkele uren i.p.v dagen) Kwan9ta9ef Specifiek voor bepaald type bacterie Minder gevoelig voor contamina9e omdat er 1-2 bacteriën worden geanalyseerd Detecteert ook dode bacteriën, waardoor beter de omgeving rond de anastomose gemonitord kan worden 3
11/11/13 C.Orelio 2013 Interne controle als technische PCR controle Pilot study Onderzoeksvraag: zijn E.coli en E. faecalis geschikte biomarkers (indicator organismen) voor de diagnos9ek van anastomose lekkage? 17 drainage monsters kweek- posi9eve monsters (n = 10) kweek- nega9eve monsters (n = 7) 4
qpcr curves en smeltpieken E.coli posi9eve controle Cq= 26,3 nega9eve controle Cq= 35,9 monsters Cq= 34,2-37,7 Resultaten N. Komen et al. 2009. J.Microbiol. Methods Geen van de pa9ënten heeg klinische anastomose lekkage ontwikkeld Wel lage hoeveelheid E.coli of E.faecalis in kweek en qpcr te detecteren 5
Discussie qpcr is gevoeliger of minstens net zo gevoelig als de gouden standaard, de microbiologische kweek. qpcr is dus geschikt als diagnos9sche test. Voordeel qpcr: snellere uitslag Bacterie aanwezigheid kan worden veroorzaakt door intra- opera9eve verontreiging/ post- opera9eve wondinfec9e => hoeg niet te ontwikkelen in AL APPEAL- studie Analysis of Predic9ve Parameters for Evident Anastomo9c Leakage 259 pa9ënten in de studie 35 pa9ënten (13.6%) met ontstekings- gerelateerde ziektes 220 pa9ënten (84.9%) met maligniteiten 4 pa9ënten (1.5%) met ischemische coili9s 19 van de 259 pa9ënten (7.3%) kregen anastomose lekkage (9 pa9ënten sepsis; 7 pa9ënten peritoni9s, 3 pa9ënten abces, 8 pa9ënten CT- scan, 7 pa9ënten nieuwe opera9e, 4 pa9ënten feces in drainvloeistof) Komen et al. Int. J. Colorectal Disease; in press 6
Methode Dag 0-5 na de opera9e zorgt een drain voor afvoeren van drainagevloeistof van het wondgebied. Dit versnelt het genezingsproces Analyse drainvloeistof d.m.v. qpcr Analyse drainvloeistof d.m.v. microbiologische kweek (aantal bacteriën in CFU/ml), iden9fica9e (VITEK 2) Resultaten kweek 7
Sensi9viteit en specificiteit Posi9ef en nega9ef voorspellende waarde 8
Resultaten kweek ```` `` ```` `` Op dag 1 is er in 5 pa9ënten met AL een posi9eve kweek gevonden Op dag 1 is er in 12 pa9ënten zonder AL ook een posi9eve kweek gevonden Resultaten kweek ```` `` ```` `` Op dag 1 zijn er in 12 pa9ënten met AL geen bacteriën in de kweek gevonden Op dag 1 zijn er in 197 pa9ënten zonder AL ook geen bacteriën in de kweek gevonden 9
Resultaten kweek hoge specificiteit = grote kans op een nega9eve uitslag bij gezonde pa9ënt lage sensi9viteit =lage kans op posi9eve uitslag bij zieke pa9ënt Lage posi9ef voorspellende waarde (PPV) hoge nega9ef voorspellende waarde (NPV) Resultaten qpcr gemiddeld- hoge specificiteit = grote kans op een nega9eve uitslag bij gezonde pa9ënt gemiddelde sensi9viteit = gemiddelde kans op posi9eve uitslag bij zieke pa9ënt Lage posi9ef voorspellende waarde (PPV) => als de qpcr posi9ef is, dan wil dat niet zeggen dat de pa9ënt AL heeg, maar is verder onderzoek gewenst hoge nega9ef voorspellende waarde (NPV) =>als de PCR nega9ef is, dan is de kans groot dat de pa9ent geen AL heeg 10
Samenvanng resultaten en conclusie kweek qpcr Sensi9viteit 13-37% 50-75% specificiteit 75-97% 75-95% PPV 11-29% 27-50% NPV 93-94% 94-96% Vergelijking testen: de qpcr is minstens zo goed als de gouden standaard (de kweek) Dus de qpcr kan ingezet worden als snelle screeningsmethode om aan te tonen dat de pa9ënt geen AL heeg Alle pa9ënten met een posi9eve qpcr uitslag komen sneller in aanmerking voor aanvullende onderzoeken zoals een CT- scan Aan deze studie hebben bijgedragen: N. Komen P. Willemsen E. van der Harst J.F. Lange M. Morsink S. Beiboer A. Miggelbrink C. van Heerinkhuizen H. Dekter C.Orelio W.B. van Leeuwen 11
qpcr E.faecalis posi9eve controle Cq= 23,4 nega9eve controle Cq= 35,8 monsters Cq= 31,8-36,4 Smeltcurves en smeltpieken E.faecalis 12
qpcr PhHV posi9eve controle Nega9eve controle en monsters Smeltcurves en smeltpieken PhHV 13