UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE

Transcriptie

1 UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE Academiejaar Het effect van prebiotica en probiotica op obesitas bij honden en de darm microbiota door Charlyne Polderman Promotoren: Daisy Liu Prof. Myriam Hesta Literatuurstudie in het kader van de Masterproef 2015 Charlyne Polderman

2

3 Universiteit Gent, haar werknemers of studenten bieden geen enkele garantie met betrekking tot de juistheid of volledigheid van de gegevens vervat in deze masterproef, noch dat de inhoud van deze masterproef geen inbreuk uitmaakt op of aanleiding kan geven tot inbreuken op de rechten van derden. Universiteit Gent, haar werknemers of studenten aanvaarden geen aansprakelijkheid of verantwoordelijkheid voor enig gebruik dat door iemand anders wordt gemaakt van de inhoud van de masterproef, noch voor enig vertrouwen dat wordt gesteld in een advies of informatie vervat in de masterproef.

4 UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE Academiejaar Het effect van prebiotica en probiotica op obesitas bij honden en de darm microbiota door Charlyne Polderman Promotoren: Daisy Liu Prof. Myriam Hesta Literatuurstudie in het kader van de Masterproef 2015 Charlyne Polderman

5 VOORWOORD Voor het tot stand komen van deze literatuurstudie, in het kader van de Masterproef deel I, zou ik graag mijn promotoren professor Hesta en mevrouw Liu willen bedanken voor hun goede begeleiding. Met vragen of problemen kon ik altijd terecht en door hun snelle communicatie kon ik ook weer vlot verder met het schrijven van deze literatuurstudie. Het schrijven van deze literatuurstudie was een zeer interessant en leuk leerproces. Verder zou ik graag mijn moeder willen bedanken voor het doorlezen en het controleren van dit verslag.

6 INHOUDSOPGAVE: SAMENVATTING... 1 INLEIDING... 2 LITERATUURSTUDIE OBESITAS: DEFINITIE, PREVALENTIE EN RISICOFACTOREN PROBIOTICA EN PREBIOTICA PROBIOTICA PREBIOTICA DE MICROBIOTA VAN DE DARM DE NORMALE MICROBIOTA VAN DE DARM HET EFFECT VAN PRO- EN PREBIOTICA OP DE DARM MICROBIOTA VAN GEZONDE HONDEN OBESITAS EN DE DARM MICROBIOTA HET EFFECT VAN PRO- EN PREBIOTICA OP OBESITAS BESPREKING REFERENTIELIJST... 17

7 SAMENVATTING Obesitas is een steeds vaker voorkomend probleem bij honden. Al vele jaren bestaan er behandelingen voor obesitas, zoals diëten, maar toch zijn er nog steeds obese honden. Vandaar dat er veel onderzoek is gedaan naar andere mogelijke oplossingen voor het probleem of naar hulpmiddelen die de bestrijding van obesitas vergemakkelijken. Onder andere zijn pre- en probiotica onderzocht die mogelijks een gunstig effect kunnen hebben op obesitas bij honden. In onderzoeken bij obese honden, maar ook bij andere dieren en mensen, werd gezien dat er een verandering is van de microbiota van de darm, in vergelijking met slanke dieren en mensen. Omdat pre- en probiotica een effect hebben op de samenstelling van de microbiota van de darm, zouden pre- en probiotica kunnen bijdragen in de behandeling van obesitas. Pre- en probiotica kunnen bij obese dieren en mensen de microbiota veranderen, waarbij de samenstelling van bacteriën in de darm meer gaat lijken op deze van slanke dieren. Bij muizen en mensen zijn er al anti-obesitas effecten van pre- en probiotica waargenomen. Bij honden is dit een nog niet veel onderzocht onderwerp, vandaar dat het echte effect van pre- en probiotica op obesitas en de microbiota van de darm nog niet gekend is. In de toekomst zal er meer onderzoek gedaan moeten worden naar de gunstige effecten van pre- en probiotica op de microbiota van de darm bij obese honden en op obesitas zelf. Sleutelwoorden: Hond - Microbiota - Obesitas - Prebiotica - Probiotica. 1

8 INLEIDING Obesitas komt steeds meer voor bij mensen, maar ook bij honden, zoals in het Verenigd Koninkrijk waar 15% van de honden die waren onderzocht obees was (Holmes et al., 2007). Het ontstaat door een energieopname die relatief hoger is dan het energieverlies van een individu. Obesitas wordt in verband gebracht met hormonale en metabole veranderingen in het lichaam van de hond. Door deze veranderingen kan obesitas onder andere glucose intolerantie, diabetes mellitus, hypertensie, osteoartritis, dystocie en een verhoogd anesthesie en chirurgie risico met zich mee dragen (Kealy et al., 2000; German, 2006; Montaya et al., 2006). Obesitas is een probleem dat al langere tijd bij honden bestaat, en waarvoor ook al behandelingen gekend zijn. Een combinatie van een gezond dieet en voldoende beweging is het meest belangrijke in de behandeling. Alhoewel deze behandelingen bestaan, zijn er nog steeds veel honden met obesitas, en daarom wordt er nog altijd gezocht naar andere behandelingsmogelijkheden. Er wordt onder andere onderzoek gedaan bij mensen, muizen en ratten naar het gebruik van pre- en probiotica in de behandeling van obesitas (Genta et al., 2009; Kadooka et al., 2010). Helaas is er bij de hond hiernaar tot op heden nog geen onderzoek naar gedaan. Waarom er wordt gedacht aan pre- en probiotica als mogelijke behandeling van obesitas is namelijk het volgende: bij het ontstaan van obesitas zouden de microbiota van de darm ook een rol spelen. De darm microbiota zouden namelijk de vet opslag van de gastheer kunnen reguleren (Bäckhed et al., 2004). Daar de samenstelling van microbiota in de darm kan worden beïnvloed door pre- en probiotica, zou de toediening van pre- en probiotica aan obese honden een bijdrage kunnen leveren bij de behandeling van obesitas. Het is daarom belangrijk om te weten wat het effect is van deze pre- en probiotica op de samenstelling van de microbiota van de darm bij obese honden en daarmee als gevolg het effect op de dieren met obesitas. Vandaar dat deze literatuurstudie tot stand is gekomen. Allereerst zal er gekeken moet worden naar wat pre- en probiotica zijn en naar welke al onderzoek is gebeurd, en wat voor effect ze hebben op de normale microbiota van de darm. Daarnaast wordt het effect van obesitas op de microbiota ook besproken. 2

9 LITERATUURSTUDIE 1. OBESITAS: DEFINITIE, PREVALENTIE EN RISICOFACTOREN Obesitas wordt gekenmerkt door een overmaat aan lichaamsvet (Burkholder, 2000). De oorzaak is een onevenwicht tussen energieopname en verbruik. Het bepalen van obesitas bij honden kan op verschillende manieren worden gedaan. Ten eerste kan het lichaamsgewicht gebruikt worden. Een hond wordt als obees beschouwd, wanneer zijn lichaamsgewicht op zijn minst 20% hoger is dan zijn optimale gewicht (Simpson et al., 1993; Laflamme, 2001). Een andere methode om overgewicht en obesitas te bepalen is het lichaamsconditie score systeem (BCS). Bij het BCS wordt met behulp van inspectie, lichamelijk onderzoek en palpatie van de ribben, een abdominale plooi, de taille en de dorsale spinaaluitsteeksels ter hoogte van de staartbasis de hond gecategoriseerd op basis van een negen punten score systeem, waarbij een hond overgewicht heeft vanaf score 6 en obees is vanaf score 8 (Laflamme, 1997; Burkholder en Toll, 2000). Er kan ook gebruik worden gemaakt van een scoresysteem van 1 tot 5 (Edney en Smith, 1986), waarbij een score van 4 aangeeft dat de hond overgewicht heeft en score 5 obesitas (Lund et al., 1999). Het 9 scoresysteem, is gevalideerd met behulp van dual-energy X-ray absorptiometry (DEXA) bij honden (Laflamme et al., 1994). Obesitas komt steeds meer voor bij honden (Corbee, 2013). Er zijn verschillende studies wereldwijd uitgevoerd voor het bepalen van de prevalentie van obesitas en overgewicht bij honden (Tabel 1). Tabel 1. Prevalentie van obesitas bij de hond Locatie van de studie Prevalentie van obesitas(%) Referentie Australië 25-41,1 Robertson, 2003; McGreevy et al., 2005 Beijing (China) 44 Mao et al., 2013 Frankrijk 5 Colliard et al., 2006 Verenigd Koninkrijk 15 Holmes et al., 2007 Verenigde Staten 5,1 Lund et al., 2006 Verschillende risicofactoren voor het ontwikkelen van obesitas, zoals sterilisatie of castratie, leeftijd, genetica of ras, geslacht, bepaalde endocriene ziekten, bepaalde virussen en ook bepaalde eigenschappen van de eigenaar van de hond werden al vermeld. Sterilisatie of castratie komt als een veel genoemde risico factor naar voren (Edney en Smith, 1986; Sloth, 1992; McGreevy et al., 2005; Colliard et al., 2006; Courcier et al., 2010). Uit verschillende studies bleek dat bij honden van middelbare leeftijd de prevalentie van obesitas het hoogst is (Robertson, 2003; McGreevy et al., 2005; Colliard et al., 2006), echter vanaf de leeftijd van 10 jaar neemt de prevalentie van obesitas af (McGreevy et al., 2005; Lund et al., 2006). Ook genetica wordt als een mogelijke oorzaak is van obesitas genoemd (Burkholder et al., 2000). Een aantal studies geeft hier ook een indicatie voor, waarbij de volgende rassen als risicofactor naar voren komen, namelijk de Labrador, Golden Retriever, Beagle, teckel, Rottweiler, Cocker Spaniël, Shetland 3

10 Sheepdog, Dalmatiër en Chow Chow (Edney en Smith, 1986; Kronfeld et al., 1991; Colliard et al., 2006; Lund et al., 2006; Mao et al., 2013). Kruisingen van honden bleken wel een hoger risico te hebben op obesitas (McGreevy et al., 2005; Courcier et al., 2010). Vrouwelijke honden zouden een hoger risico kunnen hebben op obesitas volgens sommigen (Colliard et al., 2006; Holmes et al., 2007; Mao et al., 2013), echter andere spreken dit weer tegen (Robertson, 2003; McGreevy et al., 2005; Lund et al., 2006; Bland et al., 2009; Courcier et al., 2010). Bij hypothyreoïde honden kwam volgens onderzoek in 41% tot 44% van de gevallen obesitas voor (Panciera, 1994; Dixon et al., 1999), wat betekent dat obesitas ook veroorzaakt zou kunnen worden door hyperthyreoïdie, maar dat dit wel een zeldzame oorzaak is voor obesitas. Naast deze hond-gerelateerde risicofactoren, leveren de eigenenaren een zeer grote bijdrage in het ontwikkelen van obesitas. Uit verschillende onderzoeken is gebleken dat een lager inkomen (Courcier et al., 2010), een hogere leeftijd (Holmes et al., 2007; Courcier et al., 2010) en zwaarlijvigheid van de eigenaar (Nijland et al., 2010) een verhoogd risico geven op obesitas bij honden. Het geven van snacks of beloningen zou ook een risicofactor kunnen zijn voor obesitas (Mason, 1970; Sloth, 1992; Robertson, 2003). Daarnaast geeft minder beweging ook een hoger risico op obesitas (Robertson, 2003; Courcier et al., 2010; Morrison et al., 2013). Ten slotte waren volgens een onderzoek het type voer, namelijk niet-commerciële voeding, en de frequentie van voederen, meerdere malen per dag, ook risicofactoren voor de ontwikkeling van obesitas bij de hond (Mao et al., 2013). Echter de frequentie van voederen had volgens een ander onderzoek geen effect op obesitas (Courcier et al., 2010). De aanwezigheid van obesitas wordt geassocieerd met een laaggradige ontsteking en verhoogde intestinale permeabiliteit in de darm en daarnaast voor een metabole endotoxemie (Cani et al., 2007b; Cani et al., 2008). De in de darm aanwezige microbiota zouden daarnaast ook een kleine invloed hebben op obesitas en de microbiota zouden dus ook als risicofactor gezien kunnen worden voor obesitas (Haemer et al., 2009; Diamant et al., 2010). Bij de behandeling van obesitas zijn verschillende manieren in combinatie mogelijk, met de bedoeling de risicofactoren van obesitas aan te pakken. Een gezond dieet en voldoende beweging zijn belangrijk in de behandeling van obesitas. Deze behandelingen bestaan al zeer lang, maar er zijn nog steeds veel honden met obesitas alhoewel hun effectiviteit in verschillende onderzoeken op de korte termijn is aangetoond (German et al., 2007; Gosselin et al., 2007; German et al., 2010). Het is mogelijk dat na een succesvolle behandeling van obesitas, het bereikte gewicht niet kan worden behouden en dat er een gewichtstoename optreedt. Een onderzoek hieromtrent liet inderdaad zien dat 48% van de succesvol met een dieet behandelde obese honden, weer in gewicht toenam met meer dan 5%. Het soort dieet had ook een effect op de gewichtstoename, waarbij dieren gevoerd met een speciaal obesitas management dieet voeder minder in gewicht toenamen dan honden die een normaal voeder kregen (hierbij koos de eigenaar van de hond het type voeder), maar dus toch in gewicht toenamen (German et al., 2012). Vandaar dat er ook naar andere behandelingsmogelijkheden onderzoek is 4

11 gedaan, en nog zal gedaan worden in de toekomst. Hiervan zijn pre- en probiotica een voorbeeld (Genta et al., 2009; Kadooka et al., 2010). 2. PROBIOTICA EN PREBIOTICA 2.1. PROBIOTICA Probiotica worden door de Food and Agriculture Organization (FAO) en de World Health Organization (WHO) gedefinieerd als levende organismen, die, wanneer opgenomen in voldoende hoeveelheid, een gezondheidsvoordeel verlenen aan de gastheer (FAO en WHO, 2002). Meestal zijn probiotica bacteriën, maar schimmels of gisten kunnen ook gebruikt worden (McDonald et al., 2002). Probiotica komen voor als voedingssupplement, zoals poeder, vloeibaar, gel, pasta, granulen, capsules, sachets, enzovoorts (Thronton, 1996). Ze zijn daarnaast ook aanwezig in voedsel, zoals yoghurt en melk, waar de probiotica van origine al aanwezig kunnen zijn, ofwel toegevoegd zijn tijdens de bereiding van het product (Gill en Guarner, 2004). Probiotica kunnen zowel levend als dood een positief effect hebben op de gastheer, waarbij dode probiotica enkel een anti-inflammatoire reactie teweegbrengen in het gastro-intestinaal kanaal (Kamiya et al., 2005; Turner et al., 2008, Clifford, 2010). Het aantal microorganismen dat levend door de darm passeren, hangt af van de stam, de dosis die door het dier is opgenomen en factoren die gerelateerd zijn aan de gastheer en het vector voedsel (AFFSA, 2005). Er worden verschillende mechanismen voorgedragen waarmee probiotica gunstige effecten voor de gastheer zouden kunnen uitvoeren. Probiotica produceren enzymen die het verteringsvermogen van de gastheer aanvullen en hun aanwezigheid zorgt voor een barrière tegen binnendringende pathogenen. Zo hechten ze zich vast aan de darmwand om kolonisatie van pathogene microorganismen te voorkomen, gaan in competitie voor nutriënten en zorgen ze voor stimulatie van immuniteit en productie van antimicrobiële substanties (Rolfe, 2000; McDonald et al., 2002). Lactobacilli bijvoorbeeld produceren door fermentatie lactaat waarmee de ph wordt verlaagd tot een niveau die een aantal bacteriën niet kan tolereren (Rolfe, 2000; McDonald et al., 2002; Eswranandam et al., 2004). De antimicrobiële activiteit van lactaat producerende bacteriën, die het meest worden gebruikt in probiotica, ontstaat door hun productie van onder andere lactaat, acetaat, ethanol en waterstofperoxide (De Vuyst en Vandamme, 1994). Naast anti-pathogene effecten hebben probiotica ook andere gunstige effecten. Ze kunnen onder andere zorgen voor reductie van de systemische cholesterol concentratie, vertering van lactose, absorptie van calcium verbeteren en vitamines synthetiseren (Tannock, 1997). Aan de volgende voorwaarden moeten probiotica voldoen. Ze moeten een onderdeel zijn van de natuurlijke microbiota van het dier, zoals Lactobacillus en Enterococcus bij de hond, niet schadelijk zijn voor de gastheer en resistent zijn aan gal- en maagzuur (Kasthan, 1990; Erkkila en Petaja, 2000). Daarnaast moeten probiotica stabiel zijn onder productie en opslagcondities en deze processen kunnen overleven (Lee en Salminen, 1995; Saavedra, 1995; Campieri en Gonchetti, 2001). 5

12 2.2. PREBIOTICA Onder prebiotica worden niet verteerbare voedsel ingrediënten verstaan die gunstige effecten hebben op de gastheer, door selectief de groei en activiteit van één of enkele specifieke bacteriën in de darm te stimuleren (Gibsons en Roberfroid, 1995). Prebiotica zullen aan een aantal voorwaarden moeten voldoen. Ze moeten ten eerste, net zoals probiotica, resistent zijn aan maagzuur en daarnaast resistent zijn aan hydrolyse van zoogdier enzymen en gastro-intestinale absorptie, om zo gebruikt te kunnen worden door de microbiota aanwezig in de darm. Verder moeten ze door intestinale microbiota verteerbaar zijn en de groei en activiteit van voor de gastheer gunstige intestinale bacteriën stimuleren. Zo zorgt inuline voor een toename in het aantal Bifidobacterium spp. (Gibson et al., 2004). Bepaalde prebiotica zorgen voor een daling van ongunstige bacteriën die aanwezig zijn in het gastro-intestinaal stelsel, zoals Escherichia coli en Clostridium spp. MOS, bijvoorbeeld, bewerkstelligd dit door de binding van pathogene bacteriën aan de darmwand te verhinderen. Pathogene bacteriën hebben lectinen aan hun celoppervlak, waarmee zij unieke configuraties van glycoproteïnen en glycolipiden kunnen herkennen. Deze componenten zijn aanwezig aan het celoppervlak van enterocyten en hiermee hechten zij zich vast aan de enterocyten. E. coli heeft een mannose specifieke lectine. Dit houdt in dat deze bacterie in de aanwezigheid MOS, welke mannose bevatten, niet meer zal kunnen vasthechten aan het darmoppervlak en dus zal worden uitgescheiden (McDonald et al., 2002). Er bestaan verschillende types prebiotica, gebaseerd op hun structuur. Fructanen zijn één van de meest populaire prebiotica. Fructo-oligosachariden (FOS), korte keten FOS (scfos), oligofructose (OF) en inuline zijn voorbeelden van fructanen. Naast fructanen worden mannan-oligosachariden (MOS), galacto-oligosachariden (GOS) en trans-galacto-oligosachariden (TGOS/TOS) gebruikt als prebiotica, welke ook natuurlijk kunnen voorkomen. Daarnaast kunnen prebiotica ook worden gesynthetiseerd, en worden ze synthetische prebiotica genoemd (Barry et al., 2009a). FOS, GOS en inuline zijn hier voorbeelden van (Flamm et al., 2001; Deepak en Sheweta, 2013). 3. DE MICROBIOTA VAN DE DARM 3.1. DE NORMALE MICROBIOTA VAN DE DARM Bacteriën, archaea, schimmels, protozoa en virussen zijn aanwezig in het gastro-intestinaal systeem en maken deel uit van de intestinale microbiota (Jones en Marchesj, 2007; Suchodolski et al., 2009; Handl et al., 2011). In het verdere verloop van deze literatuurstudie zal er met microbiota enkel de bacteriën worden bedoeld. Hieronder zal de samenstelling van de microbiota bij de hond worden besproken, alsook de interacties met de gastheer. De samenstelling van de bacteriële microbiota in de darm is afhankelijk van verschillende factoren, zoals het individu, de plaats in het intestinaal stelsel, leeftijd, ras en de techniek waarmee de bacteriën worden aangetoond (Hopkins et al., 2002; Simpson et al., 2002; Suchodolski et al., 2005; Mentula et al., 2005). Met de plaats in het intestinaal stelsel wordt de verschillende compartimenten van de darm bedoeld en de samenstelling van bacteriën in elk van de compartimenten van de darm verschilt. De bacteriële diversiteit in de darmen bij elke hond neemt toe vanaf het duodenum naar distaal, waarbij 6

13 de diversiteit in het colon en rectum het hoogst is (Suchodolski et al., 2005; Suchodolski et al., 2008). Ook de bacteriële concentratie neemt van proximaal naar distaal toe, waarbij in het ileum ongeveer 10 7 CFU/ml ileaal vocht en in het colon CFU/ml bacteriën aanwezig zijn (Suchodolski, 2011). Bij honden is er met behulp van moleculaire analyse met 16S rrna sequencing achterhaald dat in de dunne darm de phyla Firmicutes (voornamelijk Clostridiales en Lactobacillales), Bacteroidetes Proteobacteria en Actinobacteria de meerderheid uitmaken van de bacteriën die daar aanwezig zijn (Suchodolski et al., 2009). In het ileum en colon van honden samen zijn Firmicutes, Fusobacteria en Bacteroidetes het meest aanwezig en in veel mindere mate zijn Proteobacteria aanwezig (Suchodolski et al., 2008). Terminale restrictie fragment polymorfisme analyse uitgevoerd bij honden toonde dat de orde Clostridiales het meest aanwezig is in het duodenum en jejunum. De orden Fusobacteriales en Bacteroidales bevinden zich het meest in het ileum en colon en komen maar sporadisch voor in het duodenum en colon. Met behulp van bacteriële cultuur werden Bacteroides, Clostridium, Lactobacillus, Bifidobacterium spp. en Enterobacteriaceae aangetoond als de prominente groepen algemeen aanwezig in de darm (Jia et al., 2010; Suchodolski, 2011). De samenstelling van bacteriën in de feces verschilt met die van de darmen. In een onderzoek behoorden de bacteriën dan voornamelijk tot de phyla Firmicutes, onder andere Clostridium en Lactobacillus spp., Bacteriodetes en Fusiobacteria. Bacteriën uit de phyla Proteobacteria en Actinobacteria komen veel minder voor (Middelbos et al., 2010). Phyla Firmicutes en Bacteroidetes kwamen ook bij de groep Swanson et al. (2011) predominant voor en phylum Proteobacteria kwam minder voor, maar anders dan bij Middelbos et al. kwamen Proteobacteria ook iets minder voor. Bij dit onderzoek werd echter wel gebruik gemaakt van een andere techniek, namelijk pyrosequencing. Park et al. (2015) bevestigden dat bacteriën behorende tot het phylum Firmicutes het meest prominent aanwezig zijn in de feces, met als voornaamste de Lactobacillus spp. De phyla die in proportie op Firmicutes volgden, waren Actinobacteria, Proteobacteria en Bacteroidetes (Park et al., 2015). Bell et al. identificeerden met behulp van terminale restrictie fragment polymorfisme analyse bacteriën van de ordes Bifidobacteriales, Bacteriodales, Bacillales, Clostridiales en Enterobacteriales in mest, wat overeenkomt met de verschillende phyla bij het eerder genoemde feces onderzoek (Bell et al., 2008). Lactobacillales komt voor in alle delen van het intestinaal stelsel (Suchodolski et al., 2008).) In het ecosysteem van de intestinale microbiota vinden complexe microbiële interacties en interacties met de gastheer plaats (Ley et al., 2008; Jones et al., 2010; Nicholson et al., 2012). De microbiota in het gastro-intestinaal stelsel hebben een nauw contact met de intestinale mucosa of epitheliale oppervlak. Ze vormen een onderdeel van de mucosale barrière en interageren met het mucosale immuunsysteem (Tsuji et al., 2008; Turnbaugh et al., 2009). Daarnaast produceren onder andere Bifidobacteria en Lactobacilli vitaminen van de B en K groep (Suchodolski, 2011; LeBlanc et al., 2013). Ook spelen ze een belangrijke rol in de intestinale vertering. Zo degraderen ze niet verteerbare polysachariden en andere niet verteerbare voedsel onderdelen en helpen zij mee energie uit het voedsel te halen, produceren ze korte keten vetzuren, metabolieten die een belangrijke fysiologische functie spelen, en zorgen ze voor de ontwikkeling van de intestinale microvilli (Yamanaka et al., 1977; Bäckhed et al., 2005; Resta, 2009; Cani en Delzenne, 2009; Qin et al., 2010; Suchodolski, 2011). 7

14 3.2. HET EFFECT VAN PRO- EN PREBIOTICA OP DE DARM MICROBIOTA VAN GEZONDE HONDEN Het effect van probiotica De meest onderzochte probiotica behoren tot de species Bifidobacterium en Lactobacillus. Met deze probiotica werd onder andere onderzocht of deze intestinale ziekten kunnen voorkomen of genezen zoals antibioticum geassocieerde diarree, infectieuze virale en bacteriële diarree en bacteriële overgroei in de dunne darm bij de mens (Rolfe, 2000). Ook bij gezonde honden zijn probiotica gebruikt en onderzocht om te achterhalen wat ze voor effecten hebben op de darm microbiota. Bij al deze onderzoeken werd enkel droog voeder gegeven. Er zijn veel onderzoeken gedaan naar het effect van het supplementeren van verschillende Lactobacillus spp. waarbij is gekeken welke bacteriën in aantal toenemen of afnemen als gevolg van de probioticum toediening. Het toedienen van Lactobacillus fermentum streng AD1, geïsoleerd uit honden feces, zorgt voor een stijging in fecale Lactobacillus en Enterococcus spp. (Strompfova et al., 2006). Een andere streng van L. fermentum, namelijk LAB8, zorgde ook voor een stijging van de Lactobacillus spp. in het jejunum (Manninen et al., 2006). Baillon et al. (2004) hebben met L. acidophilus streng DSM toediening een toename van de fecale Lactobacillus en een daling van Clostridium spp. waargenomen, maar in een ander onderzoek was de daling van Clostridium en Lactobacillus spp. niet significant (Pascher et al., 2008). Een daling van Clostridium spp. kan gunstig zijn, daar honden met inflammatoire darmziekten (IBD) een stijging van Clostridium perfringens kunnen hebben (Suchodolski et al., 2012). L. animalis streng LA4 toediening zorgde ook voor een daling van fecale C. difficile en een verhoogd aantal Lactobacillus spp. (Biagi et al., 2007). De toediening van Lactobacillus spp. als probioticum zorgt dus bij honden algemeen voor een toename in Lactobacillus spp. en eventueel voor een afname in Clostridium spp. Ook het gebruik van Bifidobacterium spp. als probiotica is onderzocht. Bifidobacterium animalis AHC7 toediening zorgde voor een verlaging van fecale Clostridia en C. difficile (O Mahony et al., 2009). Ook Enterococcus faecium NCIB zorgde voor een afname van Clostridium spp. (Vahjen en Männer, 2007). Een andere stam van E. faecium EE3 had een vermindering van fecale Staphylococcus spp. en Pseudomonas achtige bacteriën en een toename van fecale Lactobacillus spp. tot gevolg (Marcinakova et al., 2006) Het effect van prebiotica Zoals eerder vernoemd zijn er verschillende soorten prebiotica, waarbij fructanen een populair prebioticum is. Daarnaast zijn MOS, GOS en xylo-oligosacharide (XOS) ook prebiotica die bij de gezonde hond zijn onderzocht voor hun effect op de microbiota van de darm, samen met een droog voeder. Over het algemeen nemen Bifidobacterium en Lactobacillus spp. toe ten gevolge van de toediening van prebiotica en kan Clostridium perfringens en Escherichia coli afnemen. 8

15 Wanneer aan het dieet van honden bij één onderzoek FOS, MOS of XOS werden toegevoegd, gaven deze geen effect op de fecale Bifidobacterium spp. De fecale C. perfringens waren lager in aantal bij MOS dan FOS en XOS supplementatie. In de dikke darm hadden deze prebiotica relatief weinig effect (Strickling et al., 2000). In een ander onderzoek zorgde MOS wel voor een toename aan fecale Bifidobacteria, en daarnaast een daling van fecale E. coli (Grieshop et al., 2004). Daarnaast kan MOS ook enkel zorgen voor een hogere concentratie aan fecale Lactobacillus (Swanson et al., 2002c). Indien MOS samen met scfos wordt gesupplementeerd, kan deze combinatie zorgen voor een toename van fecale Bifidobacteria en fecale en ileale Lactobacilli concentraties (Swanson et al., 2002b), maar er kan ook enkel een daling van de totale anaerobe bacterie concentratie optreden (Swanson et al., 2002c). scfos aan een lage dosis (0,7 gram, 1,4 gram (respectievelijk 0,2% en 0,4% van 175g voer 2 keer per dag) en 1 capsule van 1 gram 2 keer per dag) heeft geen effect op de microbiota aanwezig in de feces (Swanson et al., 2002c; Barry et al., 2009b), maar bij een ander onderzoek met een hogere dosis scfos (per hond 2 keer per dag 2 gram per capsule), was er wel een toename in Bifidobacterium en Lactobacillus spp. en een verlaging van C. perfringens in de feces (Swanson et al., 2002a). Inuline toediening bij slanke honden heeft verschillende effecten. Zo zorgt toediening hiervan onder de vorm van cichorei als voedingssupplement voor een toename van Bifidobacteria in de feces (Zentek et al., 2003; Grieshop et al., 2004). Daarnaast geeft de supplementatie van inuline een beperkte daling van C. perfringens in de feces (Zentek et al., 2003). Bij een later uitgevoerd onderzoek, ook met inuline, daalde het aantal Enterobacteriaceae en nam het aantal Megamonas toe, maar een echt duidelijk effect op de microbiota werd niet waargenomen (Beloshapka et al., 2013). In een lage dosis zorgt inuline supplementatie niet voor veranderingen in de fecale microbiota (Barry et al., 2009b). De toediening van inuline zorgt dus in lage dosis voor geen veranderingen, maar in een hogere dosis voor een stijging van Bifidobacterium en Meganomas spp. in feces en voor een daling van C. perfringens, weliswaar beperkt, en Enterobacteriaceae. Bij supplementatie van lactosucrose, een ander prebioticum, neemt het aantal Bifidobacterium spp. in de feces toe, terwijl C. perfringens afneemt (Terada et al., 1992). Een sterke toename in Bifidobacterium spp. kan ook worden veroorzaakt door galactoglucomannan oligosacharide als supplement te geven (Faber et al., 2011) OBESITAS EN DE DARM MICROBIOTA Daar de microbiota van de darm meehelpen met de vertering en opname van voedingsstoffen en de opslag van vet, zouden deze ook een bijdrage kunnen leveren aan het ontstaan van obesitas en ook kunnen veranderen ten gevolge van obesitas, of dat door een verandering in de microbiota obesitas in de hand wordt gewerkt (Yamanaka et al., 1977; Bäckhed et al., 2005). Vandaar dat er veel is onderzocht naar de microbiota samenstelling bij obese en slanke dieren en mensen en de mogelijke mechanismen waarmee de microbiota bijdragen aan obesitas. Om het effect van microbiota op de voedsel en energie opname en vertering te achterhalen, is er bij muizen onderzoek gedaan met kiemvrije muizen. Bij muizen zonder microbiota is aangetoond dat zij 9

16 bij meer voedsel opname toch minder lichaamsvet hebben dan muizen met microbiota in de darm. Bij introductie van microbiota in de darmen van deze kiemvrije muizen werd er een toename van het lichaamsvet waargenomen, in combinatie met minder voedselopname. De aanwezigheid van de microbiota zorgt voor een verhoogde intestinale monosachariden absorptie en de mogelijkheid om energie uit voor de muizen niet-verteerbare voedsel componenten te halen. Daarnaast is er ook een hogere glycemie en insulinemie waar te nemen, die zorgen voor de novo lipogenese ter hoogte van de lever (Bäckhed et al., 2004). Dit onderzoek en een ander onderzoek met kiemvrije en gewone muizen liet zien dat de microbiota de in het darmepitheel aanwezige lipoproteïne lipase inhibitoren, vasten-geïnduceerde adipose factor(fiaf) genoemd, onderdrukken. De aanwezigheid van de microbiota zorgt voor een toename van lipoproteïne lipase activiteit waardoor meer energie zal worden opgeslagen in vet (Bäckhed et al., 2004; Wolf, 2006). Onderzoeken naar de microbiële samenstelling bij obese mensen en muizen hadden tegenstrijdige conclusies. Bij genetisch obese muizen is aangetoond dat hun darm microbiota in verhouding verschillen van deze aanwezig bij muizen met een normaal gewicht. Firmicutes zijn relatief meer aanwezig bij obese muizen, en Bacteroidetes komt relatief minder voor in vergelijking met slanke muizen (Ley et al., 2005; Turnbaugh et al., 2006). Ook bij obese mensen werden bij een onderzoek meer Firmicutes en minder Bacteroidetes aangetroffen in de feces dan in de feces van mensen met een normaal gewicht (Ley et al., 2006). Maar een ander onderzoek toonde juist geen verschil in Firmicutes tussen slanke en obese mensen (Duncan et al., 2008). En Schiertz et al. (2010) had juist een lagere ratio van Firmicutes ten opzichte van Bacteroides bij obese mensen. Een ander onderzoek gaf een lagere proportie van Bacteroidetes bij obese mensen in vergelijking met slanke mensen, met hierbij meer Actinobacteria en geen verschil in Firmicutes. Verder werd er bij obese mensen een vermindering van bacteriële diversiteit vastgesteld (Turnbaugh et al., 2009). Verder werd er bij muizen een daling van Bifidobacterium spp. waargenomen wanneer ze een vetrijk dieet gevoed kregen (Cani et al., 2007a, Cani et al., 2007b, Cani et al., 2008). Bifidobacterium spp. kunnen de hoeveelheid lipopolysacharide (LPS) aanwezig in de darm doen laten afnemen en de mucosale barrière van de darm verbeteren (Griffiths et al., 2004; Wang et al., 2004; Wang et al., 2006). De daling van de aanwezige Bifidobacterium spp. kan dus worden gecorreleerd aan een verminderde functie van de mucosale darmbarrière en een stijging van LPS. Dankzij meerdere onderzoeken naar LPS in verband met obesitas, wordt er gedacht dat LPS een onderdeel is van de connectie tussen de microbiota en de door vetrijke diëten geïnduceerde ontsteking, in onder andere het vetweefsel en de lever, en metabole ziekte (Shi et al., 2006; Cani et al., 2007b, ; Suganami et al., 2007; Tsukimo et al., 2007; Cani et al., 2009). Bij obese honden is er, net zoals bij de mens en de muis, minder microbiële diversiteit, wanneer deze wordt vergeleken met de diversiteit van slanke honden (Park et al., 2015). Daarbij is er een verschil tussen de microbiële samenstelling van obese en slanke honden, maar tussen de onderzoeken zijn er tegenstrijdige conclusies. Bacteriën van het phylum Firmicutes komen juist relatief minder voor bij obese honden, in tegenstelling tot wat bij muizen en mensen is aangetoond. Bacteriën behorende tot het phylum Proteobacteria zijn de predominante microbiota in de darm van obese honden, wel 10

17 gevolgd door Firmicutes (Park et al., 2015). Uit een ander onderzoek kwam echter naar voren dat bacteriën behorende tot het phylum Firmicutes het meest aanwezig zijn bij zowel obese als slanke honden en er werd geen verschil in verhouding tussen Firmicutes en Bacteroidetes gevonden tussen obese en slanke honden. Verder waren er meer bacteriën van het phylum Actinobacteria en genus Roseburia, behorende tot de orde Clostridiales, aanwezig bij obese honden (Handl et al., 2013). Uit al deze onderzoeken is dus gebleken dat er minder microbiële diversiteit is bij obese dieren en mensen en dat er een verandering is van de samenstelling van de microbiota, alhoewel deze verschilt tussen de verschillende dieren en de mens en de verschillende uitgevoerde onderzoeken. 4. HET EFFECT VAN PRO- EN PREBIOTICA OP OBESITAS 4.1. PROBIOTICA Het gebruik van probiotica bij obese honden is nog niet duidelijk onderzocht. Bij obese muizen en mensen daarentegen wel. Bij obese dieren en mensen worden vooral bacteriën als probioticum toegediend, die bij obese dieren en mensen zijn verminderd ten opzichte van slanke dieren. Verschillende probiotica lijken een anti-obesitas effect te hebben bij mensen en muizen. Bifidobacterium spp. toename in de darm van muizen, zou een daling kunnen geven van de met obesitas geassocieerde en door vetrijke voeding geïnduceerde metabole endotoxemie en ontsteking (Cani et al., 2006; Cani et al., 2007a). Zoals eerder genoemd zorgen Bifidobacterium spp. voor een daling van LPS aanwezig in de darmen en een verbetering van de mucosale barrière functie van de darm (Griffiths et al., 2004; Wang et al., 2004; Wang et al., 2006). Vandaar dat er verschillende onderzoeken met Bifidobacterium spp. als probiotica zijn uitgevoerd. Wanneer Bifidobacterium pseudocatenulatum SPM 1204, B. longum SPM 1205 en B. longum SPM 1207 gegeven worden aan obese ratten, hebben deze een anti-obesitas effect. Ze zorgen voor minder gewichtstoename, lager totaal cholesterol, HDL (high-density-lipoproteïne) en LDL (low-density-lipoproteïne) cholesterol, triglyceride, glucose, leptine, ASAT (aspartaat-aminotransferase), ALAT (alanine-aminotransferase) en lipase (An et al., 2011). Pancreas lipase hydroliseert vetten, zodat deze door de darmwand kunnen worden opgenomen, dus een inhibitie van dit enzym heeft een gunstig effect bij de behandeling van obesitas (Ono et al., 2006). Bifidobacterium spp. kunnen afhankelijk van de streng een ander effect hebben op obese muizen. Bifidobacterium L66-5, L75-4, M13-4 en FS31-12, afkomstig van normale humane darmen, gaven bij obese ratten namelijk de volgende effecten. B. M13-4 zorgde voor een lichaamsgewicht toename, B. L66-5 zorgde voor een daling in lichaamsgewicht. De andere twee strengen hadden geen significant effect op het lichaamsgewicht. Alle strengen zorgen voor een daling van het serum en lever triglyceride en toename van lipide afzetting in de lever, waarbij B. L66-5 en B. FS31-12 een sterke verlagend effect hadden, dan de andere twee strengen. Het serum insuline en glucose blijft onveranderd (Yin et al., 2010). Naast Bifidobcterium spp. zijn er ook onderzoeken met Lactobacillus spp. uitgevoerd, waarbij bij sommige species aanwijzingen van de link tussen het probioticum en zijn anti-obesitas effect zou gevonden kunnen zijn. Supplementatie van Lactobacillus plantarum streng nummer 14 heeft een anti- 11

18 obesitas effect bij obese muizen, mogelijks doordat het een geconjugeerd linoleenzuur producerende bacterie is en dit geconjugeerd linoleenzuur zou lichaamsvet kunnen reduceren (Park et al., 1997). Lactobacillus plantarum streng nummer 14 heeft gewichtsverlies en een daling van het lichaamsvet, het totaal cholesterol in het serum en de leptine concentratie tot gevolg (Takemura et al., 2010). Indien obese muizen Lactobacillus rhamnosus PL60, een origineel humane bacterie, toegediend krijgen, daalt hun lichaamsgewicht en hoeveelheid vetweefsel. Er treedt echter geen verandering op van de serumconcentratie van HDL, LDL en totaal cholesterol, en ook blijft de leversteatose onveranderd. Deze anti-obesitas effecten zouden kunnen komen doordat L. rhamnosus PL60, net zoals L. plantarum streng nummer 14 ook een geconjugeerd linoleenzuur producerende bacterie is (Lee et al., 2006). Bij mensen met overgewicht zorgde Lactobacillus gasseri SBT2055 voor een afname van het abdominale viscerale en subcutane vet en het gewicht. Ook de body mass index, taille- en heupomtrek waren afgenomen. Bij dit onderzoek behielden de participanten hun normale voedselopname en beweging (Kadooka et al., 2010). Bij toediening van Lactobacillus casei streng Shirota kunnen obesitas geassocieerde ziekten, insuline resistentie en glucose intolerantie, voorkomen worden bij muizen, mogelijks door de vermindering van endotoxemie, die aanwezig is bij obese dieren (Naito et al., 2011). Niet alleen individuele probiotica zijn getest, maar ook een mengsel van verschillende probiotica. Zo zorgde het toedienen van VSL #3, een mengsel van gevriesdroogde Bifidobacteria, Lactobacilli en Streptococcus thermophiles, bij obese muizen voor een daling van het gewicht, en een verminderde insulineresistentie en lever steatose (Ma et al., 2008) PREBIOTICA Van veel prebiotica is geweten welke specifieke microbiota zullen toenemen na toediening ervan. Net zoals bij probiotica, wordt getracht met prebiotica specifieke microbiota in aantal te doen toenemen, die bij obese dieren en mensen verminderd zijn in aantal. Er zijn verschillende onderzoeken uitgevoerd om te achterhalen welke prebiotica een anti-obesitas effect bij ratten, muizen en bij de mens. Bij honden zijn er nog maar weinig studies hieromtrent uitgevoerd. Bij obese honden is er tot nu toe enkel met scfos onderzoek gedaan, waarbij er werd onderzocht wat hun effect was op de insuline resistentie, glucose homeostase en bepaalde bloedparameters. scfos supplementatie zorgde in een onderzoek bij obese honden voor een daling van de basale insulineresistentie en perifeer voor een betere insuline gevoeligheid, maar zorgde niet voor een daling van de triglyceridemie of energieopname (Respondek et al., 2008). Wanneer scfos in verschillende hoeveelheden samen met een energiebeperkt dieet aan obese honden werd toegediend, werd er gewichtsverlies en een daling van triglyceriden, cholesterol, insuline en leptine, obesitas-gerelateerde parameters waargenomen. Er was echter geen verschil tussen honden met een lagere of hogere scfos dosis. Daarom is het moeilijk af te leiden of de effecten op de obese honden enkel door het dieet of ook door de scfos supplementatie veroorzaakt zijn (Ricci et al, 2011). Het dalen van de concentratie triglyceriden in het bloed wordt voornamelijk toegeschreven aan een gedaalde de novo synthese van vetten in de lever (Kok et al., 1996). 12

19 Ook bij ratten is er een onderzoek gedaan met prebiotica, namelijk oligofructose en dit zonder een dieet om gewicht te verliezen. Het zorgde bij obese ratten voor een inhibitie van de hepatocytaire lipogenese, waardoor er minder accumulatie van triacylglycerol in de lever optrad. De fermentatie van deze oligofructose zorgt voor een stijging van portale propionaat, en dit propionaat heeft een inhiberend effect op de hepatocytaire lipogenese. De oligofructose zorgde ook voor een lagere energieopname en een lager lichaamsgewicht (Daubioul et al., 2002). Bij het onderzoek dat bij muizen is uitgevoerd, hadden verschillende prebiotica verschillende effecten op de microbiota en op de obese dieren zelf, terwijl de dieren geen afslank dieet hierbij kregen. Zo zorgde oligofructose opname voor een normalisatie in het aantal Bifidobacterium spp, die bij de obese muizen verlaagd was, en daarbij zorgde oligofructose voor een verminderde voedselopname, een daling in lichaamsgewicht en vetgehalte, een verbeterde glucose tolerantie en een normalisatie van de glucose-geïnduceerde insulinesecretie (Cani et al., 2007a). Bij een onderzoek met onder andere oligofructose als prebioticum, werd er een daling van de Firmicutes/Bacteroidetes ratio opgemerkt, welke bij gezonde obese muizen is verhoogd (Everard et al., 2011). Een ander effect van oligofructose supplementatie bij obese muizen was een hoger totaal bacterie aantal, hogere Lactobacillus spp., Bifidobacterium spp., en C. coccoides-e. rectale cluster (Cani et al., 2009). Andere prebiotica, namelijk inuline-type fructanen, zorgde bji toediening aan obese muizen voor een toename van Bifidobacterium spp., en daarnaast voor een afname van Roseburia spp. en Clostridium cluster XIVa. Dit had geen verminderde energieopname tot gevolg, maar wel voor een afname van het gemiddelde gewicht van de adipocyten, een toename van de basale lipolyse in adipocyten, een verhoogd effect van insuline op de lipolyse en een afname van de insuline resistentie, waardoor al deze parameters zijn genormaliseerd tot op het niveau van deze van slanke muizen (Dewulf et al., 2011). Onderzoek bij obese mensen werd onder andere gedaan met fructanen en inuline en bij al deze onderzoeken volgden de mensen hierbij geen afslankingsdieet. Bij obese vrouwen zorgde een inname van fructanen voor een daling van het lichaamsgewicht en de lichaamsomtrek en voor een verhoogd verzadigingsgevoel (Genta et al., 2009). Korte keten inuline-type fructanen zorgde voor een verlaagde voedselopname, verlaagde lichaamsgewicht toename en vet massa ontwikkeling bij obese mensen (Parnell en Reimer, 2009). Toediening van inuline aan obese mensen had een verlaging van het insulinegehalte en triglyceriden concentratie tot gevolg (Jackson et al., 1999). 13

20 5. BESPREKING Op zoek naar nieuwe behandelingsmogelijkheden van obesitas wordt al geruime tijd in de richting van pre- en probiotica onderzocht. Bepaalde pre- en probiotica zouden een effect hebben op obesitas, waarbij ze door verandering van de microbiële samenstelling van de darm kunnen zorgen voor minder voedselopname, gewichtsverlies, lagere glucose concentraties in het serum en minder lichaamsvet (Cani et al., 2007a; Parnell en Reimer, 2009). Echter er zijn maar weinig tot geen onderzoeken bij honden uitgevoerd en de resultaten zijn soms tegenstrijdig, en dit kan verschillende oorzaken hebben. Ten eerste is er door alle tegenstrijdigheden bij de verschillende onderzoeken (Ley et al., 2006; Turnbaugh et al., 2009; Handl et al., 2013; Park et al., 2015), nog altijd niet duidelijk geweten welke bacteriën precies aan de basis liggen van het probleem obesitas. En als er niet wordt bekeken welke bacteriën ten gevolge van pre- of probioticum toediening uiteindelijk worden beïnvloed met een antiobesitas effect, kan er ook niet achter worden gekomen welke bacteriën dus effect hebben op obesitas en met welke mechanismes. Ook de echte link tussen microbiota en obesitas is ook nog niet gekend. Vandaar dat er nog niets kan gezegd worden welke pre- of probiotica gebruikt kunnen worden bij de behandeling van obesitas bij honden. Daarnaast is gebleken dat bij het gebruik van prebiotica soms een daling van de voedselopname optreedt (Cani et al., 2007a; Parnell en Reimer, 2009). Hierbij kan worden afgevraagd, of het anti-obees effect direct af te leiden is van de verminderde voedselopname of dat de verminderde voedselopname het gevolg is van een verandering van de microbiota door de toediening van prebiotica. Als dit laatste het geval is, dan is nog niet gekend welke bacterie toename of afname hiervoor aan de oorzaak ligt. In vergelijking met de hond, zijn er veel meer onderzoeken met pre- en probiotica en obesitas gedaan bij mensen en muizen. Maar of de resultaten uit deze onderzoeken te extrapoleren zijn naar de hond is de vraag. Het voeder dat bij honden wordt gegeven is vaak gelijk voor alle deelnemende dieren, net zoals bij muizen, terwijl de mens zijn eigen maaltijden samenstellen. Ook het soort voedsel is verschillend tussen honden en muizen en mensen. Daarnaast is het gastro-intestinaal stelsel anders bij de hond in vergelijking met de mens of muis, wat fysiologie en anatomie betref en de samenstelling van de microbiota bij mens, hond en muis is ook licht verschillend. Zo is er een verschil in lengte van de dunne en dikke darm, heeft de hond in tegenstelling tot de mens geen sacculi in de dikke darm, maar wel een caecum welke bij de mens slecht gedefinieerd is. Ook de hoeveelheid galzouten verschilt tussen de hond en de mens. Daarnaast is de transittijd door het gastro-intestinaal kanaal van de hond veel korter dan bij de mens (Kararli, 1995). De verschuiving van microbiota ten gevolge van obesitas is anders bij de hond dan bij muis en mens, maar bij dit onderzoek waren slechts zeven honden onderzocht (Park et al., 2015). Een ander probleem is de studieopzet van de verschillende onderzoeken, waarbij een interpretatie van de resultaten soms lastig is. Zo worden er vaak bij gebruik gemaakt van slechts een beperkt aantal dieren, meestal bij honden, maar ook bij muizen (Strickling et al., 2000; An et al., 2008; Respondek et al., 2008, Ricci et al., 2011; Park et al., 2015). Omdat het aantal dieren laag is, kunnen resultaten die significant lijken in het onderzoek, enkel het gevolg zijn van toeval en individuele 14

21 verschillen. Daarnaast verschilden de dosissen van prebiotica tussen de onderzoeken, waarbij bij onderzoeken met een lagere dosis soms geen effect, zoals de verandering van microbiota en bepaalde bloedwaarden, werd toegeschreven aan de toediening van dat bepaalde prebioticum, terwijl deze wel een effect had bij een hogere dosis (Strickling et al., 2000; Respondek et al., 2008). Bij onderzoeken bij de mens en ratten, maar ook bij muizen, zijn er grotere aantallen gebruikt in vergelijking met de hond (Jackson et al., 1999; Ono et al., 2006; Cani et al., 2009; Parnell en Reimer, 2009; Yin et al., 2010). Naast het aantal dieren, kan ook het voeder mogelijks interfereren met de resultaten van onderzoeken. Alhoewel de meeste groepen honden allemaal hetzelfde voeder kregen tijdens de onderzoeken, is er ook gebruik gemaakt van honden van eigenaren, en deze krijgen het voedsel dat ze normaal gewend zijn te krijgen thuis en dit kan verschillen tussen de verschillende eigenaren (Handl et al., 2013). Het interpreteren van de resultaten is hierdoor lastig daar voedsel een effect heeft op de samenstelling van de microbiota. De concentratie C. perfringens kan bij honden worden beïnvloed door de hoeveelheid en het soort voedseleiwitten (Amstberg et al., 1980). En ook het vezelgehalte heeft een effect (Simpson et al., 2002). Ook werd er in enkele onderzoeken slechts één of enkele bacteriële genera onderzocht met betrekking tot verandering hiervan ten gevolge van obesitas of pre- of probioticum toediening. Dit betekent dat wanneer er een verandering van de niet onderzochte bacteriële genera optreedt, dit niet wordt gezien en dat er dan ook geen informatie wordt gevonden over welke bacteriën een effect hebben op obesitas (Manninen et al., 2006). Bij obesitas is er een verschuiving in aantal van meerdere bacteriën, maar of deze verschuiving de oorzaak is van obesitas of juist een gevolg is van het ontstaan van obesitas in nog niet gekend. Daarbij is, als bacteriën een oorzaak zouden zijn van obesitas, nog niet geweten of slecht één of juist meerdere bacteriën verantwoordelijk zouden kunnen zijn voor het ontstaan van obesitas. Verder werd er bij het kwalificeren en kwantificeren van de microbiota aanwezig in de darmen gebruik gemaakt van verschillende technieken, die ook tegenstrijdige uitkomsten bij onderzoeken zouden kunnen verklaren. Met standaard cultuur technieken (O Mahony et al., 2009; Jia et al., 2010; Suchodolski, 2011) worden de meerderheid van de microbiota niet geïdentificeerd, vandaar dat tegenwoordig bacteriële cultuur minder wordt gebruikt (Leser et al., 2002; Brooks et al., 2003). Het gebruik van moleculaire technieken, zoals 16s RNA sequencing, is een goed middel voor bepaling van de bacteriële microbiota die aanwezig zijn in de darmen en feces (Simpson et al., 2002). Verder wordt er bij het onderzoek naar de aanwezige bacteriën in het colon van mensen en dieren er in onderzoeken ook gebruik gemaakt van fecale stalen, aangezien collectie hiervan gemakkelijk is. Hieruit wordt dan geconcludeerd wat de samenstelling is van de microbiota in het colon. Er is echter een verschil tussen de microbiota aanwezig in het colon en in de feces. In het colon zijn luminale en mucosale bacteriën aanwezig. De mucosale bacteriën worden voor een deel met de verloren mucosacellen uitgescheiden in de feces, samen met de luminale bacteriën, maar deze twee groepen bacteriën in dezelfde verhouding in de mest aanwezig zijn, is niet gekend (Eckburg et al., 2005). 15

22 Ook het tijdsbestek zou invloed kunnen hebben op de resultaten. Veel onderzoeken bestreken maar enkele weken, terwijl er op lange termijn de effecten van pre- en probiotica op obesitas niet werd onderzocht (Baillon et al., 2004; Ley et al., 2005; Wolf, 2006; Respondek et al., 2008). Tegenstrijdige resultaten uit deze kortdurende onderzoeken zouden hierdoor eventueel verklaard kunnen worden. Dit zou ook een goede reden kunnen zijn waarom bepaalde onderzoeken geen effect konden waarnemen van de toediening van pre- of probiotica (Strickling et al., 2000; Swanson et al., 2002c; Barry et al., 2009b; Ricci et al, 2011). Om uiteindelijk te achterhalen welke bacteriën hoe verantwoordelijk zijn en een bijdrage leveren in het ontstaan en behandelen van obesitas, zal meer onderzoek nodig zijn. Zo zal er meer onderzoek nodig zijn met het oog op de effecten van obesitas op de microbiota van de darm, de effecten van de microbiota op obesitas en ook de effecten van pre- en probiotica op obesitas en de microbiota aanwezig bij obesitas. En dit onderzoek zal dan ook met honden moeten worden uitgevoerd, omdat onder andere de effecten van prebiotica slechts eenmalig en probiotica nog nooit zijn onderzocht bij obese honden. Hierbij zou het verstandiger zijn om meer dieren in de onderzoeken te gebruiken, maar zonder dat er onnodig veel dieren zullen worden gebruikt. Wanneer er bij toekomstige onderzoeken pre- en probiotica worden gevonden die een gunstig effect hebben op gewichtscontrole en behandeling van obesitas, zal nog steeds de meest belangrijke oorzaak van het probleem obesitas moeten worden aangepakt, namelijk de voeding en beweging. Pre- en probiotica kunnen echter wel deze behandeling ondersteunen en vergemakkelijk, maar als vervanging voor een gezonde evenwichtige voeding en bewegen moet dit niet worden gezien. 16