- PDF Free Download

Transcriptie

1 SAMENVATTING

2

3 Coeliakie is binnen de Westerse samenleving een veelvoorkomende voedingsintolerantie en heeft een prevalentie van ongeveer 1%. In de vroege kindertijd, wanneer een overgang wordt gemaakt naar glutenbevattend voedsel (m.n. tarwegerelateerde producten), manifesteert de ziekte zich middels vette diarree, buikkrampen, en een opgezette buik. In haast alle gevallen verdwijnen deze klachten als de patiënten overgaan op een glutenvrij dieet. Echter, in moderne samenlevingen die gekenmerkt worden door een hoge standaard van pediatrische zorg, is er een toenemende groei waarneembaar van patiënten die coeliakie vertonen als adolescent en volwassene. In deze leeftijdsgroepen vertonen coeliakiepatiënten minder specifieke klinische verschijnselen zoals oververmoeidheid, bloedarmoede, botontkalking, groeiachterstand, dermatitis herpetiformis (coeliakie van de huid) en mogelijk ook voortplantingsproblemen. Ongeacht de klinische presentatie van coeliakie, zij is het gevolg van een door gluten veroorzaakte ontsteking van de dunne darm. Deze ontsteking leidt tot de kenmerkende veranderingen in het slijmvlies (mucosa) van de dunne darm: infiltratie met lymfocyten in het epitheel en de dieper gelegen lamina propria; vergroting van de tussen de darmvlokken (villi) gelegen crypten (crypt hyperplasie); en het verlies van de darmvlokken (villeuze atrofie). Zo krijgt de darm het uiterlijk van een gladde darm. Deze ontsteking veroorzaakt ook een verhoogde doorlaatbaarheid van de darmwand voor zouten en suikermoleculen (de zgn. lekke darm ). Het verlies aan darmvlokken heeft een dramatische afname van het opnameoppervlakte tot gevolg en leidt tot voedingdeficiëntie in onbehandelde patiënten, resulterend in een gevarieerd beeld van chronische gezondheidsklachten. Coeliakie is een multifactoriële ziekte, wat betekent dat het wordt veroorzaakt door een interactie van omgevingsfactoren (bijv. gluten; borstvoeding; infecties) and erfelijke factoren (risicogenen). De genetisch bedrage aan coeliakie komt duidelijk aan het licht door het verhoogde herhalingsrisico bij nakomelingen waarvan er één is aangedaan, en door het vergelijken van het risico bij eeneiige en twee-eiige tweelingen. Ook patiënten met een auto-immuunziekte hebben een verhoogde kans om coeliakie te ontwikkelen, wat duidt op gedeelde risicogenen en veroorzakende mechanismen. De belangrijkste risicofactoren om coeliakie te ontwikkelen zijn de genen gelegen binnen het MHC-complex op chromosoom 6p21.3 die coderen voor de heterodimeren HLA-DQ2 en HLA-DQ8. De aanwezigheid van de MHCgenen die coderen voor deze HLA moleculen dragen slechts voor 40% bij aan het totale genetische risico. De aanwezigheid van deze genvarianten is noodzakelijk, maar niet afdoende om coeliakie te ontwikkelen. Coeliakie is een complexe genetische aandoening, wat betekent dat meerdere genen, elke met een bescheiden risicobijdrage, betrokken zijn bij het ontstaan van de ziekte. De identiteit van deze genen, hun totale aantal, en de combinatie waarin zij voorkomen is voor het grootste deel nog een raadsel. In dit proefschrift hebben we gebruik gemaakt van 197

4 een combinatie van genetische en genexpressie methoden om genen en moleculaire paden te identificeren die bijdragen aan de oorzaak en de pathologie van coeliakie. De hoofdstukken 1 en 2 verschaffen meer achtergrondinformatie over coeliakie in het algmeeen en verder een overzicht van de diverse methoden voor genetisch onderzoek die eerder zijn toegepast. Verder wordt het vaststellen van genexpressieprofielen besproken als methode om inzicht te verkrijgen in de pathologie. Middels de identificatie van door de ziekte beïnvloede moleculaire paden kan dit een bijdrage leveren aan genetische studies. Nadruk wordt gelegd op de integratie van genetica en genomics voor de identificatie van kandidaatgenen en gennetwerken die betrokken zijn bij de pathogenese. In sectie II worden high-throughput technologieën toegepast voor het bestuderen van genexpressie in de mucosa van de duodenum (twaalfvingerige darm) in coeliakiepatiënten. In hoofdstuk 3 hebben we het effect onderzocht dat weefselheterogeniteit mogelijk zou hebben op het vaststellen van genexpressie. Waargenomen werd dat de mate van ontsteking en de differentiatiegraad van de mucosa (weergegeven door de expressie van IFNG, respectievelijk TM4SF4) omgekeerd evenredig waren en afhankelijk van de mate van weefselveranderingen in de mucosa. Opmerkelijk genoeg was de variatie in genexpressie tussen afzonderlijke monsters van dezelfde persoon min of meer onafhankelijk van de variatie in weefselstructuur van dezelfde monsters. Deze variatie in genexpressie was ook aanwezig, en in de zelfde mate, in controle monsters. Dus, variaties in genexpressie zijn aanwezig ongeacht het pathologisch stadium van de darm. Dit heeft geleid tot het poneren van een model waarin een mozaïek patroon van genexpressie in de duodenum kan resulteren in weefselheterogeniteit o.i.v. veranderingen in de ontstekingsgraad. Hoofstukken 4 en 5 beschrijven het gebruik van microarrays* voor de bestudering van genoomwijde genexpressie in de duodenum van coeliakiepatiënten. De twee studies verschilden in het type microarray (cdna of oligonucleotiden) en het soort patiëntenmonsters (patiënt-controle of herstelreeks) dat werd gebruikt. De twee groepen van differentieel tot expressie komende genen was nauwelijks overlappend, hoewel de biologische processen die ze vertegenwoordigden wel vergelijkbaar waren. De veranderingen geïnduceerd door coeliakie wijzen op een verhoogde celdeling in de mucosa die gepaard gaat met een onvolledige ontwikkeling van de darmcellen (enterocyten). Dit ontwikkelingsdefect verstoort m.n. de opname en verwerking van vetten, sterolen, suikers, eiwit(fragmenten), en ijzer. De resulterende deficiënties dragen mogelijk bij aan het gevarieerde klinische beeld van coeliakie. Ook werd aantasting van het ontgiftingssysteem waargenomen dat reeds eerder was beschreven voor dikke 198

5 darmontstekingen (IBD). Mogelijk wordt IBD net als coeliakie gekenmerkt door een defect in de ontwikkeling van darmcellen. In sectie III bespreken we de analyse van moleculaire paden bij de uitvoering van genetische (hoofdstuk 6) en genexpressie (hoofdstuk 7) studies. Hierbij richtten we ons op het tight junction gennetwerk, dit mede gebaseerd op de verhoogde darmpermeabiliteit in coeliakiepatiënten en het eerder geïdentificeerde risicogen MYO9B. Het expressiepatroon van genen uit de claudin-familie bleek geconserveerd te zijn gebleven gedurende minstens 75 miljoen jaren van evolutie. Drie paren van claudin-genen vertoonden een synchrone regulatie. Patiënten lieten dynamische patronen van claudin genexpressie zien met vaak opmerkelijk afwijkende waarden. Met name genen betrokken bij signaaloverdracht en regulering van het celskelet vertoonden de tendens tot verandering in genexpressie. Patiënten gaven ook een opmerkelijke verhoging in expressie van het groeifactorgen EGF te zien. Hetzelfde gennetwerk werd ook onderzocht voor genetische associatie waarbij gebruik gemaakt werd van varianten van enkelvoudige nucleotiden (SNPs) en informatie over de linkage disequilibrium structuur van het genoom afkomstig van het International HapMap Consortium. Twee tight junction genen werden geïdentificeerd die geassocieerd bleken met coeliakie, en in mindere mate ook met dikke darmontsteking (IBD). Mogelijk delen beide darmaandoeningen, coeliakie en IBD, een genetisch defect in de darmbarrière. De adaptieve respons van het immuunsysteem in coeliakiepatiënten, opgeroepen door gluten, wordt gekarakteriseerd door een T helpercel type 1 activatie waarbij interferon-gamma een cruciale rol speelt. In sectie IV waar we kandidaatgenen onderzoeken met betrekking tot immuniteit, beschrijven we de genetica en genexpressie van IFNG. In hoofdstuk 8 laten we zien dat de mate van weefselverandering in de mucosa gecorreleerd is met het niveau van IFNG genexpressie. Een studie uitgevoerd met de CA-repeat uit het eerste intron van het IFNG gen (een veelgebruikte merker), vertoonde geen genetische associatie binnen onze Nederlandse patiëntengroep. In hoofdstuk 9 werd het IFNG gen weer getest, maar nu met SNP merkers, en werd een zwakke genetische associatie aangetoond met coeliakie binnen de Nederlandse bevolking. Tot slot hebben we ook een genetische en genexpressiestudie uitgevoerd naar vier leden uit de familie van SPINK (serine protease remmers van het Kazal type) genen. SPINK-genen zijn betrokken bij bescherming van weefsels en inperking van bacteriële groei, en kunnen worden beschouwd als onderdeel van de aangeboren immuniteit. Drie van deze vier SPINK genen liggen binnen twee kandidaatgebieden voor coeliakie (chromosomen 5q32 en 9p21-13), wat hun tot aantrekkelijke positionele en functionele kandidaatgenen maakte. Echter, geen van deze SPINK-genen bleek genetisch geassocieerd met coeliakie binnen de Nederlandse bevolking. 199

6 Ter afsluiting wordt in de Discussie een evaluatie gegeven van onze onderzoeksbenadering met interpretaties van de behaalde resultaten in de context van andere onderzoeken. Deze worden dan verwerkt in modellen m.b.t. de mogelijke oorzaak en het verloop van de ziekte coeliakie. *) microscopisch kleine druppeltjes met het DNA van meer dan afzonderlijke genen, aangebracht op vlakke glaasjes en geordend in een rasterpatroon) 200