UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE. Academiejaar

Transcriptie

1 UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE Academiejaar PROBIOTICA VOOR DE BEHANDELING VAN BOVIENE MASTITIS EN METRITIS door Lukas MICHIELS Promotoren: Prof. dr. Evelyne Meyer Prof. dr. Geert Opsomer Literatuurstudie in het kader van de masterproef 2016 Lukas Michiels

2 2016 Lukas Michiels

3 Universiteit Gent, haar werknemers of studenten bieden geen enkele garantie met betrekking tot de juistheid of volledigheid van de gegevens vervat in deze masterproef, noch dat de inhoud van deze masterproef geen inbreuk uitmaakt op of aanleiding kan geven tot inbreuken op de rechten van derden. Universiteit Gent, haar werknemers of studenten aanvaarden geen aansprakelijkheid of verantwoordelijkheid voor enig gebruik dat door iemand anders wordt gemaakt van de inhoud van de masterproef, noch voor enig vertrouwen dat wordt gesteld in een advies of informatie vervat in de masterproef Lukas Michiels

4 UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE Academiejaar PROBIOTICA VOOR DE BEHANDELING VAN BOVIENE MASTITIS EN METRITIS door Lukas MICHIELS Promotoren: Prof. dr. Evelyne Meyer Prof. dr. Geert Opsomer Literatuurstudie in het kader van de masterproef 2016 Lukas Michiels

5 VOORWOORD Het schrijven van deze literatuurstudie vergde bloed, zweet en tranen, maar zonder de hulp van enkele personen zou ik er moeilijk in geslaagd zijn dit werk tot een goed einde te brengen. Ten eerste wil ik Prof. dr. Evelyne Meyer en Prof. dr. Geert Opsomer bedanken voor hun uitstekende begeleiding en handige tips bij het schrijf- en opzoekwerk. Ten tweede wil ik Prof. dr. Mario Vaneechoutte danken voor het verstrekken van nuttige informatie omtrent probiotica. Als laatste wil ik mijn ouders en mijn vriendin loven voor hun steun en geduld zowel tijdens het schrijven van deze masterproef, als doorheen mijn volledige universitaire carrière Lukas Michiels

6 INHOUDSOPGAVE Samenvatting... 1 Inleiding Mastitis en metritis: een analyse Mastitis Indeling Pathogenen Economische impact Metritis Indeling Pathogenen Economische impact Microbioom van de uier en de uterus Methodologie Microbioom van de uier Flora van de melk Flora van de uierhuid Microbioom van de uterus Evolutie na kalving Flora van de uterus Flora van de vagina Probiotica Definitie Huidige situatie in bovien probioticagebruik Eigenschappen van probiotica Probioticagebruik bij mastitis Onderzoek naar potentiële micro-organismen Toepassing van probiotica Probioticagebruik bij metritis Onderzoek naar potentiële micro-organismen Toepassing van probiotica Toediening van probiotica Bespreking Referentielijst Lukas Michiels

7 SAMENVATTING Probiotica worden al veel gebruikt in de humane geneeskunde en in de veevoederindustrie. Voor de behandeling en preventie van de twee meest voorkomende aandoeningen in de rundveehouderij, met name mastitis en metritis, vormen zij echter nog een relatief nieuw gegeven. Pathogenen die aan de basis liggen van beide infectieziekten zijn vaak beschreven, de definities die erbij horen daarentegen zijn aan veel meer wijzigingen onderhevig, wat soms leidt tot verwarrende situaties in de literatuur. Bij het beschrijven van de microflora aanwezig in de melk, op de uierhuid en in de voortplantingstractus worden ook vaak eerder onbeschreven flora en discrepanties tussen verschillende studies teruggevonden. Er kan besloten worden dat het normale microbioom in deze organen nog lang niet volledig gekend is. Wat betreft probiotica ligt de aandacht voornamelijk bij de lactic acid bacteria (LAB) ofwel melkzuurproducerende bacteriën, die volgens de literatuur in beide organen goed gedijen. Hun effect is reeds bewezen in de humane geneeskunde, de vraag is of deze bacteriën ook in de diergeneeskunde als alternatief kunnen dienen voor antibiotica. Meer in vivo studies moeten in de toekomst duidelijkheid scheppen over het potentieel van deze uier- en vaginabewoners. Sleutelwoorden: Mastitis Metritis Microbioom Behandeling Probiotica Lukas Michiels

8 INLEIDING Mastitis (uierontsteking) en metritis (baarmoederontsteking) zijn zeer vaak voorkomende ziekten in de melkvee en vleesveesector (Seegers et al., 2003; Azawi et al., 2008). Ze bezorgen de veehouder heel wat kopzorgen, ondermeer door de antibioticabehandeling, waarna de melk absoluut apart moet gehouden worden voor een bepaalde periode. Niet alleen vormen deze infectieziekten een probleem voor de boer, ook op gebied van dierwelzijn dringen meer doeltreffende behandelingen zich op. De economische impact op de sector en op de rekening van de boer zijn groot, zo kunnen de kosten voor de behandeling, het productieverlies en het verhoogde risico op opruiming hoog oplopen (Seegers et al., 2003; Opsomer en de Kruif, 2009). Op het vlak van preventie is er nood aan efficiënte middelen, alsook voor de curatieve behandeling. Die bestaat dezer dagen vooral nog uit het toedienen van antibiotica. Helaas neemt de antibiotica resistentie voortdurend toe, wat resulteert in therapiefalen. Bovendien stijgt de druk op het antibioticagebruik in de veehouderij, onder andere op het gebruik van preventieve droogzetpreparaten. Er is dus vraag naar alternatieve behandelingen of preventieve middelen tegen mastitis en metritis (Haimerl en Heuwieser, 2014). Probiotica kunnen een oplossing bieden aan deze problemen (Nader- Macias et al., 2008). Het principe berust hierbij op het afremmen van de groei van pathogene micro-organismen door de toediening van goedaardige bacteriën. Allerlei mechanismen, die tot op heden weinig gekend zijn in de (dier)geneeskunde, zorgen hierbij voor een inhiberende werking op de ontwikkeling van de pathogenen. In de humane geneeskunde kent het gebruik van probiotica reeds een grote opmars (Borges et al., 2014). Voor de stimulatie van de gastro-intestinale flora zijn er al heel wat producten op de markt en ook voor vaginaal gebruik zijn er al preparaten beschikbaar. Het doel van deze masterproef is om de stand van zaken in het gebruik van probiotica voor de behandeling van mastitis en metritis bij melkvee weer te geven. Hierbij wordt er stilgestaan bij de infectieziekten zelf, maar ook bij het normale microbioom van de getroffen organen Lukas Michiels

9 1 MASTITIS EN METRITIS: EEN ANALYSE 1.1 MASTITIS Mastitis ontwikkelt zich meestal nadat een bacterie zich via het slotgat van de tepel in de melkafvoergangen en de cisternen van de uier kan manifesteren. Een kritiek punt hierbij is het moment na het melken waarop het slotgat van de tepel nog geopend is en de uier in contact komt met een gecontamineerde omgeving (bv. een bezoedeld ligbed). Ook het melkproces in se is een belangrijke infectiebron, in dit specifieke geval voor uiergebonden kiemen. Na de manifestatie van de kiemen vat de vermenigvuldiging aan en komen de virulentiefactoren tot uiting. Deze bacteriële groei resulteert in inflammatie en het afsterven van secretorisch melkklierweefsel. Door deze reactie van het lichaam stijgt het celgetal ( somatic cell count ) in de melk en kan ook de melkproductie verminderen (Bogni et al., 2011) Indeling Naargelang de ernst van de ontsteking kan mastitis ingedeeld worden in drie types. Welke vorm het dier ontwikkelt, hangt af van enerzijds de aard van de pathogenen en anderzijds het ras, de leeftijd, het lactatiestadium en de immuniteit van de melkkoe (Bogni et al., 2011). Deze drie types zijn: Subklinische mastitis Klinische mastitis Chronische mastitis De subklinische vorm is het moeilijkst te diagnosticeren omdat deze zich immers niet uit in klinische symptomen. Macroscopisch zijn er geen afwijkingen aan het uitzicht van de melk, enkel het celgetal is gestegen (De Vliegher et al., 2012). Er bestaat heel wat variatie in de cut-off waarde van het celgetal tussen verschillende studies wanneer het gaat over de diagnose van subklinische mastitis, hierbij wordt er vaak ook een onderscheid gemaakt tussen unipare en multipare dieren. Royster en Wagner (2015) beschouwen een koe als verdacht van subklinische mastitis indien het celgetal groter is dan cellen/ml. Normale melk wordt echter volgens Deb et al. (2013) pas als gezond beschouwd als het celgetal minder dan cellen/ml bedraagt. Een verhoogd celgetal wordt meermaals door veehouder en dierenarts gemist, waardoor ernstige verliezen in kwaliteit en kwantiteit van de melk dreigen, met eventueel financiële consequenties tot gevolg (Seegers et al., 2003). De klinische vorm uit zich wel met klinische symptomen, zoals een verhoogde spanning en gezwollen uitzicht van de uier met eventuele roodheid. Verder is de melk dikwijls vlokkerig, bloederig, waterig of etterig. Algemene symptomen worden waargenomen zoals koorts, anorexie of dehydratatie (Royster en Wagner, 2015). De chronische vorm is de meest uitzichtloze vorm en kan zich ontwikkelen uit elk van de voorgaande types. Het immuunsysteem slaagt er niet in de kiem te verwijderen en de infectie blijft persisteren. Een chronische inflammatie zorgt voor een bestendig verhoogd celgetal. Abcesvorming in de uier kan eveneens optreden. Vaak is vervroegde opruiming de enige oplossing (Bogni et al., 2011) Lukas Michiels

10 1.1.2 Pathogenen Meer dan 100 pathogenen bezitten een causaal verband met het ontstaan van mastitis en daarbij zijn bacteriën lang niet de enige boosdoeners (Bogni et al., 2011). In deze literatuurstudie zullen echter enkel de bacteriële agentia belicht worden. De oorzakelijke kiemen kunnen worden ingedeeld aan de hand van hun besmettingsroute en vervolgens naar hun klinisch belang (major en minor pathogenen)(tabel 1). De eerste groep bacteriën zijn de contagieuze of koe-gebonden pathogenen. Deze hebben als kenmerk dat ze zich in of op de uierhuid bevinden, zodat ze zich meestal rechtstreeks van koe tot koe verspreiden. Het melkproces en de hygiëne van de melker speelt hierin ook een belangrijke rol. In Tabel 1 staan de belangrijkste contagieuze pathogenen opgesomd. De voornaamste in deze lijst is Staphylococcus aureus (S. aureus), onder andere omdat deze kiem het laatste decennium een uitzonderlijk resistentiepatroon heeft ontwikkeld (Pyörälä, 2009). Deze kiem werd samen met Streptococcus agalactiae (S. agalactiae) volgens Royster en Wagner (2015) het meest gevonden in mastitis stalen in de laatste 20 jaar. Mycoplasma spp. worden nogal eens onderschat als potentiële oorzaak van mastitis, hoofdzakelijk doordat deze moeilijk in cultuur te detecteren zijn. De laatste jaren worden ze echter wel als opkomende mastitis pathogenen onderkend. Mycoplasma is tevens een luchtwegcontaminant en kan op die manier (via aërosol) de verspreiding van mastitis faciliteren (De Vliegher et al., 2012). De tweede groep bacteriën zijn de omgevingspathogenen. Het gamma aan mastitisverwekkers in deze groep is heel wat uitgebreider dan de contagieuze pathogenen. Vooreerst is Escherichia coli (E. coli) de frequentst voorkomende coliforme bacterie als oorzaak van mastitis. E. coli wordt het meest geïsoleerd uit de melk. Dat is niet vreemd want de verschillende serotypes van E.coli zijn zeer vaak maagdarmbewoners van het rund en worden dus massaal uitgescheiden met de faeces, wat op die manier makkelijk tot contaminatie van uier en melk leidt. Er moet echter onderscheid gemaakt worden tussen pathogene en niet-pathogene serotypes. Het zijn de pathogene serotypes die mastitis veroorzaken, meestal rond de partus en in de vroege lactatie met soms levensbedreigende algemene symptomen (Podstatzky et al., 2011; Bogni et al., 2011). Verder worden ook Streptococcus spp. (niet S. agalacticae) beschreven met als voornaamste kiemen S. dysgalactiae en S. uberis. Deze laatste ligt aan de basis van de meeste mastitis gevallen bij vaarzen met weidegang (De Vliegher et al., 2012). Andere niet te onderschatten omgevingsbacteriën zijn Klebsiella spp., Trueperella pyogenes (zomerwrang), Enterobacter spp. e.a.. Ten slotte zijn er nog verschillende andere minor pathogenen (Tabel 1). Een aparte groep is die van de Coagulase-negatieve Staphylokokken (CNS). Deze kiemen liggen aan de basis van mastitis rond de partus en dan vooral bij vaarzen (Bogni et al., 2011; De Vliegher et al., 2012). Net zoals S. aureus zijn deze gekend om relatief makkelijk multiresistentie op te bouwen (Pyörälä, 2009). Hun pathogeniciteit staat echter nog ter discussie: hoewel er onschadelijke species bekend zijn, bestaan er ook pathogene species die subklinische en milde klinische vormen van mastitis kunnen veroorzaken. Aan sommige species wordt zelfs een beschermende functie tegenover mastitis toegeschreven (De Vliegher et al., 2012). Van andere species is het minder duidelijk in Lukas Michiels

11 hoeverre zij tot de uiergebonden, dan wel tot de omgevingsgebonden kiemen, behoren. De indeling is dan ook niet zwart-wit en heel wat kiemen kunnen zowel op de uierhuid als in de omgeving worden teruggevonden (Bogni et al., 2011). Tabel 1. De meest voorkomende bacteriële agentia geassocieerd met mastitis bij het rund. * geclassificeerd als major pathogeen, ** geclassificeerd als minor pathogeen (naar Bogni et al., 2011). Contagieuze pathogenen Omgevingspathogenen Andere pathogenen Staphylococcus aureus* Escherichia coli* Coagulase-negatieve staphylococci (CNS)** Streptococcus agalactiae* Klebsiella spp.* Mycoplasma spp.* Corynebacterium spp. ** Citrobacter spp.* Serratia spp.* Enterobacter spp.* Proteus spp.* Streptococcus dysgalactiae* Streptococcus uberis * Streptococcus spp.* Enterococcus faecalis * Enterococcus faecium * Aerococcus spp. * Pseudomonas spp.* Bacillus spp.* Trueperella pyogenes * Nocardia spp.** Gisten spp. ** Prototheca spp.* Economische impact Mastitis is één van de belangrijkste infectieziekten voor de melkveesector wat betreft productieverliezen. Redenen hiervoor zijn niet ver te zoeken. Niet alleen de melkproductie, maar ook de kwaliteit van de melk (en dus ook de tankmelkkwaliteit) daalt. Per verdubbeling van het celgetal, zou de melkproductie met 0.5 kg afnemen en dit vanaf cellen/ml (Seegers et al., 2003). Indien mastitis niet onder controle wordt gehouden en het celgetal bepaalde grenzen blijft overstijgen, dreigt de melkveehouder sancties te krijgen of premies te mislopen, wat in aanzienlijke winstverliezen resulteert. Mastitis is zelden dodelijk voor een melkkoe maar draagt voor een groot deel bij tot het vroegtijdig opruimen ervan. Dit laatste kan oplopen van een 1,5 tot 5 maal grotere kans om opgeruimd te worden, afhankelijk van de ernst van het productieverlies en de instelling van de boer (Seegers et Lukas Michiels

12 al., 2003). Ook reeds bij vaarzen kan deze ziekte een groot probleem vormen. Een vaars die na afkalven een ontsteking van de uier oploopt, zal ook de rest van haar productieperiode een lagere melkproductie en een verhoogd celgetal hebben. Dit effect is voornamelijk te wijten aan de abrupte remming en destructie van het melkklierweefsel in volle ontwikkeling (De Vliegher et al., 2012). Verder zijn de bijkomende kosten van de behandeling niet te onderschatten. Vaak wordt subklinische mastitis niet behandeld omdat dit niet economisch rendabel is vanwege de kostelijke behandeling en de soms slechte resultaten (Pyörälä, 2009). De exacte verliezen die mastitis met zich meebrengt op een melkveebedrijf zijn moeilijk te berekenen. Bijkomend onderzoek hiernaar is nog vereist; Seegers et al. (2003) houdt het op een raming van 78 euro per koe per jaar. In 1961 werd de National Mastitis Council (NMC) opgericht om deze ziekte te monitoren en veehouders en dierenartsen te voorzien van heet van de naald informatie en nieuwigheden omtrent de bestrijding van mastitis. In Vlaanderen is het M-Team van de Universiteit Gent ook actief met het verstrekken van info rond de preventie en behandeling van mastitis ( 1.2 METRITIS De laatste decennia is de melkproductie van melkkoeien enorm gestegen door uitgebreide fokprogramma s. De optimalisatie van de melkproductie per koe ging gepaard met hogere winstmarges en ook het milieu werd meer gespaard. De keerzijde van de medaille is echter het feit dat door deze doorgedreven selectie de vruchtbaarheid sterk gedaald is, wat vooral gekenmerkt wordt door toegenomen problemen rond de partus zoals retentio secundinarum, metritis en witvuilen. De aanwezigheid van pathogene bacteriën in de uterus zorgt voor een verminderde secretie van luteïniserend hormoon (LH) en folliculaire groei, terwijl de gevormde etter het innestelen van het embryo sterk kan bemoeilijken (Sheldon et al., 2006). Hoewel men dacht dat runderen, veel minder dan paarden, metritis ontwikkelden als gevolg van bacteriële contaminatie tijdens en na de partus, blijken ze de laatste jaren hier toch meer en meer vatbaar voor te zijn. Metritis zorgt niet alleen voor een verlaagde vruchtbaarheid, maar ook de melkproductie en body condition score (BCS) verlaagt. Dit alles leidt tot vervroegde opruiming en economisch verlies (Giuliodori et al., 2013; Azawi, 2008). Deze vaststellingen waren een trigger om aan deze ziekte veel meer aandacht te besteden (Opsomer en de Kruif, 2009). Waarom hoogproductieve melkkoeien deze aandoening ontwikkelen, hangt sterk af van een aantal factoren. Eerst en vooral is de infectiedruk in de afkalfstal belangrijk, deze moet zo schoon mogelijk zijn. Immers, hoe minder bacteriën een melkkoe moet trotseren in het puerperium, hoe makkelijker ze deze ook zal overwinnen (Opsomer en de Kruif, 2009). Vervolgens zijn het verloop van de kalving, het afkomen van de nageboorte en de involutie van de baarmoeder belangrijke aandachtspunten (Giuliodori et al., 2013). Na een normale kalving bevat het endometrium scheurtjes en is er vocht en celdebris aanwezig in de uterus, een ideale kweekbodem voor bacteriën. Na een zware kalving is de schade in de uteruswand, de hoeveelheid vocht en celafval veel groter en is het niet onlogisch dat de Lukas Michiels

13 kans op bacteriële infectie dan ook een stuk groter is (Azawi, 2008). Het afkomen van de nageboorte en de involutie van de uterus houden hier rechtstreeks verband mee. Bij retentio secundinarum (ophouden van de nageboorte) is de hoeveelheid celdebris sterk vergroot en de involutie van de uterus verloopt vertraagd (bv. bij hypocalcemie). De restfractie in het uteruslumen zal niet snel of grondig genoeg worden uitgedreven, met een sterk verhoogde kans op het ontwikkelen van metritis. Ten slotte is de immuniteit van de melkkoe een doorslaggevende factor. Deze is typisch verlaagd in het puerperium. Dit wordt geïllustreerd in Figuur 1, waarin de activiteit van de neutrofielen om bacteriën af te doden rondom het moment van de partus is weergegeven. Het precieze mechanisme van deze immuniteitsdaling is niet echt geweten maar er zijn wel verschillende oorzaken aan toe te wijzen zoals de verminderde voedselopname, de hoge metabolisatie van vet en proteïnen en de verschillende veranderingen in de hormonenbalans. Ook een negatieve energiebalans blijkt bij te dragen aan de verminderde afweer van de melkkoe (Leblanc, 2008). Figuur 1. De activiteit van neutrofielen om bacteriën af te doden rond de partus (uit Opsomer en Kruif, 2009) Indeling Histopathologisch gezien is metritis afhankelijk van de diepte van de ontsteking. Endometritis beperkt zich tot het stratum compactum van het endometrium, bij metritis reikt de ontsteking dieper in het endometrium met zelfs aantasting van het klierweefsel en eventueel het myometrium. Echter, er is nood aan betere definities die vooral ook klinisch bruikbaar zijn (Leblanc, 2008; Azawi, 2008). Omdat er nog geen gouden standaard voor de diagnose van metritis bestaat en er ook weinig informatie beschikbaar is over de link tussen histopathologische en de klinische observaties, is het moeilijk om specifieke definities van de verschillende types van metritis vast te leggen (Sheldon et al., 2006). Daarom heeft men in het artikel van Sheldon et al. (2006) getracht duidelijke definities op te stellen die kunnen gebruikt worden door onderzoekers en dierenartsen in hun volgende studies. Op dit onderzoek van Sheldon et al is de indeling in deze literatuurstudie dan ook gebaseerd. Men onderscheidt 4 vormen: Puerperale klinische metritis Klinische endometritis Lukas Michiels

14 Subklinische endometritis Pyometra Men spreekt van puerperale klinische metritis bij een acute ontsteking van de uterus binnen de 21 dagen post partum met een piek in het aantal gevallen rond dag 10 (zie figuur 2). De basis van de klinische diagnose ligt op het voorkomen van abnormale uitvloeiing (deze kan roodbruin en waterig zijn en bovendien etter bevatten) en het vinden van een vergrote baarmoeder bij rectaal onderzoek (Sheldon et al., 2006; Armengol en Fraile, 2015). Deze vorm wordt verder opgesplitst in 3 verschillende graden afhankelijk van de ernst van de aandoening. Bij dieren die lijden aan een graad 1 metritis worden geen algemene symptomen waargenomen. Dieren die naast de afwijkende uitvloeiing en vergrote baarmoeder ook algemene symptomen zoals koorts (>39.5 C), melkproductie daling en algemene malaise vertonen, lijden aan graad 2 metritis. Bij dieren waarbij deze algemene symptomen dermate ernstig zijn dat de koe endotoxemische shock vertoont, spreekt men van een graad 3 metritis (Sheldon et al., 2009). Bij klinische endometritis is de vaginale uitvloei ofwel mucopurulent (50% etter en 50% mucus) meer dan 26 dagen na de partus ofwel purulent (>50% etter) 21 dagen of meer na de partus. Uiteraard dient deze uitvloei afkomstig te zijn van de uterus en niet van andere structuren zoals de urineblaas of vagina. Deze aandoening gaat in tegenstelling tot puerperale metritis niet gepaard met systemische ziekte (Sheldon et al., 2006; Leblanc, 2008). Een vergrote diameter van uterus en cervix kan worden vastgesteld maar is op zich alleen niet genoeg voor de diagnose (Leblanc, 2008; Dubuc et al., 2010). Met de diagnose van klinische endometritis moet opgelet worden, 90% van de afgekalfde koeien maakt immers een milde vorm door in de eerste weken na de kalving (Figuur 2). Indien de melkkoe deze lichte infectie of een puerperale metritis niet kan overwinnen en de pathogene bacteriën persisteren kan er zich een klinische vorm van endometritis ontwikkelen (Földi et al., 2006). Subklinische endometritis kan worden gediagnosticeerd door cytologie toe te passen op het endometrium van de uterus. Hierbij is er geen vaginale uitvloei waar te nemen en wordt dus een staal genomen van de uteriene inhoud met behulp van een cytobrush of een lavage, waarna men de proportie van het aantal neutrofielen bepaalt (Sheldon et al., 2006; Galvao, 2012). Hierover zijn er al verschillende studies gepubliceerd met verschillende resultaten. Als conclusie volgt Sheldon et al. (2006) de aanwezigheid van >18% neutrofielen dagen post partum of >10% neutrofielen dagen post partum als maatstaf voor de diagnose van subklinische endometritis. Als laatste type van metritis is er de pyometra. Bij deze aandoening bevindt er zich een accumulatie van purulent of mucopurelent materiaal in de uterus. Dit komt doordat deze massa niet of weinig kan afvloeien naar de buitenwereld omwille van een gesloten cervix. De cervix is gesloten omdat er reeds een ovulatie heeft plaats gevonden waarna er zich een progesteron producerend corpus luteum heeft gevormd met het sluiten van de cervix tot gevolg. De diagnose kan makkelijk gesteld worden door echografisch onderzoek via het rectum waarbij men een gespikkeld aspect (etter) kan zien in de uterus in aanwezigheid van een actief corpus luteum (Sheldon et al., 2006) Lukas Michiels

15 Figuur 2. De prevalentie van metritis en endometritis bij melkkoeien na kalving. Vierkantjes = koeien met bacteriën geïsoleerd uit de vagina op verschillende tijdstippen van verschillende studies, lichtblauw = aandeel koeien met metritis 2 weken na kalving, geel = aandeel koeien met endometritis 3-5 weken na kalving, Roze lijn = percentage dieren met inflammatie van het endometrium (histologisch) (uit Sheldon et al., 2008) Pathogenen De pathogene agentia blijven net zoals bij mastitis niet alleen beperkt tot bacteriën, ook virussen en schimmels kunnen aan de basis liggen van metritis (Sheldon et al., 2008). In de eerste twee weken na de partus worden pathogene bacteriën zoals Trueperella pyogenes (T. pyogenes), Escherichia coli, Pseudomonas spp., Streptococcus spp., Staphylococcus spp., Pasteurella multocida, Clostridium spp., Fusobacterium spp. en Bacteroides spp. al dan niet in combinatie het meest geïsoleerd uit de geïnfecteerde uterus. Zij worden dan ook als belangrijkste oorzaak beschreven van puerperale metritis (LeBlanc, 2008). E. coli en T. pyogenes zijn hiervan de meest voorkomende ziekteverwekkers. Stilstaande lochiën in de uterus zijn een ideale voedingsbodem voor coliformen zoals E. coli, deze kan dus makkelijk de uterus koloniseren na contaminatie. Na de kolonisatie volgt het tot uiting brengen van zijn endotoxines. Deze toxines stimuleren op hun beurt de ontwikkeling van T. pyogenes al of niet gecombineerd met Gram-negatieve anaërobe bacteriën zoals Fusobacterium necrophorum (F. necrophorum), Bacteroides spp. of Prevotella spp.. Deze anaëroben zorgen voor een gunstige omgeving voor de kolonisatie van T.pyogenes. De productie van toxines heeft ook een effect op de leukocyten in het bloed, zij worden namelijk massaal aangetrokken door chemotactische signalen en vervolgens geactiveerd met ontsteking van de baarmoederwand tot gevolg (Földi et al., 2008; Sheldon et al., 2004). De belangrijkste micro-organismen bij klinische endometritis zijn eveneens E. coli en T. pyogenes. Deze komen ofwel alleen voor ofwel in combinatie met andere Gram negatieve anaërobe bacteriën Lukas Michiels

16 zoals F. necrophorum, Bacteroides spp. en Prevotella spp. De invloed van E.coli op dit type neemt wel af naarmate de tijd na afkalven verstrijkt (Földi et al., 2008). Momenteel is er nog heel wat discussie in de literatuur omtrent het al dan niet betrokken zijn van bacteriën in de pathogenese van subklinische endometritis. Volgens een aantal auteurs blijkt er geen verband te zijn tussen het aantal neutrofielen gevonden na uteriene brush en het al dan niet aanwezig zijn van bacteriën in de uterus (Földi et al., 2008; Sheldon et al., 2004) Economische impact De economische impact van metritis is net zoals deze van mastitis, zeer groot. De verminderde vruchtbaarheid zorgt voor een langere tussenkalftijd omdat er gemiddeld meer pogingen nodig zijn om conceptie te bekomen. Tevens daalt de melkproductie en de BCS (zie hoger) van de koeien gaat achteruit wat op zich leidt tot sneller opruimen (Giuliodori et al., 2013). Omwille van de discrepantie in de karakterisatie van metritis en de heterogeniteit in de gebruikte diagnostische methoden voor metritis is de prevalentie moeilijk in te schatten en dat is net één van de doorslaggevende factoren om tot behandeling over te gaan (Azawi, 2008; Sheldon et al., 2006). Verder kost een metritisgeval typisch 150 tot 450 euro per zieke koe (Opsomer en de Kruif, 2009; Huzzey en von Keyserlingk, 2013). De diagnostiek en terminologie van metritis uniformiseren is dan ook van groot belang. Volgens Földi et al. (2006) is een kwaliteitsvol monitoringsysteem op elk bedrijf een noodzaak om tot een efficiëntere therapie te komen. 2 MICROBIOOM VAN DE UIER EN DE UTERUS 2.1 METHODOLOGIE Bij het onderzoeken van de bacteriële flora werd in het verleden vooral gebruik gemaakt van cultuur om de aanwezige bacteriën te identificeren. Verschillende media werden hiervoor getest, maar men slaagde er nooit in om alle species te cultiveren. Cultuurgebaseerd onderzoek zou zelfs de zeldzamere bacteriesoorten preferentieel aantonen en de meest prominente species vaak missen (Swartz et al., 2014). De laatste jaren werd er vooruitgang geboekt op het gebied van de bacteriologie. Steeds meer bacteriesoorten werden geïsoleerd en de diversiteit van de flora blijkt zeer groot te zijn. Vernieuwende methodes leidden tot betere staalnames en men slaagde er in om zonder cultuurmedia bacteriesoorten te identificeren aan de hand van nieuwe technieken zoals PCR en MALDI-TOF MS. Ook in de agars voor cultuur is er vooruitgang geboekt bij het ontwikkelen van geschikte media om moeilijker te kweken bacteriën alsnog te laten groeien. Een sterke boost aan nieuwe onderzoeken en informatie over de bacteriële populaties in zowel uier als uterus is daarvan het gevolg. Deze effent het pad naar het ontdekken van potentiële goedaardige bacteriën voor de preventie en eventuele behandeling van mastitis en metritis (Santos en Bicalho, 2012; Duarte et al., 2015) Lukas Michiels

17 2.2 MICROBIOOM VAN DE UIER Flora van de melk In koemelk komen verschillende genera bacteriën voor die via het slotgat van de tepel zijn binnengedrongen tijdens de lactatie of tijdens de droogstand. Volgens het cultuurgebaseerde onderzoek van Hagi et al. (2013) zijn de meest voorkomende genera in melk Lactococcus, Stenotrophomonas, Microbacterium, Chryseobacterium, Serratia en Pseudomonas (deze laatste vooral in de winter). Deze bacteriën worden vaak beschreven, maar over hun relatie met het melkklierweefsel is weinig bekend (Hagi et al., 2013). Het ontstaan van mastitis begint steeds met de vasthechting van pathogene bacteriën op de epitheelcellen van de uier (Bogni et al., 2011). Deze vasthechting werd vooral toegeschreven aan pathogene micro-organismen, maar ook goedaardige bacteriën zoals Lactococcus lactis (L. lactis) blijken hiertoe in staat. Studies hebben aangetoond dat L. lactis zelfs een protectieve functie kan hebben door zijn antimicrobiële activiteit (Hagi et al., 2013). Lactococcus behoort tot de groep van melkzuurbacteriën of lactic acid bacteria (LAB), een heterogene groep van bacteriën bestaande uit de genera: Lactobacillus, Lactococcus, Enterococcus, Streptococcus, Leuconostoc en Oenococcus (Bouchard et al., 2015b). Oikonomou et al. (2014) gebruikten een 16S rrna pyrosequencing techniek in plaats van cultuurmedium om de melk te onderzoeken en kwamen een andere bacteriële samenstelling uit dan voorheen beschreven (Hagi et al., 2013) (Figuur 3). Hierbij werd een onderverdeling gemaakt in 5 groepen koeien met een stijgend celgetal waarbij 1 en 5 respectievelijk het laagste en hoogste celgetal bevatten. De genera Faecalibacterium, ongeklassifieerde Lachnospiraceae, Propionibacterium en Aeribacillus werden in alle melkstalen aangetroffen, ongeacht hun celgetal. Propionibacterium acnes werd in de meeste van de gezonde melkstalen als grootste fractie geïsoleerd. De prevalentie van deze bacterie zou dus wel eens een negatieve correlatie kunnen hebben met het ontstaan van mastitis. Propionibacterium en Lachnospiraceae worden tevens vaak aangetroffen in gezonde humane melkstalen (Jost et al., 2013). Verder constateerden Oikonomou et al. (2014) dat deze rijke bacteriële flora in de melk zeer weinig inflammatie veroorzaakt in de uier, een observatie die suggereert dat ze als lichaamseigen of commensaal wordt herkend, zoals dat ook in de darm het geval is (Artis, 2008). Bij het vergelijken van de verschillende groepen met een gezond celgetal, bleek de tweede groep met een celgetal tussen de en cellen/ml een significant verschillend microbioom te bezitten dan de groepen met een hoger en een lager celgetal. In deze tweede groep was de prevalentie van Lactobacillus spp. ook hoger dan in de andere groepen. Lactobacillus spp. zou een antagonistisch effect hebben tegen onder andere E. coli (Bouchard et al., 2015a). Melk met een intermediair celgetal tussen en cellen/ml zou dus een betere resistentie tegen mastitis kunnen bezitten dan melk met een hoger of lager celgetal. Paenibacillus spp. zouden ook geassocieerd zijn met een lager celgetal, terwijl Sphingomonas spp. dan weer gelinkt werden aan klinische mastitis (Oikonomou et al., 2014) Lukas Michiels

18 Figuur 3. Via 16S rrna pyrosequencing geïdentificeerde bacteriën uit koemelkstalen. 1= gezond kwartier met celgetal <20.000, 2= gezond kwartier met celgetal tussen en , 3= gezond kwartier met celgetal >50.000, 4= subklinisch aangetast (cultuur positief) kwartier met celgetal > , 5= kwartier met klinische mastitis (cultuur negatief)) (uit Oikonomou et al., 2014) Flora van de uierhuid Sommige koeien zullen in hun leven zeer vaak geconfronteerd worden met mastitis, terwijl andere koeien veel minder vatbaar zijn en zelfs nooit mastitis zullen doormaken ( resistentie ). Eén van de factoren die kan bijdragen tot deze resistentie is de flora op de uierhuid, wat reeds een kwarteeuw geleden werd gesuggereerd (Woodward et al., 1987). In dit oudere onderzoek kon 25% van de isolaten uit de uierhuid van vaarzen de groei van pathogene micro-organismen remmen. Veel recenter onderzochten Braem et al. (2012) de diversiteit van de microflora op de huid bij gezonde, subklinische geïnfecteerde en klinisch geïnfecteerde koeien. De 4 gevonden phyla waren ten eerste de Firmicutes (42%) met genera zoals Aerococcus, Staphylococcus, Streptococcus en Lactococcus, ten tweede de Actinobacteria (32%) met Corynebacterium, Kocuria, Bifidobacterium, Propionibacterium en Streptomyces als belangrijkste genera, ten derde de Proteobacteria (25%) waarbij Acinetobacter, Psychrobacter en Enterobacter de belangrijkste genera zijn en ten slotte de Bacteroidetes (1%) met enkel Myroides als genus van belang. De grootste variëteit in genera werd gevonden bij nietgeïnfecteerde uiers. Aerococcus (met name A. viridans) was het meest geïsoleerde genus, gevolgd door Acinetobacter en Corynebacterium. Allen kunnen zij ziekte verwekken en vooral dan bij immuun-gecompromitteerde patiënten, maar worden toch vooral aanzien als normale huidbewoners (Braem et al., 2012). Verder Lukas Michiels

19 werden ook verschillende soorten staphylococcen geïdentificeerd, waaronder de pathogene S. aureus, maar ook zeer vaak CNS. De rol van CNS in het ontstaan van mastitis is zoals hoger vermeld onduidelijk en wordt dan ook intensief onderzocht. Zo zouden CNS het celgetal verhogen in de melk, maar toch een beschermend effect bieden tegen klinische mastitis indien ze zich op de uierhuid bevinden. Ook de melkproductie zou verhoogd zijn bij geïnfecteerde vaarzen (Piepers et al., 2010; Braem et al., 2012, 2014). De aanwezigheid van deze bacteriën werd onderzocht door Braem et al. (2013), waarbij CNS het meest frequent gevonden werden en meer bepaald verschillende soorten werden aangetroffen, waarvan sommige bekend zijn als pathogeen en andere een protectieve werking kunnen hebben (Braem et al., 2013). 2.3 MICROBIOOM VAN DE UTERUS Evolutie na kalving Tijdens de dracht wordt de inhoud van de uterus vooralsnog als steriel beschouwd, de vraag rond de aanwezigheid van bacteriën in de drachtige uterus rijst echter wel. Tijdens de partus met het openen van de cervix en het uitdrijven van de vrucht, al dan niet met behulp van menselijk handelen, komt er een einde aan deze steriliteit en wordt de uterus blootgesteld aan heel wat micro-organismen (Sheldon et al., 2004). Hierna blijft de uterus nog gedurende enkele weken vatbaar voor kiemontwikkeling door de aanwezigheid van achtergebleven celdebris. De bacteriële contaminatie in de postpartum periode is echter geen statisch proces. Contaminatie en afdoding van bacteriën wisselen elkaar voortdurend af (Sheldon et al., 2004; Carneiro et al., 2015). De hoogste concentratie aan bacteriële isolatie wordt meestal vastgesteld op twee weken na de partus. Dit kan verklaard worden door de vaginale flora die de uterus invadeert door de geopende cervix na de kalving. Deze bacteriën kunnen weinig pathogeen zijn maar zullen zeker wijzigingen aanbrengen in het uterusmilieu. Deze veranderingen in het milieu kunnen al dan niet gunstig zijn voor de ontwikkeling van andere pathogene micro-organismen. Nadien zal deze contaminatie gradueel afnemen tot een min of meer constant niveau op 7 weken post partum. Gedurende deze periode bestaat er een grote variatie in de hoeveelheid geïsoleerde bacteriën van de verschillende species (Hussain et al.,1990) Flora van de uterus De isolatie van de bacteriële contaminanten verschilt doorheen de vele studies. Om toch een summier overzicht te bekomen worden in Tabel 2 alle geïsoleerde bacteriën uit het onderzoek van Carneiro et al. (2015) opgelijst naargelang hun pathogeen vermogen. Deze lijst is helaas niet helemaal compleet. In de postpartum periode kunnen namelijk meer dan 200 verschillende species geïdentificeerd worden (Wagener et al., 2015). Hierbij zijn T. Pyogenes (vroeger Arcanobacterium Pyogenes (Tabel 2)), E. Coli, Prevotella spp., Staphylococcus spp. en Streptococcus spp. de meest geïsoleerde bacteriën. Men is er nog lang niet in geslaagd om al deze bacteriën te cultiveren, evenals blijven er wat betreft hun onderlinge interacties veel vraagtekens (Santos en Bicalho, 2012; Carneiro et al., 2015). Dat er Lukas Michiels

20 een associatie bestaat tussen de aanwezigheid van E. Coli en het ontstaan van T. Pyogenes infecties wordt in verschillende studies aangenomen (Dohmen et al., 2000). Dat er dus ook een synergisme tussen andere opportunistische (eventueel beschermende) bacteriën kan bestaan, lijkt dus niet onmogelijk. Zo wordt in het onderzoek van Wagener et al. (2015) gevonden dat de simultane isolatie van Bacillus spp. en Staphylococcus spp. meer voorkomt bij koeien zonder abnormale uteriene uitvloei dan bij koeien met abnormale uteriene uitvloei. Meer onderzoek naar deze verschillende interacties is echter nodig en ook virale-bacteriële synergismen moet men hierin betrekken. Het ontstaan van metritis wordt in deze studie (Wagener et al., 2015) aangenomen als een verandering in de volledige bacteriële populatie, dan wel als het uitgroeien van één bacteriesoort boven de rest. Deze hypothese wordt gestaafd doordat men bij koeien met een normale uitvloei een meer diverse microbiële populatie identificeert dan bij koeien met een abnormale uitvloei, wat op een dysbiose kan wijzen bij deze laatste gevallen. Een andere interessante bevinding is het aantonen van Lactococcus spp. (LAB) in alle gevallen buiten deze met een sterk afwijkende uitvloei. Dit zou kunnen wijzen op een mogelijks beschermend effect van deze bacteriesoort op de uterus, zoals dat in de humane geneeskunde al vaak is aangetoond (Wagener et al., 2015). Net zoals Lactococcus spp. worden in het onderzoek van Machado et al. (2012) ook Lactobacillus spp. (LAB) en Propionibacter spp. in verband gebracht met een beschermend effect op de gezondheid van de uterus. Coagulase-negatieve staphylococcen (CNS) en α-hemolytische streptococcen worden ook vaak geïsoleerd uit de uterusstalen, over deze opportunistische bacteriën is er nog heel wat discussie of ze een beschermend effect kunnen hebben of niet (Werner et al., 2012; Sens en Heuwieser, 2013). Hieruit kan besloten worden dat een correcte beschrijving van de normale uterusflora vooralsnog ontbreekt en het bepalen van specifieke goedaardige bacteriën allesbehalve makkelijk is. Omtrent het probioticagebruik voor de behandeling van metritis is er dus nog veel voorafgaand onderzoek vereist. Tabel 2. De geïsoleerde bacteriën uit het uterus lumen in het onderzoek van Carneiro et al. (2015) (naar Carneiro et al., 2015). Pathogenen Potentiële pathogenen Contaminanten Escherichia coli Acinetobacter spp. Aerococcus viridans Trueperella pyogenes Bacillus licheniformis Clostridium butyricum Prevotella spp. Enterococcus faecalis Clostridium perfringens Fusobacterium necrophorum Haemophilus somnus Corynebacterium spp. Fusobacterium nucleatum Mannheimia haemolytica Enterobacter aerogenes Pasteurella multocida Klebsiella pneumoniae Lukas Michiels

21 Pathogenen Potentiële pathogenen Contaminanten Peptostreptococcus spp. Staphylococcus aureus (coagulase +) Streptococcus uberis Bacteroidetes spp. Firmicutes spp. Fusobacteria spp. Micrococcus spp. Providencia rettgeri Providencia stuartii Proteus spp. Propionibacterium granulosa Staphylococcus spp. α- haemolytic Streptococci Streptococcus acidominimus Flora van de vagina Bij het openen van de cervix tijdens de partus kan de vaginale flora makkelijk doordringen tot in de uterus. De flora die dan ontstaat kan dus sterk beïnvloed worden door de bacteriën aanwezig in de vagina. Zelfs de systemische en lokale immuunrespons ter hoogte van het endometrium kan versterkt worden door de aanwezige flora in de vagina. Lactic acid bacteria (LAB) of melkzuurbacteriën spelen hierin een grote rol door de stimulatie van het endometrium. Een verhoogde secretie van siga ter hoogte van het uteruslumen is het resultaat, maar ook andere systemische effecten werden waargenomen (Deng et al., 2015). In het onderzoek van Swartz et al. (2014) waren de meest voorkomende bacteriespecies, waargenomen in de vaginale tractus, de volgende: Aggregatibacter spp., Streptobacillus spp., Phocoenobacter spp., Sediminicola spp., Sporobacter spp.. Deze resultaten contrasteren met eerdere cultuurgebaseerde onderzoeken waarin vooral Streptococcus spp. Staphylococcus spp., Bacillus spp. en Enterococcus spp. werden geïsoleerd. (Otero et al., 1999; Otero et al., 2000; Swartz et al., 2014). Verder werden in al deze studies ook Lactobacillus spp. (LAB) teruggevonden. De species aangetroffen in de oudere studies kwamen ook terug in het onderzoek van Swartz et al. (2014) maar hun prevalentie bleek vele malen lager te liggen dan bij cultuurgebaseerde onderzoeken. De bacteriën waargenomen in dit onderzoek blijken ook sterk overeen te komen met de bacteriën gevonden in de uterus bij het onderzoek van Machado et al. (2012). Dit bevestigt nogmaals de stelling dat de uterusflora sterk beïnvloed wordt door deze van de vagina. Het microbioom in de vagina is net zoals deze van de uterus een dynamisch proces. Zowel doorheen de groei van het rund, als tijdens de oestrus cyclus zijn er schommelingen in de vaginale flora. Wat betreft de dynamiek tijdens de groeifase van het rund lijken de meest prominente species relatief Lukas Michiels

22 stabiel te blijven, enkel het aandeel Lactobacillus spp. neemt significant toe naarmate het dier ouder wordt (Otero et al., 2000). Doorheen de oestrus cyclus van het rund schommelt het aantal bacteriën van twee groepen, namelijk Enterococcus spp. en Lactobacillus spp.. Tijdens de oestrus nemen de aantallen van beide groepen toe, om daarna in de dioestrus weer op hun laagste niveau te komen. Ook de variëteit in micro-organismen neemt toe tijdens de oestrus (Otero et al., 1999). 3 PROBIOTICA 3.1 DEFINITIE Omdat er in de laatste 15 jaar veel producten op de markt zijn verschenen met het opschrift probioticum was er nood aan een universele, specifieke definitie van de term probiotica voor humaan én diergeneeskundig gebruik (Hill et al., 2013). Deze definitie, opgesteld door een panel van het FAO/WHO, luidt als volgt: Levende organismen die wanneer toegediend in een adequate hoeveelheid een voordeel vormen voor de gastheer. (Reid, 2016). Hoewel ze nog onderhevig is aan kritiek en er ook nog vaak fouten tegen gemaakt worden, wordt zij tot op heden toch beschouwd als de enige juiste (Reid, 2016). Metabole bijproducten van bacteriën, dode micro-organismen of andere niet-leefbare microbiële producten worden volgens de definitie dus niet beschouwd als probiotica (Hill et al., 2013). 3.2 HUIDIGE SITUATIE IN BOVIEN PROBIOTICAGEBRUIK De laatste jaren is de interesse in probiotica ook in de rundveesector sterk toegenomen, ondermeer door de toenemende druk op het antibioticagebruik. Probiotica zijn dus een hot topic geworden in het wetenschappelijk onderzoek. In deze onderzoekstak concentreert men zich vooral op het bevorderen van de intestinale flora met het oog op het verhogen van melkproductie, groeisnelheid en verlagen van de voedingsconversie, alsook het verbeteren van de voedselveiligheid. Bacteriën (en gisten) gebruikt voor deze doelen worden omschreven als direct-fed microbials of DFM s. Men stuit bij het gebruik van deze organismen vaak op moeilijkheden door de reeds aanwezige pensflora die de werking van de probiotica kan ontkrachten (Callaway et al., 2012; Trevisi et al., 2014). Het onderzoek naar probioticagebruik voor de behandeling van mastitis en metritis staat nog in de schaduw van het onderzoek voor het verbeteren van de intestinale flora. Verder spitst men zich bij de ontwikkeling van deze preparaten meestal toe op de preventie eerder dan op de behandeling (Nader- Macias et al., 2008). De verscheidene micro-organismen worden hiertoe eerst geïsoleerd uit de betreffende organen nl. uier, resp. uterus en vagina. Daarna wordt hun effect op pathogene bacteriën en hun veiligheid ten opzichte van de gastheer nagegaan. Indien ze veilig worden bevonden, krijgen ze de GRAS (generally recognised as safe) -status toegewezen. De groep met de meeste aandacht op dit gebied zijn de LAB (Ametaj et al., 2014; Bouchard et al., 2015a, 2015b). Zoals eerder vermeld, vormen deze een heterogene groep van bacteriën bestaande uit de genera: Lactobacillus, Lactococcus, Enterococcus, Streptococcus, Leuconostoc en Oenococcus (Bouchard et al., 2015b) Lukas Michiels

23 3.3 EIGENSCHAPPEN VAN PROBIOTICA Bij het isoleren van de verschillende bacteriespecies uit hun natuurlijke boviene ecosysteem (in dit geval de uier, de uterus en vagina) worden ze getest op een aantal karakteristieken om te bepalen of ze geschikt zijn om gebruikt te worden als probioticum. Dit wordt steeds voorafgegaan door een genetische identificatie aan de hand van biochemische testen (Nader-Macias et al., 2008). Het eerste kenmerk waarop gelet wordt is de specificiteit die dit organisme bezit ten opzichte van het orgaan waarin het gedijt. Er wordt gekeken naar de mogelijkheid om de weefsels te koloniseren, dit is een belangrijke factor in het langer persisteren in de weefsels en zo dus een beter en langduriger effect te kunnen bewerkstelligen (Bouchard et al., 2015b). De manier waarop de bacterie zich vasthecht op het epitheel of in de mucus wordt ondermeer nagegaan door een tweetal oppervlakte karakteristieken op te sporen, namelijk het hydrofobe karakter en de autoaggregatie. Het hydrofobe karakter van de bacteriën wordt gebruikt om te voorspellen of een bacterie eerder zal adhereren aan de hydrofobe epitheliale cellen dan wel aan de hydrofiele mucus. De meerderheid van de geïdentificeerde bacteriën blijkt hydrofiel te zijn. De autoaggregatie dient dan weer om te bepalen of een soort in staat is om een beschermende biofilm te vormen in het betreffende orgaan. Aggregatieve soorten blijken hiertoe in staat te zijn, maar de meeste soorten blijken niet-aggregatief te zijn in vitro. Het is afwachten naar volgende studies of dit in vivo ook het geval is (Nader-Macias et al., 2008; Bouchard et al., 2015a, 2015b). Het tweede kenmerk waarop wordt gescreend is de antagonistische activiteit ten opzichte van pathogenen. De antagonistische werking wordt bepaald via verschillende parameters: waterstofperoxide-, melkzuur- en bacteriocineproductie, immunomodulatie, potentieel effect tegen specifieke pathogenen etc.. Uit onderzoek is gebleken dat soorten met de hoogste productie aan waterstofperoxide het vaakst voorkomen in een gezonde vaginale tractus. Bacteriocines zijn antimicrobiële peptides met een nauw spectrum, dat wordt bepaald door de gevoeligheid te testen van pathogene kiemen (Al-Qumber en Tagg, 2006; Nader- Macias et al., 2008; Bouchard et al., 2015b). De eigenschap van immunomodulatie is als een tweesnijdend zwaard: een licht pro-inflammatoire eigenschap kan er voor zorgen dat de lokale immuniteit toeneemt en het probioticum dus een goede preventieve werking kan hebben, anderzijds zijn meer anti-inflammatoire eigenschappen goed voor het verminderen van de ontstekingsreactie om zo bijvoorbeeld de melkproductie weer op gang te krijgen (Bouchard et al., 2015a). Het derde kenmerk dat de soort dient te bezitten is de hogervermelde GRAS-status. Dit wordt nagegaan nadat is gebleken dat de bacteriestam voordelige effecten genereert, ook wordt er gecontroleerd op ongewenste genetische eigenschappen zoals antimicrobiële resistentiegenen (Nader-Macias et al., 2008; Bouchard et al., 2015b). 3.4 PROBIOTICAGEBRUIK BIJ MASTITIS In de humane geneeskunde zijn er al een aantal probioticapreparaten beschikbaar ter preventie of behandeling van mastitis. Veel onderzoek is nog lopende naar andere LAB stammen die mogelijks Lukas Michiels

24 een beter therapeutisch effect zouden hebben. Deze geneesmiddelen kunnen door de vrouw oraal ingenomen worden, in tegenstelling tot de koe, waar de pensflora de opname en distributie van deze bacteriën in de weg staat. De kinetiek die deze bacteriën na orale inname kennen om in de borstmelk terecht te komen is echter nog niet gekend (Arroyo et al., 2010). Bij de koe dienen de preparaten voornamelijk lokaal ingebracht te worden via een intramammaire canule (Klostermann et al., 2008; Frola et al., 2012). Wetenschappelijk onderzoek naar boviene probiotica is vooral beperkt tot in vitro testen, het aantal in vivo onderzoeken is tot nu toe schaars. In dit onderdeel worden interessante bacteriesoorten besproken die in de toekomst zouden kunnen aangewend worden als probioticum Onderzoek naar potentiële micro-organismen Melkzuurbacteriën of LAB vormen het onderwerp van de meeste onderzoeken naar probiotica, deze komen in lage aantallen voor in zowel gezonde als geïnfecteerde kwartieren (Oikonomou et al., 2014). Enkele onderzoeken isoleerden aan de hand van in vitro testen bepaalde bacteriespecies die goede kandidaten zijn als probioticum, deze zijn weergegeven in Tabel 3 (Espeche et al., 2009, 2012; Bouchard et al., 2015a). In het onderzoek van Espeche et al. (2009) werden oppervlakte karakteristieken en antagonistische eigenschappen nagegaan bij een honderdtal bacterie-isolaten, daaruit werden vijf stammen verkozen als potentieel probioticum (Tabel 3). De meeste van de 102 isolaten vertoonden een laag hydrofoob karakter, alsook een lage autoaggregatie. Soorten met sterk hydrofobe eigenschappen werden in deze studie meer geassocieerd met een gezond kwartier van de uier, dus de nadruk voor de selectie van sterk hydrofobe kiemen woog daarom meer door. Verder waren de karakteristieken nodig voor een potentieel probioticum: een pathogeen inhiberende werking op de groeiplaat, hoge autoaggregatie en een gezond kwartier waaruit de bacterie werd geïsoleerd. Espeche et al. (2012) onderzochten met dezelfde criteria als het voorgaande onderzoek melkstalen van gezonde en geïnfecteerde kwartieren. Uit 117 isolaten werden 4 bacteriespecies geselecteerd en zijn weergegeven in Tabel 3. De resultaten waren vergelijkbaar met deze van het vorige onderzoek. De meeste bacteriën vertoonden een laag hydrofoob karakter en een lage autoaggregatie. De bacteriën die werden aangetroffen zijn echter taxonomisch verschillend. Dit is waarschijnlijk te wijten aan de geografische spreiding van de onderzoeken. De studie van Espeche et al. (2009) gebeurde in Noord-Argentinië, terwijl het onderzoek van Espeche et al. (2012) in Zuid-Argentinië plaatsvond. In een recente studie van Bouchard et al. (2015a) werden stalen genomen van het tepelkanaal en vervolgens isolaten van de genera Lactobacillus en Lactococcus onderzocht op hun eigenschappen. Er werd gecontroleerd op hun capaciteit voor groei-inhibitie van S. aureus, E. coli en S. uberis. Verder werden de oppervlakte karakteristieken nagegaan en hun capaciteit tot vasthechten op uier epitheelcellen. Vervolgens werden de eigenschappen om het immuunsysteem te stimuleren geschat door het pro-inflammatoire cytokine IL-8 te meten. Als laatste werden hun genen gescreend op resistentiegenen tegen antibiotica. Bij de vergelijking van de verschillende isolaten werd een referentie species Lactobacillus casei BL 23 gebruikt. Deze bacterie werd als een uitstekende soort gekarakteriseerd, omwille van zijn eigenschap om S. aureus adhesie en internalisatie te voorkomen in Lukas Michiels