Analyse van genen betrokken bij het Ehlers-Danlos syndroom

Transcriptie

1 FACULTEIT GENEESKUNDE EN GEZONDHEIDSWETENSCHAPPEN Academiejaar Analyse van genen betrokken bij het Ehlers-Danlos syndroom Tim VAN DAMME Promotor: Prof. Dr. Anne DE PAEPE Co-promotor: Dr. Fransiska MALFAIT Scriptie voorgedragen in de 2 de Master in het kader van de opleiding tot MASTER IN DE GENEESKUNDE

2 Toelating tot bruikleen De auteur geeft de toelating deze scriptie voor consultatie beschikbaar te stellen en delen van de scriptie te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting de bron uitdrukkelijk te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze scriptie. Tim VAN DAMME Prof. Dr. Anne DE PAEPE

3 Voorwoord Wetenschap en techniek hebben mij altijd geboeid. Ik heb de voorbije twee jaar de kans gekregen iets met die fascinatie te doen, en zou daarom graag enkele mensen bedanken. Ik wil Prof. Dr. Anne De Paepe bedanken omdat ze mijn promotor wou zijn. Het enthousiasme dat u uitstraalt bij het begeleiden van uw masterproefstudenten en het geven van de lessen klinische genetica is op zijn minst aanstekelijk. Ik wil ook Dr. Fransiska Malfait bedanken. Zonder jou was ik hoogstwaarschijnlijk al verdronken in het moeras dat de erfelijke bindweefselaandoeningen soms lijken te zijn. Philip, altijd gedreven en boordevol ideeën, ik kon mij geen betere begeleider dromen. Alles wat ik op de eerste verdieping van het MRB geleerd heb en meer, heb ik aan jou te danken. Ik zou natuurlijk nergens staan zonder de hulp van mijn familie en vrienden. Mijn ouders voor de nimmer aflatende steun. Sara, om deze masterproef tot in den treure na te lezen en omdat je er altijd bent. Ten slotte zou ik graag Alexander en Sofie bedanken die het soms eindeloze wachten op de volgende PCR een stuk draaglijker maakten. Mijn oprechte dank gaat ook uit naar het personeel van het Centrum voor Medische Genetica Gent om mijn ongetwijfeld talrijke fouten door de vingers te zien en mijn vragen te beantwoorden.

4 Inhoudsopgave Toelating tot bruikleen Voorwoord Inhoudsopgave Lijst van figuren Lijst van tabellen Gebruikte afkortingen Abstract i ii v vi vii ix xi 1 Inleiding De extracellulaire matrix Collageen Elastinevezels Glycoproteïnes Proteoglycanen Erfelijke bindweefselaandoeningen Het Ehlers-Danlos syndroom Cutis laxa Moleculaire pathogenese van enkele recessieve bindweefselaandoeningen Lysylhydroxylase Zinc finger protein

5 INHOUDSOPGAVE iv Latent TGF-β binding protein Doelstelling van de masterproef 21 3 Materialen en methode Studiepopulatie Procedures uitgevoerd door het Centrum voor Medische Genetica Gent Polymerase chain reaction Materialen Apparatuur Protocol Gelelektroforese Materialen Apparatuur Protocol Manuele sequenering Opzuiveren amplicons voor manuele sequenering Manuele sequeneringsreactie Opzuiveren van het sequeneringsproduct Referentiesequenties en analyse Bio-informatica Resultaten Ontwikkeling moleculaire analyse voor PLOD1, ZNF469 en LTBP Moleculaire analyse PLOD Moleculaire analyse ZNF Moleculaire analyse LTBP Moleculaire screening van PLOD1, ZNF469 en LTBP Moleculaire screening PLOD Moleculaire screening ZNF Moleculaire screening LTBP

6 INHOUDSOPGAVE v 5 Discussie Ontwikkeling moleculaire analyse voor PLOD1, ZNF469 en LTBP Moleculaire analyse PLOD Moleculaire analyse ZNF Moleculaire analyse LTBP Moleculaire screening van PLOD1, ZNF469 en LTBP Moleculaire screening PLOD Moleculaire screening ZNF Moleculaire screening LTBP Vergelijking van PLOD1- en ZNF469-positieve patiënten Moleculaire pathogenese van EDS VI en aanverwante fenotypes Fenotype LH1-activiteit Vergelijking van FBLN5- en LTBP4-positieve patiënten Moleculaire pathogenese van autosomaal recessieve cutis laxa Fenotype Algemene conclusie Bibliografie 64 Bijlage 1 Diagnostische criteria van het Ehlers-Danlos syndroom 70 Bijlage 2 Primersequenties voor PLOD1, ZNF469 en LTBP4 73 Bijlage 3 Aminozuren 77

7 Lijst van figuren 1.1 Opbouw van een α-keten en een collageen triple helix Voorstelling van de assemblage van fibrillaire collagenen Biosynthese van fibrillaire collagenen Schematische weergave van LH Schematische weergave van ZNF D-model van een zinkvingermotief Schematische weergave van LTBP Het TGF-β large laten complex (LLC) Opzet duplicatie analyse (gdna) Overzicht van de gevonden genetische veranderingen in PLOD1 bij de probands van HL Conservatie N27 in PLOD1 homo- en orthologen Conservatie D519 in PLOD1 homo- en orthologen Schematische weergave van de gevonden genetische veranderingen in LH Schematische weergave van de gevonden genetische veranderingen in ZNF Schematische weergave van de gevonden genetische veranderingen in LTBP

8 Lijst van tabellen 1.1 Overzicht van de meest voorkomende fibrillaire collagenen Overzicht van de erfelijke vormen van cutis laxa Overzicht van de gekende genetische veranderingen in LTBP Overzicht van de klinische kenmerken van patiënten EDS VI of BCS Overzicht van de technische onderzoeken uitgevoerd bij patiënten met EDS VI of BCS Overzicht van de klinische kenmerken van patiënten met LTBP4-geassocieerde ARCL Samenstelling PCR-mastermix voor het KAPA Taq HotStart PCR-systeem Samenstelling PCR-mastermix voor het Kapa HotStart Robust PCR-systeem Temperatuurschema gebruikt bij een AT-PCR-programma Temperatuurschema gebruikt bij een TD-PCR-programma Temperatuurschemata gebruikt bij opzuiveringsreactie van amplicons Temperatuurschema gebruikt bij de sequenering van de bekomen amplicons Genomische referentiesequenties voor PLOD1, ZNF469 en LTBP Accessienummers van PLOD1, -2, -3, ZNF469 en LTBP Overzicht geoptimaliseerde PCR-condities en PCR-mastermixes voor PLOD1 (gdna) Overzicht geoptimaliseerde PCR-condities en PCR-mastermixes voor ZNF469 (gdna) Overzicht geoptimaliseerde PCR-condities en PCR-mastermixes voor LTBP4 (gdna) Overzicht van de gekende polymorfismen in PLOD1 gevonden bij de gescreende patiënten Overzicht van de gevonden genetische veranderingen in PLOD1 bij de gescreende patiënten Overzicht van de gekende polymorfismen in ZNF469 gevonden bij de gescreende patiënten Overzicht van de gevonden genetische veranderingen in ZNF469 bij de gescreende patiënten Overzicht van de gekende polymorfismen in LTBP4 gevonden bij de gescreende patiënten Overzicht van de gevonden genetische veranderingen in LTBP4 bij de gescreende patiënten Overzicht van de gevonden genetische veranderingen bij patiënten met een vermoeden van EDS VI of BCS Overzicht van de kenmerken van EDS VIA, EDS VIB en BCS Overzicht van de gevonden genetische veranderingen bij patiënten met een vermoeden van ARCL

9 LIJST VAN TABELLEN viii 4 Overzicht van de EDS-subtypes Primersequenties voor PLOD Primersequenties voor ZNF Primersequenties voor LTBP

10 Gebruikte afkortingen 8-Cys 8-cysteïne domein, TB domein AD Autosomaal dominant ADAMTS2 A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin type I repeats 2 ADCL Autosomaal dominante cutis laxa AR Autosomaal recessief ARCL Autosomaal recessieve cutis laxa ASD Atriaal septumdefect BCS Brittle cornea syndroom BDT buffer Big Dye Terminator buffer C- CarboxycbEGF Calciumbindend epidermal growth factor-like domein cdna Complementair DNA CL Cutis laxa CMGG Centrum voor Medische Genetica Gent COPD Chronic obstructive pulmonary disease CVA Cerebrovasculair accident datp Deoxyadenosinetrifosfaat dctp Deoxycytosinetrifosfaat ddntp Dideoxynucleosidetrifosfaten dgtp Deoxyguanidinetrifosfaat DMSO Dimethylsulfoxide DNA Deoxyribonucleïnezuur dntp Deoxyribonucleosidetrifosfaat dsdna Double-stranded DNA dttp Deoxythymidinetrifosfaat ECM Extracellulaire matrix EDS Ehlers-Danlos syndroom EDTA Ethyleendiaminetetra-azijnzuur EJC Exon-exon junctie complex

11 GEBRUIKTE AFKORTINGEN x EM Elektronenmicroscopie ER Endoplasmatisch reticulum EtBr Ethidiumbromide FMD Fibromusculaire dysplasie GAG Glycosaminoglycan gdna Genomisch DNA HP Hydroxylysyl pyridinoline HPLC High performance liquid chromatography hyb Hybride domein LAP Latency-associated protein LH1 Lysylhydroxylase 1 LLC Large latent complex LP Lysyl pyridinoline LTBP Latent TGF-β binding protein mrna Messenger RNA N- Amino- NMD Nonsense-mediated mrna decay OHS Occipital horn syndroom OI Osteogenesis imperfecta PCR Polymerase chain reaction PLOD1 Procollagen lysyl, 2-oxoglutaraat, 5-dioxygenase 1 PolyPhen Polymorphism Phenotyping PTC Premature termination codon RER Ruw endoplasmatisch reticulum RNA Ribonucleïnezuur RR-mix Ready Reaction mix RT-QPCR Kwantitatieve real-time PCR SIFT Sifting Intolerable From Tolerable TB TGF-β bindend domein, 8-cysteïne domein TBE Tris-boraat-EDTA TD-PCR Touchdown polymerase chain reaction TGF-β Transforming growth factor-β UV Ultraviolet WT Wild type XRCL X-gebonden recessieve cutis laxa ZNF469 Zinc finger protein 469 Aminozuren en nucleotiden werden benoemd volgens de International Union of Pure and Applied Chemistry standaarden (

12 Analyse van genen betrokken bij het Ehlers-Danlos syndroom Inleiding Humane bindweefselaandoeningen behoren tot de meest voorkomende genetische aandoeningen. Het ontrafelen van de moleculaire pathogenese van deze aandoeningen kan bijdragen tot een specifiekere classificatie die toestaat sterk gelijkende fenotypes van elkaar te onderscheiden. In deze masterproef werd geprobeerd een moleculaire analyse te ontwikkelen voor drie genen die een rol spelen in de pathogenese van enkele zeldzame recessieve bindweefselaandoeningen. PLOD1 codeert voor het enzym lysylhydroxylase 1 (LH1) dat lysineresiduen hydroxyleert tijdens de biosynthese van collageen. Mutaties in dit gen zijn de oorzaak van het kyphoscoliosis type van EDS (EDS VI), een ernstige aandoening gekenmerkt door een progessieve kyphoscoliose, spierhypotonie, gewrichtshypermobiliteit en ruptuur van de oogbol. Het fenotype van EDS VI vertoont echter sterke gelijkenissen met het brittle cornea syndroom (BCS). Recente studies hebben bewezen dat de moleculaire oorzaak van deze aandoening gelegen is in het ZNF469-gen dat codeert voor een zinkvingerproteïne. Ten slotte werd ook een test ontwikkelt voor LTBP4. Defecten in LTBP4 worden geassocieerd met een autosomaal recessieve vorm van cutis laxa die verder gekenmerkt wordt door een verstoorde ontwikkeling van de longen, het gastro-intestinaal, urogenitaal en locomotorisch stelsel. Het oppuntstellen van de moleculaire tests werd gevolgd door de screening van een reeks patiënten met een vermoeden EDS VI en/of BCS of ARCL. Materialen en methode 23 patiënten werden geselecteerd op basis van de beschikbare klinische informatie. Acht van deze patiënten werden weerhouden voor een screening op genetische defecten in PLOD1 en ZNF andere patiënten werden gecontroleerd op veranderingen in het LTBP4-gen. De screeningsmethodes werden ontwikkeld op basis van polymerase chain reaction (PCR) en manuele

13 ABSTRACT xii sequenering. Veel gebruikte predictiealgoritmes werden gebruikt om de invloed van de gevonden varianten op de eiwitfunctie in te schatten. Alle experimenten werden uitgevoerd volgens de procedures beschreven in het kwaliteitshandboek van het Centrum voor Medische Genetica Gent (CMGG). Resultaten Moleculaire screening van PLOD1 identificeerde mogelijk causale mutaties bij drie probands. Er werden twee missense varianten aangetoond bij twee verschillende patiënten (p.n27h, p.d519h). Daarnaast werden twee gekende mutaties, een homozygote missense (p.w446g) en een heterozygote nonsense mutatie (p.r670x), bevestigd. Bio-informatische analyse van de aminozuursubstituties veroorzaakt door missense mutaties suggereerde een schadelijk effect van alle varianten op de eiwitfunctie van LH1. Een genomische analyse van ZNF469 werd uitgevoerd bij drie patiënten met een vermoeden van BCS. Er werden twee homozygote frameshift mutaties (c dupTCTT, c.9792dupt) ontdekt. Naast deze mutaties, die leiden tot een verschuiving van het leesraam en de introductie van een prematuur stopcodon (PTC) stroomafwaarts in de aminozuursequentie, werden nog twee heterozygote missense varianten (p.a2475q, p.r2461g) aangetroffen. 15 patiënten met een fenotype suggestief voor ARCL, werden gescreend op genetische defecten in LTBP4. Dit leverde tien loss-of-function mutaties op (p.r448x, p.c617x, p.s803x, p.q1221x, p.c1242x, p.q1296x, p.r1377x, c.1263delc, c.4114dupc and c.780+2t>g). Daarnaast werd één gekende variant bevestigd (c.4127insc). Discussie Deze masterproef toont aan dat een mutatie-analyse van PLOD1 moet worden uitgevoerd bij patiënten met een vermoeden van EDS VI of BCS. Daarnaast bevestigen de resultaten van de moleculaire screening van ZNF469 de rol van dit zinkvingereiwit in de pathogenese van BCS. Vergelijking tussen PLOD1- en ZNF469-mutatie positieve patiënten maakt het bovendien mogelijk de fenotypische verschillen tussen EDS VI en BCS verder te verfijnen. Mutaties in ZNF469 zijn, in vergelijking met PLOD1-mutaties, geassocieerd met een meer uitgesproken oculair fenotype en faciale dysmorfie. Daarnaast werd aangetoond dat bij ARCL LTBP4-mutaties frequenter voorkomen dan FBLN5-mutaties en werd gewezen op een aantal duidelijke verschillen tussen FBLN5- en LTBP4-positieve patiënten. LTBP4-positieve patiënten vertonen o.a. meer uitgebreide gastro-intestinale en urogenitale manifestaties.

14 1 Inleiding 1.1 De extracellulaire matrix De oorsprong van de extracellulaire matrix (ECM) is terug te voeren op het ontstaan van de multicellulaire organismes, omdat hij de vorming van bindweefsel mogelijk maakt en verschillende cellulaire processen bevordert. De ECM is een complex netwerk van proteoglycanen en structurele eiwitten zoals collageen en fibrilline. Dit netwerk biedt weerstand aan uitwendige mechanische krachten en laat de diffusie van kleine moleculen zoals nutriënten, hormonen en signaalmolecules toe. Grofweg kunnen we stellen dat de matrix wordt opgebouwd uit vier verschillende macromoleculen: collageen, elastine, glycoproteïnes en proteoglycanen. Elk van deze componenten wordt aangemaakt door weefselspecifieke cellen zoals chondrocyten, chondroblasten, epitheelcellen en osteocyten. Er werd lang gedacht dat de ECM niets meer dan een steungevend omhulsel was voor cellen en weefsels. Het wordt echter steeds duidelijker dat de matrix een dynamische structuur is die een rol speelt

15 INLEIDING 2 bij de homeostase van weefsels en tussenkomt bij belangrijke biologische processen zoals cellulaire groei, proliferatie, differentiatie, migratie en overleving Collageen Collageen is het meest abundante eiwit in het menselijk lichaam en een belangrijke component van de ECM. De collageensuperfamilie bestaat uit minstens 27 verschillende types collageen, 42 verschillende polypeptideketens en meer dan 20 eiwitten met collageenachtige domeinen (Myllyharju and Kivirikko, 2004). Hoewel ze genetisch en biochemisch divers zijn, vertonen alle leden van de collageensuperfamilie structurele gelijkenissen. Ze bevatten minstens één triple helicaal domein bestaande uit drie linksdraaiende polypeptideketens of α-ketens, die rijk zijn aan het G-X-Y triplet (FIGUUR 1.1(D)). Hierbij is elk derde aminozuur glycine (G), het kleinste aminozuur, dat perfect binnenin de helix past (FIGUUR 1.1(F)). De posities X en Y worden voornamelijk ingevuld door proline, hydroxyproline, lysine en hydroxylysine. De ringstructuur van proline en hydroxyproline speelt een belangrijke rol bij de stabilisatie en assemblage van de compacte helix. De vorming van waterstofbruggen tussen de aanwezige amine- en carbonylgroepen zal de helicale structuur verder stabiliseren. Daarnaast maken de hydroxylgroepen op hydroxyproline en -lysine de vorming van extra waterstofbruggen mogelijk. (c) (d) (e) (f) Figuur 1.1: Opbouw van een α-keten en een collageen triple helix. (c) Voorstelling van een linksdraaiende α- keten. (d) Associatie van die linksdraaiende α-ketens tot een rechtsdraaiende collageen triple helix. (e) Space-filling model van een collageen triple helix. (f) Belang van glycine (geel) als kleinste aminozuur aan de binnenzijde van de helix. (GLY, glycine; PRO, proline; HYP, hydroxyproline).

16 INLEIDING 3 Veranderingen in de genen die coderen voor de verschillende types collageen of in de genen die een rol spelen in de biosynthese ervan, liggen aan de basis van een aantal erfelijke bindweefselaandoeningen zoals het Ehlers-Danlos syndroom (EDS) en osteogenesis imperfecta (OI) Fibrillaire collagenen Ongeveer 70% van alle collagenen zijn fibrillaire collagenen. Ze bieden weerstand aan trekkrachten in weefsels zoals de huid, bot, kraakbeen en bloedvaten. Fibrillaire collagenen worden gekenmerkt door de aanwezigheid van één ononderbroken triple helix. Ze vormen lange, lineaire collageenvezels, gekenmerkt door een karakteristieke D-periode van 67 nm die ontstaat door de laterale aggregatie van de 280 nm lange collageenketens (FIGUUR 1.2). Type I collageen is het meest voorkomende fibrillaire collageen. Het komt meestal voor onder de vorm van een heterotrimeer eiwit opgebouwd uit twee α1-ketens en één α2-keten, die respectievelijk worden gecodeerd door het COL1A1- en COL1A2-gen gelegen op chromosoom 17 (17q21.33) en 7 (7q22.1). TABEL 1.1 geeft een overzicht van de meest voorkomende fibrillaire collagenen en de humane aandoeningen die in verband worden gebracht met veranderingen in deze types collageen. Tabel 1.1: Overzicht van de meest voorkomende fibrillaire collagenen. (M, kwantitatief majeur fibrillair collageen; m, kwantitatief mineur fibrillair collageen; OI, osteogenesis imperfecta; EDS, Ehlers-Danlos syndroom) Type Keten Gen Weefselexpressie Humane aandoeningen I (M) α1(i) COL1A1 Huid, pezen OI; osteoporose; EDS arthrochalasis type; ziekte van Caffey α2(i) COL1A2 Arteriën, bot II (M) α1(ii) COL2A1 Kraakbeen, vitreum Verschillende types van chondrodysplasie; osteoarthrose III (M) α1(iii) COL3A1 Huid, arteriën, uterus EDS vasculaire type; arteriële aneurysmata V (m) α1(v) COL5A1 Huid, placenta EDS klassieke type α2(v) COL5A2 Bloedvaten, chorion α3(v) COL5A3 Uterus XI (m) α1(xi) COL11A1 Kraakbeen Milde chondrodysplasieën; niet-syndromaal gehoorsverlies; osteoarthrose α2(xi) COL11A2 Biosynthese van fibrillaire collagenen Fibrillaire collagenen zijn trimerische molecules die ontstaan door de associatie van drie procollageenketens (pro-α ketens) in een rechtsdraaiende helix. De

17 INLEIDING 4 (a) (b) Figuur 1.2: Voorstelling van de assemblage van fibrillaire collagenen. (a) Tweedimensionale verhouding tussen een triple helix en een geassembleerde collageenfibril. De rechtsdraaiende triple helix heeft een lengte van 300 nm en is opgebouwd uit drie afzonderlijke linksdraaiende collageenketens. Een partiële overlap tussen deze ketens verklaart de typische D-periode van 67 nm. Naar: Kielty and Grant (2002). (b) Elektronenmicroscopische (EM) opname van het typisch dwarsbandpatroon van collageenvezels.

18 INLEIDING 5 biosynthese ervan is een complex meerstappenproces dat gekenmerkt wordt door modificaties die eigen zijn aan de collageensynthese. Intracellulaire modificaties maken de assemblage in triple-helicale procollagenen mogelijk, terwijl extracellulaire modificaties aan de basis liggen van de fibrilvorming (FIGUUR 1.3). Figuur 1.3: Biosynthese van fibrillaire collagenen. De polypetideketens worden gesynthetiseerd op membraangebonden ribosomen en in het lumen van het endoplasmatisch reticulum (ER) gesecreteerd. Hier vinden verschillende modificaties plaats die de assemblage van triple-helicale procollagenen mogelijk maakt. Transport naar het Golgi-apparaaat vindt plaats via secretoire vesikels (niet afgebeeld). Na secretie uit de cel associëren de verschillende collageenketens tot fibrillen. Naar: Myllyharju and Kivirikko (2004). De collageensynthese begint met de synthese van pre-procollageenketens (pre-pro-α ketens) door de ribosomen ter hoogte van het ruw endoplasmatisch reticulum (RER). Pre-pro-α ketens zijn opgebouwd uit een signaalpeptide, een aminopropeptide (N-propeptide), een carboxypropeptide (Cpropeptide) en een triple helicaal domein, dat wordt omgeven door een N- en C-telopeptide. Een specifiek peptidase splitst de signaalpeptide af wat de omzetting van pre-procollageen naar procollageen initieert. De assemblage van de verschillende procollageenketens (pro-α ketens) tot een trimere molecule begint met de vorming van disulfidebruggen ter hoogte van de C-propetide waarna de helixwinding verder gaat in de richting van de N-terminus. Tijdens deze assemblage ondergaan de pro-

19 INLEIDING 6 α ketens verschillende posttranslationele modificaties. De belangrijkste wijzigingen, respectievelijk gekatalyseerd door drie hydroxylases (prolyl-3-hydroxylase, prolyl-4-hydroxylase en lysylhydroxylase) en twee glycosyltransferases (hydroxyllysyl-galactosyl-transferase en hydroxylysyl-glycosyltransferase), zijn de hydroxylatie van prolyl- en lysylresiduen en de glycosylatie van hydroxylysylresiduen. Lysylhydroxylase 1 (LH1) of procollageen lysyl, 2-oxoglutaraat, 5-dioxygenase 1 (PLOD1) wordt, gezien de aangetoonde associatie met het kyphoscoliosis type van EDS, verder uitvoerig besproken (ZIE 1.3.1). De modificaties gaan door tot de definitieve vorming van de procollageenhelix die verdere modificatie verhindert. De N- en C-propeptides, die spontane polymerisatie binnenin de cel verhinderen, worden na secretie uit de cel verwijderd door peptidases. C-terminaal wordt de propeptide door een procollageen C-proteïnase verwijderd. De N-propeptide wordt verwijderd door ADAMTS2 (a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin type I repeats 2). Deficiënties in dit enzym zijn geassocieerd met het dermatosparaxis type van EDS (EDS VIIC) doordat structureel afwijkende collageenketens aggregeren tot abnormale collageenvezels (Colige et al., 2004, 1999). De laastste stap in de biosynthese is de associatie van de verschillende mature polypeptideketens tot fibrillaire collageenvezels met een lengte van µm. De vorming van covalente intra- en intermoleculaire cross-links door de oxidatie van (hydroxy)lysylresiduen door het enzym lysyl oxidase stabiliseert de collageenfibrillen. (Lodish et al., 2003; Myllyharju and Kivirikko, 2004; Royce and Steinmann, 2002) Elastinevezels Elastinevezels vormen een netwerk dat elasticiteit en veerkracht geeft aan weefsels zoals de bloedvaten, de longen en de huid. Ze bestaan uit een kern van lateraal en dicht op elkaar gepakte filamenten omgeven door een mantel van microfibrillen. Microfibrillen worden opgebouwd uit verschillende eiwitten, waaronder fibrilline en microfibril-associated glycoproteïnes de belangrijkste zijn. Ze voorzien elastische weefsels van een raster waartegen tropo-elastine, de voorloper van elastine, wordt afgezet tijdens de elastogenese. Fibrillines zijn de voornaamste structurele component in de opbouw van microfibrillen. Het zijn grote glycoproteïnes (ongeveer 350 kda) die worden opgebouwd uit verschillende calciumbindende epidermal growth factor-like (cbegf) domeinen. De latente TGF-β bindende proteïnes (LTBP) worden beschouwd als leden van deze fibrilline superfamilie op basis van hun structurele gelijkenissen. Ze worden eveneens gekenmerkt door het voorkomen van epidermal growth factor-like (EGF) repeats maar bevatten daarnaast ook hybride (hyb) domeinen en specifieke

20 INLEIDING 7 domeinen bestaande uit 8 cysteïneresiduen (8-Cys repeats of TB domeinen) Glycoproteïnes Naast structurele eiwitten en proteoglycanen vinden we in de ECM ook glycoproteïnes zoals fibronectine, laminine en tenascine terug. De glycoproteïnes laminine, fibronectine, tenascine en entacine dragen toe tot de stabiliteit van het bindweefsel en maken interacties tussen de cellen en de matrix mogelijk. De tenascines, een familie glycoproteïnes (TN-C, TN-R, TN-W, TN-X en TN-Y), zijn van bijzonder belang gezien de betrokkenheid van tenascine-x bij een fenotype dat sterk gelijkt op het klassieke type van EDS (Mao et al., 2002) Proteoglycanen Proteoglycanen bestaan uit verschillende oligosacchariden of langere glycosaminoglycanen (GAG s) die covalent zijn verbonden met een eiwitkern. GAG s zijn lange, lineaire disaccharidepolymeren, die sterk negatief geladen zijn door de aanwezigheid van verschillende anionische sulfaat- en carboxylaatgroepen. Ze creëren een sterk hydrofiel milieu dat water en andere kationische molecules zoals groeifactoren, chemokines en enzymes aantrekt en opslaat. 1.2 Erfelijke bindweefselaandoeningen Erfelijke bindweefselaandoeningen behoren tot de meest voorkomende humane genetische aandoeningen. Gezien het onderwerp van deze masterproef zullen het Ehlers-Danlos syndroom, het brittle cornea syndroom (BCS) en cutis laxa (CL) worden besproken Het Ehlers-Danlos syndroom Het Ehlers-Danlos syndroom is een heterogene groep van erfelijke bindweefselaandoeningen die worden gekarakteriseerd door hypermobiele gewrichten, een hyperextensibele huid en algemene weefselfragiliteit. Eén van de belangrijke diagnostische criteria van EDS (behalve EDS IV) is de hyperelasticiteit van de huid, dit wil zeggen dat de huid gemakkelijk uitrekt en onmiddellijk terugschiet bij loslaten (in tegenstelling tot de lakse huid bij CL). Verder voelt de huid ook zacht aan, ontstaan er snel hematomen en is er een slechte en vertraagde wondheling. De gewrichten van deze patiënten

21 INLEIDING 8 zijn laks en kunnen aanleiding geven tot dislocaties van kleine en grote gewrichten. De gewrichtshypermobiliteit kan worden beoordeeld aan de hand van de Beighton score die een eenvoudige en kwantitatieve evaluatie mogelijk maakt. Ten slotte wordt een algemene weefselfragiliteit opgemerkt die bijvoorbeeld de oorzaak is van arteriële ruptuur (EDS IV) of ruptuur van de oogbol (EDS VI). De prevalentie van EDS wordt geschat op 1/5000 levend geboren kinderen. (Steinmann et al., 2002) De classificatie van de verschillende vormen van EDS is door de jaren heen sterk veranderd door de ontdekking van nieuwe fenotypes, causale genetische defecten en inzicht in de moleculaire fysiopathogenese. De huidige classificatie is gebaseerd op de Villefranche nosology en onderkent zes EDS-types op basis van de klinische manifestaties, het overervingspatroon en de biochemische en moleculaire kenmerken (ZIE BIJLAGE 1) (Beighton et al., 1998). We erkennen volgende autosomaal dominante (AD) vormen: het klassieke (EDS I/II), hypermobiele (EDS III) en vasculaire type (EDS V) die het frequentst voorkomen en het arthrochalasis type (EDS VIIA&B) dat zelden voorkomt. De autosomaal recessieve (AR) EDS-types, kyphoscoliosis (EDS VI) en dermatosparaxis (EDS VIIC), zijn zeldzaam. In deze masterproef wordt enkel het kyphoscoliosis type (EDS VI) uitvoeriger besproken EDS - kyphoscoliosis type en aanverwante fenotypes EDS - kyphoscoliosis type Het meest markante kenmerk van het kyphoscoliosis type is de kyphoscoliose, die soms congenitaal aanwezig is maar zich vaak tijdens de eerste kinderjaren ontwikkelt. De scoliose is meestal progressief en kan onbehandeld aanleiding geven tot ernstige complicaties zoals restrictief longlijden. De andere majeure criteria zijn de aanwezigheid van een congenitale musculaire hypotonie, een gegeneraliseerde gewrichtshypermobiliteit, sclerale fragiliteit en ruptuur van de oogbol. Oculaire en vasculaire complicaties dragen in sterke mate toe tot de morbiditeit en mortaliteit die wordt gezien bij patiënten met deze aandoening. Door de ernstige hypotonie en overbeweeglijke gewrichten lopen deze kinderen het risico op een vertraagde neuromotore ontwikkeling. Andere mineure criteria zijn een hyperelastische, fragiele huid, het voorkomen van atrofe littekens, een marfanoïde habitus, micorcornea en osteopenie. (Steinmann et al., 2002) Sommige vormen van EDS VI worden veroorzaakt door een mutatie in het PLOD1-gen dat codeert voor het enzym LH1, maar bij een aantal andere vormen is de moleculaire oorzaak niet gekend (Yeowell and Walker, 2000; Giunta et al., 2005). We noemen deze specifieke types respectievelijk EDS

22 INLEIDING 9 VIA en VIB. EDS VIB vertoont dus geen gedaalde LH1-activiteit. Dit wordt weerspiegeld door een normaal migratiepatroon van de collageenketens op gelelektorforese en een normale lysyl pyridinoline/hydroxylysysl pyridinoline (LP/HP) ratio in de urine (ZIE ) (Al-Hussain et al., 2004). Brittle cornea syndroom Het brittle cornea syndroom is een zeldzame AR bindweefselaandoening die wordt gekenmerkt door een fragiele cornea, keratoconus of keratoglobus, blauwe sclerae, een hyperelastische huid zonder uitgesproken fragiliteit en hypermobiliteit. De uitgesproken fragiliteit van de cornea kan leiden tot ruptuur van de oogbol na mineure trauma. Het onderliggend genetisch defect is onvoldoende opgehelderd, maar recente studies tonen de mogelijke rol aan van ZNF469. (Steinmann et al., 2002; Abu et al., 2008) Het onderscheid met het kyphoscoliosis type van EDS is moeilijk, gezien de gelijkaardige klinische manifestaties van beide aandoeningen ter hoogte van de huid en gewrichten. Beide aandoeningen delen ook een verhoogd risico op ruptuur van de oogbol, hoewel die bij EDS VI minder frequent en dan vooral ter hoogte van de sclerae voorkomt. EDS VI onderscheidt zich klinisch van BCS door de aanwezigheid van congenitale hypotonie, een progressieve kyphoscoliose die vaak start op jonge leeftijd, een fragiele huid, ernstige gewrichtshypermobiliteit gecompliceerd door luxaties, een marfanoide habitus, osteopenie, vaatrupturen en vroegtijdig overlijden door cardiopulmonaire insufficiëntie (Steinmann et al., 2002). Biochemische analyses van de lysylhydroxylase activiteit maken het onderscheid tussen EDS VIA en BCS mogelijk, maar laten geen differentiaal diagnose toe tussen EDS VIB en BCS (ZIE ) (Al-Hussain et al., 2004) Cutis laxa Cutis laxa is een aangeboren of verworven bindweefselaandoening gekenmerkt door een verminderde elasticiteit van de huid. Verworven vormen gaan gepaard met de destructie van normale elastinevezels t.h.v. de huid door een inflammatoire reactie. Eczeem, urticaria, erytheem of toediening van bepaalde geneesmiddelen kunnen een dergelijke reactie uitlokken. Aantasting van andere organen zoals de longen, het hart en de bloedvaten komt voor. Aangeboren vormen worden gekenmerkt door veralgemeende laxiteit van de huid die congenitaal aanwezig is of kort na de geboorte ontwikkelt. Andere organen die vaak worden aangetast zijn de longen, de aorta, de gastrointestinale en de urogenitale tractus. Emfyseem is de meest voorkomende

23 INLEIDING 10 vorm van longaantasting bij cutis laxa en komt vooral voor bij de AR vormen. De AD en verworven vormen van cutis laxa gaan eerder gepaard met chronische obstructieve longziekte (chronic obstructive pulmonary disease, COPD). Aorta ascendens aneurysmata, hypoplasie van de pulmonale arteriën, blaas- en darmdivertikels, hernia diaphragmatica, inguinale hernia en hypermobiele gewrichten werden eveneens gerapporteerd. De huid van een patiënt met CL is duidelijk te onderscheiden van die bij EDS. De eerste is laks, hangt af in uitgesproken huidplooien en vertoont diepe rimpels, terwijl de laatste juist hyperelastisch is en terugveert na uitrekking. (Davidson and Giro, 2002) Erfelijke vormen van cutis laxa TABEL 1.2 geeft een overzicht van de erfelijke vormen van CL en hun genetische basis. Hieronder volgt een korte beschrijving van de meest voorkomende erfelijke vormen van CL. Tabel 1.2: Overzicht van de erfelijke vormen van cutis laxa. (ADCL, autosomaal dominante cutis laxa; ARCL, autosomaal recessieve cutis laxa; XRCL, X- gebonden recessieve cutis laxa; AD, autosomaal dominant; AR, autosomaal recessief; XR, X- gebonden recessief) Naar: Morava et al. (2009); Reversade et al. (2009). Type Overerving Eiwit Gen Fysiopathogenese ADCL AD Elastine ELN Abnormale elastine synthes/afbraak Fibuline 5 FBLN5 Abnormale fibuline-5 synthese/assemblage Onbekend ARCL I AR Fibuline 4 FBLN4 Abnormale fibuline-4 synthese Fibuline 5 FBLN5 Abnormale fibuline-5 synthese Onbekend ARCL II AR ATP6V0A2 ATP6V0A2 Abnormale ph-gradiënt in het Golgi-apparaat PYCR1 PYCR1 Mitochondriale dysfunctie leidend tot een verhoogde graad van apoptose Onbekend XRCL XR ATP7A ATP7A Abnormale koper efflux Autosomaal dominante cutis laxa De autosomaal dominante vorm van cutis laxa (ADCL) wordt gekenmerkt door de congenitale aanwezigheid of vroegtijdige ontwikkeling van een losse, gerimpelde huid die veerkracht mist. Klepafwijkingen, hernia diaphragmatica en inguinale hernia komen ook voor. De meest gevreesde complicatie is dilatatie van de aorta die leidt tot aortadissectie. Histologisch

24 INLEIDING 11 onderzoek van de huid is vaak pathognomonisch: de elastinevezels zijn gefragmenteerd en liggen ver uit elkaar. Deze vormen zijn geassocieerd aan genetische veranderingen t.h.v. het ELN- (chromosoom 7 q11.23), die leiden tot een gestoorde synthese, assemblage of afbraak van elastine (Davidson and Giro, 2002). Markova et al. (2003) hebben bij één patiënt met ADCL ook een heteozygote mutatie gevonden in het FBLN5-gen (chromosoom 14 q32.1). Autosomaal recessieve cutis laxa De autosomaal recessieve vormen van cutis laxa (ARCL) vormen een heterogeen klinisch spectrum dat sterk wisselt in ernst en orgaanaantasting. Klassiek wordt er echter een onderscheid gemaakt tussen twee groepen: ARCL I en ARCL II. (Davidson and Giro, 2002; Morava et al., 2009) ARCL I is een ernstige en soms levensbedreigende aandoening gekenmerkt door uitgebreide aantasting van de longen (atelectasiën en emphyseem), gastro-intestinale en urogenitale divertikels en cardiovasculaire afwijkingen zoals aneurysmata, fibromusculaire dysplasie (FMD) en de vorming van arteriële stenoses. EM toont een kenmerkende daling van de hoeveelheid elastine in de dermis en kwalitatieve veranderingen van de elastinevezels. De oorzaak is in de meeste gevallen onbekend. Enkel de ernstige en vaak lethale vormen van ARCL zijn geassocieerd aan mutaties in FBLN4 (chromosoom 11 q13) en FBLN5 (Elahi et al., 2006; Hucthagowder et al., 2006). ARCL II is een verzamelnaam voor talrijke aandoeningen die gekenmerkt worden door een wisselende aantasting van de huid, een vertraagde groei en psychomotore achterstand en skeletale afwijkingen. De huid van deze patiënten is sterk gerimpeld en weinig elastisch, maar het aangezicht is vaak weinig getroffen. Een beperkte subgroep van deze patiënten vertoont een mutatie in ATP6V0A2 (chromosoom 12 q24.3). (Davidson and Giro, 2002; Morava et al., 2009; Kornak et al., 2008) Recent werd een vorm van ARCL II gekenmerkt door een sterk gerimpelde huid, osteopenie en een progeroid voorkomen geassocieerd aan mutaties in PYCR1 (Reversade et al., 2009). X-gebonden recessieve cutis laxa Patiënten met X-gebonden recessieve cutis laxa (XRCL) vertonen bij de geboorte een uitgesproken faciale dysmorfie: ze hebben een langwerpige facies, een lang philtrum, een gehaakte neus, broos haar, een hoog voorhoofd en een vergrote fontanel. Er kunnen ook belangrijke extracutane manifestaties aanwezig zijn zoals chronische diarree, malabsorptie, congenitale hydronephrose en divertikels ter hoogte van de blaas en de urethra. De aanwezigheid van exostosen ter hoogte van het occiput is pathognomonisch voor deze aandoening. XRCL wordt daarom

25 INLEIDING 12 ook het occipital horn syndroom (OHS) genoemd. De combinatie van een lakse huid met hypermobiele gewrichten, skeletale afwijkingen, neurologische degeneratie, mentale retardatie en vasculaire complicaties is suggestief voor dit syndroom. De moleculaire basis van XRCL is een mutatie in het ATP7A-gen (X-chromosoom q12 13) dat codeert voor een kopertransporter. (Morava et al., 2009; Davidson and Giro, 2002). Mutaties in hetzelfde gen zijn eveneens geassocieerd aan de ziekte van Menkes (Tümer and Moller, 2010). 1.3 Moleculaire pathogenese van enkele recessieve bindweefselaandoeningen De betrokkenheid van PLOD1 bij het kyphoscoliosis type van EDS, meer bepaald EDS VIA, is al lang bekend: de gedaalde lysylhydroxylase activiteit is verantwoordelijk voor de ontwikkeling van het ernstig en progressief karakter van deze aandoening. Daarnaast hebben recente studies gewezen op het belang van ZNF469 en LTBP4 bij de moleculaire pathogenese van respectievelijk BCS en ARCL Lysylhydroxylase 1 Het PLOD1-gen, gelegen op de korte arm van chromosoom 1 (1p36.3 1p36.2), codeert voor het enzym lysylhydroxylase 1. De 19 exonen van PLOD1 leveren een eiwit op van 727 aminozuren of 85 kda Het eiwit LH1 LH1 (of procollageen lysyl, 2-oxoglutaraat, 5-dioxygenase 1, PLOD1) is een membraangebonden, homodimeer eiwit gelokaliseerd ter hoogte van de cisteren van het ER. De retentie in het ER is onafhankelijk van de aanwezigheid van een C-terminaal KDEL-motief (lysine-aspartaat-glutamaat-leucine) dat meestal wordt teruggevonden bij andere ER-residente eiwitten (Lewis and Pelham, 1992; Murshid and Presley, 2004). Mogelijks staan de laatste 32 C-terminale aminozuren in voor de permanente retentie van het enzyme in het ER (Suokas et al., 2003).

26 INLEIDING 13 Figuur 1.4: Schematische weergave van LH1 gebaseerd op de data aanwezig op UniProtKB. (accessienummer Q02809) Functie van LH1 De sterkte van de collageenketens wordt bepaald door de posttranslationele vorming van covalente intra- en intermoleculaire verbindingen. LH1 katalyseert, samen met prolyl 4-hydroxylase en prolyl 3- hydroxylase, de vorming van pyridinoline crosslinks door de hydroxylatie van lysyl- en prolylresiduen in de helicale regio van de collageenketen. Deze drie glycoproteïnes behoren tot de familie van de 2-oxoglutaraat dioxygenases en vereisen een niet-helicaal substraat. Ze werken dus zolang de proα(i)- ketens niet assembleren tot een triple helix. De hydroxylatie vereist Fe 2+, 2-oxoglutaraat, moleculair O 2 en ascorbaat als cofactoren. Bij patiënten met EDS VIA zullen er, door een gedaalde activiteit van LH1, meer lysyl pyridinoline (LP) dan hydroxylysyl pyridinoline (HP) crosslinks worden gevormd. De gevolgen van deze verschuiving op de fysiologie van bindweefsel zijn onvoldoende gekend, omdat beide types eenzelfde crosslinking activiteit hebben. Daartegenover staat dat enkel de HP crosslinks in staat zijn carbohydraatketens te binden, wat zijn weerslag kan hebben op de vorming en stabilisatie van de triple helix. Een bijkomend gevolg van de gedaalde hydroxylatie is de snellere migratie van de collageenketens tijdens gelelektroforese. LP/HP ratio Pyridinoline crosslinks worden niet gemetaboliseerd of opgenomen via de voeding en worden rechtstreeks gesecreteerd in de urine onder vrije of eiwitgebonden vorm. Een chromatografische bepaling van de LP/HP ratio in de urine kan dus indirect de enzymactiviteit van LH1 bepalen. Verschillende studies hebben aangetoond dat deze ratio in de urine van patiënten met EDS VIA (5/1) sterk afwijkt van die van controlestalen (1/3), omdat er minder HP crosslinks gevormd worden (Steinmann et al., 2002; Al-Hussain et al., 2004). Dit staat toe de LP/HP ratio in urine te gebruiken bij de

27 INLEIDING 14 diagnose van EDS VIA. Bovendien maakt deze biochemische analyse ook de differentiaal diagnose tussen EDS VIA enerzijds en EDS VIB en BCS anderzijds mogelijk, omdat bij de laatste een normale enzymactiviteit aanwezig is Het 2-histidine-1-carboxylaat motief De 2-oxoglutaraat dioxygenases zijn in staat Fe 2+ op een haemonafhankelijke manier te binden door de aanwezigheid van het 2-histidine-1-carboxylaat motief (H-X-D/E-Xn-H). Dit motief bevindt zich in de sterk geconserveerde (94-99%) C-terminale regio van LH1 ter hoogte van de aminozuren H656, D658 en H708. Het verlies van één van de histidineresiduen in deze regio doet de enzymactiviteit sterk dalen (tot < 2,5% van de normale activiteit). Dit suggereert het belang van dit motief en deze regio bij de werking van LH1. (Pirskanen et al., 1996) Gekende moleculaire veranderingen Er zijn meer dan 20 verschillende mutaties in PLOD1 gekend die verantwoordelijk zijn voor een gedaalde hydroxylase activiteit en het fenotype van EDS VI (Steinmann et al., 2002; Walker et al., 2005). De meest frequente zijn te wijten aan homologe recombinatie tussen Alu-sequenties in de intronen 9, 16 en 17 van PLOD1. Dit resulteert meestal in een grote duplicatie van exonen en een deletie van 3 kilobasenparen in intron 16 en 17 (Walker et al., 2005). Daarnaast vindt men vooral missense mutaties die via het mechanisme van nonsense-mediated mrna decay (NMD) aanleiding geven tot een gedaalde hoeveelheid messenger RNA (mrna) (Pousi et al., 1994; Heikkinen et al., 1997; Walker et al., 2005). NMD is een fylogenetisch sterk geconserveerd mechanisme dat foutieve mrna s zoals premature stopcodons (PTC) opspoort en verwijdert. Zo voorkomt men de translatie van mrna dat codeert voor afunctionele of zelfs schadelijke polypeptides. Daarnaast is NMD ook een regulator bij de expressie van normale genen: het laat toe het onderscheid te maken tussen een normaal stopcodon en een prematuur. Een normaal stopcodon bevindt zich meestal in het laatste exon op een afstand van ongeveer 50 baseparen (bp) van de 3 -terminus. PTC s kunnen ook meer stroomopwaarts of in eerdere exonen gelegen zijn. Tijdens de splicing van mrna-transcripten wordt een exon-exon junctie complex (EJC) geplaatst ter hoogte van het 5 -uiteinde van de exon-exon juncties. De aanwezigheid van tenminste één EJC stroomafwaarts van een PTC zal het proces van NMD activeren. Gestoorde activatie van dit mechanisme leidt tot de expressie van getrunceerde eiwitten die een dominant negatief effect of een

28 INLEIDING 15 gain-of-function effect kunnen uitoefenen. Wanneer een PTC op minder dan bp van de meest 3 -gelegen exon-exon junctie ligt, bestaat het risico dat het mrna ontsnapt aan nonsense-mediated mrna decay (Holbrook et al., 2004). De complicaties van NMD bij de translatie van foutieve PLOD1-transcripten zijn erg duidelijk. Homozygote of compound heterozygote mutaties gaan gepaard met een sterke daling van de hoeveelheid mrna en enzymactiviteit. Deze patiënten ontwikkelen een fenotype dat beantwoordt aan de kenmerken van het kyphoscoliosis type van EDS (Steinmann et al., 2002). Patiënten die heterozygoot zijn voor een mutatie vertonen slechts een geringe daling van de enzymactiviteit (tot 20%). Zij zullen geen klinische kenmerken van EDS VI vertonen. Er moet worden opgemerkt dat er steeds een residuele lysylhydroxylase activiteit (plusminus 20%) aanwezig blijft door de aanwezigheid van twee PLOD-isovormen, PLOD2 en PLOD3 (Takaluoma et al., 2007) Zinc finger protein 469 ZNF469 is gelegen op chromosoom 16 (16q24). Dit gen, bestaande uit twee zeer grote exonen van respectievelijk 3178 en 8598 bp, codeert voor een zinkvinger van 3925 aminozuren of 410 kda. De exonen van dit gen worden gescheiden door een intron van slechts 84 baseparen Het eiwit ZNF469 Zinkvingers behoren tot de meest voorkomende eiwitten in het menselijk lichaam. ZNF469 is een klassieke C 2 H 2 -zinkvinger die vijf zinkvingermotieven, twee proline-rijke domeinen en één argininerijk domein bevat. Twee serineresiduen en één threonineresidu worden posttranslationeel gefosforyleerd. (FIGUUR 1.5) Figuur 1.5: Schematische weergave van ZNF469 gebaseerd op de data aanwezig op UniProtKB. (accessienummer Q96JG9)

29 INLEIDING 16 C 2 H 2 -zinkvingers worden gekenmerkt door de aanwezigheid van één of meerdere zinkvingermotieven die klassiek bestaan uit een kort β-vouwblad en een α-helix. Twee histidine- en cysteïneresiduen of vier cysteïneresiduen coördineren het zinkatoom (Zn) binnen het zinkvingermotief wat essentieel is voor een goede werking van het eiwit door stabilisatie van de secundaire structuur. (Iuchi, 2001; Gamsjaeger et al., 2007) (FIGUUR 1.6) Figuur 1.6: 3D-model van een zinkvingermotief. Het Zn-atoom (groen) interageert met de cysteïneresiduen (geel) en de histidineresiduen (blauw) die zich respectievelijk ter hoogte van het β-vouwblad en de α-helix bevinden Localisatie van ZNF469 ZNF469 wordt op basis van de eiwitsequentie beschouwd als een kerneiwit. Er zijn echter geen studies die dit concreet aantonen. De aanwezigheid van mrna-transcripten in de cornea, de sclerae, huidfibroblasten en het skeletspierweefsel suggereert de aanwezigheid van ZNF469 in deze weefsels (Abu et al., 2008) Functie van ZNF469 De exacte functie is op dit moment nog niet gekend. Zinkvingers worden klassiek beschouwd als DNA-bindende eiwitten doordat ze specifieke DNA-sequenties kunnen herkennen. Zinkvingermotieven worden dan ook frequent teruggevonden bij transcriptiefactoren (Gamsjaeger et al., 2007). Recente studies tonen echter aan dat ze ook in staat zijn specifieke RNA-sequenties en eiwitten te herkennen (Gamsjaeger et al., 2007; Brayer et al., 2008). Een beperkte overeenkomst met de sequentie van bepaalde collageenketens wijst mogelijk op een rol als extra-nucleaire regulerende factor in

30 INLEIDING 17 de synthese of organisatie van collageenfibrillen (Abu et al., 2008). Het gaat hier weliswaar over een uiterst beperkte homologie van een kleine regio Gekende moleculaire veranderingen Genetische veranderingen in ZNF469 zijn gerapporteerd bij slechts twee families met een vermoeden van BCS. Twee deleties (c.5943dela, c.9527delg) zijn geïdentificeerd bij een Palestijnse familie en een joodse familie van Tunesische origine. Beide veranderingen leiden tot een verschuiving van het leesraam en de introductie van een PTC (Abu et al., 2008). Dit leidt normaal tot NMD, maar het is mogelijk dat de foutieve transcripten aan dit proces ontsnappen omdat het stopcodon in beide gevallen in het laatste exon ligt. Dit kan leiden tot de expressie van afunctionele of schadelijke eiwitten. Een derde mutatie werd recent gerapporteerd. Het betreft een homozygote missense mutatie (p.c3339y) in het vijfde C 2 H 2 -zinkvingermotief (Christensen et al., 2010) Latent TGF-β binding protein Het gen LTBP4 Het LTBP4-gen bevindt zich op chromosoom 19 (19q13.1-q13.2). Er bestaan verschillende LTBP4- varianten die naar analogie met LTBP1 waarschijnlijk ontstaan door alternatieve splicing en het gebruik van afzonderlijke promotoren. LTBP-4L (long) wordt beschouwd als referentiesequentie en onderscheidt zich van LTBP-4S (short) door een verlenging van de N-terminale regio. (Saharinen et al., 1998; Koski et al., 1999) Het eiwit LTBP4 LTBP s behoren tot de fibrilline superfamilie op basis van structurele gelijkenissen. Ze worden gedomineerd door een aaneenschakeling van epidermal-growth-factor like (EGF) repeats onderbroken door hybride domeinen (hyb) en specifieke domeinen bestaande uit 8 cysteïne-residuen (8-Cys repeats of TB domeinen). LTBP4 wordt gekenmerkt door de aanwezigheid van drie calciumbindende (cbegf) en vijftien nietcalciumbindende EGF-like repeats. De cbegf zijn intensief bestudeerd bij fibrilline-1. De aanwezigheid van calcium stabiliseert samen met hydrofobe interacties de interactie tussen cbegf domeinen, die zich hierdoor op een specifieke manier organiseren (Downing et al., 1996; Reinhardt et al., 1997).