Woord vooraf. Interactie tussen Verticillium tricorpus en Verticillium longisporum bij bloemkool

Transcriptie

1 Interactie tussen Verticillium tricorpus en Verticillium longisporum bij bloemkool Woord vooraf Dit eindwerk is tot stand gekomen in de Universiteit Gent, Fac. Bioingenieurswetenschappen, vakgroep gewasbescherming, labo Fytopathologie. Hier liep namelijk een onderzoek naar Verticillium bij bloemkool en het vinden van een biologische bestrijding ervan. Ik mocht dan ook meehelpen in dit onderzoek, het was een zeer toffe ervaring waaruit ik veel geleerd heb. Hierbij wil ik mijn stagebegeleider Bart Quartier bedanken die zorgde voor de goede opvolging van mijn eindwerk en alle antwoorden op mijn vragen. Ook wil ik Prof. dr. ir. Monica Höfte bedanken voor het nakijken van mijn eindwerk en het openstellen van haar laboratorium. In het bijzonder wil ik Soraya França en Sarah Van Beneden bedanken die mij sterk gesteund hebben in het praktische werk en het maken van mijn eindwerk. Zulke stagementoren wens ik alvast iedereen toe! Natuurlijk wil ik ook alle mensen van het labo Fytopathologie bedanken voor hun goede hulp en warmhartigheid! Ook de mensen van het PSKW en POVLT verdienen een dankwoordje. Zij gaven ons namelijk de zaden voor het in vitro experiment, de planten voor het in vivo experiment en namen de grondstalen. Ten slotte zou ik mijn ouders willen bedanken voor het mogelijk maken van mijn studies. Mijn vriend Andy verdient ook een speciaal dankwoordje, op zijn schouders kon ik altijd steunen wanneer ik het even moeilijk had. Hij gaf mij telkens een duwtje in de rug om door te zetten. 1

2 Interactie tussen Verticillium tricorpus en Verticillium longisporum bij bloemkool Samenvatting Verticillium longisporum is een pathogeen bij bloemkool en veroorzaakt vergeling, verwelking en dwerggroei. De ziekte wordt ook wel verwelkingsziekte of slaapziekte genoemd. Enkele Verticillium spp. produceren microscleroten. Dit zijn overlevingsstructuren die tot 15 jaar in de grond kunnen overleven. Eens de ziekte in het veld is, is deze dus zeer moeilijk weg te krijgen. De ziekte heeft dus een grote impact voor telers door de dalende kwaliteit en opbrengst die ermee gepaard gaat. In de regio van Klein-Brabant wordt de bloemkoolteelt al enkele jaren zwaar geteisterd door Verticillium. In West-Vlaanderen duikt de ziekte ook al sporadisch op. Uit voorgaande veldproeven bleek dat er in West-Vlaanderen naast V. longisporum nog een ander species van Verticillium aanwezig is, nl. V. tricorpus. In velden waar beide species voorkwamen werd meestal geen ziekte vastgesteld. Dit suggereert dat V. tricorpus een onderdrukkend effect heeft op de ziekte veroorzaakt door V. longisporum. V. tricorpus is een zwak pathogeen en in literatuur werd reeds aangetoond dat deze schimmel de ziekte veroorzaakt door V. dahliae kon onderdrukken bij aardappel en sla. In dit werk werd de interactie van V. tricorpus en V. longisporum grondig bestudeerd. De pathogeniciteit en interactie werd bestudeerd met in vitro en in vivo experimenten. Bij het in vitro experiment werd een grotere hoeveelheid microscleroten waargenomen bij de wortels van de bloemkolen Clapton geïnoculeerd met V. tricorpus dan deze geïnoculeerd met V. longisporum. Dit wijst hoogstwaarschijnlijk op de resistentie van de plant t.o.v. V. tricorpus. Ook zag men dat V. tricorpus een groeistimulatie gaf bij de bloemkoolplanten Clapton. Dit was echter niet het geval bij het in vivo experiment, waarbij het bloemkoolras Cornell gebruikt werd. Een mogelijke reden hiervan is het verschillend ras en de wijze van inoculatie. Ook is het mogelijk dat deze groeistimulans maar te zien is bij het begin van de groei. In dit experiment veroorzaakte V. tricorpus geen vasculaire zwartverkleuring van de stam en kon niet herisoleerd worden vanuit de bladeren of stam, terwijl V. longisporum de typische symptomen veroorzaakte en dikwijls ook herisoleerd kon worden vanuit de bladeren. Hoogstwaarschijnlijk is het ras Cornell resistent tegen V. tricorpus kolonisatie, zoals gesuggereerd werd in 2

3 Interactie tussen Verticillium tricorpus en Verticillium longisporum bij bloemkool het experiment in vitro met het ras Clapton. De pre-inoculatie met V. tricorpus kon de planten Cornell niet beschermen tegen V. longisporum gedurende de 6 weken na inoculatie. Zeven weken na inoculatie leek de aanwezigheid van V. tricorpus toch een afzwakking van de stijging van de ziekte-index te weeg te brengen. Het experiment was gelimiteerd door de beperkte potgrootte en werd beëindigd 9 weken na inoculatie van de schimmels. Het zou dus interessant zijn om dit experiment nogmaals te herhalen voor een besluit getrokken wordt. Een tweede doelstelling in dit eindwerk was de detectie van microscleroten afkomstig van Verticillium in de grond. De meest gebruikte techniek hiervoor is de uitplating op MSEA (Modified Soil Extract Agar). Omdat deze techniek tijdrovend is en soms moeilijk onderscheid gemaakt kan worden tussen de microscleroten van de species, werd geprobeerd een species-specifieke PCR voor detectie van verschillende Verticillium spp. in grondstalen te optimaliseren. Dit werd uitgevoerd a.d.h.v. DNA van zuivere kolonies van de verschillende species en van enkele grondstalen waarvan men wist welke species aanwezig waren. De optimalisatie is echter nog niet voltooid. Een laatste doelstelling was te bevestigen of er effectief een verschil van voorkomen van V. tricorpus en de voorteelt merkbaar was. Ook wilden we de correlatie bekijken tussen het voorkomen van V. tricorpus en de aantasting in gronden van West- Vlaanderen en Klein Brabant. Praktisch alle grondstalen afkomstig van West- Vlaanderen bevatten microscleroten van V. tricorpus wat ook bleek uit voorgaande studies. In Klein-Brabant werd slechts in één grondstaal V. tricorpus waargenomen. De voorteelt lijkt een effect te hebben, maar verder onderzoek is hier vereist. 3

4 Interactie tussen Verticillium tricorpus en Verticillium longisporum bij bloemkool Lijst met afkortingen en symbolen a.d.h.v. aan de hand van AUDPC Area Under the Disease-Progress Curve BLASTn Basic Local Alignment Search Tools: Vergelijkt een nucleotide sequentie t.o.v. de nucleotidensequenties in de database. DAS Dubbele Antilichaam Sandwich DNA Deoxyribonucleïnezuur ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assays ITS Inter Transcribed Spacers ITS4 Universele reverse primer van de ITS-regio voor schimmels: 5 TCCTCCGCTTATTGATATGC 3 ITS5 Universele forward primer van de ITS-regio voor schimmels: 5 GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG 3 m.b.v. met behulp van MSEA-medium Modified Soil Extract Agar NCBI National Center for Biotechnology Information PCR Polymerase Chain Reaction PDA Potato Dextrose Agar POVLT Provinciaal Onderzoeks- en Voorlichtingscentrum voor Land- en Tuinbouw PSKW Proefstation Sint-Katelijne Waver rdna ribosomaal DNA RNA Ribonucleïnezuur Rpm Rounds per minute rrna ribosomaal RNA SSU rrna Small Subunit rrna t.o.v. ten opzichte van VCG Vegetatieve Compatibiliteitsgroepen VD1 Forward primer van V. dahliae: 5 CACATTCAGTTCAGGACGGA 3 4

5 Interactie tussen Verticillium tricorpus en Verticillium longisporum bij bloemkool VD2 Reverse primer van V. dahliae: 5 CCGAAATACTCCAGTAGAAGG 3 VDS2 Reverse primer van V.dahliae: 5 CCTTCTACTGGAGTATTTCGG 3 VL1 Forward primer van V. longisporum: 5 TCTCCTCTCTACGAGAACGA 3 VL2 Reverse primer van V. longisporum: 5 CACTTTCTAAGTATCCTTCCT AT 3 VT1 Forward primer van V. tricorpus: 5 CGCCGGTACATCAGTCTCTT 3 VT2 Reverse primer van V. tricorpus: 5 ACTCCGATGCGAGCGAA 3 5

6 Interactie tussen Verticillium tricorpus en Verticillium longisporum bij bloemkool Verklarende woordenlijst Apocytisch hyfen bevatten septa of dwarswanden Chlorofylsynthese bladgroensynthese Conidioforen sporendragers Conidiën ongeslachtelijke sporen Dicotyle planten tweezaadlobbigen Ecologie studie van de relatie tussen plant, dier en hun milieu Elongatie verlenging Extensie polymerisatiereactie Fialiden gespecialiseerd in de productie van sporen Fotosynthese Proces waarbij chlorofylhoudende planten CO 2 en H 2 O kunnen omzetten in sacchariden waarbij O 2 geproduceerd wordt. Glucosinolaten Organische stoffen die bestaan uit zwavel, stikstof en glucose. De afbraakproducten zijn sulfiden, isothiocyanaten, thiocyanaten en nitrillen. Ze zouden een fungicide werking hebben. Huminezuren Deze zorgen voor een betere beschikbaarheid van voedingsstoffen (zoals fosfor, stikstof, calcium, ijzer en magnesium) en de stimulatie van groeihormonen in de plant. Hyalien doorschijnend Hyfen schimmeldraden, geheel van hyfen vormt mycelium Hypocotyl overgang tussen wortel en stengel Inoculatie Inenting Longitudinaal in de lengte groeiend Multinucleair bevatten meerdere kernen per cel Mycelium geheel van hyfen Mycorrhiza (Arbusculaire). Mutualistische symbiose tussen schimmel en plantenwortel. Deze schimmel penetreert de wortels van de plant. De hyfen groeien tussen de epidermiscellen van de wortel. En vertonen kolonisatie. De mycorrhiza gaan niet binnen in de xyleemvezels maar gaan binnen in de epidermiscellen waar ze een soort boom- 6

7 Interactie tussen Verticillium tricorpus en Verticillium longisporum bij bloemkool structuur vormen. Het is niet de bedoeling dat ze de plantencellen kapot maken. Ze wisselen er enkel nutriënten uit. Necrose Afstervend weefsel Node Vertakking van de conidiofoor Petiolen bladstengels Verticillate fialiden staan als een spiraal rond de conidioforen Waardplant gastheer(plant) Wortelcortex wortelschors, buitenste laag van de wortels Wortelexudaten Uitscheidingen van de wortels die bestaan uit organische stoffen Xyleemvaten (=houtvaten), stuwen water en mineralen vanuit de wortels naar bovenliggende gedeelten van de plant 7

8 Interactie tussen Verticillium tricorpus en Verticillium longisporum bij bloemkool Lijst van tabellen en figuren Lijst met tabellen: Tabel 2.1. Verticillium spp. [3, 4, 5, 24, 25, 30] Tabel 2.2. Morfologie van de microscleroten van Verticillium spp. op MSEA. [7,54].. 24 Tabel 2.3. Amplificatie van de zuivere schimmelculturen met de verschillende primers [7] Tabel 2.4. Werkingsmechanismen antagonisme [64] Tabel 3.1. Isolaten gebruikt in de experimenten, vanuit de collectie van het labo Fytopathologie Tabel 3.2. Nutriëntenoplossing (1M) Tabel 3.3. Behandelingen met grondbevloeiingsmethode Tabel 3.4. Primers voor species-specifieke PCR Tabel 3.5. ITS-primers voor PCR van ITS-regio [47] Tabel 3.6. Overzicht staalname februari 2008 van PSKW Tabel 3.7. Overzicht staalname maart 2008 van POVLT Tabel 4.1. AUDPC van de verschillende behandelingen [73]. Behandelingen met eenzelfde letter zijn niet significant verschillend (p 0,05) Tabel 4.2. Aantal herisolaties van Verticillium uit plantenstalen Cornell (3planten/behandeling) op PDA+sp Tabel 4.3. Aantal herisolaties van Verticillium uit plantenstalen Cornell (3 planten/behandeling) op MSEA Tabel 4.4. Grondstalen gebruikt voor PCR met de aantallen microscleroten afkomstig uit voorgaande tellingen op MSEA Tabel 4.5. Resultaten staalname februari 2008 door PSKW. Telling gebaseerd op het patroon van de kolonie microscleroten op MSEA Tabel 4.6. Resultaten staalname maart 2008 door POVLT. Telling gebaseerd op het patroon van de kolonie microscleroten op MSEA Lijst van figuren: Figuur 2.1. Bloemkool [23]

9 Interactie tussen Verticillium tricorpus en Verticillium longisporum bij bloemkool Figuur 2.2. Conidioforen die vertakken in fialiden met hun conidiën (V. tricorpus) (A) Conidioforen die opwaarts groeien vanuit MSEA-medium. (B) Conidioforen met conidiën in MSEA-medium. (Foto s laboratorium Fytopathologie) Figuur 2.3. Anastomosebrug tussen twee hyfen [2] Figuur 2.4. Microscleroot van V. dahliae [52] Figuur 2.5. Levenscyclus van Verticillium [2] Figuur 2.6. Symptomen van Verticillium verwelking. (A): asymmetrische vergeling van het blad. (B) zwarte vaten in de stengel. [28] Figuur 2.7. Verticillium kolonies op PDA. (A): V. longisporum, (B): V. tricorpus (foto s laboratorium Fytopathologie) Figuur 2.8. Microscleroten op MSEA. (A): Kolonie microscleroten van V. longisporum/v. dahliae. (B): Kolonie microscleroten van V. tricorpus. (Foto s laboratorium Fytopathologie) Figuur 2.9. Polymerase Chain Reaction. (1): Denaturatie, (2): Annealing van de primers, (3) elongatie, (4): Einde eerste cyclus, de volgende cyclus kan starten [9].. 25 Figuur ITS1 en ITS2 regio in rdna [47] Figuur 3.1. Bürker telkamer. De 2 grote vierkanten zijn aangeduid met een zwarte rand [10] Figuur 4.1. In vitro pathogeniciteit in bloemkool 'Clapton' inoculatie met myceliumplugs van V. tricorpus Figuur 4.2. Wortels van bloemkool Cornell geïnfecteerd met V. longisporum die gekleurd werd met 5% inktazijn. ( : soort gum of gel, : xyleemvaten) Figuur 4.3. Licht microscopie (A+C) en corresponderende fluorescentie microscopie (B+D) van de interactie tussen bloemkoolwortels en V. longisporum. (A+B): Groei van V. longisporum in worteltip van het ras Cornell. (C+D): groeipatroon van V. longisporum op het worteloppervlak. De KOH-anilineblauw kleuringstechniek werd gebruikt Figuur 4.4. In vitro bloemkool Clapton (27 dagen oud) geïnfecteerd met V. longisporum, V. tricorpus en een controle. (A): Vers gewicht van de volledige planten (mg). Behandelingen met eenzelfde letter zijn niet significant verschillend. (B): in vitro 9

10 Interactie tussen Verticillium tricorpus en Verticillium longisporum bij bloemkool planten geïnoculeerd met Verticillium (van links naar rechts: Controle, V. longisporum, V. tricorpus) Figuur 4.5. Microscleroten op de wortels van bloemkool Clapton geïnoculeerd met V. longisporum en V. tricorpus in vitro. (A): Worteloppervlak bedekt door microscleroten. De volledige wortel van elke plant wordt overlopen op een vergroting 100x en de microscoopvelden die microscleroten bevatten werden als positief gescoord. Behandelingen met eenzelfde letter zijn niet significant verschillend (p 0,05). (B) en (D): wortel geïnoculeerd met V. longisporum en gekleurd met 5% inktazijn. (C) en (E): wortel geïnoculeerd met V. tricorpus en gekleurd met 5% inktazijn Figuur 4.6. Microscleroot binnenin de wortelcortex van bloemkool Clapton gekleurd met 5% inktazijn Figuur 4.7. In vivo pathogeniciteit+interactie bij bloemkool Cornell in serre Figuur 4.8. Temperaturen in de serre gedurende het in vivo experiment. (Rood: maximum temperatuur, Blauw: minimum temperatuur) Figuur 4.9. Experiment: in vivo pathogeniteit + interactie tussen V. longisporum en V. tricorpus. (A) Overzicht bloemkolen Cornell in de serre. (B) Typische asymmetrische vergeling veroorzaakt door V. longisporum bij bloemkool Cornell Figuur Evolutie van de ziekte-index. Behandelingen met eenzelfde letter zijn niet significant verschillend op een bepaald tijdstip (p 0,05) Figuur In vivo pathogeniciteit + interactie bij bloemkool Cornell : Eindevaluatie vasculaire zwartverkleuring van score 0-3. Behandelingen met eenzelfde letter zijn niet significant verschillend (p 0,05) Figuur In vivo pathogeniciteit + interactie bij bloemkool Cornell : Vers gewicht van het bovengrondse gedeelte van de plant. Behandelingen met eenzelfde letter zijn niet significant verschillend (p 0,05) Figuur Elektroforesegel van PCR-product met de primers van V. longisporum met een annealingstemperatuur van 56,1 C. (L): MassRuler DNA Ladder Mix, (1) DNA van zuivere cultuur van V. longisporum. (2) DNA van zuivere cultuur van V. tricorpus. (3) DNA van zuivere cultuur van V. dahliae. (4) DNA van grondstaal 120- PSKW. (5) DNA van grondstaal 120-PSKW (10x verdund). (6) DNA van grondstaal 10

11 Interactie tussen Verticillium tricorpus en Verticillium longisporum bij bloemkool 120-PSKW (100x verdund). (7) DNA van grondstaal 305-POVLT (10x verdund). (8) DNA van grondstaal 305-POVLT (100x verdund) Figuur Elektroforesegel van PCR-product (PCR op PCR) met V. longisporum primers met een annealingstemperatuur van 56,1 C. (L) MassRuler DNA Ladder Mix. (1) DNA van zuivere cultuur V. longisporum. (2) DNA van zuivere cultuur V. tricorpus. (3) DNA van zuivere cultuur V. dahliae. (4) DNA van grondstaal 120-PSKW (10x verdund). (5) DNA van grondstaal 120-PSKW (100x verdund). (6) DNA van grondstaal 305-POVLT (10x verdund). (7) DNA van grondstaal 11-PSKW (10x verdund). (8) DNA van grondstaal 16-PSKW (10x verdund) Figuur Elektroforesegel van PCR-product met V. tricorpus primers met een annealingstemperatuur van 60 C. (L) MassRuler DNA Ladder Mix. (1) DNA van zuivere cultuur V. longisporum. (2) DNA van zuivere cultuur V. tricorpus. (3) DNA van zuivere cultuur V. dahliae. (4) DNA van grondstaal 120-PSKW. (5) DNA van grondstaal 120-PSKW (10x verdund). (6) DNA van grondstaal 305-POVLT. (7) DNA van grondstaal 305-POVLT (10x verdund). (8) DNA van grondstaal 305-POVLT (100x verdund) Figuur Amplificatie ITS regio met ITS4 en ITS5 (600bp) van 2 verschillende DNA-extracties (fractie 1 en fractie 2) van V. dahliae. Van links naar rechts: MassRuler DNA Ladder Mix, tweede DNA-extractie (11/3) fractie 1 V. dahliae, tweede DNA-extractie (11/3) fractie 2 V. dahliae, eerste DNA-extractie (20/02) fractie 1 V. dahliae, eerste DNA-extractie (20/02) fractie 2 V. dahliae [47]

12 Interactie tussen Verticillium tricorpus en Verticillium longisporum bij bloemkool Inhoudsopgave Woord vooraf... 1 Samenvatting... 2 Lijst met afkortingen en symbolen... 4 Verklarende woordenlijst... 6 Lijst van tabellen en figuren... 8 Inhoudsopgave Inleiding, situatieschets en probleemstelling Literatuurstudie Bloemkoolteelt Algemeen Ziekten en plagen Verticillium... Fout! Bladwijzer niet gedefinieerd Algemeen Levenscyclus Verticillium bij bloemkool Identificatie Bestrijding Chemische bestrijding Fysische bestrijding Onderwerken van ziekte-onderdrukkend materiaal Resistente rassen Biologische bestrijding Materialen en methoden Gebruikte Verticillium isolaten Pathogeniciteit in vitro In vitro pathogeniciteit: met vierkante petriplaten

13 Interactie tussen Verticillium tricorpus en Verticillium longisporum bij bloemkool In vitro pathogeniciteit: met cultuurbuizen Pathogeniciteit in vivo + interactie Materialen Methoden Moleculaire detectie van Verticillium DNA-extractie PCR Sequenering van ITS-regio Bepaling van aantal kiemkrachtige microscleroten in grond Materialen Methoden Statistische verwerking Resultaten en bespreking In vitro pathogeniciteit In vitro pathogeniciteit: met vierkante petriplaten In vitro pathogeniciteit: met cultuurbuizen Pathogeniciteit in vivo + interactie Moleculaire detectie van Verticillium spp Optimalisatie van de PCR-reactie Bepaling van aantal kiemkrachtige microscleroten in grond Conclusie Bibliografie Colofon Voor akkoord verklaring

14 Inleiding, situatieschets en probleemstelling 1 Inleiding, situatieschets en probleemstelling Aan de Universiteit Gent loopt momenteel een onderzoek over Verticillium verwelking bij bloemkool. Deze ziekte wordt in de volksmond ook wel vaatziekte of slaapziekte genoemd en wordt veroorzaakt door de schimmel Verticillium longisporum. Verticillium bij bloemkool werd voor het eerst ontdekt in 1990 in Californië. Eerst werd verondersteld dat de veroorzaker V. dahliae was. Verder onderzoek wees echter uit dat de ziekteverwekker V. longisporum is. V. longisporum veroorzaakt vergeling, verwelking en dwerggroei bij bloemkool. Dit heeft een grote impact op de telers door de dalende kwaliteit en opbrengst. Enkele Verticillium spp. produceren ook microscleroten. Dit zijn overlevingsstructuren die tot 15 jaar in de grond kunnen overleven. Eens de ziekte in het veld is, is deze dus zeer moeilijk weg te krijgen. In België heeft men ook al enkele jaren problemen met Verticillium. In Klein-Brabant wordt de bloemkoolteelt zwaar geteisterd door deze schimmel. In West-Vlaanderen duikt de ziekte slechts sporadisch op. Uit voorgaande veldproeven bleek dat in West- Vlaanderen, naast V. longisporum een ander Verticillium sp. aanwezig was, nl. V. tricorpus. Dit is een zwakke pathogeen die zelden ziekte veroorzaakt. Er werd een negatieve correlatie gevonden tussen het voorkomen van V. tricorpus en het voorkomen van Verticillium verwelking bij bloemkool. Een mogelijke verklaring zou kunnen dat er een interactie optreedt tussen V. longisporum en V. tricorpus en dat V. tricorpus de ziekte veroorzaakt door V. longisporum, onderdrukt. In dit eindwerk is het de bedoeling om de interactie tussen deze twee species verder na te gaan. Hiervoor zal gebruik gemaakt worden van een in vivo test. Een in vitro pathogeniciteitstest zou wat duidelijkheid moeten geven over hoe de schimmel de plant infecteert en welke symptomen zichtbaar zijn over de ganse plant. Ook wordt geprobeerd een species-specifieke PCR te optimaliseren. Als laatste worden enkele grondstalen vanuit Klein-Brabant (PSKW= Proefstation Sint-Katelijne Waver) en West-Vlaanderen (POVLT= Provinciaal Onderzoeks- en Voorlichtingscentrum voor Land- en Tuinbouw) uitgeplaat op MSEA (Modified Soil Extract Agar) om na te gaan 14

15 Inleiding, situatieschets en probleemstelling welk species van Verticillium aanwezig is. Voorgaande veldexperimenten gebeurden ook in samenwerking met deze proefcentra. 15

16 Literatuurstudie 2 Literatuurstudie 2.1 Bloemkoolteelt Algemeen Rijk: Plantae Phylum: Embryophyta Klasse: Spermatopsida Orde: Brassicales Familie: Brassicaceae Genus: Brassica Species: oleracea Variëteit: botrytis Brassica oleracea var. botrytis of bloemkool werd al geproduceerd in de 6 de eeuw voor Christus in Turkije en Egypte. Gedurende lange tijd was bloemkool een exclusief product. Intussen wordt bloemkool over de ganse wereld geteeld. In België is bloemkool één van de meest geteelde gewassen [20]. Deze plant groeit het best rond een temperatuur van 15,6 C en wordt het gehele jaar rond geteeld. Het gewas bestaat uit groene grote bladeren die opwaarts groeien en binnenin zit een witte kool (Zie figuur 2.1). De kool kan paars kleuren door blootstelling aan zonlicht daarom dient ze afgedekt te worden [21,22]. Figuur 2.1. Bloemkool [23] 16

17 Literatuurstudie Ziekten en plagen Bloemkool kan last hebben van heel wat ziekten (bv. knolvoet, ringvlekkenziekte) en plagen (bv. koolvlieg, koolrups) die kunnen zorgen voor een sterk dalende kwaliteit. Het is dan ook een gewas dat nauwlettend gevolgd en verzorgd moet worden. De ziekte die in dit eindwerk het belangrijkst is, is de Verticillium verwelking [51]. 2.2 Verticillium Algemeen Rijk: Fungi Phylum: Ascomycota Genus: Verticillium Verticillium behoort tot de Mitosporische Fungi. Van deze groep schimmels is de sexuele cyclus niet gekend. Het mycelium van de schimmel is hyalien, apocytisch en multinucleair met haploïde kernen. De conidiën of de ongeslachtelijke sporen worden geproduceerd aan fialiden die in een spiraalachtige vorm gericht staan ten opzichte van de conidioforen (sporendragers). De sporen zijn ovaal of ellipsvormig en zijn meestal eencellig. De naam Verticillium komt van de verticillate stand van de fialiden ten opzichte van de conidioforen [1,2]. (Zie figuur 2.2) Figuur 2.2. Conidioforen die vertakken in fialiden met hun conidiën (V. tricorpus) (A) Conidioforen die opwaarts groeien vanuit MSEA-medium. (B) Conidioforen met conidiën in MSEAmedium. (Foto s laboratorium Fytopathologie) 17

18 Literatuurstudie Binnen de Verticillium species ziet men een variatie in morfologie en pathogeniciteit. Omwille van de afwezigheid van een seksuele cyclus is anastomose de enige manier om genetische variatie te brengen. Anastomose treedt op bij twee naburige hyfen waartussen een anastomosebrug gevormd wordt (zie figuur 2.3). Daarin worden cellulaire componenten uitgewisseld en bekomt men kleine variaties in het genoom binnen eenzelfde Verticillium species. De verschillende groepen binnen eenzelfde species worden VCG (Vegetatieve compatibiliteitsgroepen) genoemd. Binnen éénzelfde VCG kan anastomose optreden. Ze kunnen gelijkenissen vertonen in hun morfologie, pathogeniciteit, fysiologie, ecologie en hun voorkeur van waardplanten [2,44]. Figuur 2.3. Anastomosebrug tussen twee hyfen [2] Verticillium bevindt zich in de grond. Het is een plantpathogene schimmel welke ziekte kan veroorzaken aan een 200-tal dicotyle planten. Tuinbouwgewassen, fruitbomen en loofbomen zijn mogelijke waardplanten. De pathogeen veroorzaakt verwelking door invasie van het vasculaire systeem van de plant [1]. De eerste drie Verticillium species in tabel 2.1 zijn zeer gekende pathogenen. De overige veroorzaken niet altijd ziekte en worden daarom zwakke pathogenen genoemd [6]. 18

19 Literatuurstudie Tabel 2.1. Verticillium spp. [3, 4, 5, 24, 25, 30] Naam Voornaamste waardplanten Overlevingsstructuren V. longisporum bloemkool, spruit, Chinese kool, koolzaad Microscleroten V. dahliae aardappel, tomaat, aubergine, tabak, Microscleroten munt, sla, katoen V. albo-atrum aardappel, tomaat donker overwinteringsmycelium V. tricorpus tomaat, tabak, chinese kool, sojascheuten, aardappel, sla, katoen microscleroten, donker overwinteringsmycelium, chlamydosporen V. nubilum aardappel chlamydosporen V.nigrescens aardappel, munt chlamydosporen In dit werk zal vooral gesproken worden over V. longisporum, V. tricorpus en V. dahliae. Deze drie Verticillium species produceren overlevingsstructuren, microscleroten genaamd (Zie figuur 2.4). Microscleroten zijn erg resistent en kunnen ongeveer 15 jaar in de grond overleven [1]. Ze ontstaan uit dicht opeengepakte myceliumdraden. Deze melaniseren wat de oorzaak is van de resistentie van de microscleroten [27]. Melanine is een component dat de stevigheid van de celwand verhoogt. Het is een donkere pigment dat voorkomt bij dieren, planten en micro-organismen [32]. Melanine beschermt de microscleroot tegen UV- en X-stralen, extreme temperaturen, andere micro-organismen en fungiciden. Ook bindt melanine met water en ionen zodat de microscleroten niet uitdrogen [33, 34]. Figuur 2.4. Microscleroot van V. dahliae [52] 19

20 Literatuurstudie V. tricorpus maakt ook nog andere overlevingsstructuren aan zoals donker overwinteringsmycelium en chlamydosporen. Chlamydosporen zijn een soort van rustsporen. Het zijn eencellige asexuele sporen met een dikke celwand. Chlamydosporen kunnen geproduceerd worden aan het einde van de hyfe of in het midden. De hyfe wordt gesepteerd. Ze zwelt op en vormt knoppen. Deze cellen worden zwartkleurig en verdikken om ovale structuren te vormen die de chlamydosporen genoemd worden. De rest van de hyfen die geen chlamydosporen vormen wordt het typische donker overwinteringsmycelium genoemd [25,40] Levenscyclus De levenscyclus van Verticillium kan ingedeeld worden in een slapende, parasitaire en saprofytische fase (zie figuur 2.5). Figuur 2.5. Levenscyclus van Verticillium [2] 20

21 Literatuurstudie Verticillium groeit optimaal in gronden met een temperatuur van 22,5 C [25]. Microscleroten, die zich in de grond bevinden (slapende fase), worden aangezet tot kieming door wortelexudaten van de groeiende plant [1]. Hierbij gaat de parasitaire fase van start. De schimmel penetreert de wortel van de dichtsbijzijnde gastheerplant in de regio van elongatie. De cortex van de wortel wordt gekoloniseerd waarbij de hyfen de xyleemvaten binnendringen. In de xyleemvaten worden conidiën gevormd. Op deze manier worden sporen meegevoerd met het opstijgend water en koloniseert de schimmel grote delen van de plant. De vaten worden geblokkeerd door de vorming van gums en gels. Deze gums en gels worden gevormd door de accumulatie van oxidatieproducten van plantencellen die afgebroken werden door enzymen van de schimmel. Op deze manier wordt de watertoevoer van bepaalde delen van de plant afgesloten en sterven de bladeren af. Blokkering van de vaten is niet de enige reden van necrose van de bladeren. Ook toxines geproduceerd door de schimmel spelen mee in de symptomologie. De geproduceerde toxines worden meegevoerd met de waterstroom naar de bladeren. Dit zorgt voor een reducering van de chlorofylsynthese en fotosynthese van de plant. Daarbij verlaagt de permeabiliteit van de bladcelmembranen en wordt de waterregulatie verstoord [1]. Vergeling en verwelking van de bladeren zijn de eerste symptomen. De symptomen zijn soms maar te zien in bepaalde delen van de plant, zo kan bv. de helft van een blad ziek zijn en de andere helft nog kerngezond zijn. Daarom wordt ook wel gesproken van asymmetrische vergeling. Dit is een typisch patroon bij vasculaire aandoeningen omdat maar een aantal vaten aangetast worden. Wanneer een doorsnede gemaakt wordt van de stengel ziet men een zwarte verkleuring van de vaten. Deze verkleuring is te wijten aan de aanwezigheid van mycelium, sporen en polysacchariden geproduceerd door de schimmel. Ook jonge kwetsbare wortels verwelken. Het aangetaste weefsel zal uiteindelijk afsterven. Bij afsterving gaat de saprofytische fase van start, de schimmel produceert overlevingsstructuren (zoals microscleroten) die voor een lange tijd in de grond kunnen blijven zitten [1,2]. 21

22 Literatuurstudie Verticillium bij bloemkool Symptomen Bij kolonisatie van Verticillium bij bloemkool ziet men vergeling, verwelking, dwerggroei en necrose van de plant [45]. De verwelking en asymmetrische vergeling (Zie figuur 2.6A) is eerst te zien bij de oudste bladeren en breidt daarna uit naar bovenliggende gedeelten van de plant. Meestal zijn de symptomen maar zichtbaar wanneer de kool wordt gevormd. In de meeste gevallen kan de bloemkool nog geoogst worden, maar hierbij ziet de teler de zwartverkleurde vaatbundels en is de kool kleiner (Zie Figuur 2.6B). Ook is het onmogelijk om de kool wit te houden door de zieke bladeren. Na de oogst zullen de achtergebleven oogstresten afsterven en zullen de microscleroten gevormd worden. Door het land te bewerken worden de microscleroten verspreid over het veld [15,35]. Figuur 2.6. Symptomen van Verticillium verwelking. (A): asymmetrische vergeling van het blad. (B) zwarte vaten in de stengel. [28] Verticillium longisporum De verwelkingsziekte bij bloemkool is voor het eerst ontdekt in 1990 in Californië. Men ging er toen van uit dat de veroorzaker V. dahliae was alhoewel deze nog nooit eerder geïdentificeerd werd op bloemkool [35]. Verder onderzoek heeft uitgewezen dat de ziekte niet veroorzaakt werd door V. dahliae maar wel door V. longisporum [46,15]. V. longisporum is pathogeen voor een groot deel van de Brassicaceae of de kruisbloemigen (bloemkool, koolzaad, Chinese kool) [28]. 22

23 Literatuurstudie Verticillium in België In België wordt de bloemkoolteelt ook al enkele jaren geteisterd door Verticillium. Land- en tuinbouwers in Klein-Brabant hebben er op dit moment veel last van. In West-Vlaanderen duikt de vaatziekte ook al op. De dalende opbrengst en kwaliteit van het product heeft dus een grote impact voor de telers [71] Identificatie In het onderzoek op Verticillium is het belangrijk een onderscheid te kunnen maken tussen de verschillende species. In dit werk is het belangrijk een onderscheid te kunnen maken tussen V. longisporum, V. tricorpus en V. dahliae. Verticillium kan geïdentificeerd worden op verschillende methoden. Zo wordt gebruik gemaakt van microscopie waarbij de morfologische kenmerken van de schimmel bestudeerd worden. Ook via PCR (Polymerase Chain Reaction) kunnen verschillende species geïdentificeerd worden Morfologie Potato Dextrose Agar (PDA) De kolonies op PDA van V. longisporum, V. tricorpus en V. dahliae hebben een zwarte kleur die te wijten is aan de productie van microscleroten. De kolonie van V. longisporum en V. dahliae wordt omringd door een laag wit mycelium. De kolonie van V. tricorpus wordt omringd door een dunne film jong mycelium die geelgekleurd is (Zie figuur 2.7) [24,25]. Figuur 2.7. Verticillium kolonies op PDA. (A): V. longisporum, (B): V. tricorpus (foto s laboratorium Fytopathologie) 23

24 Literatuurstudie Microscopie Microscopische identificatie is mogelijk aan de hand van morfologische karakteristieken die verschillend zijn voor elk species. V. longisporum heeft langwerpige conidiën ( 7µm) en heeft meestal 3 of 4 fialiden per node. De lengte van de conidiën bij V. tricorpus varieert tussen 3,5 en 10,0µm [4]. V. dahliae heeft conidiën die kleiner of gelijk aan 5,5µm zijn. Hier hangen 4-5 fialiden per node [5] Microscleroten op MSEA Op basis van morfologie van de microscleroten op MSEA (Modified soil extract agar) kan uitgemaakt worden met welk species men te maken heeft (zie tabel 2.2). Bij V. longisporum en V. dahliae worden de microscleroten radiaal gevormd. De microscleroten van V. tricorpus zijn groter. Ze worden niet volgens een bepaald patroon gevormd en komen verspreid voor (Zie figuur 2.8) [7,54]. Tabel 2.2. Morfologie van de microscleroten van Verticillium spp. op MSEA. [7,54] V. longisporum V. tricorpus V. dahliae Vorm Onregelmatig, soms Onregelmatig, donkere Bolvormig met slijme- met donkere hyfen hyfen rige randen Grootte <1275µm² >1275µm² <1275µm² Patroon Radiaal Verspreid Radiaal A B Figuur 2.8. Microscleroten op MSEA. (A): Kolonie microscleroten van V. longisporum/v. dahliae. (B): Kolonie microscleroten van V. tricorpus. (Foto s laboratorium Fytopathologie) 24

25 Literatuurstudie PCR via species-specifieke primers Met behulp van PCR wordt een specifieke regio (doelsequentie) in het DNA geamplificeerd zodat er miljoenen identieke DNA-strengen verkregen worden. Primers zijn enkelstrengige DNA-sequenties die complementair zijn aan de uiteinden van de doelsequentie. Een PCR-reactie bestaat uit drie stappen (Zie figuur 2.9). Bij de denaturatie worden complementaire strengen gedenatureerd zodat er twee enkelstrengen bekomen worden. De tweede stap is de annealingstap waarbij de primers binden aan de doelsequentie. Daarop volgt de derde stap waar de elongatie gebeurt. De sequentie, begrensd door de primers, wordt geamplificeerd door het DNA-polymerase. Daarop volgt opnieuw een denaturatie en wordt de cyclus een aantal keren herhaald [72]. Figuur 2.9. Polymerase Chain Reaction. (1): Denaturatie, (2): Annealing van de primers, (3) elongatie, (4): Einde eerste cyclus, de volgende cyclus kan starten [9]. 25

26 Literatuurstudie De PCR wordt gevolgd door een gelektroforese. Kleine DNA-sequenties gaan verder migreren dan grote stukken [72]. Aan de hand van specifieke primers is het mogelijk om bepaalde Verticillium species van elkaar te onderscheiden. In Zweden gebruikten onderzoekers 3 primer-paren voor de identificatie van V. longisporum, V. tricorpus en V. dahliae. De volgende primers werden gebruikt [7]: - nucleaire SSU rrna primers: 18SVDF: 5 GCGAAACTGCGAATGGCT 3 18SVDR: 5 GTAATGATCCCTCCGCTG 3 Bij deze primers bekomt men voor V. longisporum een fragment van 2,5kb, voor V. dahliae en V. tricorpus wordt een fragment van 1,65kb bekomen. - V. longisporum specifieke primers VL1: 5 TCTCCTCTCTACGAGAACGA 3 VL2: 5 CACTTTCTAAGTATCCTTCCTAT 3 De primers amplificeren een fragment van 340bp bij V. longisporum [38]. - V. tricorpus specifieke primers (op basis van ITS-regio s): VT1: 5 CGCCGGTACATCAGTCTCTT 3 VT2: 5 ACTCCGATGCGAGCGAA 3 Het bekomen DNA-fragment geamplificeerd door het primerpaar heeft een grootte van 337bp [18]. Hierbij isoleerden ze de schimmel eerst uit de grond, na opzuivering werd een zuivere schimmelcultuur bekomen. Na DNA-extractie kon de PCR-reactie gebeuren voor de identificatie van de 3 species. Omdat de schimmels eerst uit de grond moeten worden geïsoleerd, is deze techniek zeer tijdrovend. Rechtstreekse detectie en identificatie in grondstalen is echter niet mogelijk met deze primers want bij aanwezigheid van zowel V. dahliae en V. tricorpus kan men de aanwezigheid van V. dahliae niet aantonen. In tabel 2.3 wordt dit verduidelijkt [7]. 26

27 Literatuurstudie Tabel 2.3. Amplificatie van de zuivere schimmelculturen met de verschillende primers [7]. 18SVDF en 18SVDR VT1 en VT2 VL1 en VL2 V. dahliae 1,65kb / / V. tricorpus 1,65kb 337bp / V. longisporum 2,5kb / 340bp De gebruikte species-specifieke primers voor V. longisporum en V. tricorpus werden door vele andere onderzoekers ook gebruikt [6,4,19]. Li et al. (1999) verkozen voor de detectie van V. dahliae als forward primer VD1 5 CACATTCAGTTCAGGACGGA 3 en als reverse primer VDS2 5 CCTTCTACTGGAGTATTTCGG 3. De PCR primers amplificeerden een fragment van 521bp. De specificiteit werd getest en dit toonde aan dat de primers specifiek amplificeerden met V. dahliae [17]. De Zhou et al. (2006) gebruikten voor hun detectie van V. dahliae in koolzaad dezelfde forward primer maar een verschillende reverse primer nl. VD2 CCGAAATACTCCAGTAGAAGG 3. Een bandje van 400bp wordt bekomen. De specificiteit van dit primerpaar is echter niet bewezen [19]. Een tweede mogelijkheid om Verticillium spp. van elkaar te onderscheiden is op basis van sequenering van de Inter Transcribed Spacers (ITS). Onder de ITS regio verstaat men ITS1, ITS2 en 5,8S rrna. ITS1 en ITS2 zijn twee variabele niet coderende regio s die zich bevinden tussen de hoog geconserveerde 5,8S subunit en de twee grote geconserveerde subunits 18S en 28S rrna genen in het rdna (Zie figuur 2.10). Deze regio wordt vaak aangewend bij de identificatie van schimmels. De ITS1 en ITS2 zijn binnen eenzelfde species wel geconserveerd, maar tussen verschillende species variëren deze sterk. Op deze manier zou het mogelijk zijn om species van elkaar te onderscheiden [48]. 27

28 Literatuurstudie Figuur ITS1 en ITS2 regio in rdna [47]. Deze regio werd al door verschillende onderzoekers aangewend bij de identificatie van Verticillium spp. [18,28,7]. Debode (2005) kon met behulp van de primers van ITS5 (5 GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG 3 ) en ITS4 (5 TCCTCCGCTTATTGATATGC 3 ) V. longisporum identificeren uit bloemkool [28,47] Andere technieken De microscleroten van elk species kunnen opgespoord worden via Enzyme-linked immunosorbent assays of de ELISA-techniek. Het is een minder gebruikte methode. Heppner en Heitefuss (1997) ontwikkelden een dubbele antilichaam sandwich (DAS) ELISA. Er wordt een specifiek monoklonaal antilichaam gebruikt, samen met een polyklonaal antistof, die reageert met oplosbare eiwitten van microscleroten. De methode via bioassays is een andere techniek die sporadisch gehanteerd wordt. Het zijn gestandaardiseerde laboratoriumexperimenten waarin plantenweefsel wordt blootgesteld aan wel of niet besmette grondstalen. Het effect kan achteraf bestudeerd worden [16, 53]. 2.3 Bestrijding In België zijn er geen bestrijdingsmiddelen erkend voor de bestrijding van Verticillium bij bloemkool. Wereldwijd wordt er onderzoek gedaan naar geschikte bestrijdingsmiddelen. Er zijn wel chemische en fysische controles maar deze mogen of kunnen niet gebruikt worden in België. Dit onderzoek richt zich vooral op het vinden van biologi- 28

29 Literatuurstudie sche bestrijders van Verticillium. Ook bestaan er reeds rassen die meer resistent zijn maar die worden omwille van andere negatieve effecten minder geteeld [54,28] Chemische bestrijding Methylbromide (CH 3 Br), de wellicht bekendste chemische bestrijder, is een zeer goed breedspectrum biocide. Het probleem bij dit fungicide is het gevaar dat giftige broomresidu s accumuleren in het plantenweefsel. Deze broomresidu s zijn niet alleen zeer slecht voor het milieu maar ook voor de mens. Daarenboven heeft methylbromide een negatief effect op de ozonlaag. Daarom werd methylbromide vanaf 2006 volledig verboden in België [55]. Monam dat als werkzame stof metam-natrium bevat kan ook toegepast worden om Verticillium spp. in de bodem af te doden. Dit product is echter te duur om een volledig veld mee te behandelen [56]. Daarom wordt op dit moment volop naar alternatieven gezocht om Verticillium en zijn overlevingsstructuren af te doden Fysische bestrijding In warme klimaten is solarisatie een mogelijkheid om Verticillium te bestrijden. Hierbij wordt de grond bedekt met polyethyleenplastiek. De zon, schijnend op de plastiek, zorgt voor verwarming van de bodem. De bodem wordt zodanig verwarmd dat de Verticillium spp. niet overleven. In België is het klimaat niet gunstig genoeg om deze techniek toe te passen [13] Onderwerken van ziekte-onderdrukkend materiaal Organische afvalstoffen van andere gewassen kunnen bijdragen tot de reductie van Verticillium spp. in de bodem. In Californië is het probleem met Verticillium verwelking bijna helemaal van de baan. Tenminste als de bloemkoolteelt afgewisseld wordt met broccoli. Broccoli hoort bij de familie van de Brassicaceae maar is niet vatbaar voor Verticillium spp. De afbraakproducten van de glucosinolaten in broccoli bevatten veel zwavelhoudende stoffen. Uit onderzoek is gebleken dat deze stoffen een mogelijke 29

30 Literatuurstudie oorzaak zijn van de dalende concentratie Verticillium spp. Dit in combinatie met solarisatie is een zeer effectief bestrijdingsmiddel [14]. Ook bevat broccoli lignine. Er werd verband aangetoond met de lignine-inhoud van de ondergewerkte gewassen en het afdoden van microscleroten. Lignine is een stof die voorkomt in alle planten. Sommige planten bevatten echter wel grotere hoeveelheden lignine dan andere (bv. hout). Het is een soort bindmiddel dat zorgt dat plantenvezels samengehouden worden [26]. Er wordt gesuggereerd dat lignine zorgt voor een groeistimulatie van lignine-afbrekende micro-organismen. Lignine en melanine zijn gelijksoortige componenten. Ligninases, de enzymen geproduceerd door deze lignineafbrekende micro-organismen kunnen ook melanine afbreken. Door de melanineafbraak worden microscleroten niet meer beschermd tegen extreme temperaturen, fungiciden, microbiële antagonisten enz. Ook zagen Debode et al. (2005) dat zuivere lignine een afdodend effect had op microscleroten. In onze streken werkt het principe om de bloemkoolteelt af te wisselen met broccoli niet [28]. Debode et al. (2005) vonden ook dat raaigras, een gewas die ook veel lignine bevat, een reductie weergaf van het aantal microscleroten in de grond [15]. Aan het labo Fytopathologie in de Universiteit Gent wordt momenteel onderzoek gedaan om het werkingsmechanisme verder uit te klaren Resistente rassen Men kan ook gebruik maken van rassen die resistentie vertonen ten opzichte van V. longisporum (bv. Sernio). Hierbij blijkt echter dat de producenten en consumenten deze resistente rassen vaak afwijzen door andere negatieve effecten (zoals slechte groei en kwaliteit). De rassen die een grotere gevoeligheid voor Verticillium vertonen worden wel veel gebruikt door telers. Ze bieden namelijk een betere groei en kwaliteit [28]. 30

31 Literatuurstudie Biologische bestrijding Antagonisten Een belangrijk punt in de biologische bestrijding is de antagonistische werking van bepaalde micro-organismen ten opzichte van de Verticillium spp. Pseudomonas heeft een sterke antagonistische werking t.o.v. V. longisporum [60]. Berg en Ballin (1994) en Berg et al.(1994) publiceerden dat enkele species van Bacillus, Pseudomonas en Serratia sterke antagonisten zijn van V. dahliae [61,62,12]. Debode et al. (2005) rapporteerden dat Pseudomonas spp. en Serratia plymuthica het aantal microscleroten in de grond kon reduceren. Hierbij waren de Pseudomonas spp. de sterkste antagonisten [28]. De belangrijkste fungale antagonisten zijn Talaromyces spp., Trichoderma spp. en Gliocladium spp.[12] Ook onder de arbusculaire Mycorrhiza zijn er enkele isolaten die een antagonistische werking vertonen ten opzichte van Verticillium. Deze Mycorrhiza groeien niet in de Brassica maar wel in andere gewassen (aardappelen, tomaten,...). Ze kunnen dus niet gebruikt worden als bestrijding in bloemkool. In andere gewassen kunnen de arbusculaire Mycorrhiza wel gebruikt worden. Het mechanisme is echter niet gekend [63]. De werking van de meeste antagonisten is meestal te wijten aan één of een combinatie van verschillende factoren: antibiose, competitie, geïnduceerde resistentie en/of parasitisme (Zie tabel 2.4) [64]. 31

32 Literatuurstudie Tabel 2.4. Werkingsmechanismen antagonisme [64]. Werkingsmechanisme Werking Antibiose Micro-organismen die metabolieten produceren die een antibiotische werking hebben. Competitie Strijd tussen verschillende micro-organismen voor nutriënten (Fe, C, N) Geïnduceerde resistentie Afweermechanisme van de plant wordt geïnduceerd. Parasitisme Biologische antagonist leeft ten koste van de pathogeen Interacties tussen Verticillium species Declercq (2005) stelde vast dat in de gronden in West-Vlaanderen, waar nochtans heel gevoelige bloemkoolrassen geteeld werden, geen Verticillium verwelking aanwezig was. Op deze percelen werd al 10 jaar bloemkool gekweekt. In de percelen van Klein-Brabant werden wel duidelijke Verticillium symptomen waargenomen. Uit onderzoek bleek dat in de gronden van West-Vlaanderen microscleroten van V. tricorpus aanwezig waren [65]. V. tricorpus is een zwakke pathogeen die sporadisch ziekte kan veroorzaken [25]. In recent onderzoek aan het labo Fytopathologie werd aangetoond dat in West-Vlaanderen een negatieve correlatie te zien was tussen het aantal microscleroten en het voorkomen van ziekte. Ook een groot deel van deze microscleroten bleken afkomstig te zijn van V. tricorpus. In Klein-Brabant vond men deze microscleroten niet terug wat terug gepaard ging met meer ziekte [66]. Zo werd de hypothese gesteld dat V. tricorpus in de bodem van West-Vlaanderen de Verticillium verwelking veroorzaakt door V. longisporum, verhindert [65]. Onderzoek in andere landen heeft ook al aangetoond dat V. tricorpus in competitie treedt met andere pathogene Verticillium species [67]. In Idaho werd al enkele jaren een negatieve correlatie vastgesteld tussen de aanwezigheid van V. tricorpus en de ziekte die V. dahliae bij aardappel veroorzaakt. Er wordt hier dan ook gesproken van suppressive soils. Een isolaat van V. tricorpus in deze 32

33 Literatuurstudie suppresive soils zou de ziektesymptomen van V. dahliae onderdrukken [68]. Suppresive soils zijn bodems die een bepaalde ziekte onderdrukken. Dit kan door de aanwezige micro-organismen die een antagonistische werking hebben op een bepaalde ziekte [8]. In Californië werd aangetoond dat de inoculatie van V. tricorpus samen met V. dahliae een daling van de Verticillium symptomen geeft bij sla in vergelijking tot inoculatie met V. dahliae alleen. Betere resultaten werden verkregen wanneer V. tricorpus een week voor de inoculatie van V. dahliae geïnoculeerd werd. V. tricorpus zou eerst tijd nodig hebben om de plant te infecteren en te koloniseren voordat de plant beschermd wordt tegen V. dahliae [6]. V. tricorpus geeft niet alleen dalende ziekteverschijnselen in combinatie met V. dahliae maar geeft ook een reductie van ziekte in combinatie met V. albo-atrum in aardappel [31]. V. tricorpus is ook al bekend als biologische bestrijder van andere plantpathogene schimmels. Zo publiceerden Paplomatas et al. (2000) dat V. tricorpus interactie vertoonde met Rhizoctonia solani in katoen. Het mycelium van V. tricorpus werd gemengd met de grond die ook R. solani bevatte. Er werd een duidelijk verschil waargenomen t.o.v. de positieve controles. Intussen is er ook al een manier gevonden om V. tricorpus aan de katoenzaden te coaten [70]. Het voorkomen van V. tricorpus zou waarschijnlijk te maken hebben met de voorteelt. In katoenvelden werden veel hogere concentraties V. tricorpus waargenomen in delen van het veld waar de teelt afgewisseld werd met tomaten t.o.v. de delen waar katoen in monocultuur gekweekt werd [69]. Aardappelrassen die resistent zijn t.o.v. Verticillium gaven een stijging van het aantal microscleroten in grond, wat niet te zien was in de gevoelige aardappelrassen [29]. 33

34 Materialen en methoden 3 Materialen en methoden 3.1 Gebruikte Verticillium isolaten De isolaten komen vanuit de collectie van het labo Fytopathologie (Zie tabel 3.1). Gedurende alle experimenten werden deze isolaten gebruikt: Tabel 3.1. Isolaten gebruikt in de experimenten, vanuit de collectie van het labo Fytopathologie Isolaat Oorsprong V. longisporum O1 Bloemkool in Klein-Brabant V. dahliae IS5 Grondstaal uit bloemkoolveld in Klein-Brabant V. tricorpus 305 type C Grondstaal West-Vlaanderen 3.2 Pathogeniciteit in vitro In vitro pathogeniciteit: met vierkante petriplaten Materialen PDA (Difco Potato Dextrose Agar, LOT: ) Gamborg B5 Medium o Basal Salt mixture (Dushefa Biochemie, LOT: P , 3051,98mg/L) o Vitamin mixture (Dushefa Biochemie, LOT: P , 112.0mg/L) o Plant agar (Dushefa Biochemie, LOT: , 10mg/L) Bloemkoolzaden o Cornell, Hybride bloemkool met filmcoat (Royal Sluis) o Clapton F1 Hybride, EC System (Sygenta Seeds B.V.) Vierkante petriplaten (12x12cm) 70% ethanol 1% Na-hypochloriet (Haz-tabs) Steriel water STERI 350 (Swiss model) 34

35 Materialen en methoden Groeikamer (Snijders Scientific, T = 18,5 C) 5% inktazijn [58] 0,05% anilineblauw (45mL) [59] o 0,05% anilineblauw in 0,067M K 2 HPO 4 (Acros Organics, LOT: A ) 0,05% AB= 0,0225g 0,067M K 2 HPO 4 : m = c.v.m = 0,067M.0,045L.174,18 g/mol = 0,5251g Licht- en fluorescentiemicroscoop (Olympus BX51) Methoden Overzetten van zuivere V. longisporum en V. tricorpus op PDA. De zuivere schimmels vanuit de stockculturen worden overgezet op PDA. De PDA platen worden gegoten, gedroogd en vervolgens geënt. Om contaminatie te voorkomen worden ze afgesloten met parafilm. Ze worden geïncubeerd op kamertemperatuur in het donker. Sterilisatie van de zaden De zaden worden in een steriele falcon tube gebracht. Ze worden in 70% alcohol gebracht gedurende één minuut onder voortdurend schudden. Daarna worden ze 15 minuten in 1% javel gebracht waarbij ook geschud wordt. Vervolgens worden ze 4-5 maal gewassen met steriel water en gebracht op een steriel filtreerpapier in een petriplaat zodat ze kunnen drogen (enkele minuten). Steriele zaden zetten op Gamborg B5 Medium De steriele zaden van de gewassen worden op het Gamborg B5 Medium met behulp van steriele pincetten die gesteriliseerd werden met STERI 350. Opdat de zaadjes niet zouden wegrollen dienen ze een klein beetje in het medium geduwd te worden. 35

36 Materialen en methoden Per gewas worden 6 platen gebruikt waarop elke petriplaat 6 zaden bevat. Voor elke behandeling zijn er 2 platen voorzien (V. longisporum, V. tricorpus en Controle). De petriplaten worden beschermd tegen contaminatie en uitdroging door ze af te schermen met parafilm. Na uitplanten van de zaden worden ze in het donker bewaard gedurende 2 dagen in de groeikamer op 18,5 C. Na 2 dagen starten de zaden met het kiemproces en wordt de onderkant van de petriplaat in het donker gebracht met behulp van hoesjes gemaakt uit krantenpapier. De petriplaten worden in een hoek van 60 gezet zodat de wortels naar beneden groeien [43]. Inoculatie met V. longisporum en V. tricorpus Wanneer de wortels van de plantjes een degelijke grootte bereikt hebben (8-12dagen) kan de inoculatie van de schimmels van start gaan. We nemen plugs met een kurkboor van de zuivere schimmelkolonies vanuit PDA. De plugs worden zeer dicht bij de wortel en op een gelijke afstand van de hypocotyl geplaatst. Als de schimmel groeit, raakt hij in contact met de wortel en kan hij overgaan tot de infectie [43]. De plantjes worden zorgvuldig opgevolgd. Beginnende contaminaties kunnen op een steriele manier weggesneden worden. Na ongeveer 2-3 weken worden de planten geëvalueerd en voorbereid tot het microscopisch onderzoek. Microscopisch onderzoek De plantjes worden voorzichtig uit het medium gehaald. Het medium wordt zoveel mogelijk verwijderd en de bladeren worden afgesneden zodat enkel de wortel en stengel overgehouden wordt. Deze worden gedurende één week in 50% ethanol gebracht. Daarna worden ze nog één week in 10% KOH gebracht om de wortels transparant en zacht te maken. Na het zorgvuldig spoelen van de plantjes kunnen ze gekleurd worden. De ene helft wordt behandeld met inktazijn, de andere met anilineblauw [59]: 36

37 Materialen en methoden 5% inktazijn: De plantjes worden in 5% inktazijn gebracht en gedurende 3 minuten in kokend water gebracht. De plantjes worden opnieuw gewassen met water. Vervolgens wordt de plant in stukken gesneden en op een draagglas gebracht. Het water wordt afgegoten en er worden enkele druppels 50% glycerol aangebracht. Luchtbellen worden zo veel mogelijk vermeden bij het opbrengen van het dekglas. De preparaten worden lichtmicroscopisch bekeken [58]. 0,05% Anilineblauw: De anilineblauw-oplossing wordt minstens 2 uur vooraf aangemaakt. De planten worden in stukken gesneden en op een draagglas gebracht. Het water wordt afgegoten en er worden enkele druppels anilineblauw opgebracht. Nadien wordt het dekglas aangebracht. Hier is het de bedoeling dat deze preparaten direct onder de microscoop bekeken worden wegens gevaar voor uitdroging. De preparaten worden lichtmicroscopisch bekeken en vergeleken met fluorescentie [59] In vitro pathogeniciteit: met cultuurbuizen Materialen PDA (Difco Potato Dextrose Agar, LOT: ) Grote cultuurbuizen Gamborg B5 Medium (±20mL/cultuurbuis) o Basal Salt mixture (Dushefa Biochemie, LOT: P , 3051,98mg/L) o Vitamin mixture (Dushefa Biochemie, LOT: P , 112.0mg/L) o Plant agar (Dushefa Biochemie, LOT: , 10mg/L) Bloemkoolzaden o Clapton F1 Hybride, EC System (Sygenta Seeds B.V.) 70% ethanol 1% Na-hypochloriet (Haz-tabs) Steriel water STERI 350 (Swiss model) 5% inktazijn [58] 0,05% anilineblauw (45mL) [59] 37

38 Materialen en methoden o 0,05% anilineblauw in 0,067M K 2 HPO 4 (Acros Organics, LOT: A ) 0,05% AB= 0,0225g 0,067M K 2 HPO 4 : m = c.v.m = 0,067M.0,045L g/mol = 0,5251g Rek met TL-lampen Bürker-telkamer Microscoop (Leitz) Licht- en fluorescentiemicroscoop (Olympus BX51) Methoden Overzetten van zuivere V. longisporum en V. tricorpus op PDA. Zelfde methode als Sterilisatie van de zaden Zelfde methode als Zaden op Gamborg B5 Medium zetten De steriele zaden van de gewassen worden op het Gamborg B5 Medium met behulp van steriele pincetten die gesteriliseerd werden met STERI 350. Opdat de zaadjes niet zouden wegrollen dienen ze een klein beetje in het medium geduwd te worden. Per cultuurbuis wordt een steriel zaadje gezet. Er werden 13 buizen gerekend per behandeling (V. longisporum, V. tricorpus en Controle). Na uitplanten van de zaden worden ze in het donker bewaard gedurende 2 dagen. Na 2 dagen starten de zaden met het kiemproces en wordt de onderkant van de cultuurbuis in het donker gebracht met behulp van aluminiumfolie. De buizen worden op ge- 38

39 Materialen en methoden lijke afstanden van elkaar verspreid in het rek met TL-lampen. Zo krijgt iedere plant evenveel licht [28]. Inoculatie met V. longisporum en V. tricorpus Na 9 dagen worden de planten geïnoculeerd met 0,2µL sporensuspensie van elke schimmel (± sporen/ml). Deze sporensuspensie wordt bekomen door een goed gegroeide kolonie (d=5-10cm) met steriel water te overgieten. Met een steriele spatel wordt voorzichtig over de kolonie gegaan zodat de sporen loskomen en suspenderen in het water. Deze suspensie wordt in een steriele falcon tube (50mL) gebracht. De concentratie sporen wordt geteld met een Bürker-telkamer (Zie figuur 3.1). Figuur 3.1. Bürker telkamer. De 2 grote vierkanten zijn aangeduid met een zwarte rand [10]. Er worden 2x2 grote vierkanten geteld daaruit wordt het gemiddelde berekend. Het gemiddelde wordt vermenigvuldigd met 10 4 zodat men het aantal sporen/ml bekomt. De gewenste concentratie van ± sporen/ml wordt bekomen door de suspensie eventueel te verdunnen. De sporensuspensie wordt op een steriele manier op de wortel van de plant gebracht. Als controle wordt 0,2µL steriel water op de wortel gebracht. Achttien dagen na inoculatie wordt de evaluatie uitgevoerd waarbij het vers gewicht beoordeeld wordt en gekeken wordt of er typische Verticillium symptomen te zien zijn. De plantjes worden in twee gesneden in het midden van de stam waarbij de bladeren verwijderd worden. Deze twee delen worden voorbereid tot het microscopisch onderzoek [28]. 39

40 Materialen en methoden Microscopisch onderzoek Zelfde methode als Ook de aan- of afwezigheid van microscleroten wordt geteld. De volledige wortel wordt doorlopen op een vergroting 100x, de microscoopvelden die microscleroten bevatten worden als positief (score 1) gescoord, microscoopvelden die geen microscleroten bevatten krijgen score 0. Op basis hiervan kan dan het % worteloppervlak bedekt door microscleroten worden berekend: aantal velden met score 1 gedeeld door totaal aantal velden. Op deze manier kan het % microscleroten vergeleken worden bij V. longisporum en V. tricorpus. De resultaten van het vers gewicht en de aanwezigheid van microscleroten worden statistisch verwerkt met SPSS Pathogeniciteit in vivo + interactie Materialen 50 potten met een diameter van ongeveer 17 cm. krantenpapier 80L gesteriliseerde potgrond/zand (20/80) 50 bloemkoolplantjes (Ras: Cornell) Kurkboor Bürker-telkamer Microscoop (Leitz) Nutriëntenoplossing (1M) (Zie tabel 3.2): o Bij aanmaak autoclaveren en bewaren in koelkast. Tabel 3.2. Nutriëntenoplossing (1M) Product Hoeveelheid nodig om finale concentratie van Hoeveelheid nodig voor 1L 1M te bekomen. (g/l) KH 2 PO 4 (VWR, LOT: 136,0 100µL 07H160046) KNO 3 101,1 5mL 40

41 Materialen en methoden (Sigma, LOT: 016K1368) Ca(NO 3 ) 2.4H 2 O ( Fluka, LOT: ) MgSO 4.7H 2 O (Acros Organics, LOT: A ) Fe-EDTA (Acros Organics, LOT: A ) Micro-elementen 236,15 5mL 246,48 2mL mL 2,68g boorzuur (Acros 1mL Organics, LOT: A ) 1,81g mangaanchloride- 4H2O (ocb, LOT: ) 0,22g zinksulfaat.7h 2 O (Merck, LOT: ) 0,08g kopersulfaat.5h 2 O (Vel nv. LOT: ) 0,02g 85% molybdeenzuur (Acros Organics, LOT: A ) Falcon tubes (50mL) PDA (Difco Potato Dextrose Agar, LOT: ) PDA + streptomycine (c= 2,5g/10ml) (400µL/L: toevoegen na autoclaveren) MSEA (Modified soil extract agar medium) (1L) o 20.26g MSEA medium (Dushefa Biochemie LOT: P ) o 1g NaOH (VWR, LOT: 04B170009) o 24mL grond extract o 1mL imbentin (Fluka, LOT: /1) o Gedestilleerd water 41

42 Materialen en methoden Methoden Onderin de potten wordt een laagje krantenpapier gelegd omdat de watergaten te groot zijn. Een ongeveer gelijke hoeveelheid gesteriliseerde grond wordt in de potten gedaan (1,5L/pot). Er wordt gebruik gemaakt van de grondbevloeiingsmethode: De bloemkoolplanten worden in hun blokje gelaten en zo geplant. Het blokje wordt doorprikt met een kurkboor. Er worden 4 gaten van ongeveer 3 cm diep gemaakt zo dicht mogelijk bij de plant. 2mL sporensuspensie of water wordt verdeeld per gat (Zie tabel 3.3) [6,28]. Tabel 3.3. Behandelingen met grondbevloeiingsmethode Nr. 1 e behandeling 2 de behandeling (1 week nadien) 1 Water Water 2 Water V. longisporum 3 Water V. tricorpus 4 V. tricorpus V. longisporum Gedurende de gehele groeiperiode wordt de temperatuur en eventuele effecten nauw opgevolgd. Ook wordt de plant tijdig voorzien van water of nutriëntenoplossing. Ongeveer 4 weken na inoculatie worden de bloemkolen elke week geëvalueerd door middel van scores (0 5): - 0: geen geelverkleuring van het blad - 1: 0-25% van blad is geelverkleurd - 2: 25-50% van blad is geelverkleurd - 3: 50-75% van blad is geelverkleurd - 4: >75% van blad is geelverkleurd - 5: blad is dood Ook wordt het totaal aantal bladeren iedere week geteld. Door middel van onderstaande formule wordt de ziekte-index berekend: 42

43 Materialen en methoden ((5*n 5 )+(4*n 4 )+(3*n 3 )+(2*n 2 )+(1*n 1 )) x 100 = ziekte-index (%) (n*5) n a = aantal bladeren met score a n= totaal aantal bladeren Bij de eindevaluatie wordt het gewicht van de bloemkoolplant bepaald (zonder wortels). Dan wordt de stengel in 2 gesneden en worden de xyleemvaten grondig bekeken op vasculaire zwartverkleuring. Hierbij wordt een score gegeven van 0 3 (0: geen zwartverkleuring, 1: onderste gedeelte van de stengel vertoont zwartverkleuring, 2: 2/3 van de stengel is aangetast, 3: de gehele stengel is aangetast). Vervolgens wordt de stengel nogmaals in 2 verdeeld en wordt opnieuw een score van 0 3 gegeven. Zo bekomt men 2 scores per plant. De gewichten en scores worden statistisch verwerkt met SPSS De AUDPC (Area Under the Disease-Progress Curve) wordt berekend a.d.h.v. volgende formule [73]: AUDPC = [(t/2. (S 1 + (2.S 2 ) + + (2.S i ) + S i ))/(A.n)] x 100 t= interval (in dagen) tussen de observaties S i = Ziekte-index A= maximum ziekte-score n= aantal observaties Per behandeling worden drie planten genomen. Hierbij wil men nagaan of er een schimmel of welke schimmel aanwezig is in de plant. Tien stukjes van elk plantgedeelte (onderste deel van stengel, bovenste gedeelte van stengel en petiolen of bladstengels) van ongeveer 1,5cm worden gesneden. Deze stukjes worden gesteriliseerd door 1 minuut in 1% javel te brengen en worden vervolgens éénmaal gewassen met steriel water. Men laat de plantenstukjes dan enkele minuten drogen op steriel filtreerpapier. Acht plantenstukjes per plantendeel worden uitgeplaat op PDA met streptomycine. De overige worden uitgeplaat op MSEA-medium. De groei van de platen wordt nauwge- 43

44 Materialen en methoden zet opgevolgd, eventueel worden stukjes waar men zeker is van de groei van Verticillium overgezet op nieuwe PDA + streptomycine platen. 3.4 Moleculaire detectie van Verticillium DNA-extractie Materialen DNA-extractie van zuivere schimmelculturen Zuivere culturen van V. longisporum, V. tricorpus en V. dahliae gegroeid op PDB (Difco, Potato Dextrose Broth, LOT: ) Vloeibare stikstof Mortier en stamper Filtreerpapier + filter Steriele eppendorfjes (1,5mL en 2mL) Steriel MilliQ-water DNeasy Plant Mini Kit (50) (Qiagen, LOT: ) Microcentrifuge (Eppendorf MiniSpin AG, 22331) Warmwaterbad bij 65 C DNA-extractie vanuit grond Powersoil DNA Isolation Kit (MO BIO Laboratories, Inc., LOT: P57B15) 0,25g van de grondstalen Microcentrifuge (Eppendorf MiniSpin AG, 22331) Vortexapparaat (VWR) MO BIO Vortex Adapter tube holder Schudder: Retch Westburg MM

45 Materialen en methoden Methoden DNA-extractie m.b.v. DNeasy Plant Mini Kit uit zuivere culturen van de schimmels gegroeid op PDB 1. Filtreer de myceliumfilm, hierbij worden de agar-schijfjes eruit gepikt omdat agar interfereert met de PCR-reactie. 2. Drogen van filtraat. Toerollen filtreerpapier met gewoon papier om het water te verwijderen. 3. Vloeibare stikstof in mortier brengen. 4. Overbrengen van gedroogde myceliumfilm in het mortier. 5. Kloppen met stamper op mycelium zodat het uiteen valt in stukken. 6. Wanneer de vloeibare stikstof ongeveer verdampt is wordt het mycelium vermalen met de stamper. 7. Het poeder wordt overgebracht in een epje van 2mL waarbij ze terug in de vloeibare stikstof gebracht worden om ontdooiing tegen te gaan µL van buffer AP1 toevoegen. 9. 4µL RNase toevoegen en goed mengen. 10. Het mengsel wordt geïncubeerd in een warmwaterbad bij 65 C gedurende 10 min. Tijdens deze stap worden de epjes 2 à 3 maal omgedraaid µL AP2 buffer toevoegen, vervolgens goed mengen. 12. Incubatie op ijs gedurende 5 minuten. 13. Het lysaat wordt overgebracht op de QiaShredder mini spin kolom (paars). Het lysaat kunnen we makkelijker opzuigen door de pipettip enkele millimeters af te knippen. 14. Centrifugatie bij rpm gedurende 2 minuten. 15. De flow-through fractie wordt overgebracht in een nieuw epje zonder de pellet aan te raken ,5 volume AP3/E wordt toegevoegd en vervolgens goed gemengd µL lysaat wordt overgepipeteerd op de DNeasy mini spin kolom (wit). 18. Centrifugatie bij 8000rpm gedurende 1 minuut. 19. De flow-through fractie wordt verwijderd. 20. Stap 17, 18 en 19 worden herhaald met het resterende staal. 45

46 Materialen en methoden 21. De kolom wordt in een nieuw epje geplaatst waarbij 500µL AW buffer wordt toegevoegd. 22. Centrifugatie bij 8000 rpm gedurende 1 minuut. 23. De flow-through fractie wordt verwijderd. 24. Vervolgens wordt nogmaals 500µL AW buffer toegevoegd. 25. Centrifugatie bij rpm gedurende 2 minuten. 26. De kolom wordt overgebracht in een nieuw 1,5mL epje gelabeld als fractie µL AE buffer wordt op het membraan gebracht. 28. Incubatie op kamertemperatuur gedurende 5 minuten. 29. Centrifugatie bij 8000 rpm gedurende 1 minuut. 30. Stap worden herhaald met een nieuw epje gelabeld als fractie DNA-extractie met Powersoil DNA Isolation Kit vanuit grondstalen 1. Aan de PowerBead Tubes wordt 0,25g grondstaal toegevoegd. 2. Dit wordt voorzichtig gevortexd om te mengen. 3. Vervolgens wordt 60µL van Solution C1 toegevoegd. Indien Solution C1 neergeslagen is dan wordt deze opgewarmd tot 60 C tot alles opgelost is. Na toevoeging wordt gemengd door de tube enkele keren om te draaien of kort gevortexd. 4. Vervolgens worden de secure PowerBead Tubes in het MO BIO Vortex Adapter tube holder gebracht. Dit wordt toegeplakt met plakband en wordt gevortexd op de maximum snelheid gedurende 10 minuten in Retch Westburg MM De PowerBead Tubes worden in de microcentrifuge gebracht op 12,2rpm gedurende 30 seconden op kamertemperatuur. Wees zeker dat de PowerBead Tubes vrij kunnen bewegen in de centrifuge zonder hapering. Wees ook zeker dat de rotatiesnelheid van 12,2rpm niet overschreden wordt of anders zullen de tubes breken. 46

47 Materialen en methoden 6. Het supernatans wordt vervolgens in een nieuwe 2mL Collection Tube gebracht ( µL). Het supernatans mag nog enkele grondpartikels bevatten. 7. Voeg 250µL Solution C2 toe en vortex gedurende 5 seconden. Incubeer gedurende 5 minuten op 4 C. 8. Centrifugeer de epjes op kamertemperatuur voor 1 min op 12,2rpm. 9. Er wordt niet meer dan 600µL supernatans opgezogen, waarbij de pellet vermeden wordt, en in een nieuw 2mL Collection Tube gebracht µL van Solution C3 wordt toegevoegd en kort gevortexd. Nadien wordt geïncubeerd op 4 C voor 5min. 11. De epjes worden gecentrifugeerd gedurende 1 min op 12,2rpm. 12. Transfereer 750µL van het supernatans in een 2 ml Collection Tube zonder het pellet aan te raken. 13. Voeg 1200µL van Solution C4 toe en vortex gedurende 5 seconden. 14. Neem ongeveer 675µL en breng dit in een Spin Filter waarna gecentrifugeerd wordt op 12,2rpm voor 1 minuut op kamertemperatuur. De flow-through fractie wordt weggegooid en er wordt opnieuw 675µL supernatans op de Spin Filter gebracht en terug gecentrifugeerd op 12,2rpm gedurende 1 minuut. De rest supernatans wordt vervolgens op de Spin Filter gebracht en gecentrifugeerd op 12,2rpm voor 1 minuut op kamertemperatuur µL Solution C5 wordt op de Spin Filter gebracht en gecentrifugeerd op kamertemperatuur voor 30 seconden op 12,2rpm. 16. De flow through fractie wordt weggegooid. 17. Centrifugeer opnieuw op kamertemperatuur voor 1 minuut op 12,2rpm. 18. De Spin Filter wordt nu voorzichtig in een nieuwe 2 ml collection tube gebracht. Opmerking: Zorg dat de Spin Filter de C5 Solution niet raakt! 19. Voeg 100µL van Solution C6 in het midden van het witte filtermembraan. Alternatief: MilliQ-water 20. Centrifugeer op kamertemperatuur voor 30 seconden op 12,2rpm. 21. Gooi de Spin Filter weg. Het geëxtraheerd DNA bevindt zicht in het epje. 47

48 Materialen en methoden Het DNA wordt het best bewaard tussen -20 C en -80 C PCR Materialen PCR-toestel (Eppendorf Master Cycler) DNA-stalen Q-buffer 10x bevat 15mM MgCl 2 (Qiagen, LOT : ) dntp s (10mM dntp mix, Fermentas, LOT : ) Q solution 5x (Qiagen, LOT: ) Taq polymerase (5u/µL, Fermentas, LOT : ) MilliQ-water DNA-ladder: MassRuler DNA Ladder mix Laadkleurstof Ethidiumbromide Primers (Zie tabel 3.4) Tabel 3.4. Primers voor species-specifieke PCR Naam Richting Sequentie Concentratie (µm) VL1 [38] Forward 5 TCTCCTCTCTACGAGAACGA 3 10 VL2 [38] Reverse 5 CACTTTCTAAGTATCCTTCCT AT 3 10 VT1 [18] Forward 5 CGCCGGTACATCAGTCTCTT 3 10 VT2 [18] Reverse 5 ACTCCGATGCGAGCGAA 3 10 VD1 [19] Forward 5 CACATTCAGTTCAGGACGGA 3 10 VD2 [19] Reverse 5 CCGAAATACTCCAGTAGAAGG 3 10 VDS2 [17] Reverse 5 CCTTCTACTGGAGTATTTCGG

49 Materialen en methoden Methoden Er wordt een PCR-mix gemaakt voor ieder primerpaar: 2,5µL Q-buffer 10x 0,5µL dntp s 5µL Q solution 5x 1,75µL VL1/VT1/VD1(10µM) 1,75µL VL2/VT2/VD2/VDS2 (10µM) 0,15µL Taq-polymerase 11,35µL MilliQ-water 23µL PCR-mix + 2µL DNA-staal Opmerking: - Er wordt voortdurend op ijs gewerkt. - Het Taq-polymerase wordt toegevoegd aan de PCR-mix nadat de PCR-epjes gevuld worden met het DNA-staal en voor het toevoegen van de PCR-mix aan de PCR-epjes. Dit alles wordt in het PCR-toestel gebracht en het correcte PCR-programma met de correcte annealingstemperaturen wordt ingesteld. Het PCR-programma ziet er als volgt uit [38, 18, 19 of 17]: 10 min op 94 C (denaturatie) 2 min op 94 C (denaturatie) 1 min op 56,1 C (VL1/VL2) (annealing) 60 C (VT1/VT2) 35x 37 C of 67 C (VD1/VD2/VDS2) 1 min op 72 C (extensie) 10 min op 72 C (finale extensie) 49

50 Materialen en methoden Opmerking: Om een gradiënt PCR uit te voeren worden verschillende annealingstemperaturen gebruikt. Op deze manier is het mogelijk na te gaan welke annealingstemperatuur zorgt voor de meest specifieke amplificatie. Vervolgens wordt bij 10µL PCR-product 2µL laadkleurstof gebracht. Dit wordt op 1% agarosegel (gekleurd met 2µL/100mL ethidiumbromide) geladen samen met 2µL DNA Ladder (MassRuler DNA Ladder mix). De gel laat men lopen onder 100V gedurende ±30min. De bandjes worden gevisualiseerd door UV-licht Sequenering van ITS-regio Materialen PCR van ITS-regio PCR-toestel (Eppendorf Master Cycler) DNA van te sequeneren staal Q-buffer 10x bevat 15mM MgCl 2 (Qiagen, LOT : ) dntp s (10mM dntp mix, Fermentas, LOT : ) Q solution 5x (Qiagen, LOT: ) Taq polymerase (5u/µL, Fermentas, LOT : ) MilliQ-water DNA-ladder: MassRuler DNA Ladder mix Laadkleurstof Ethidiumbromide ITS-primers (Zie tabel 3.5) Tabel 3.5. ITS-primers voor PCR van ITS-regio [47] Naam Richting Sequentie Concentratie (µm) ITS5 Forward 5 GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG 3 10 ITS4 Reverse 5 TCCTCCGCTTATTGATATGC

51 Materialen en methoden DNA-opzuivering QIAquick PCR Purification Kit (50) (Qiagen, LOT: ) Microcentrifuge (Eppendorf MiniSpin AG, 22331) Steriele epjes (1,5mL) Concentratiebepaling Opgezuiverd staal UV/Vis spectrophotometer (UVIKON 932) Quartz cuvetten (zwarte QS cuvetten Hellma, pathlength=1cm) Steriele epjes (1,5mL) Methoden PCR van ITS-regio Om DNA te sequeneren wordt eerst een PCR van de ITS-regio gedaan met universele primers (ITS4 en ITS5) voor schimmels. Er wordt een fragment van +/- 600bp bekomen dat vervolgens gesequeneerd kan worden. PCR-Mix: 5µL Q-buffer 10x 1µL dntp s 10µL Q solution 5x 3.5µL ITS4 (10µM) [47] 3.5µL ITS5 (10µM) [47] 0.30µL Taq polymerase 22.7µL MilliQ-water 46µL PCR-mix + 4µL DNA-staal 51

52 Materialen en methoden PCR-programma: 10 min op 94 C (denaturatie) 1 min op 94 C (denaturatie) 1 min op 55 C (annealing) 35 x 1 min op 72 C (extensie) 10 min op 72 C (finale extensie) Vervolgens wordt bij 10µL PCR-product 2µL laadkleurstof gebracht. Dit wordt op 1% agarosegel (gekleurd met 2µL/100mL ethidiumbromide) geladen samen met 2µL DNA Ladder (MassRuler DNA Ladder mix). De gel laat men lopen onder 100V gedurende ±30min. De bandjes worden gevisualiseerd door UV-licht DNA opzuivering met QIAquick PCR Purification Kit 1. Voeg 5 volumes van Buffer PB1 toe aan 1 volume van het PCR-product en mix. 2. Controleer of de kleur geel wordt want dit wil zeggen dat de ph 7,5. 3. Plaats een Qiaquick spin kolom in een 2 ml collection tube. 4. Hierop wordt het DNA-staal gebracht en gecentrifugeerd voor seconden op rpm. 5. De flow-through fractie wordt weggegooid en de Qiaquick spin kolom wordt terug op het epje gezet. 6. Om het DNA-staal te wassen wordt 0,75mL Buffer PE op de Qiaquick kolom gebracht en gecentrifugeerd op rpm. 7. De flow-through fractie wordt weggegooid en de Qiaquick kolom wordt terug in hetzelfde epje geplaatst en droog gecentrifugeerd gedurende 1 minuut op rpm. 8. Plaats de QIAquick kolom in een nieuw 1,5mL epje. 9. Om het DNA in oplossing te brengen wordt 30µL MilliQ-water in het midden van de kolom gebracht. Dit wordt gecentrifugeerd gedurende 1 minuut op 13000rpm. 10. Het DNA wordt bewaard op -20 C. 52

53 Materialen en methoden Concentratiebepaling Voor de sequentie-analyse is twee maal 10µL (voor Forward en Reverse staal) en een DNA-concentratie van 20ng/µL vereist. Daarom moet eerst de concentratie bepaald worden. Die kan daarna verdund worden naar de juiste concentratie. Er wordt gebruik gemaakt van de UV/Vis spectrofotometer (UVIKON 932). 8µL van het staal wordt aangelengd tot 70µL met milliq-water. De metingen worden uitgevoerd bij 260nm, 280nm en 320 nm. De absorbantie (A) bij 260nm wordt gebruikt om de concentratie te bepalen. De DNA-concentratie wordt bepaald via onderstaande formule. DNA concentratie (µg/ml) = absorbantie (bij 260nm). 50. verdunningsfactor Om de zuiverheid te bepalen van het DNA wordt de absorbantie bij 260nm gedeeld door de absorbantie gemeten bij 280nm. Als deze groter is dan 1,8 dan betekent dit dat het DNA zuiver is. Bij dit DNA, die gesequeneerd moet worden, is dit niet zo kritisch. Als zekerheid voor de zuiverheid kan volgende berekening worden uitgevoerd: A (260nm) A (320nm) > 1,8 zuiver DNA A (280nm) A (320nm) Sequenering De sequenering gebeurt in het VIB Zwijnaarde. Hierbij worden volgende zaken opgestuurd: Forward staal, 20ng/µL, 10µL (forward analyse met forward primer) Reverse staal, 20ng/µL, 10µL (reverse analyse met reverse primer) Forward primer (ITS5, 5mM, 10µL/Forward staal) Reverse primer (ITS4, 5mM, 10µL/Reverse staal) 53

54 Materialen en methoden Excel-werkblad met identificatie van de stalen en lengte van het geamplificeerde fragment (hier +/- 600bp) 3.5 Bepaling van aantal kiemkrachtige microscleroten in grond Materialen 2 mm, 100µm en 20µm zeef 0,08% wateragar (50ml/staal) (Certa Agar (-agar) LOT: 04J22GR) MSEA (Modified soil extract agar medium) (1L) o 20.26g MSEA medium (Dushefa Biochemie LOT: P ) o 1 g NaOH (VWR, LOT: 04B170009) o 24mL grond extract o 1mL imbentin (Fluka, LOT: /1) o Gedestilleerd water Na autoclaveren: 1mL tetracycline(50mg/ml)/l medium 70% alcoholbad Stereomicroscoop: Olympus SZX12 Grondstalen PSKW en POVLT De stalen werden genomen in Klein-Brabant (PSKW) en in West-Vlaanderen (POVLT). In tabel 3.6 en 3.7 wordt een overzicht van de staalnames gegeven. Tabel 3.6. Overzicht staalname februari 2008 van PSKW Staal Teler Perceel Voorvrucht Aantasting 1 Michel Vervloet Kuikestraat 1/jaar bloemkool Geen 1/jaar prei 2 Luc Selleslagh Perceel 1 naast huis Raaigras Zeer weinig 1/jaar bloemkool Afwisseling graan 3 Luc Selleslagh Perceel 2 naast huis, iets natter Raaigras (kleiner) Enkel zomerbloemkool Zeer veel 54

55 Materialen en methoden 4 Luc Selleslagh Links van rijweg rechts van schuilhok 5 Luc Selleslagh Links van rijweg, perceel 3 na schuilhok, naast winterbloemkool Luc Selleslagh Rechts van betonweg, links van perceel Verbruggen (07: spruiten) 7 Eddy Maes Waterstraat, rijweg tegenover Caluwé in buitenbocht links deel van perceel 8 Eddy Maes Waterstraat, rijweg tegenover Caluwé in buitenbocht, rechts deel van perceel 2007: spruiten veel Afwisseling graan 2007: bloemkool minder Nu gefreesd 2007: bloemkool Zeer veel Raaigras Zeer veel Raaigras geen 9 Jan De Wit Rechts naast huis Steeds vroege bloemkool geen gevolgd door prei 10 Jan De Wit Achter schuur 1/jaar bloemkool weinig 11 Frank De Keyzer Achter L midden : prei rest: 1 Zeer veel of 2/jaar bloemkool 12 Jos Stevens Ceustermont-kapelspoor Laatste 40 jaar: vooral Geen bloemkool afwisseling prei 13 Jos Stevens Achter kerkhof Laatste 40 jaar: vooral Zeer veel bloemkool afwisseling prei 14 Stijn Vandevoorde Tegen bos buis 1 Veel bloemkolen Zeer veel 15 Stijn Vandevoordtje Buis 3- rechtop baan- Afwisseling aardappel Minder 16 Stijn Vandevoorde Nabij huis-rechts van rijweg Afwisseling aardappel, prei, sla geen 55

56 Materialen en methoden Tabel 3.7. Overzicht staalname maart 2008 van POVLT Staal Teler Perceel Teelt Aantasting 1 Coopman Achter Desauw 2007 aardappelen, Geen 2006 suikerbieten 2005 tarwe 2 POVLT Zwarte kapel 2007 prei Geen 2006 prei 3 POVLT Zwarte kapel 2007 prei Geen 2006 aardappelen 4 POVLT Vooraan proeftuin achter waterbassin 2007 aardappelen 2006 bloemkool Slechte groei kolen witloof 5 POVLT Zwarte kapel, vooraan 2007 sudangras of Geen geurproef 2006 sorghum 2006 bloemkool 6 Chris Devroe WP 1 Nu raaigras Zeer veel 2007 bloemkool 2006 bloemkool 7 Chris Devroe WP 2 Nu raaigras Zeer veel 2007 bloemkool 2006 bloemkool 8 Chris Devroe Rassenproef 2007 bloemkool Gemiddeld 2006 bloemkool/prei 9 Chris Devroe Voor zijn deur 2007 bloemkool/broccoli Zeer veel 10 Paul Carpentier Voor zijn deur 2007 bloemkool Geen 2006 knolselder 11 Paul Carpentier Rijksweg, rassenproef 2007 bloemkool Geen knolselder 12 Jozef Claerhout Over t hof 2007 prei Geen 2007 bloemkool 2006 aardappelen 13 Marnix Deleye Naast t hof Nu raaigras 2007 bloemkool 2006 mais Geen 56

57 Materialen en methoden 14 Marnix Deleye 2007 bloemkool 2006 courgette Geen, kolen hadden eens bladtoppen Methoden Er worden grondstalen genomen op een diepte van 0-30cm van bloemkoolvelden. Het gewenste aantal stalen wordt genomen en wordt gedroogd voor 2 weken. Na het drogen wordt de grond gezeefd met een 2mm zeef. Vervolgens wordt 12,5g van de gezeefde grond afgewogen. Hierop wordt de natte zeeftechniek toegepast zodat we deeltjes bekomen met een grootte tussen 20 en 100µm. Hierbij wordt het monster op de 100µm zeef gebracht waaronder zich de 20µm zeef bevindt. Vervolgens wordt het monster gedurende 5 minuten besproeid met water. De fractie tussen 100µm en 20µm wordt gesuspendeerd in 50mL 0.08% wateragar. Tussenin de stalen worden de zeven goed afgespoeld en enkele minuten in het 70% alcoholbad gedompeld. 0,8mL van deze fractie wordt gespreid met een spatel op het MSEA-medium (6platen/staal). De petriplaten worden geïncubeerd bij 22 C gedurende 4 weken. Grondpartikels worden vervolgens verwijderd van de platen door ze voorzichtig te wassen onder kraantjeswater. De grondpartikels kunnen het gemakkelijkst verwijderd worden door met de vingers voorzichtig te wrijven over het oppervlak van het medium. Vijf platen van ieder grondstaal worden geteld m.b.v. de stereomicroscoop (Olympus SZX12). Om zeker te zijn dat alles geteld wordt kan een soort raster gebruikt worden met horizontale lijnen die telkens 1 cm van elkaar staan. Daarbij wordt meestal vergroting 10x gebruikt. Wanneer men een eventuele Verticillium kolonie ziet, kan men de vergroting wijzigen. De microscleroten moeten kiemen en een kolonie vormen voor we ze kunnen tellen. De microscleroten van V. longisporum en V. dahliae zijn niet zo compact als die van V. tricorpus. Ook zijn de microscleroten van V. tricorpus groter en scherper. De kolonies van V. dahliae en V. longisporum worden radiaal gevormd. Bij V. tricorpus eerder verspreid soms ziet men ook soms donkere hyfen rond de microscleroten [42]. Er kan dus geen onderscheid gemaakt worden tussen de microsclero- 57

58 Materialen en methoden ten van V. longisporum en V. dahliae. Vervolgens wordt het totaal aantal microscleroten/g grond bekomen door het totaal aantal getelde microscleroten te vermenigvuldigen met 1, Statistische verwerking De resultaten van de verschillende experimenten worden verwerkt met het programma SPSS De grafieken worden in MS Excel 2007 gemaakt. Eerst en vooral wordt via de Kolmogorov-Smirnov test de normaliteit van de steekproef nagegaan. Dan wordt een Levene-test uitgevoerd. Deze test onderzoekt de homogeniteit van de varianties. Significantieniveaus van meer dan 0,05 betekenen dat de steekproefverdeling normaal is en de varianties homogeen zijn. Indien dit het geval is mag overgegaan worden tot de parametrische toetsen. Dit gebeurt met de Oneway-ANOVA-test met een Post-Hoc Tukey test. Een significantieniveau onder 0,05 betekent dat er een verschil is tussen verschillende behandelingen. Indien de gegevens niet normaal verdeeld zijn en de varianties verschillend zijn wordt overgegaan tot een niet-parametrische toets. Meerdere steekproefverdelingen worden vergeleken a.d.h.v. de Kruskal-Wallistoets. De Mann-Whitney wordt gebruikt om 2 steekproefverdelingen te vergelijken. Een significantieniveau onder 0,05 betekent dat er een verschil is tussen verschillende behandelingen. 58

59 Resultaten en bespreking 4 Resultaten en bespreking 4.1 In vitro pathogeniciteit Twee in vitro methoden werden uitgetest om de pathogeniciteit van V. longisporum en V. tricorpus ten opzichte van bloemkool te vergelijken In vitro pathogeniciteit: met vierkante petriplaten In het eerste experiment werd het ras Cornell gebruikt. Dit ras kwam in aanmerking omwille van het gebruik in voorgaande veldproeven met Verticillium in het PSKW in het kader van het project. Voor een in vitro test is het de bedoeling dat de coating rond de zaadjes die fungiciden bevatten, weggekregen wordt zodat er geen eventuele interferentie is met schimmel-inhiberende stoffen. Dit bleek echter niet mogelijk met ethanol (70%) en javel (1%). Ook gebeurde de kieming niet zo goed en was er veel contaminatie in de platen aanwezig. In een tweede experiment werd het ras Clapton gebruikt. Dit ras werd ook gebruikt bij Verticillium-veldproeven voor het project in het POVLT. Hierbij verdween de coating al snel bij de sterilisatie met ethanol (70%) en javel 1%. Het gebruik van vierkante petriplaten leek zeer geschikt omdat alle delen van de plant zeer duidelijk zichtbaar zijn zodat de symptomen van Verticillium nauwkeurig opgevolgd konden worden. Deze methode had als voordelen dat er 6 zaden op het medium konden en dus het plaatsen van de zaden snel en makkelijk verloopt. De inoculatie gebeurde met myceliumplugs die naast de wortel werden geplaatst (Zie figuur 4.1). Het nadeel is echter dat Verticillium een traag-groeiende schimmel is. De methode was oorspronkelijk ontwikkeld voor Rhizoctonia solani, deze schimmel heeft slechts 7 dagen nodig om de kiemplanten te infecteren [43]. In dit experiment moesten de plantjes minimum 3-4 weken gehouden werden in de vierkante petriplaten. Dit vergroot meteen de kans op contaminatie. 59

60 Resultaten en bespreking Figuur 4.1. In vitro pathogeniciteit in bloemkool 'Clapton' inoculatie met myceliumplugs van V. tricorpus Wanneer de in vitro planten een degelijke grootte hadden (8-12 dagen na zaaiing) vond de inoculatie plaats. Ongeveer 2 weken na inoculatie werden nog geen typische symptomen van Verticillium in het kiemplantje vastgesteld terwijl er al veel contaminatie aanwezig was, ook in de platen van de controleplanten. Met deze methode was het dus niet mogelijk verschillen in de pathogeniciteit waar te nemen tussen V. longisporum en V. tricorpus. Bij sommige planten (afkomstig van platen vrij van contaminatie) zagen we wel interessante aspecten van het infectieproces in de wortels van bloemkool onder de microscoop. In de bloemkolen van het ras Cornell, die geïnoculeerd werden met V. longisporum werd hoogstwaarschijnlijk een soort van gum of gel gevormd in de xyleemvaten van de wortels (Zie figuur 4.2). Ook in de wortels van het ras Clapton die geïnoculeerd werden met V. tricorpus werden deze structuren waargenomen in de xyleemvaten. De schimmel kon echter niet gedetecteerd worden en dit kon dus niet met zekerheid geassocieerd worden met dit type van accumulatie. Deze test zou in de toekomst nog enkele keren herhaald moeten worden ter bevestiging. 60

61 Resultaten en bespreking Figuur 4.2. Wortels van bloemkool Cornell geïnfecteerd met V. longisporum die gekleurd werd met 5% inktazijn. ( : soort gum of gel, : xyleemvaten) Om de schimmeldraden in de wortels te visualiseren werd de KOH-anilineblauw kleuringstechniek gebruikt. Door deze kleuring fluoresceren de schimmeldraden wanneer ze blootgesteld worden aan UV licht. Onder UV licht kunnen ook celreacties in de plant worden gedetecteerd. Wanneer een cel beschadigd wordt, worden er heel wat sterk fluorescerende stoffen geaccumuleerd. Als reactie op de penetratie van de schimmel in de plant treedt er namelijk een soort afweerreactie op in de plant. Hierbij worden de celwanden van de plant versterkt en worden er o.a. fenolische componenten geaccumuleerd. Deze componenten fluoresceren onder UV licht. Er zijn ook elementen in de plant die natuurlijke fluorescerende eigenschappen bezitten (bv. lignine in de xyleemvaten). Aan de buitenzijde van de worteltip van het ras Cornell konden duidelijk schimmeldraden van V. longisporum worden waargenomen (Zie figuur 4.3 A+B). Duitse onderzoekers die de interactie tussen Verticillium en koolzaad onderzochten, vonden echter geen kolonisatie van de worteltip of in de wortelharen. Op andere plaatsen in de wortel zagen ze dat V. longisporum tussen de epidermiscellen of direct de epidermiscellen penetreerde [41]. In ons experiment werd er fluorescentie waargenomen tussen de epidermiscellen, wat er ook op kan wijzen dat bij bloemkool de penetratie op dezelfde manier gebeurt (data niet weergegeven). Meer onderzoek is echter nodig om dit te bevestigen. 61

62 Resultaten en bespreking Er werd eveneens een sterke fluorescentie waargenomen in sommige worteltippen. Dit fenomeen zag men echter ook in de controles maar hoogstwaarschijnlijk in mindere mate. Om te bevestigen dat deze fluorescentie in mindere mate voorkomt in de controle en een reactie zou zijn op de penetratie van de schimmel zouden er meer stalen moeten worden onderzocht. De schimmeldraden leken longitudinaal te groeien op het worteloppervlak (zie figuur 4.3 C+D). Dit is in overeenstemming met wat werd waargenomen bij de interactie tusssen V. longisporum en koolzaad [41]. A B C D Figuur 4.3. Licht microscopie (A+C) en corresponderende fluorescentie microscopie (B+D) van de interactie tussen bloemkoolwortels en V. longisporum. (A+B): Groei van V. longis- 62

63 Resultaten en bespreking porum in worteltip van het ras Cornell. (C+D): groeipatroon van V. longisporum op het worteloppervlak. De KOH-anilineblauw kleuringstechniek werd gebruikt In vitro pathogeniciteit: met cultuurbuizen Omwille van de contaminatieproblemen bij de vierkante petriplaten werd overgestapt op het gebruik van cultuurbuizen [28]. Bij deze methode is de kans op contaminatie veel kleiner. Maar hierbij neemt het plaatsen van de zaadjes meer tijd in beslag en is er voor ieder zaadje een nieuwe cultuurbuis nodig. Er werd gebruik gemaakt van een sporensuspensie. De wortels zijn ook niet zo duidelijk te zien aangezien ze zich in het medium bevinden, ook het verwijderen van de plantjes uit het medium verloopt moeilijker dan bij de vierkante petriplaten. In dit experiment werd geen contaminatie vastgesteld in de cultuurbuizen wat op zich al een zeer goed punt is. Achttien dagen na inoculatie vertoonden de planten ook hier geen symptomen van Verticillium. Wat opviel was dat de met V. tricorpus geïnoculeerde plantjes groter waren dan de andere behandelingen. Er werd een significant verschil (p 0,05) waargenomen tussen het vers gewicht van de met V. tricorpus geïnoculeerde planten t.o.v. de andere behandelingen. De planten geïnoculeerd met V. tricorpus wogen 66% zwaarder dan de controle (Zie figuur 4.4). Ook zag Declercq (2005) in serre-experimenten na 5-6 weken na inoculatie dat sommige bloemkoolrassen (Fremont, Vinson en Hermon) geïnoculeerd met V. tricorpus significant groter waren dan de niet geïnfecteerde controle. De auteur testte het ras Clapton dat hier gehanteerd werd niet [65]. 63

64 Resultaten en bespreking B Figuur 4.4. In vitro bloemkool Clapton (27 dagen oud) geïnfecteerd met V. longisporum, V. tricorpus en een controle. (A): Vers gewicht van de volledige planten (mg). Behandelingen met eenzelfde letter zijn niet significant verschillend. (B): in vitro planten geïnoculeerd met Verticillium (van links naar rechts: Controle, V. longisporum, V. tricorpus). Bij het microscopisch onderzoek werd de groei van de schimmel aan de buitenkant van de plant en vorming van microscleroten duidelijk waargenomen (Zie figuur 4.5). Er werd een significant verschil (p 0,05) in de hoeveelheid microscleroten bij de planten die met V. tricorpus geïnoculeerd werden t.o.v. V. longisporum vastgesteld (Zie figuur 4.5A). 64

65 Resultaten en bespreking B C D E Figuur 4.5. Microscleroten op de wortels van bloemkool Clapton geïnoculeerd met V. longisporum en V. tricorpus in vitro. (A): Worteloppervlak bedekt door microscleroten. De volledige wortel van elke plant wordt overlopen op een vergroting 100x en de microscoopvelden die microscleroten bevatten werden als positief gescoord. Behandelingen met eenzelfde letter zijn niet significant verschillend (p 0,05). (B) en (D): wortel geïnoculeerd met V. longisporum en gekleurd met 5% inktazijn. (C) en (E): wortel geïnoculeerd met V. tricorpus en gekleurd met 5% inktazijn. 65

66 Resultaten en bespreking Bij V. tricorpus werden ook microscleroten binnenin de wortelcortex waargenomen (Zie figuur 4.6). Bij V. longisporum werd dit fenomeen zelden gezien. V. tricorpus kon de plant dus wel penetreren, maar kon zich hoogstwaarschijnlijk niet gemakkelijk verderzetten in de plant en ging dus over tot de vorming van microscleroten. Het fenomeen dat we zien bij de wortels van bloemkool Clapton geïnoculeerd met V. tricorpus lijkt wat op al gerapporteerd werd bij V. dahliae op resistente waardplanten. Levy en Isaac (1976) vergeleken de kolonisatie van V. dahliae op het worteloppervlak van erwt en gerst. Erwt was gevoelig aan V. dahliae en gerst vertoont resistentie t.o.v. V. dahliae. Microscleroten werden zelden gezien op de wortels van erwt terwijl op gerst al enkele microscleroten te zien waren na enkele dagen na inoculatie. Na 3-4 weken na inoculatie was het worteloppervlak van gerst volledig bedekt met microscleroten. Deze auteurs zagen ook soms vorming van microscleroten in de wortelcortex van gerst. Ze veronderstellen wanneer enkele hyfen de wortel toch kunnen penetreren, de hyfen niet verder kunnen groeien dan de wortelcortex en overgegaan wordt tot de vorming van microscleroten. Hun resultaten tonen aan dat wanneer de penetratie niet lukt, de wortel meer gekoloniseerd wordt door groei van de schimmel aan het worteloppervlak [50]. Declercq (2005) toonde aan dat Verticillium in resistente bloemkoolrassen niet terug te vinden was in de hypocotyl van de plant. In gevoelige rassen kon Verticillium al enkele dagen na inoculatie herisoleerd worden uit de hypocotyl van de bloemkoolplanten. Verticillium kan zich dus duidelijk makkelijker verspreiden in gevoelige waardplanten dan in eerder resistente planten [65]. 66

67 Resultaten en bespreking Figuur 4.6. Microscleroot binnenin de wortelcortex van bloemkool Clapton gekleurd met 5% inktazijn. 4.2 Pathogeniciteit in vivo + interactie Bloemkolen van het ras Cornell werden in de serre opgekweekt (Zie figuur 4.7). Ze ondergingen verschillende behandelingen. De planten werden geïnfecteerd met V. longisporum of V. tricorpus of de combinatie van beide. Figuur 4.7. In vivo pathogeniciteit+interactie bij bloemkool Cornell in serre 67

68 Resultaten en bespreking Gedurende de gehele groeiperiode van de bloemkolen werd de temperatuur opgemeten (Zie figuur 4.8). Figuur 4.8. Temperaturen in de serre gedurende het in vivo experiment. (Rood: maximum temperatuur, Blauw: minimum temperatuur). Ongeveer 4 weken na inoculatie van de bloemkoolplanten werden de eerste Verticillium symptomen waargenomen (Zie figuur 4.9). Hierbij zag men vooral de asymmetrische vergeling van de bladeren op de planten geïnoculeerd met V. longisporum. Vanaf dit moment werd elke week een evaluatie op de vergeling van de bladeren uitgevoerd en werd de ziekte-index berekend. 68

69 Resultaten en bespreking Figuur 4.9. Experiment: in vivo pathogeniteit + interactie tussen V. longisporum en V. tricorpus. (A) Overzicht bloemkolen Cornell in de serre. (B) Typische asymmetrische vergeling veroorzaakt door V. longisporum bij bloemkool Cornell. De ziekte-index werd bekomen op basis van de geelverkleuring per blad waar een score aan toegekend werd. Met behulp van statistische verwerking van de scores werd deze grafiek bekomen (Zie figuur 4.10). In de eerste weken van de evaluatie had de combinatie van V. tricorpus en V. longisporum de hoogste ziekte-index. Maar dan zwakte de stijging af en onderging de behandeling met V. longisporum alleen een forse stijging zodat deze de hoogste ziekte-index had. Er was geen significant verschil tussen de behandeling van V. longisporum alleen en de combinatie (p 0,05). Bij de controleplanten werd ook een algemene graad van vergeling waargenomen in oude bladeren. Bij de planten behandeld met V. tricorpus werd geen significant verschil in de ziekte-index waargenomen t.o.v. de controle (p 0,05). Hier werden ook geen typische Verticillium symptomen waargenomen. Het leek interessant om de verdere evolutie van de symptomen op te volgen tot aan de oogst. Maar het experiment moest gestopt worden omwille van de beperkte grootte van de potten. Wanneer de AUDPC berekend werd, werd geen significant verschil verkregen met V. longisporum en de combinatie van de twee schimmels (p 0,05) (Zie tabel 4.1). De behandeling met V. tricorpus vertoonde geen significant verschil t.o.v. de controle, de behandeling met V. longisporum en de combinatie daarentegen wel (p 0,05). Om duidelijkheid te verkrijgen zou dit experiment nogmaals herhaald moeten worden. 69

70 Resultaten en bespreking Figuur Evolutie van de ziekte-index. Behandelingen met eenzelfde letter zijn niet significant verschillend op een bepaald tijdstip (p 0,05). Tabel 4.1. AUDPC van de verschillende behandelingen [73]. Behandelingen met eenzelfde letter zijn niet significant verschillend (p 0,05). Behandeling AUDPC Controle 624,89 a V. longisporum 1123,47 bc V. tricorpus 781,31 ab V. tricorpus en V. longisporum 1334,07 c Negen weken na inoculatie werd de eindevaluatie uitgevoerd. Hierbij werden scores gegeven op de vasculaire zwartverkleuring van de stengel (Zie figuur 4.11). Bij V. tricorpus en de controle werd geen vasculaire zwartverkleuring waargenomen. Bij de behandeling met V. longisporum en de combinatie van beide schimmels was er geen significant verschil bij de vasculaire zwartverkleuring (p 0,05). Wel zag men meer variatie in de scores bij de behandeling met de combinatie van de schimmels. De combinatie van beide species leek dus geen duidelijk effect hebben op de bescherming van de bloemkoolplant Cornell. Ons experiment was gelimiteerd omdat er maar één 70

71 Resultaten en bespreking ras getest werd. Ook is het mogelijk dat de wijze van inoculatie een rol kan spelen. In de literatuur werden ook al verschillen gezien in de resultaten bij een verschillende wijze van inoculatie [6]. Figuur In vivo pathogeniciteit + interactie bij bloemkool Cornell : Eindevaluatie vasculaire zwartverkleuring van score 0-3. Behandelingen met eenzelfde letter zijn niet significant verschillend (p 0,05). Het gewicht van de bloemkolen werd ook bepaald (Zie figuur 4.12). De combinatie van de schimmels gaf een significant verschil met de controle (p 0,05). Er werd ook gezien dat de planten geïnoculeerd met V. tricorpus een beetje kleiner zijn. Mogelijk vergt de resistentie van de plant tegen V. tricorpus energie. Het is dus mogelijk dat de combinatie van de schimmels eveneens veel energie vraagt van de plant. Enerzijds door de afweer van de plant tegen V. tricorpus en anderzijds het negatief effect van de ziekte veroorzaakt door V. longisporum. Om dit te bevestigen is herhaling van het experiment vereist. In de in vitro test met Clapton zagen we dat V. tricorpus een groeistimulatie gaf. Hier werd echter geen groeistimulans waargenomen bij de behandeling met V. tricorpus. Declercq (2005) merkte dat bepaalde rassen die behandeld werden met V. tricorpus groter waren. Bij Cornell zag de auteur ook geen duidelijke groeistimulatie [65]. De resultaten kunnen dus variëren door het gebruikte ras. 71

72 Resultaten en bespreking Figuur In vivo pathogeniciteit + interactie bij bloemkool Cornell : Vers gewicht van het bovengrondse gedeelte van de plant. Behandelingen met eenzelfde letter zijn niet significant verschillend (p 0,05). Nadien werden plantenstukjes (onderste gedeelte van de stengel, bovenste gedeelte van de stengel, petiolen) uitgeplaat op PDA + streptomycine en MSEA-platen. Men wou nagaan of de schimmels herisoleerd konden worden uit de planten (Zie tabel 4.2 en 4.3). Tabel 4.2. Aantal herisolaties van Verticillium uit plantenstalen Cornell (3planten/behandeling) op PDA+sp. Behandeling Onderste gedeelte Bovenste gedeelte Petiolen van de stengel van de stengel V. longisporum V. tricorpus V. longisporum + V. tricorpus

73 Resultaten en bespreking Tabel 4.3. Aantal herisolaties van Verticillium uit plantenstalen Cornell (3 planten/behandeling) op MSEA. Plant Onderste gedeelte Bovenste gedeelte Petiolen van de stengel van de stengel V. longisporum V. tricorpus V. tricorpus + V. longisporum In de controle werd Verticillium niet herisoleerd. Er werd gezien dat Verticillium het makkelijkst geïsoleerd kon worden uit de petiolen. Deze delen van de plant zijn jong in tegenstelling tot de stengel. Uit de behandeling met V. longisporum en de combinatie van V. tricorpus en V. longisporum kon Verticillium herisoleerd worden. Hoogstwaarschijnlijk enkel V. longisporum. Bij de behandeling met V. tricorpus kon de schimmel niet herisoleerd worden. Dit is hoogstwaarschijnlijk te wijten aan de resistentie van de plant t.o.v. V. tricorpus. Het zou interessant zijn om ook stalen van de wortels uit te platen. 4.3 Moleculaire detectie van Verticillium spp. Met behulp van een moleculaire detectiemethode wensen we de microscleroten van Verticillium spp. op een snelle en nauwkeurige manier te detecteren in de grond. De techniek met de uitplatingen op MSEA is eerder tijdrovend en daarbij is het onderscheid tussen microscleroten van verschillende species soms moeilijk (Zie Literatuurstudie p24, Materiaal en methoden p54-58 en Resultaten en bespreking p80-83). Deze methode kan ook gebruikt worden ter bevestiging van de resultaten bekomen met de tellingen. Eerst en vooral werd geprobeerd de species-specifieke PCR te optimaliseren a.d.h.v. zuivere schimmelculturen, bij iedere PCR werden ook telkens twee grondstalen meegenomen (Zie tabel 4.4). 73

74 Resultaten en bespreking Tabel 4.4. Grondstalen gebruikt voor PCR met de aantallen microscleroten afkomstig uit voorgaande tellingen op MSEA. Grondstaal Oorsprong Totaal aantal microscleroten/g grond Aantal microscleroten van V. tricorpus 120 PSKW 0 0 (17/08/07) 305 POVLT (11/7/07) 57,2 33 De detectielimiet bij deze methode ligt op 1,1 microscleroten/g grond. Bij grondstaal 120 weet men met zekerheid dat V. longisporum aanwezig was door de hoge graad van Verticilliumaantasting in dit veld. Mogelijk werden hier geen microscleroten gedetecteerd omwille van de kleine hoeveelheid die uitgeplaat wordt op MSEA. Later werden ook nog enkele andere grondstalen meegenomen die beschreven zijn in tabel 3.6 en 3.7 op p54-57 in Materiaal en Methoden en tabel 4.5 en 4.6 op p81-83 in Resultaten en bespreking Optimalisatie van de PCR-reactie V. longisporum specifieke primers Als primerpaar werd VL1 en VL2 gebruikt. Door gebruik te maken van deze primers zou enkel bij V. longisporum een fragment van 340bp mogen worden geamplificeerd, andere Verticillium spp. zouden geen bandjes mogen vertonen. Volgens de literatuur zou een annealingstemperatuur van 48 C moeten worden gebruikt [38]. Om praktische redenen werden deze PCR-reacties uitgevoerd bij een annealingstemperatuur van 48,5 C. Een bandje werd bekomen bij het DNA van de zuivere cultuur van V. longisporum. Bij de andere zuivere culturen van V. tricorpus en V. dahliae werd geen bandje waargenomen wat wijst op de specificiteit van het primerpaar. Maar, wanneer de PCR herhaald werd, werd toch een bandje bekomen bij de zuivere cultuur van V. tricorpus. Dit resultaat wees erop dat de specificiteit van de primers te laag 74

75 Resultaten en bespreking was. In de grondstalen 120-PSKW (10x verdund) en 305-POVLT (10x en 100x verdund) werd een bandje waargenomen. Hierbij waren echter problemen met de herhaalbaarheid. In de onverdunde grondstalen werd geen bandje waargenomen. Huminezuren en zware metalen die zich bevinden in de grond kunnen interfereren met de PCR-reactie. Door het DNA-staal te verdunnen worden deze stoffen ook verdund en geeft dit een betere PCR-reactie [37]. De specificiteit kan o.a. worden verhoogd door de annealingstemperatuur te verhogen. De optimale annealingstemperatuur is theoretisch ±5 C lager dan de smelttemperatuur van de primers [11]. De optimalisatie kan gebeuren d.m.v. gradiënt PCR [39]. Hierbij worden verschillende annealingstemperaturen getest om na te gaan welke temperatuur specifiek is voor V. longisporum. Een gradiënt PCR werd uitgevoerd tussen 48,3 C en 58,8 C. 56,1 C leek hierbij de beste temperatuur. Bij herhaling van de PCR leek het primerpaar steeds specifiek te werken op deze temperatuur (Zie figuur 4.13). Bij de grondstalen 120-PSKW (10x verdund) en 305-POVLT (10x verdund) werden echter geen bandjes waargenomen bij deze temperaturen. Figuur Elektroforesegel van PCR-product met de primers van V. longisporum met een annealingstemperatuur van 56,1 C. (L): MassRuler DNA Ladder Mix, (1) DNA van zuivere cultuur van V. longisporum. (2) DNA van zuivere cultuur van V. tricorpus. (3) DNA van zuivere cultuur van V. dahliae. (4) DNA van grondstaal 120-PSKW. (5) DNA van grondstaal 120- PSKW (10x verdund). (6) DNA van grondstaal 120-PSKW (100x verdund). (7) DNA van grondstaal 305-POVLT (10x verdund). (8) DNA van grondstaal 305-POVLT (100x verdund). 75

76 Resultaten en bespreking Mogelijk was de hoeveelheid geamplificeerd DNA van V. longisporum te klein om te detecteren in de grondstalen. Daarom werd besloten een PCR op PCR uit te voeren om de opbrengst DNA te verhogen. Deze methode is beter dan het aantal cycli van de PCR te verhogen want dit heeft een negatief effect op de activiteit van het Taqpolymerase [11]. Een PCR op PCR werd uitgevoerd waarbij nog 2 grondstalen aan toegevoegd werden (11-PSKW 10x verdund en 16-PSKW 10x verdund). Een PCR werd uitgevoerd waarbij 1µL van het eerste PCR-product opnieuw PCR onderging (Zie figuur 4.14). Figuur Elektroforesegel van PCR-product (PCR op PCR) met V. longisporum primers met een annealingstemperatuur van 56,1 C. (L) MassRuler DNA Ladder Mix. (1) DNA van zuivere cultuur V. longisporum. (2) DNA van zuivere cultuur V. tricorpus. (3) DNA van zuivere cultuur V. dahliae. (4) DNA van grondstaal 120-PSKW (10x verdund). (5) DNA van grondstaal 120-PSKW (100x verdund). (6) DNA van grondstaal 305-POVLT (10x verdund). (7) DNA van grondstaal 11-PSKW (10x verdund). (8) DNA van grondstaal 16-PSKW (10x verdund). Grondstaal 305-POVLT (10x verdund) vertoonde hier een bandje wat in overeenstemming is met de MSEA tellingen (Zie tabel 4.4). Grondstaal 120-PSKW vertoonde echter geen bandje bij deze temperatuur, bij 48,5 C wel. Een mogelijke verklaring is het gebrek aan specificiteit van de PCR-reactie bij 48,5 C of degradatie van het DNA door herhaaldelijke ontdooiing. Grondstaal 11-PSKW en 16-PSKW vertoonden geen bandje. Deze grondstalen bevatten respectievelijk 6,6 en 12,1 microscleroten van V. longisporum/g grond wat een kleinere hoeveelheid is vergeleken met staal 305- POVLT. De kleine hoeveelheid grondstaal (0,25g) die onderworpen werd aan de 76

77 Resultaten en bespreking DNA-extractie kan een mogelijke verklaring zijn. De kans bestaat dat deze kleine hoeveelheid geen microscleroot bevat. Verder onderzoek is hier nog vereist V. tricorpus specifieke primers Het primerpaar dat hier gebruikt werd is VT1 en VT2. Volgens de literatuur zou een annealingstemperatuur van 60 C moeten worden gebruikt. De primers zouden een fragment van 337bp amplificeren [18]. Bij V. longisporum en V. dahliae zou geen bandje waargenomen mogen worden. Om na te gaan of de primers bij deze annealingstemperatuur specifiek werken, werd PCR uitgevoerd op een zuivere cultuur van V. tricorpus. Hierbij werd een duidelijk bandje waargenomen. Bij het DNA van de andere schimmelculturen werd nooit een bandje waargenomen. In grondstaal 305-POVLT (10x verdund) werd eveneens een bandje waargenomen. In grondstaal 120-PSKW werd geen bandje waargenomen wat een zeer goed resultaat was (Zie figuur 4.15). Maar ook bij deze bleek de herhaalbaarheid een probleem te zijn. Figuur Elektroforesegel van PCR-product met V. tricorpus primers met een annealingstemperatuur van 60 C. (L) MassRuler DNA Ladder Mix. (1) DNA van zuivere cultuur V. longisporum. (2) DNA van zuivere cultuur V. tricorpus. (3) DNA van zuivere cultuur V. dahliae. (4) DNA van grondstaal 120-PSKW. (5) DNA van grondstaal 120-PSKW (10x verdund). (6) DNA van grondstaal 305-POVLT. (7) DNA van grondstaal 305-POVLT (10x verdund). (8) DNA van grondstaal 305-POVLT (100x verdund). 77

78 Resultaten en bespreking Ook het DNA van grondstalen 16-PSKW en 3,8,9,12-POVLT werden eens meegenomen aan een verdunning 10x. Hierbij vertoonde 12-POVLT een fijn bandje. Dit was ook het enige grondstaal die een grote hoeveelheid microscleroten bevatte van V. tricorpus (40,7 microscleroten/g grond). De andere grondstalen 16-PSKW en 3, 8, 9- POVLT bevatten echter een kleine hoeveelheid microscleroten van V. tricorpus en hierdoor is de kans ook kleiner dat er een microscleroot in 0,25g grondstaal zit. Een PCR op PCR zou hier mogelijk nog betere resultaten geven. Maar aangezien de primers van V. tricorpus binden op de ITS-regio van het genoom zou een nested-pcr hier ook een mogelijkheid zijn. Bij een nested-pcr zou de ITS-regio eerst geamplificeerd worden. Bij een tweede PCR op het vorige PCR-product worden dan speciesspecifieke primers gehanteerd. Deze methode is specifieker dan PCR op PCR en verkleint de kans op contaminatie en misamplificatie V. dahliae specifieke primers Als V. dahliae primerpaar werd eerst gekozen voor VD1 en VD2. Volgens de literatuur zou een annealingstemperatuur van 37 C een bandje van 400bp leveren. In het artikel waaruit de primers genomen werden, was het de bedoeling om V. dahliae te kunnen opsporen in koolzaad. In het artikel werd echter niet bewezen dat het primerpaar specifiek was [19]. Bij de eerste PCR werd een bandje bij V. longisporum en V. dahliae bekomen met als annealingstemperatuur 38,5 C. Deze annealingstemperatuur ligt iets hoger of aangegeven in de literatuur omwille van praktische redenen. Er werd eenmaal een fijn bandje bekomen bij grondstaal 120-PSKW onverdund en 100x verdund. Herhaling van dit resultaat was hier echter ook niet mogelijk. Er werd dus gezien dat de primers niet specifiek reageren met V. dahliae. 38,5 C is ook een zeer lage annealingstemperatuur wat tot deze niet specifieke amplificatie kan leiden. Daarom werd besloten om de annealingstemperatuur te verhogen naar 54,4 C. Er werd enkel een bandje verkregen voor V. longisporum niet voor V. dahliae. Omdat werd gedacht dat het DNA misschien van slechte kwaliteit was en daarom geen amplificatie gaf, werd opnieuw een DNAextractie uitgevoerd op een zuivere V. dahliae cultuur. Voortaan werd dit DNA verder 78

79 Resultaten en bespreking gebruikt. Bij de volgende PCR s werd geen bandje meer bekomen bij V. dahliae, echter wel bij V. longisporum. Ook een gradiënt PCR (53,5 66,1 C) bood geen oplossing, V. longisporum werd geamplificeerd, V. dahliae niet. Omdat we bij de hogere temperaturen nooit een amplificatie verkregen met beide DNA-stalen afkomstig van de V. dahliae cultuur werd besloten de ITS-regio van de gebruikte DNA-stalen te sequeneren. Op deze manier zou men er zeker van zijn dat het DNA effectief van V. dahliae is. Hierbij werd eerst en vooral een PCR uitgevoerd met universele primers (ITS5 en ITS4) die de ITS-regio (ITS1-5,8S-ITS2) amplificeren (Zie figuur 4.16) [47]. Figuur Amplificatie ITS regio met ITS4 en ITS5 (600bp) van 2 verschillende DNAextracties (fractie 1 en fractie 2) van V. dahliae. Van links naar rechts: MassRuler DNA Ladder Mix, tweede DNA-extractie (11/3) fractie 1 V. dahliae, tweede DNA-extractie (11/3) fractie 2 V. dahliae, eerste DNA-extractie (20/02) fractie 1 V. dahliae, eerste DNA-extractie (20/02) fractie 2 V. dahliae [47]. Dit DNA werd opgezuiverd en de DNA-concentratie werd op punt gesteld zodat het DNA gesequeneerd kon worden door het VIB Zwijnaarde. Het DNA werd gesequeneerd in twee richtingen (forward en reverse). Uit deze forward en reverse sequentie werd een concensus sequentie verkregen met Bio edit [57]. De concensus sequentie werd vergeleken m.b.v. Blastn met de NCBI-databank [36]. Uit de resultaten bleek dat het DNA van de eerste extractie niet afkomstig was van V. dahliae. Er werd 100% homologie verkregen met Trichoderma hamatum (AM ). Het DNA van de tweede DNA-extractie vertoonde wel 100% homologie met V. dahliae (AF ). Dus er kon met zekerheid gezegd worden dat het DNA van de tweede DNA-extractie afkomstig was van V. dahliae, maar toch werd hier nog nergens een bandje verkregen. Vervolgens werd besloten om een andere primer te gebruiken. Li et al. (1999) gebruikte dezelfde forward primer maar een verschillende reverse primer (nl.: VDS2 5 79