GENETISCHE KARAKTERISATIE VAN RECESSIEVE OSTEOGENESIS IMPERFECTA

Transcriptie

1 Academiejaar GENETISCHE KARAKTERISATIE VAN RECESSIEVE OSTEOGENESIS IMPERFECTA Nathalie RAES Promotor: Prof. dr. A. De Paepe Co-promotor: drs. A. Willaert, dr. S. Symoens Scriptie voorgedragen in de 2 de Master in het kader van de opleiding tot ARTS

2 Voorwoord Voorwoord Vooraf zou ik graag enkele personen bedanken zonder wie deze scriptie waarschijnlijk niet tot stand was gekomen. Eerst en vooral wil ik mijn promotor, prof. dr. Anne De Paepe bedanken om mij de mogelijkheid te geven dit onderzoeksproject uit te voeren en om het congres rond osteogenesis imperfecta bij te wonen. Mijn begeleider Drs. Andy Willaert wil ik heel erg bedanken voor de goede begeleiding, het aanleren van de technieken en de vlotte transcontinentale communicatie. Ook dank aan de laboranten van het labo moleculaire genetica. In het bijzonder wil ik Jozefien Weytens en Els De Vogelaere bedanken voor de vele hulp en hun engelengeduld bij de talrijke zoektochten naar het juiste materiaal. Ook een woordje van dank aan mijn medestudente Evelien Snauwaert voor het aangename gezelschap en de vlotte samenwerking. Nathalie Raes I

3 Inhoudstafel Inhoudstafel Voorwoord... I Inhoudstafel... II 1. Abstract Inleiding Fenotype OI Structuur en processing collageen Structuur en functie P3H Mutaties in Col I Recessieve vormen van OI Methodologie Overzicht patiënten De polymerase Chain reaction Principe Ontwerpen van primers Materiaal Programma Agarosegelektroforese Principe Protocol Sanger dideoxy sequeneringsmethode Western blot Principe Celkweek II

4 Inhoudstafel Cellabeling Cellyse SDS-Page analyse Antilichaam labeling Immunocytochemie Protocol Resultaten Screening Lepre Screening cdna Condities primers cdna Screening gdna Resultaten screening Lepre Bespreking genvariaties Splice site mutatie c G>A Nonsense mutatie c.1102c>t Nonsense mutatie c.628c>t variaties c c>t en c C>G Silent mutaties Western blot Immunocytochemie Discussie Conclusie Kandidaatgenen recessieve OI Referenties Bijlage... V 7.1 Overzicht screening... V III

5 Inhoudstafel 7.2 Sequentie primers... IX 7.3 Bijkomende gegevens PCR-reactie... X Reactiemix PCR... X 7.4 Protocol agarosegelektroforese... XI 7.5 Manuele sequencing... XII Enzymatisch opzuiveren PCR-producten... XII Sequencing reactie... XII 7.6 Transcripten Lepre1... XIII 7.7 Condities primers gdna... XV 7.8 Overzicht gekende mutaties Lepre1... XVI IV

6 Abstract 1. Abstract Osteogenesis imperfecta (OI) is een congenitale aandoening die hoofdzakelijk wordt gekenmerkt door fragiele botten en een verminderde botmassa. OI wordt meestal veroorzaakt door mutaties in Col1A1 of Col1A2, de coderende genen van het collageen I eiwit. Ongeveer 10% van de individuen met duidelijke fenotypische manifestaties van OI hebben echter geen primair collageen defect. Recent werden recessieve mutaties beschreven in het Lepre1 of het CRTAP gen (Cabral et al, 2007; Baldridge et al, 2008; Bodian et al, 2009). Het doel van dit onderzoeksproject is nader in te gaan op de rol van Prolyl 3-hydroxylase 1 (P3H1) bij het ontstaan van OI. 42 patiënten met fenotypische kenmerken van OI zonder mutaties in COL1A1 en COL1A2 werden gescreend. Bij een aantal van deze patiënten werd een afwijkend migratiepatroon van Collageen I gezien. Er werd op gdna nagegaan of er afwijkingen waren in Lepre1. Om onder andere intronische mutaties en exondeleties op te sporen werd een screening opgestart van de 15 exonen van Lepre1 op het cdna. Kwantitatieve afwijkingen op eiwitniveau werden vastgesteld door middel van western blot analyse en immunocytochemie. Ten slotte werd aan de hand van een literatuuronderzoek nieuwe kandidaat-genen geselecteerd voor recessieve OI. Sequentieanalyse leverde mutaties in Lepre1 op bij vier patiënten. Twee patiënten zijn homozygoot voor een nonsense mutatie in exon 3. Het transcript wordt afgebroken door nonsense mediated decay. Een derde patiënt is homozygoot voor een splice site mutatie ter hoogte van de overgang van exon 14 naar intron 14. De vierde patiënt geïdentificeerd in deze studie is compound heterozygoot voor dezelfde splice site mutatie en een nonsense mutatie in exon 6. De splice site mutatie heeft enkel invloed op transcript 1 van Lepre1, het enige transcript dat voor een KDEL-retentiesignaal codeert. Men heeft kunnen aantonen dat dit transcript verantwoordelijk is voor de 3-hydroxylatie. De functie van de andere splice vormen is nog niet ontrafeld. In deze onderzoeksthesis werden drie nieuwe mutaties in Lepre1 gevonden die leiden tot recessieve OI. De splice site mutatie, geïdentificeerd in twee patienten, geeft tevens meer inzicht in de rol van P3H1 als intracellulair enzym. 1

7 Inleiding 2. Inleiding Osteogenesis imperfecta (OI) is een erfelijke bindweefselaandoening gekenmerkt door broze beenderen en multipele fracturen. De prevalentie wordt geschat boven de 1 op individuen (Kielty et al, 2002). De ziekte bestaat uit een heterogene groep van presentatievormen die naast het bot ook pezen, ligamenten, de huid, sclerae, tanden en het gehoor aantast. De voornaamste extraskeletale manifestaties zijn blauwe sclerae, dentinogenesis imperfecta, hyperlaxiteit van ligamenten en de huid en gehoorsverlies (Rauch et al, 2004). Voor diagnostisch en therapeutisch gemak worden patiënten ingedeeld in verschillende types naargelang de klinische kenmerken. Hierbij wordt gebruik gemaakt van de classificatie volgens Sillence (1979). Deze gaat van een milde vorm (type I) over een matige (type IV) en een ernstig vervormende (type III) tot een perinataal letale vorm (type II). De best gekende oorzaken van OI zijn dominant overerfbare mutaties in COL1A1 of COL1A2, de genen die coderen voor het eiwit collageen type I. Dit eiwit is het belangrijkste bestanddeel van bot. Tegenwoordig bestaat de diagnostische test voor OI uit kwantitatief en kwalitatief onderzoek van de type I procollageen molecules uit dermale fibroblasten. Wanneer dit afwijkend is, kan sequenering van alle COL1A1 en COL1A2 exonen en flankerende intronen of hun volledige cdna worden uitgevoerd. Hieruit is gebleken dat 10-15% van de individuen met duidelijke botdysplasie binnen het OI spectrum geen primair collageen defect hebben. Toch vertonen sommigen duidelijke overmodificatie van het Collageen I gesynthetiseerd door dermale fibroblasten. Deze patiënten hebben symptomen gelijkaardig aan osteogenesis imperfecta type II of III. Het overervingpatroon lijkt ook recessief te zijn waarbij uit twee gezonde ouders meerdere aangetaste kinderen geboren worden. Een deel van deze gevallen kunnen verklaard worden door de novo mutaties of mozaïcisme bij een van de ouders. In de overige gevallen gaat het om recessieve vormen van OI die niet toe te schrijven zijn aan een mutatie in collageen I. De subgroep die overmodificatie van collageen I vertoont, 2

8 Inleiding wordt veroorzaakt door een defect in een molecule die interageert met de vorming van collageen I. Deze onderzoeksthesis richt zich dan ook op de verdere karakterisatie van recessieve osteogenesis imperfecta veroorzaakt door een mutatie in het prolyl 3-hydroxylase eiwit. Dit is een eiwit dat mede verantwoordelijk is voor posttranslationele modificatie van collageen I. 2.1 Fenotype OI In 1979 maakten Sillence et al een onderverdeling in de verschillende fenotypische vormen van osteogenesis imperfecta die tot vandaan nog steeds wordt toegepast. Op basis van een verschil in fenotype en genotype kunnen vier categorieën onderscheiden worden. Later werden hieraan nog 4 categorieën toegevoegd. (tabel 2.1) Type Ernst Kenmerken Overerving- patroon Mutatie I Mild niet vervormend Normale gestalte Blauwe sclerae Wisselend aantal fracturen Gehoorsverlies volwassen leeftijd Autosomaal Dominant CoL1A1 Prematuur stopcodon II Perinataal letaal Multipele breuken ribben en lange beenderen Lage ossificatie Donkere sclerae Autosomaal Dominant (De novo mutatie) Col1A1/Col1A2 Glycinesubstitutie Exon skipping iiipartiële gendeleties Mutatie C- iiipropeptide III Ernstig vervormend Kort gestalte Ernstige scoliose Grijze sclerae (wisselend) Dentinogenesis imperfecta Autosomaal Dominant Autosomaal recessief (zelden) - Col1A1/Col1A2 Glycinesubstitutie Exon skipping - Col1A2 mutaties die associatie van de ketens verhinderen - Glycinesubstituties 3

9 Inleiding IV Matig vervormend Matig kort gestalte Matige scoliose Grijs tot witte sclerae Dentinogenesis imperfecta Autosomaal Dominant Col1A1/Col1A2 Glycinesubstitutie Exonskipping Partiële gendeleties V Matig vervormend Mild tot matig kort gestalte Radius dislocatie hyperplastische callus Witte sclerae Cacificatie interosseuse membraan voorarm (waarschijnlijk) Autosomaal dominant Ongekend VI Matig tot ernstig vervormend Matig kort gestalte Scoliose Schubachtige botmineralisatie Witte sclerae ongekend Ongekend VII Matig vervormend Mild tot matig kort gestalte Rhizomelie, coxa vara Witte sclerae Congenitale fracturen Vroege vervormingen benen Autosomaal recessief CRTAP VIII Ernstig tot letaal Witte sclerae Ernstige groeiachterstand Extreme ondermineralisatie skelet Knopvormige metaphysen Autosomaal recessief Lepre1 Tabel 2.1: Classificatie van osteogenesis imperfecta (Byers, 2002; Rauch et al, 2004) Type I is een milde vorm. Deze groep wordt gekenmerkt door fracturen, blauwe sclerae en preseniele doofheid. De fracturen en hematomen zijn het meest opmerkelijke kenmerk. De meeste patiënten zijn echter in staat zelfstandig te stappen. Scoliose is frequent maar doorgaans mild. Minder frequent zijn vervormingen van de onderste ledematen en indien zij voorkomen blijken zij eveneens mild te zijn. Hoewel deze kinderen geboren worden met een normaal gewicht en lengte wordt een postnatale groeiachterstand vastgesteld. De hoofdomtrek is groot in vergelijking met leeftijdsgenoten. Het karakteristieke driehoekige gelaat komt voor bij 30%. Een groot deel van de patiënten vertoont gehoorsverlies door otosclerotische doofheid op vrij jonge leeftijd. Vroegtijdige osteoporose kan zich op volwassen leeftijd presenteren. De typische dentinogenesis imperfecta wordt klinisch niet vastgesteld. 4

10 Inleiding Biochemisch is de meest voorkomende vorm een verminderde hoeveelheid normaal collageen, veroorzaakt door een preterm stopcodon in Col1A1. De perinataal letale vorm wordt onder type II gerekend. Er is slechts een heel beperkte ossificatie, waardoor reeds in utero breuken en misvormingen voorkomen. De kenmerken op radiografie zijn accordeonachtige femura, knopvormige botaanwassen ter hoogte van de ribben en platyspondylie. Meestal ziet men overlijden door respiratoir falen veroorzaakt door multipele ribfracturen. Dit type is geassocieerd aan glycinesubstituties in Col1A1 of Col1A2. Het progressief vervormend type is OI type III. De voornaamste kenmerken binnen dit type zijn de toenemende vervormingen van de onderste ledematen tijdens de eerste levensjaren en van de ruggengraat, later in de kindertijd en tijdens de adolescentie. De frequentie van fracturen neemt af in de loop van het leven terwijl vervormingen als kyphoscoliose toenemen. De meeste patiënten zijn dan ook niet in staat zelfstandig te stappen. Dentinogenesis imperfecta en een driehoekig gelaat zijn frequente vaststellingen. Op volwassen leeftijd komt dwerggroei algemeen voor. Indien kinderen geboren worden met een lichte blauwverkleuring van de sclerae is deze zo goed als verdwenen op volwassen leeftijd. Ook in deze groep is respiratoir falen de belangrijkste doodsoorzaak. Net zoals bij OI type II gaat het hier hoofdzakelijk over dominante mutaties door een glycine substitutie in Col1A1 of Col1A2. Type IV wordt tenslotte gekenmerkt door normale sclerae, mild tot matig afwijkende ledematen met fracturen, een variabel kort gestalte, dentinogenesis imperfecta en gehoorsdaling (Marini et al, 2007a). Deze groep omvat alle personen die niet in de eerste drie categorieën kunnen worden ondergebracht. Recent werden ook OI type V tot en met VIII onderscheiden op basis van een verschillende botmorfologie en bepaalde klinische eigenschappen. In tegenstelling tot voorgaande vertoont deze groep echter geen mutaties in Col1A1 of Col1A2. Osteogenesis type V wordt gekarakteriseerd door matig tot ernstig broze beenderen. Deze patiënten vertonen een mild tot matig kort gestalte, dislocatie van het caput radii, een 5

11 Inleiding gemineraliseerd interosseus membraan en hyperplastische callusvorming. Zij hebben witte sclerae en normale tandvorming. Het overervingpatroon lijkt autosomaal dominant te zijn. Het oorzakelijk gen is echter nog niet achterhaald. OI type VI is eveneens een matig tot ernstige vorm. Klinisch hebben deze patiënten een matig kort gestalte, scoliose, witte sclerae en geen dentinogenesis imperfecta. Opstapeling van osteoid in het botweefsel en een schubachtige schikking van de botlammellen zijn typische histologische bevindingen. Het overervingpatroon is nog niet ontrafeld. (Rauch et al, 2004) De laatste jaren heeft men ook type VII en VIII aan deze classificatie toegevoegd. Beide vormen worden later besproken (2.5). 2.2 Structuur en processing collageen Collageen is het talrijkst aanwezige eiwit in het menselijke lichaam. Het komt voor in de extracellulaire matrix en is een belangrijke component van huid, pezen, beenderen en kraakbeen. Meer dan 70% van het totale collageen bestaat uit type I, II en III (Kielty et al, 2002). Dit zijn fibrillaire collagenen die als doel hebben weerstand te bieden aan de krachten uitgeoefend op weefsels en cellen. Van deze groep komt collageen I het meest voor. Zoals al aangehaald in de inleiding is bij osteogenesis imperfecta in de meeste gevallen de functie van collageen I verstoord. Om de fysiopathologie van deze aandoening te begrijpen is het nodig dieper in te gaan op de structuur en processing van dit eiwit. 6

12 Inleiding Fig. 2.1: structuur COL I (Kielty et al, 2002) Collageen type I wordt gevormd door drie helicale polypeptiden die samen een rechtsdraaiende coiled coil structuur vormen: α1(i) 2 α2(i). De collageen α1(i) en α2(i) ketens worden respectievelijk gecodeerd door COL1A1 op chromosoom 17q en COL1A2 op chromosoom 7q. COL1A1 bestaat uit 51 en COL1A2 uit 52 exonen. De alfaketens die gevormd worden, bestaan uit een tripelhelicaal domein van 1014 aminozuren. Ze vormen elk een linksdraaiende helix met drie aminozuren per omwinding. Elk derde aminozuur komt hierbij in het midden van de helix te liggen. Enkel glycine, het kleinste aminozuur met slechts een waterstofatoom als zijketen, is bijgevolg in staat deze plaats in te nemen. De tripelhelicale domeinen zijn opgebouwd uit 338 herhalingen van een Gly-Xaa-Yaa tripeptide geflankeerd door telopeptiden aan het amino en carboxyluiteinde. In deze sequentie wordt de X-positie vaak ingenomen door proline, terwijl hydroxyproline zich in de Y-positie bevindt. De aanwezigheid van hydroxyprolineresidu s is noodzakelijk voor de opvouwing en stabiliteit van de tripel helix terwijl de glycineresidu s zorgen voor een dichte binding. Aangezien een enkel collageen polypeptide op zichzelf structureel onstabiel is, associeert deze met twee verwante moleculen. Samen vormen ze een rechtshandige superhelix. De opvouwing van de helices gebeurt van het carboxy- naar het aminoterminaaluiteinde. De zijketens van de aminozuren op positie X en Y dragen weinig bij tot de stabiliteit van de triple helix. Zij laten echter interactie met andere moleculen in de extracellulaire matrix toe. 7

13 Inleiding Fig. 2.2: Processing Collageen I Synthese van Col I begint met translatie van het mrna op vrije ribosomen. Het N-terminaal signaalpeptide zorgt daarbij voor efficiënt transport naar het endoplasmatisch reticulum (ER). Via een minder goed gekend systeem staat het ook in voor translocatie van het preprocollageen doorheen het ER. 8

14 Inleiding Om een correcte opvouwing te bekomen, zijn de helices onderhevig aan een aantal modificaties die plaatsvinden in het ruw endoplasmatisch reticulum (rer) en het golgiapparaat. Het gaat hier hoofdzakelijk om hydroxylatie en glycosylatie van proline en lysylresiduen. Dit proces gebeurt voor het grootste deel cotranslationeel. De volledige modificatie wordt pas beëindigd wanneer de procollageenketens assembleren tot een tripel helix. Enzymen die instaan voor hydroxylatie zijn prolyl 4-hydroxylase (P4H), prolyl 3-hydroxylase (P3H) en lysylhydroxylase (LH). Het zijn allen leden van de familie der 2-oxoglutaraat dioxygenasen. Voor een correcte enzymatische werking gebruiken zij dezelfde substraten: Fe 2+, O 2, ascorbaat en 2-oxoglutaraat. Prolyl 4-hydroxylase (P4H) hydroxyleert prolineresidu s in de sequentie Xaa-Pro-Gly van onder andere de collageenmolecules. Bijna alle prolineresidu s in de Yaa positie worden gehydroxyleerd tot 4(R)-hydroxyproline. Deze modificatie is noodzakelijk voor de opvouwing en stabilisatie van een tripel helix bij fysiologische temperatuur. Het actieve enzym is een tetrameer (α 2 β 2 ) waarbij de α subunit de katalytische domeinen bevat. De β subunit is hetzelfde eiwit als het enzym proteïne disulfide-isomerase (PDI, zie verder). Het heeft een functie als chaperone tijdens de assemblage van het procollageen. (Myllyharju, 2003) Lysyl-hydroxylases staan in voor hydroxylatie van Xaa-Lys-Gly sequenties, een essentiële stap voor de stabiliteit van de inter-moleculaire collageen cross-linking. De hydroxylgroep biedt ook een aanhechtingssite voor carbohydraat units. Slechts één aminozuur op positie 986 in de α1 keten in collageen I en II wordt gehydroxyleerd door Prolyl 3-hydroxylase 1 (P3H1). Bij collageen IV en V worden daarentegen meerdere residu s omgezet tot proline 3-hydroxylase. De functie van deze modificatie is nog niet opgehelderd maar het zou een destabiliserend effect hebben op het collageen. Vervolgens worden sommige hydroxylysine residu s geglycosyleerd door hydroxylysylgalactosyltransferase en galactosyl-hydroxylysyl-glucosyltransferase. 9

15 Inleiding Opvouwing in secundaire en tertiaire structuur start van zodra translatie heeft plaatsgevonden. Tijdens het transport doorheen de membraan van het ER gebeurt er naast de hydroxylatie ook vorming van disulfidebindingen binnen de amino- en carboxyltelopeptiden van dezelfde keten. Vervolgens associëren de ketens ter hoogte van het carboxypropeptide en de helix vouwt op van C naar N-terminaal. Eenmaal de ketens hun tertiare structuur hebben aangenomen, kan geen verdere modificatie plaatsvinden. Tijdens biosynthese van procollageen in het ER helpen een aantal chaperones bij de correcte opvouwing van collageen. Deze chaperones zijn onder andere BiP/Grp78, Grp94, PDI, P4H en heat-schock proein of 47 kda (Hps47). Het enzym proteïne disulfide-isomerase (PDI) zorgt voor stabilisatie van het C-propeptide door vorming van disulfidebindingen. Het eiwit bindt enkel op monomere C-propeptiden. Daar waar P4H en PDI eerder een affiniteit hebben voor individuele procollageenketens, bindt Hsp47 preferentieel op nieuw gesynthetiseerde triple helices. Dit chaperone stabiliseert de tripel helices en voorkomt hun aggregatie in het ER. Hps47 dissocieert terug van het procollageen tijdens het transport van het ER naar het cis-golgi compartement. (Nagi et al, 2000; Ischida et al, 2006) Nadat de helix is gevormd, wordt het procollageen gesecreteerd in de extracellulaire ruimte. De C-terminale propeptiden worden verwijderd door procollageen C-proteïnasen (PCP). Procollageen C-proteïnase enhancers (PCPE s) binden op de procollageenpolypeptiden waardoor ze een conformationele verandering induceren en de proteolytische activiteit van de PCP s faciliteren(trackman, 2005). De N-terminale propetiden worden verwijderd door een familie proteasen die ADAMTS (a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin type I repeats) genoemd wordt. Na het verwijderen van de propeptiden vermindert de oplosbaarheid van het tropocollageen en zijn de moleculen in staat spontaan te assembleren tot fibrillen. De finale enzymatische stap noodzakelijk voor cross-linking van de collageenmoleculen wordt uitgevoerd door lysyloxidase. Dit eiwit komt voor in de extracellulaire matrix als proenzym en wordt geprocessed door PCP. (Trackman, 2005) Het zet hydroxylysine om in peptidyl-δ-hydroxy-δaminoadipic-δ-semialdehyde en lysine in peptidyl-α-aminoadipic-δ-semialdehyde. Deze 10

16 Inleiding aldehyden vormen covalente intra- en intermoleculaire bindingen met andere aldehyden of met lysine en hydroxylysineresidu s. Naast al deze enzymen die bijdragen tot de processing van collageen zouden ook cellen, celoppervlakte proteïnen, glycosaminoglycanen en proteoglycanen vereist zijn voor de controle van de depositie in de extracellulaire matrix en de organisatie van het collageen. (Marini et al, 2007a; Kielty et al, 2002) 2.3 Structuur en functie P3H1 In 1979 werd prolyl 3-hydroxylase opgezuiverd uit kippen embryo s door Tryggvason et al. Men kon aantonen dat het ging om een glycoproteine dat los van prolyl 4-hydroxylase in de cel voorkwam. De geschatte moleculaire massa bedroeg dalton. P3H1 werd voor het eerst geïsoleerd uit cdna van ratten als leucine proline-enriched proteoglycan (leprecan) (Wassenhove-McCarthy et al., 1999). Het is een chondroitinesulfaat proteoglycaan met 804 aminozuren. De vier mogelijke N-glycolysatie plaatsen en drie SG sequenties, die acceptorsites kunnen zijn voor aanhechting van glycosaminoglycaanketens (GAG), suggereren een sterke glycosylatie van het eiwit. Hoewel het leprecan in deze studie niet gevoelig was aan heparanase/heparitinase is het gezien de aanhechtingsplaatsen voor zowel heparansulfaat GAG als chondroïtesulfaat GAG mogelijk dat er een weefselspecifieke substitutie van glycosamineglycaangroepen bestaat. Het RDG celaanhechtingsmotief is waarschijnlijk een bindingsplaats voor celadhesiereceptoren van de integrinefamilie. Het carboxyterminaal uiteinde bevat een KDEL-retentiesignaal, wat een rol in bepaalde ER processen doet vermoeden. Immunolokalisatie toont de aanwezigheid van leprecan in het ER en golgi aan. Bovendien blijkt het KDEL signaal eveneens aanwezig te zijn in het gesecreteerde proteoglycaan. Uit immunohistochemie kan men afleiden dat leprecan voorkomt in de basale membraan van de bloedvaten en glad spierweefsel van verschillende organen. 11

17 Inleiding Fig. 2.4: structuur P3H1 Vervolgens werd Gros1, het humaan homoloog van leprecan, geïdentificeerd als een groeisuppressor gelegen op chromosoom 1. Kaul et al. (2000) slaagden er in om een gen op chromosoom 1p31 te karakteriseren. Het gen codeert voor twee verschillende transcripten. Translatie van het eerste levert een eiwit op van 736 aminozuren en 84 kda. Het tweede eiwit bestaat uit 363 aminozuren en 41 kda. De lange en korte versie van het eiwit werden respectievelijk hgros1-l en hgros1-s genoemd. Bij hgros1-s zijn er twee inserties van respectievelijk 55 en 174 bp. De eerste insertie leidt tot de inbouw van een prematuur stopcodon. Het korte transcript ontbreekt dan ook een leucine zipper domein dat wel terug te vinden is in hgros1-l. Door onsterfelijke en normale cellen met elkaar te vergelijken zag men dat bij tumorale cellen de lange vorm van het eiwit sterk verminderd tot afwezig was, terwijl de korte vorm opgereguleerd was. Hieruit leidde men af dat het 41kDa eiwit verantwoordelijk is voor groeisuppressie. Het gen werd dan ook Growth suppressive on chromosome 1 (Gros1) genoemd. Door middel van immunolocalisatie constateerde men dat hgros1-l enkel in het cytoplasma voorkwam, terwijl men hgros1-s zowel in het cytoplasma als in de celkern terug kon vinden. Uit rer extracten van kippenembryo s identificeerden Vranka et al. (2004) prolyl 3- hydroxylase. Het cdna, bekomen met RACE PCR, bleek overeen te komen met de sequentie van leprecan of gros1. Immunolokalisatie toont aan dat P3H1 voorkomt in de dermis, de pezen en het kraakbeen bij kippen. In de nier kleurt enkel de calyx positief voor P3H1. Ook in de bloedvaten en de lever komt dit eiwit voornamelijk voor waar fibrillair collageen wordt gesynthetiseerd. 12

18 Inleiding Aangezien het eiwit bindt aan gelatin-sepharose kan men concluderen dat het interageert met volledig of gedeeltelijk ontvouwen collageen. Men kon verder ook aantonen dat het eiwit een complex vormt met cyclophilin B (CYPB) en het cartilage-associated protein (CRTAP). CRTAP is een eiwit van 46.5 kda gelegen op chromosoom 3p22.3. CyPB is hetzelfde eiwit als peptidyl-prolyl cis-trans-isomerase. Het wordt gecodeerd door PPIB en bevordert helix opvouwing door cis/transisomerisatie van Xaa-Pro bindingen. (Steinmann et al., 1991) Fig. 2.5: Het complex P3H1/CRTP/CYPB Nadat Gly-Pro-4Hyp gevormd is door P4H, is P3H in staat deze sequentie om te zetten tot Gly-3Hyp-4Hyp. CRTAP en CYPB zijn in vitro niet vereist zijn voor de enzymatische werking van P3H1. Uit een studie van CRTAP knock-outmuizen blijkt wel dat 3-hydroxylatie afwezig is in α1(i) en α1(ii) collageen ketens (Morello et al., 2006). Dit suggereert dat CRTAP een noodzakelijk helpereiwit is in dit complex waarin P3H1 verantwoordelijk is voor de enzymatische werking. De rol van CYPB in dit eiwitcomplex is nog niet gekend. 2.4 Mutaties in Col I De best gekende en meest voorkomende vorm van osteogenesis imperfecta wordt veroorzaakt door dominant overerfbare mutaties in een van beide collageen I genen. Er bestaan vier groepen Col I mutaties die OI tot gevolg hebben. De eerste groep zorgt voor 13

19 Inleiding een verminderde hoeveelheid type I procollageen. Een tweede groep verandert de structuur van het triple helicaal domein. In de derde groep zitten die mutaties die door een verandering van de structuur van het C-telopeptide correcte opvouwing verhinderen. De kwantitatieve defecten zorgen voor een verminderde hoeveelheid structureel normaal collageen. Hierbij gaat het vaak om een prematuur stopcodon dat ingebouwd wordt in een van de COL1A1 allelen. Het mrna dat wordt afgeleid van dit allel wordt vervolgens door nonsense mediated decay afgebroken. De gebrekkige opbouw van de extracellulaire matrix leidt tot het klinisch beeld van OI type I. Daarnaast bestaan kwalitatieve defecten die leiden tot abnormale collageenmoleculen. Deze groep heeft een grote variëteit aan fenotypische uitingsvormen gaande van de letale vorm tot type IV, de mild tot matige vorm. De klinisch meest significante vormen worden hoofdzakelijk veroorzaakt door een substitutie van het invariabel glycineresidu. Dergelijke substitutie verstoort de opvouwing op deze plaats en vertraagt de propagatie waardoor de niet opgevouwen ketens blootgesteld worden aan modificaties. De tweede meest voorkomende mutatie is een splice site verandering. Hierdoor kunnen exonskipping, intronische inclusie of activatie van cryptische splice sites in intronen of exonen ontstaan. Verder bestaat er ook een kleine groep van deleties, inserties, duplicaties in de collageenhelix en veranderingen in het carboxyterminaal propeptide. Structurele mutaties hebben ergere gevolgen voor de botmatrix dan kwantitatieve. Zij verstoren fibrillogenese, mineralisatie van de botmatrix en interactie met de extracellulaire matrix en de cel. Marini et al. (2007b) stelden een database samen van 832 gekende COLI mutaties. Hierin zaten de substituties van het invariabel glycineresidu en splice site mutaties vervat, de grootste groep van mutaties die OI type II tot IV veroorzaken. Aan de hand van de structuur en het opvouwingspatroon van collageen I trachtte men een voorspelling te doen van het fenotype gekoppeld aan een bepaald genotype. In Col1A1 bestaat het grootste deel van mutaties uit substituties van een glycine residu. Aangezien glycine een obligaat aminozuur is in het binnenste aspect van de helix valt te verwachten dat vervanging door aminozuren met grotere en geladen zijketens de opvouwing van collageen grondig verstoren. Men constateerde inderdaad dat de meeste substituties door valine, aspartaat en arginine OI type II tot gevolg hebben. De meest 14

20 Inleiding frequente substituties zijn echter door serine en cysteïne die hoewel ze eveneens een grotere zijketen dragen, minder vaak letale gevolgen hebben. Aangezien de tripel helix opvouwt van het C-terminaal naar het N-terminale uiteinde zou men kunnen verwachten dat mutaties ergere gevolgen hebben naarmate ze meer carboxyterminaal optreden. Deze verstoren de correcte opvouwing van de helix en geven enzymatische processen de kans langer in te werken op de open polypeptide ketens. Hoewel N-terminale substituties doorgaans niet letaal bleken te zijn, zag men geen gradiënt in de ernst van het fenotype naargelang de mutatie dichter bij het C-terminale uiteinde optrad. Men kan wel stellen dat carboxyterminaal van het helicale aminozuur op positie 200 zo goed als alle glycinesubstituties met geladen aminozuren letale gevolgen hebben. Ten slotte vond men twee helicale gebieden waarin enkel letale mutaties optraden. Deze zijn geassocieerd aan ligand bindende regio s verantwoordelijk voor intermoleculaire crosslinking en interactie met andere matrixproteïnen. Voor Col1A2 gelden grotendeels dezelfde principes. Glycinesubstituties met aminozuren met geladen zijketens zijn eveneens vaker letaal. In vergelijking met de 35.6% letale substituties in Col1A1 vindt men hier slechts 20%. Een tweede verschil is dat carboxyterminaal zowel letale als niet letale substituties met geladen aminozuren voorkomen. Zowel voor Col1A1 als voor Col1A2 kon men geen statistisch significant verband aantonen tussen de stabiliteit van het triplet waarin de mutatie optrad en de ernst van het fenotype. Letale mutaties in Col1A2 treden op in clusters, regelmatig verspreid over de alfaketen. Deze clusters komen overeen met domeinen noodzakelijk voor interactie van het collageen met proteoglycanen. 2.5 Recessieve vormen van OI Zoals reeds aangehaald bij de classificatie van OI bestaan er een aantal fenotypische groepen binnen het OI spectrum waarvoor men geen mutatie in het collageen I gen kan aantonen. De laatste jaren is de aandacht dan ook uitgegaan naar de groep van eiwitten die verantwoordelijk zijn voor de posttranslationele modificatie van het procollageen. 15

21 Inleiding In 2002 identificeerden Ward et al. een aantal individuen met een matig tot ernstige vorm van OI. Multipele fracturen bij geboorte werden opgemerkt naast vroegtijdige vervormingen van de onderste ledematen, verstoorde groei en blauwe sclerae. Twee eigenschappen die nog niet eerder aan een bepaald type werden toegekend, deden zich bij alle patiënten voor: coxa vara en rhizomelie. Dergelijke fenotypische eigenschappen gelijken zeer goed op deze van OI type I. Mutaties in collageen I werden echter uitgesloten en het overervingpatroon is autosomaal recessief. In navolging van de Sillence classificatie werd deze vorm van OI type VII genoemd. Labuda et al. (2002) waren in staat om aan te tonen dat de chromosomale afwijking in deze familie gelegen is op chromosoom 3p Mutaties in CRTAP, gesitueerd ter hoogte van deze locatie, veroorzaken dergelijk fenotype (Barnes et al., 2006). Aan de hand van een knock-out muismodel konden Morello et al. (2006) aantonen dat afwezigheid van CRTAP resulteert in chondrodysplasie met een kort gestalte, kyfose en ernstige osteoporose. Men ziet eveneens een verminderde 3-hydroxylatie van type I collageen. (thesis Snauwaert E., 2009) In 2007 maakten Cabral et al. voor het eerst gewag van mutaties in P3H1 die aan de basis liggen van een nieuw type OI. Naar analogie van het type VII werd dit OI type VIII genoemd. De individuen in dit onderzoek vertonen kenmerken gelijkaardig aan ernstig tot letale OI. Ze hebben overmodificatie van collageen zonder een mutatie in Col1A1 of Col1A2. Dit is te wijten aan een mutatie in Lepre1. Ook Baldridge et al. (2008) konden mutaties in dit gen aantonen bij patiënten met een klinische vorm van OI type II of III. (tabel 2.2). De mutaties die leiden tot een verandering in de splice donor site en de nonsense en frameshift mutaties in deze studies beschreven, leiden op enkele uitzonderingen na allen tot afbraak van het mrna door nonsense mediated decay. Bijgevolg ziet men een sterke vermindering in de hoeveelheid mrna van P3H1 en afname van de 3-hydroxylatie op positie 986 van collageen I(α1). Door de afwezigheid van hydroxylatie van α1(i)pro986 is er een vertraagde opvouwing van de helix en zijn de afzonderlijke ketens langer blootgesteld aan de hydroxylases. Een andere verklaring voor de overmodificatie zou kunnen liggen in de chaperonefunctie van P3H1. 16

22 Inleiding De fenotypische kenmerken van dit type OI zijn witte sclerae, een rond gelaat en een korte tonvormige thorax (Cabral et al., 2000). Dit zou hen onderscheiden van individuen met mutaties in collageen I die voornamelijk blauwe sclerae, een driehoekig gelaat en smalle thorax vertonen. In de tweede studie (Baldridge et al., 2008) zijn deze kenmerken echter niet consistent aanwezig. De botdysplasie bij OI type VIII kan zowel verklaard worden door de verstoorde intracellulaire werking van P3H1 als door de extracellulaire functie van leprecan. In de toekomst zal dus nog moeten worden onderzocht wat nu juist bijdraagt tot het fenotype: de hydroxylatie, de functie als chaperone of het matrix glycoproteine leprecan. In beide studies ziet men bij patiënten die de neonatale periode overleefden duidelijke popcorn-achtige metafysen op radiografie. Dit geldt ook voor patiënten met een mutatie in CRTAP (Snauwaert, 2009). Naast de botdysplasie is er dus ook sprake van een kraakbeendysplasie. Morello et al. (2006) toonden aan dat het complex P3H1/CRTAP/CYPB ook Col II in het kraakbeen hydroxyleren. CRTAP knock-outmuizen hebben een volledige afwezigheid van 3-hydroxylatie in het kraakbeen. Een opmerkelijk gegeven is het feit dat bij een van de patiënten met een Lepre1 mutatie het percentage 3-hydroxyproline in de α1(i) ketens van dermale fibroblasten 4% bedraagt. In dezelfde ketens afgeleid uit botcellen loopt deze hoeveelheid op tot 30%. Hieruit kan worden afgeleid dat er compensatie optreedt voor het verlies van P3H1. Mogelijks zijn P3H2 of P3H3 hiervoor verantwoordelijk. Dergelijke compensatie wordt niet gezien bij patiënten met een CRTAP mutatie. Een overzicht van alle mutaties in Lepre1 die tot op heden beschreven zijn in de literatuur zijn terug te vinden in tabel 7.8 (Bijlage 7.8). 17

23 Methodologie 3. Methodologie 42 patiënten werden geselecteerd. Zij vertoonden allen fenotypische kenmerken van OI. Eerder werd het volledige COL1A1 en COL1A2 gescreend zonder dat men mutaties kon aantonen. Eiwitonderzoek wees echter op toegenomen modificatie van collageen I. Dit zou kunnen wijzen op een mutatie in een van de collageen modificerende eiwitten. Om die reden wordt een screening opgestart van CRTAP (Snauwaert, 2009) en P3H1. Voor P3H1 werd een volledige screening opgestart van de 15 exonen die coderen voor het eiwit. Dit gebeurde door middel van Polymerase Chain Reaction en sequentie-analyse op DNA verkregen uit fibroblasten. Voor een aantal patiënten gebeurde dit enkel op cdna, nadat vorige screening van gdna geen mutaties had opgeleverd. Bij de overigen werd zowel het cdna als het gdna gesequeneerd (bijlage 7.1, tabel 7.1). Bij patiënten die een mutatie vertoonden werd een Western-Blot uitgevoerd om verminderde hoeveelheid of afwezigheid van P3H1 te bevestigen. Ook immunocytochemie diende om de hoeveelheid en lokalisatie van het eiwit aan te tonen. 3.1 Overzicht patiënten Patiënten die in deze onderzoekthesis werden opgenomen voldoen aan volgende criteria: - Fenotypische kenmerken van OI type II of III - Verstoord migratiepatroon van Collageen I op SDS-Page - Geen mutatie in Col1A1 of Col1A2 Ook een aantal ouders van aangetaste kinderen werden in dit onderzoek opgenomen. Bij de meeste patiënten werd Lepre1 op cdna gesequeneerd. Bij 10 patiënten werd een sequenering van het gdna uitgevoerd. Voor de overige patiënten gebeurde reeds een screening op gdna. (Pelicaen J., 2007) Van de 42 patiënten die oorspronkelijk in de screening werden opgenomen werden uiteindelijk slechts 40 gesequeneerd (bijlage 7.1, tabel 7.1). 18

24 Methodologie 3.2 De polymerase Chain reaction Principe De polymerase chain reaction (PCR) is een snelle manier om op een selectieve wijze DNA fragmenten te amplificeren. Om dit toe te laten moet de sequentie van het te bekomen fragment en omliggend gebied gekend zijn. Op basis van deze informatie ontwerpt men twee oligonucleotiden primers die specifiek zijn voor de doelsequentie. Deze bevatten ongeveer 15 tot 25 nucleotiden. De primers worden vervolgens toegevoegd aan een heterogene collectie van DNA, waarna ze specifiek binden aan de complementaire DNA sequenties. Wanneer men ook een hittestabiel DNA polymerase en DNA precursoren (datp, dctp, dgtp en dttp) toevoegt, zullen complementaire DNA-strengen gesynthetiseerd worden. De nieuw gevormde strengen zullen op hun beurt als template dienen voor verdere DNA synthese. Na ongeveer 25 cycli van DNA synthese zullen naast het template DNA, 105 kopieën aanwezig zijn van de doelsequentie. Elke cyclus bestaat uit volgende stappen: - Denaturatie: tussen C - Reannealing van de primers: tussen C - Synthese van het DNA: tussen C Ontwerpen van primers De primers worden zodanig ontworpen dat zij specifiek zijn voor een bepaalde sequentie. Men wil vermijden dat één of beide primers niet-specifiek binden op een andere plaats in het DNA. Dit kan gebeuren wanneer de primer bindt met gekende repetitive DNAsequenties. Het ontwerpen van de primers werd uitgevoerd door ir. A. Willaert. Primers voor screening van het cdna werden ontwikkeld zodat ze de 15 exonen van Lepre1 omvatten. Via ensembl zijn 4 transcripten van Lepre1 terug te vinden. Transcript 1(ENST ) bestaat uit 15 exonen. Transcript 2 (ENST ) bestaat uit 14 exonen, waarbij introngebied tussen exon 14 en 15 nu deel uitmaakt van het transcript. Het 19

25 Methodologie derde transcript omvat slechts 2 exonen en het introngebied tussen exon 2 en 3 maakt deel uit van het transcript. Tenslotte bestaat transcript 4 uit 6 exonen. Een schematische voorstelling van de verschillende primers per transcript is weergegeven in figuur 4.5 (resultaten). De sequenties van de cdna primers zijn terug te vinden in de bijlage (sectie 7.2; tabel 7.2). De primers voor sequenering van het gdna zijn zodanig ontworpen dat alle exonen en het intronisch gebied tussen exon 14 en 15 worden geamplificeerd Materiaal Voor de meeste primers werd gebruik gemaakt van een standaardbuffer (Bijlage 7.3.1; tabel 7.3). Voor een aantal exonen werden geen goede resultaten bekomen met bovenstaande mix. Hiervoor werd een reactie met enhancer (invitrogen) uitgevoerd (Bijlage 7.3.1; tabel 7.4) Programma Voor de meeste exonen werd gebruik gemaakt van een touchdown programma (TD) (Bijlage 7.3.2; tabel 7.5). Op deze manier wordt de specificiteit van de reactie verhoogd. Voor de exonen die geamplificeerd werden met behulp van enhancer werd een programma met constante temperatuur toegepast (Bijlage 7.3.2; tabel 7.6). 3.3 Agarosegelektroforese Principe In neutrale ph is DNA negatief geladen. Van deze eigenschap wordt gebruik gemaakt om verschillende DNA-fragmenten op basis van hun lengte te scheiden. Indien men DNA op een agarosegel laadt, zal het naar de positieve pool toe bewegen van zodra een spanning tussen twee elektroden wordt aangelegd. Kleine fragmenten migreren verder terwijl de grootste bovenaan in de gel blijven zitten. Met de fluorescerende stof ethidiumbromide die aan de 20

26 Methodologie gel wordt toegevoegd, kan men de DNA-fragmenten visualiseren. De stof intercaleert tussen de twee complementaire strengen en licht op wanneer ze bestraald wordt met ultraviolet licht. De lengte van de fragmenten wordt vergeleken met een standaardladder (ReddyRun TM SuperLadder) die men tegelijkertijd laadt. Met deze ladder kan men fragmenten van 0,1 tot 1 kb onderscheiden Protocol Protocol: zie bijlage Sanger dideoxy sequeneringsmethode De fragmenten verkregen dmv de pcr-procedure worden als product voor de sequenering gebruikt. Hieraan worden DNA polymerase, primers, 4 types dntp s en een lage concentratie van dideoxynucleosidetrifosfaten (ddntp s) van de 4 dntp s toe. De ddntp s hebben een elongatie inhiberende werking. Een 2-3 dideoxynucleosidetrifosfaat draagt geen hydroxylgroep op de 2 plaats van het ribose, noch op de 3 plaats, maar wel een waterstof. Het ddntp kan dus wel geïncorporeerd worden in de groeiende DNA-streng door vorming van phosphodiesterbinding tussen zijn 5 koolstof atoom en het 3 koolstofatoom van het voorgaande nucleotide. Er kan echter geen verdere elongatie gebeuren. ddntp s zijn immers niet in staat een fosfodiësterbinding te vormen met het volgende dntp. Er treedt terminatie op, specifiek op plaatsen van het DNA fragment waar het ddntp werd ingebouwd. De frequentie waarmee een ddntp wordt ingebouwd is afhankelijk van de verhouding ddntp/dntp en van het soort enzyme. Door het random inbouwen van de ddntp s ontstaan fragmenten van verschillende lengte met hetzelfde 5 eind maar een verschillend 3 uiteinde. De fragmenten met verschillende lengtes kunnen gescheiden worden op een polyacrylamide gel. Elk type ddntp is gelabeld met een ander fluorochroom. Wanneer men nu de gel van boven naar onder zou lezen, bekomt men de sequentie in 5 naar 3 richting van de complementaire DNA-streng. De detectie van de gemerkte ddntp s gebeurt met behulp van een laser, dit proces is volledig geautomatiseerd. Het toestel dat gebruikt wordt voor de sequenering is ABI3730 XL van Applied Biosystems. 21

27 Methodologie Voor bepaalde exonen die geen zuivere sequenties opleverden werd manueel gesequeneerd (bijlage 7.5). 3.5 Western blot Principe Bij western blotting kan men een specifiek eiwit uit een mengsel detecteren op basis van zijn grootte. De celextracten worden eerst opgelost in sodium dodecyl sulfaat (SDS). Deze stof verbreekt nagenoeg alle niet-covalente bindingen waardoor alle eiwitten eenzelfde lading krijgen gerelateerd aan hun grootte. De eiwitmix wordt vervolgens door middel van elektroforese gelopen over een polyacrylamidegel. De verschillende bandjes, die gescheiden worden op basis van grootte, worden vervolgens overgeblot op een poreuze membraan (PVDF). Deze membraan wordt geïncubeerd met een specifiek antilichaam gericht tegen het gewenste eiwit. Overtollig en dus niet gebonden antilichaam wordt weggewassen en een tweede incubatie vindt ditmaal plaats met een antilichaam gericht tegen het eerste. Dit antilichaam is meestal gelinkt aan een fluorochroom. Wanneer het substraat wordt toegevoegd zal het gebonden eiwit gevisualiseerd worden door fluorescentie Celkweek In deze sectie wordt de bereiding van een cellysaat voor western blot uitgewerkt. De western blot beschreven in de resultaten werd echter uitgevoerd op mediumfractie. Dit werd bereid door Drs. A. Willaert. De cellen worden gekweekt in T25 en T75 flessen met kweekmedium: Bereiden medium: DMEM 1X+ Glucose 4,5 g/l + L-Glutamine + Pyruvaat(Gibco ) foetal calf serum Penicilline/streptomycine Kanamycine 50 ml 5 ml 5 ml 22

28 Methodologie Non essential amino acids 100X Fungizone 5 ml 0,5 ml Dit medium wordt om de 3 tot 4 dagen ververst. Wanneer de cellen onder microscoop confluent zijn, worden ze gesplitst: Splitsen cellen: Spoelen met Versene 1X (2,5ml per T75 en 1,5 ml per T25 fles) Toevoegen van 0,05 % Trypsine EDTA 1X GibcoR Gedurende 7 min incuberen bij 37 C 10 min centrifugeren op 1000pm Supernatans afzuigen Pellet oplossen in DMEM Opgeloste cellen verdelen over 2 T25 flacons Cellabeling Een confluente T75 fles wordt gespoeld met Versene 1X en geïncubeerd met Trypsine gedurende 7 min bij 37 C (zie 3.5.2). Cellen worden opgelost in DMEM gesupplementeerd met L-Ascorbic Acid Sodium Salt SigmaR (C4H7O6Na) 25mg/L in een steriele falcon De opgeloste cellen 10 minuten centrifugeren bij 1000 rpm. Het medium wordt afgezogen en de pellet opgelost in 4 ml DMEM verrijkt met ascorbine zuur. De Celsuspensie verdelen over P30 (1,5 ml) en P60 (2,5 ml). Deze platen worden overnacht geïncubeerd bij 37 C. Bereiden gesupplementeerd BME: BME: Basal Medium Eagle Modified 1x GibcoR (Invitrogen ) 5 ml Penicilline/Streptomycine 50 µl HEPES 1M 50 µl Ascorbic Acid Sodium Salt Sigma (C4H7O6Na) 5 mg/ml BME 50 µl 23

29 Methodologie BAPN (β-amino-propio-nitrille) 5 mg/ml BME 50 µl De platen worden gewassen met Supplemented BME: 1,5 ml per P ml per P60. Bereiden gelabeld BME: 10 ml supplemented BME 2 µl L-proline (0,575 g per 5ml) 2 % ethanol (100 μl ethanol + 5 ml H2O) Oplossing filtreren Toevoegen 100µl gedialyseer FCS Gesupplementeerd BME verwijderen. 1ml gelabeld BME per P30 en 2ml per P60 plaat toevoegen. 24 uur incuberen bij 37 C Cellyse Per P30 en P60 respectievelijk 1 en 2 ml D-PBS GibcoTM (+ CaCl2 + MgCl2) toevoegen en afzuigen. Dit 3 maal herhalen. 0,05 % Trypsine EDTA 1X Gibco toevoegen aan P30 (0.5ml) en P60 (1ml). De cellen worden opgelost in 0.5ml PBS. 2 min centrifugeren aan 7000rpm. Supernatans verwijderen. 0,2 ml lyse buffer toevoegen aan pellet. Bereiden lyse buffer Radioimmunoprecipitation buffer (RIPA) Tris base UltraPureTM NaCl D H 2 O e de buffer neutraliseren tot ph=7.4 door toevoegen Hcl 790 mg 900 mg 75 ml 24

30 Methodologie EDTA 100mM Na-deoxycholaat 10% NP40 10 % (Nonylphenylpolyethylene glycol, Nonidet P40 Substitute Fluka) 1 ml 2,5 ml 10 ml H2O toevoegen tot 100 ml Oplossing bewaren bij 2-8 C. Toevoegen van de enzymen: Aprotinin (1 mg/ml H2O) 100 µl Leupeptin (1 mg/ml H2O) 100 µl Pepstatin (1 mg/ml methanol) 100 µl PMSF 200 mm: Phenylmethylsulfonyl fluoride. (0,3484 g per 10 ml isopropanol) 500 µl Oplossing vortexen en 30 min op ijs laten afkoelen. 4 min centrifugeren op pm Supernatans bewaren bij -20 C SDS-Page analyse De mediumfractie wordt eerst geïncubeerd in een reactiemix waaraan chondroïtinase wordt toegevoegd. Reactiemix: 0,05M Tris/Hcl (ph 8) 121 g/mol 0,06M Na-acetaat 82g/mol 0,14 mg/ml BSA 1 tablet proteïnase inhibitoren 0,06U chondroïtinase ABC 25

31 Methodologie 60 µl reactiemix toevoegen per 40 µl mediumfractie. 4 uur incuberen bij 37 C Aan deze stalen 7,5 µl β-mercapto-ethanol en 42,5 µl ladingsbuffer toevoegen. 20 incuberen bij 60 C Bereiden van de gel: 5% stacking gel: H 2 O 750 µl ProSieve 50 gel solution 100 µl 1M Tris Hcl (ph 6.8) 130 µl 20% SDS (Sodium Dodecyl Sulfate Solution Bio rad ) 10 µl 10% APS (0,1 g Amonium PerSulfate ((NH 4 ) 2 SO 8 ) per 1 ml H 2 O) 10 µl Ultra Pure TM TEMED 1 µl 10% running gel: H 2 O ProSieve 50 gel solution 1M Tris Hcl (ph 8.8) 5,3 ml 2,4 ml 2,5 ml 20% SDS (Sodium Dodecyl Sulfate Solution Bio rad ) 0,05 ml 10% APS (0,1 g Amonium PerSulfate ((NH 4 ) 2 SO 8 ) per 1 ml H 2 O) 100 µl Ultra Pure TM TEMED 4 µl Eenmaal de gel opgesteven is, wordt in het eerste slotje een referentieladder geladen. De overige slotjes worden gevuld met het geïncubeerde eiwit. De draagglaasjes worden in een 1X SDS-PAGE running buffer geplaatst. Bereiden van 5 X SDS-PAGE running buffer (Tris-Glycine-SDS 5X): 26

32 Methodologie H 2 O Tris Base UltraPure TM Glycine Non animal source Sigma : Sodium Dodecyl Sulfate Solution SDS 20 % Bio rad 1l 15 g 72 g 25 ml Verdunnen naar 1X SDS-PAGE running buffer 5X Tris-Glycine-SDS H 2 O 200 ml 800 ml De stacking gel wordt op 100V gelopen, de running gel op 150V. PVDF transfer membraan, Amersham HybonTM (GE Healthcare), onderdompelen in 100%MeOH gedurende 30 PVDF-membraan en filterpapier onderdompelen in H 2 O Elektroden aanbrengen Filterpapier bovenop gel leggen en goed aandrukken 7 minuten blotten in iblot Gel Transfer Device (EU)- Invitrogen Bereiden van 0.05% TBST 1X buffer 5X TBS H 2 O Tween 0.05% 200 ml 800 ml 0,5 ml TBST 1X + 2% milkpowder TBST 1X milkpowder (membrane blocking agent- GE healthcare UK limited) 200 ml 4g 1 uur later roeren met roervlotje op magneet. 27

33 Methodologie PVDF membraan overnacht blokkeren in TBST1x + 2% milkpowder bij 4 C op schudder 10 ml per bakje Eiwit bovenaan Antilichaam labeling 2X wassen met TBST 0.05% 3X5 wassen met TBST 0.05% op schudder 6µl Lepre1 MaxPab polyclonal antibody (Abnova ): 1/1000 6µl antilichaam tegen alfa-tubuline (0.2 mg/ml) 1/6000 Beide antilichamen samen oplossen in 6ml TBST1x+2% melkpoeder Incubatie gedurende 90 bij RT op schudder 2X wassen met TBST 0.05% 3X5 wassen met TBST 0.05% op schudder Incubatie met secundair antibody (goat pab to Rm IgG (Cy5) 1ng/ml): 1/1000 (2.4µl Ab in 6 ml TBST1X) en 2.4µl (goat pab to Rm IgG (Cy3)) Incubatie gedurende 60 bij RT op schudder afschermen met zilverpapier 2X wassen met TBS1X 3X5 wassen met TBS1X op schudder 3.6 Immunocytochemie Principe Deze techniek wordt gebruikt om het expressiepatroon van een specifiek eiwit in de cel te visualiseren. Een antilichaam gericht tegen een epitoop van het eiwit wordt aangetoond door middel van een secundair antilichaam gebonden aan een fluorochroom. 28

34 Methodologie Protocol Cellen trypsiniseren gedurende 10 bij 37 C. 1.5ml trypsine per T25 Toevoegen DMEM medium gesupplementeerd met Ascorbic acid en L-proline 25 mg L-ascorbic acid oplossen in 5 ml DMEM. Filtreren 1/100 filtraat toevoegen aan DMEM 0.575g L-proline oplossen in 5ml H 2 O en 0,1ml ethanol. Filtreren 1/500 filtraat toevoegen aan DMEM 7,5ml gesupplementeerd medium toevoegen per T75 fles pellet oplossen in medium per kamertje 270 µl inzaaien uit een T25 fles en aanvullen tot 500µl met medium. Twee dagen incuberen Medium afgieten en 2x wassen met TBS(1X) Telkens 500µl per kamertje TBS 10X: 200mM Tris 24.29g 1.5M NaCl 87.75g ph 7.4 1/10 verdunnen Cellen 10 fixeren en permeabiliseren in 99.5% aceton (-20 C) 5x2 wassen met TBS(1X) 30 blokkeren met 10% geitenserum in TBS(1X). 200µl per kamertje. Kamers afhalen en veldjes markeren 2.5uur incuberen met Mouse MaxPab anti-lepre1 antilichaam 1/100 MaxPab in 10% goat serum-tbs 50µl in elk kamertje Water in incubatiebak brengen en afdekken om verdamping te voorkomen 3x10 wassen in TBS(1X) 2.5 uur incuberen met Rabbit anti-collageen1 antilichaam 29

35 Methodologie 3x10 wassen in TBS(1X) 1uur incuberen met secundair antilichaam Cy5 gelabeld anti-muis antilichaam: 1/250 in 10% goat serum-tbs (gericht tegen primair antilichaam tegen Lepre1) Cy3 gelabeld anti-rabbit antilichaam: 1/250 in 10% goat serum-tbs (gericht tegen primair antilichaam tegen collageen1) 3x10 wassen in TBS(1X) Plaatjes laten uitdrogen en Vectashield/DAPI aanbrengen kleine druppel per wel dekglaasjes opbrengen Plaatjes bewaren bij -4 C in donker 30

36 Resultaten 4. Resultaten 4.1 Screening Lepre Inleiding De PCR-reacties voor de verschillende exonen van P3H1 werden eerst op punt gesteld aan de hand van controles totdat op agarosegel een specifiek DNA-fragment werd bekomen met de correcte grootte. Er werd uitgegaan van een standaard PCR protocol: Standaard buffer en touch down (Bijlage en 7.3.2). Indien deze conditie een aspecifiek resultaat opleverde, werden verschillende buffers, cycli of een andere annealingstemperatuur uitgeprobeerd. De condities die gebruikt werden voor sequenering van het cdna en het gdna zijn terug te vinden in tabel 4.1 en Screening cdna Positie primers cdna. De primers werden ontwikkeld op basis van de vier transcripten van Lepre1 (ENSG ) bekomen uit de databank van Ensembl ( Een schematische voorstelling van de verschillende exonen en de gedetailleerde beschrijving van de transcripten zijn terug te vinden in bijlage (7.6). Uit de databank van Genbank valt een vijfde transcript (BC108311) af te leiden waarbij slechts een deel van intron 14 wordt uitgespliced in vergelijking met transcript 1. fig. 4.1: gdna Lepre1 met verschillende splice vormen. Transcript 5 is identiek aan transcript 1 uitgezonderd exon

37 Resultaten Fig. 4.2: cdna Lepre1 met aanhechting primers 32

38 Resultaten Condities primers cdna. Voor de verschillende exonen op cdna zijn de condities weergegeven in tabel 4.1. Primer Exon Transcript Lengte Mix Programma Cycli ,2,3 574 PCR enhancer system ,2 574 PCR enhancer system Enhancer 55 C Enhancer 55 C X35 X35 3 / / / / / / ,2 480 Standaard Td ,2 619 Standaard, 5% DMSO Td ,2* 573, 992* Standaard Td PCR enhancer system 2 µl template DNA 55 C X37 Tabel 4.1: condities PCR exonen Lepre1 op cdna. * In transcript 2 wordt intron 14 niet uitgespliced waardoor dit fragment 419 bp langer is ivm transcript 1 Exon 2 in transcript 3 kon niet geamplificeerd worden. Exon 2 bestaat uit de laatste 24 basen van exon 2 in transcript 1. Primer 3 werd ontworpen om dit exon te amplificeren. De forward primer hecht echter aan in het oorspronkelijke exon 2 dat in dit transcript intronisch gebied wordt (fig. 4.2). De Reverse primer ligt eveneens in intron 2, dat identiek is bij alle transcripten. Om splice site mutaties met een invloed op exon 2 op te sporen zal men dus nog een nieuw primerpaar moeten ontwerpen Screening gdna Tabel 7.7 (Bijlage 7.7) geeft de condities weer waarbij screening op gdna heeft plaatsgevonden. De optimalisatie van deze reactie op controles werd uitgevoerd door Drs. A. Willaert. 33

39 Resultaten Fig. 4.3: Positie primers 14 en 15 in gdna Lepre1 Primer 1 tot en met 13 omvatten alle exonen zoals ze worden uitgespliced in transcript 1. Primer 14 omvat Exon 6 in transcript 4 (ENST ). Dit exon ligt in intronisch gebied bij de andere drie transcripten. In deze onderzoeksthesis werd de amplificatie eerst op gdna uitgevoerd. Om een verstoorde splicing van dit exon aan te tonen zou nog een screening op cdna moeten plaatsvinden. Ook een nonsense mutatie die leidt tot een verkort transcript of volledige afbraak door NMD zal op cdna kunnen aangetoond worden. Intron 14 wordt niet uitgespliced in transcript 2 en behoort daar dus tot het coderend gebied (fig. 4.1). Primer 15 overlapt dit intron en de flankerende exonen. (fig. 4.3) Resultaten screening Lepre1 42 patiënten met fenotypische kenmerken van OI werden in deze screening opgenomen. De ernst van de kliniek benaderde OI type II of III. Analyse van collageen I op SDS-page analyse vertoonde een gestoord migratiepatroon bij een deel van de patiënten. Dit is compatibel met overmodificatie van de col I fibrillen. Sequenering van COL1A1 en COL1A2 toonde echter geen mutaties aan. Bij het grootste deel van de patiënten werd Lepre1 op cdna gesequeneerd. Bij 10 patiënten werd een sequenering van het gdna uitgevoerd. Voor de overige patiënten gebeurde reeds een screening op gdna (Pelicaen J., 2007). Een overzicht van de uitgevoerde analyses is terug te vinden in tabel 7.1 (Bijlage 7.1). 34

40 Resultaten Bij 9 patiënten werden gekende polymorfismen in Lepre1 teruggevonden (tabel 4.2). Patiënt Positie Rs-nummer Nucleotide verandering Eiwit verandering 32 Intron c G>A Intron c G>A 9 Exon c.139g>t p.47 A>S 13 Intron c G>A 47 Intron c T>A p.710 F>T (transript 2) 46 Intron c T>A p.710 F>T 35 Intron c T>A p.710 F>T 18 Intron c G>A 26 Intron c T>A p.710 F>T Tabel 4.2: Polymorfismen in Lepre1. Bij een aantal patiënten werden niet gekende variaties teruggevonden (tabel 4.3). Patiënt Positie Nucleotide verandering Eiwit verandering Exon 5 c.978 C>T p.325 T>T Exon 11 c.1594 C>T p.531 L>L Intron 7 c C>G Exon 11 c.1594 C>T p.531 L>L 44 Intron 14 c C>T 37 Intron 14 He.c.1102 C>T p.arg368x Intron 14 He.c G>A p.asp691insx 24 Intron 14 Ho.c G>A p.asp691insx 45 Exon3 Ho.c.628C>T p.arg210x 42 Exon3 Ho.c.628C>T p.arg210x Tabel 4.3: overzicht mutaties in Lepre1. 35

41 Resultaten Bespreking genvariaties Splice site mutatie c G>A Twee patiënten vertonen de mutatie c g>a. Patiënt 24 in homozygote en patiënt 37 in heterozygote vorm. Deze laatste is eveneens drager van een nonsense mutatie c.1102c>t. Dit wordt geïllustreerd op figuur 3.8. Fig 4.4: Lepre1 c g>a De mutatie is gelegen in intron 14 van transcript 1 (fig. 4.1). In transcript 2 wordt dit intron echter niet uitgespliced en wordt het dus coderend (fig. 4.1).Via NNSPLICE versie 0.9 ( kunnen de scores van donor en acceptor splice sites voorspeld worden. Aan de overgang van exon 14 naar intron 14 in transcript 1 levert dit een score van 0.63 op. Deze splice site wordt gevolgd door een herhaling van 19 identieke basenparen. Ook op deze plaats is er een splice site met een score van 0.63 (Fig 4.5). Fig 4.5: Splice sites exon 14 intron 14 36

42 Resultaten Het gebruik van deze twee splice sites levert uiteindelijk drie verschillende transcripten op (fig. 4.6). Transcript 1 maakt gebruik van de eerste splice site waarbij het volledige intron 14 wordt uitgespliced. Het codeert voor een eiwit van 736 aminozuren. Wanneer beroep wordt gedaan op de tweede splice site bekomt men een eiwit van 697 aminozuren, dit is transcript 5 (fig. 4.1). Tenslotte bestaat een derde transcript waarbij geen splicing van intron 14 optreedt (Genbank: AK027648). Dit codeert voor een eiwit bestaande uit 804 aminozuren (transcript 2, fig. 4.1) De puntmutatie c c>a leidt tot een verhoging van de score van de tweede splicing donor site tot Hierdoor wordt de eerste splicing site, met een score van 0.63, genegeerd en verdwijnt het eerste transcript (fig. 4.7). Fig. 4.6: transcripten Lepre1 37

43 Resultaten Fig. 4.7: gevolg van splice site mutatie c g>a ( ) op de splicing in intron 14. Om het resultaat van bovenstaande mutaties beter te visualiseren werden exon 14, intron 14 en exon 15 geamplificeerd op cdna door middel van primer 6. Aangezien de intronen reeds uitgespliced zijn bij cdna is het mogelijk het gevolg van dergelijke mutatie op de verschillende transcripten te visualiseren. De PCR-reactie gebeurde zowel op stalen met als zonder cyclohexemide. Deze stof verhindert de afbraak van transcripten door nonsense mediated decay. De PCR-producten werden gelopen op een 2,5% agarose gel om een beter onderscheid van de verschillende fragmenten te bekomen (fig. 4.8) Fig. 4.8: Agarosegel. CHX: cyclohexemide 38

44 Resultaten Bij de homozygote drager vinden we zoals verwacht geen transcript 1 meer terug. Patiënt 37, die compound heterozygoot is, vertoont een partieel herstel van de hoeveelheid van transcript 1 na toevoeging van cycloheximide. Als gevolg van de nonsense mutatie op het andere allel wordt dit transcript afgebroken door nonsense mediated decay. Toediening van CHX remt dit proces echter af. De overige twee transcripten zijn bij alle patiënten aanwezig Nonsense mutatie c.1102c>t Patiënt 37 is compound heterozygoot voor de nonsense mutatie c.1102c>t en bovenstaande splice site mutatie. Haar moeder, patiënt 7, is heterozygote drager van de nonsense mutatie. Haar vader, patiënt 38, is heterozygoot voor de splice site mutatie c g>a. Hieruit kan men afleiden dat de twee mutaties op verschillende allelen liggen. De nonsense mutatie veroorzaakt een vroegtijdig stopcodon in exon 6. Bijgevolg wordt het mrna afgebroken door NMD. Zoals reeds vermeld, kan een deel van het transcript 1 worden gerecupereerd na toevoeging van CHX (fig. 4.9). Fig. 4.9: He c.1102c>t Nonsense mutatie c.628c>t Een tweede nonsense mutatie, c.628c>t, komt in homozygote vorm voor bij patiënt 45 en 42, broer en zus. Deze puntmutatie introduceert een vroegtijdig stopcodon in exon 3. Nonsense mediated decay is een proces dat een prematuur van een normaal stopcodon onderscheidt. De huidige kennis van dit proces voorspelt dat transcripten met een vervroegd stopcodon 5 van de laatste 50 nucleotiden van het voorlaatste exon onderhevig zijn aan NMD (Holbrook et al., 2004). Volgens deze theorie zou men dus kunnen verwachten dat 39

45 Resultaten transcripten met deze mutatie worden afgebroken. Er bestaan echter voorbeelden van transcripten met een prematuur stopcodon (PTC) die geen NMD ondergaan. Men kan dus onmogelijk op voorhand voorspellen wat het gevolg van zo n PTC zal zijn. Om dit aan te tonen is een kwantitatieve methode voor analyse van het mrna nodig. Een voorbeeld hiervan is toevoeging van cyclohexemide aan cdna. Sequenering van het cdna werd voor deze patiënten nog niet uitgevoerd. Fig Ho c.628c>t variaties c c>t en c C>G. Het polymorfisme c c>g heeft geen effect op de splice sites. Fig. 4.11: Patiënt 46 He c c>g De variatie c c>t zorgt ervoor dat de tweede splice site met een score van 0,63 verdwijnt (fig 4.5). Dit zou impliceren dat transcipt 5 verdwijnt bij een homozygote drager. In transcript 2 ligt deze mutatie in exon 14* (fig. 4.2). Daar veroorzaakt ze een aminozuurverandering p.691t>v. Op de andere transcripten heeft deze mutatie geen invloed. 40

46 Resultaten Bij patiënt 46 is echter nog geen tweede mutatie gevonden waardoor men niet kan besluiten dat deze variatie oorzakelijk is voor het fenotype. Fig. 4.12: Patiënt 44 He c c>t Silent mutaties De silent mutaties c.978 C>T, c.1594 C>T en c.1594 C>T introduceren een codon dat codeert voor het zelfde aminozuur als het oorspronkelijke. Dit heeft dus geen weerslag op het fenotype. 4.2 Western blot Een western blot op gelyseerde fibroblasten werd uitgevoerd door Willaert et al. (2009). Er werd gebruik gemaakt van een polyclonaal antilichaam gericht tegen het volledige P3H1 eiwit. Op figuur 4.13 is duidelijk zichtbaar dat P3H1 afwezig is bij alle vier patiënten. Bij de ouders van patiënten 45 en 42 komt het eiwit verminderd voor. Het eiwit dat hier gedetecteerd wordt migreert tot op 90 kda. Dit komt overeen met de grootte die door Vranka et al. (2004) werd vastgesteld. Bij patiënten 37 en 24 is aangetoond dat enkel expressie van transcript1 is aangetast ( ). Daarom zou men verwachten dat op western blot nog een bepaalde hoeveelheid eiwit zichtbaar is na translatie van de overige transcripten. (fig. 4.7) Bijgevolg kan men de hypothese voorop schuiven dat het eiwit dat hier gebonden werd door het polyclonale 41

47 Resultaten antilichaam het product is van transcript 1. De overige transcripten konden niet worden gevisualiseerd. Fig. 4.13: Western blot met polyclonaal antilichaam tegen P3H1 op cellysaat. (Willaert et al., 2009) Willaert et al. (2009) toonden eveneens aan dat transcript 1 de enige splicing vorm is die een KDEL-retentiesignaal bevat. Dit signaal houdt eiwitten intracellulair voor een functie in het ER en Golgi. Aangezien transcript 1 intracellulair wordt weerhouden, vermoedt men bij de controles enkel de eiwitten van de andere transcripten terug te vinden in de mediumfractie. Dit geldt ook voor patiënten 37 en 24. Bij de broer en zus met een nonsense mutatie wordt geen eiwit verwacht. De eiwitten van transcript 2,3,4 en 5 bestaan uit respectievelijk 804, 207, 364 en 697 aminozuren. In deze onderzoeksthesis werd dan ook een western blot uitgevoerd op medium van fibroblasten. Hetzelfde polyclonaal antilichaam tegen P3H1 als hierboven werd gebruikt. P3H1 is een chondroïtinesulfaat proteoglycaan (Wassenhove-McCarthy, 1999). Het medium werd dan ook vooraf behandeld met chondroïtinase. Dit verwijdert de glycosamineglycanketens zodat enkel het kerneiwit bestuurd kan worden. De expressie van α-tubuline werd gebruikt als een controle voor de hoeveelheid geladen eiwit. 42

48 Resultaten Fig. 4.14: Western blot met polyclonaal antilichaam tegen P3H1 op mediumfractie In de mediumfractie werd geen P3H1 gevisualiseerd met behulp van het polyclonale antilichaam (fig. 4.14) 4.3 Immunocytochemie Voor de immunocytochemie op fibroblasten werd hetzelfde polyclonaal antilichaam tegen het volledige P3H1 eiwit gebruikt als bij de western blot. Ook hier kan men verwachten dat het eiwit gecodeerd door transcript 1 bij alle patiënten afwezig is. Bij de dragers van de splice site mutatie zou eventueel nog eiwit gecodeerd door de andere 4 transcripten kunnen voorkomen.bij de controles merkt men op dat zowel collageen I als P3H1 colokaliseren in het endoplasmatisch reticulum (fig. 4.15). Net zoals kon worden afgeleid uit de Western blot op cellysaat is ook hier het P3H1 volledig afwezig bij alle patiënten. Patiënt 42 is homozygoot voor een nonsense mutatie die resulteert in NMD van alle transcripten. Zoals voorspeld, kan geen enkele vorm van P3H1 worden aangetoond. Patiënt 37 en 42 zullen geen eiwit gecodeerd door transcript 1 meer aanmaken. Ook de overige eiwitten werden niet teruggevonden bij dit experiment. 43

49 Resultaten Fig. 4.15: Immunocytochemie P3H1 en ColI 44