Voor akkoord verklaring

Transcriptie

1 Voor akkoord verklaring Dit eindwerk is een examen; eventuele fouten die worden vastgesteld tijdens de eindwerkverdediging of erna worden niet gecorrigeerd. Het gebruik als referentie in publicaties is toegelaten na goedkeuring van de stagebegeleider, vermeld op de titelbladzijde. Martine De Bleeckere Stagementor Kathleen Claes Stagegever Stefanie Salliau Promotor

2 Woord vooraf Met dit eindwerk sluit ik mijn drie jaar durende studies biomedische laboratoriumtechnologie af. Ik heb ervan genoten dankzij mijn prima docenten van de Hogeschool West-Vlaanderen, departement Simon Stevin en mijn toffe medestudenten. In eerste instantie gaat mijn dank uit naar mijn stagebegeleidster, mevr. Stefanie Salliau, een nieuwkomer op het departement, maar niettemin een prachthulp die me bijstond met raad en daad bij het schrijven van dit eindwerk. Het onderzoek heb ik mogen behandelen in het Centrum voor Medische Genetica van het Universitair Ziekenhuis te Gent. Ik wens dan ook mijn stagegever mevr. Kathleen Claes te bedanken, niet alleen voor het aanreiken van het boeiend onderwerp, maar vooral omdat zij ondanks haar drukke werkschema nog tijd vrijmaakte om me te begeleiden doorheen dit eindwerk. Ook mijn dank aan mevr. Martine De Bleeckere, omdat ze me wegwijs maakte en me bijstond in het labo. Tenslotte dank ik mijn ouders voor hun steun en interesse en voor het helpen terugvinden van mijn enthousiasme op de momenten dat ik die even kwijt was.

3 Samenvatting In de westerse wereld is colonkanker één van de meest voorkomende, levensbedreigende vormen van kanker. Colonkankers kunnen sporadisch, familiaal of erfelijk voorkomen. In België sterven momenteel jaarlijks meer dan mensen aan deze ziekte. In de toekomst hoopt men via preventief onderzoek een daling van het aantal sterfgevallen door colonkanker te bewerkstelligen. Identificatie van patiënten met een verhoogd risico op colonkanker zorgt ervoor dat deze groep een intensievere klinische follow-up krijgt en in een vroeger stadium kan behandeld worden. Op de afdeling moleculaire genetica van het Centrum voor Medische Genetica Gent (CMGG) wordt onderzoek gedaan naar de erfelijke colonkankersyndromen: familiale adenomateuze polyposis (FAP) en hereditair non-polyposis colorectaal carcinoom (HNPCC). In het CMGG wordt momenteel voor HNPCC microsatellietinstabiliteiten-onderzoek en mutatieonderzoek aangeboden van de drie meest frequent gemuteerde genen (MLH1, MSH2 en MSH6). Informatie omtrent de methylatiestatus van de MLH1 promotor maakt het mogelijk om een beter onderscheid te maken tussen sporadische en HNPCC-geassocieerde colontumoren. Daarom wil het CMGG een protocol optimaliseren voor de bepaling van de methylatiestatus van MLH1 in colontumoren, ingebed in paraffine. In het kader van dit eindwerk werden twee methoden hiervoor uitgetest: de methylatie-specifieke PCR en de methyqesd, een combinatie van methylatie-gevoelige digestie en real-time PCR. De optimalisatie van het onderzoek naar de methylatiestatus van de MLH1 promotor in colontumoren start bij een goede methode voor DNA-isolatie van tumormateriaal ingebed in paraffine. Dit is een belangrijke stap om het aantal niet-interpreteerbare analyses te beperken, gezien de kwaliteit van de ontvangen paraffineblokken wisselend is. De methylatie-specifieke PCR bleek al snel een veel robuustere methode, met een hoge specificiteit en sensitiviteit, dan de methyqesd. Bijgevolg werd geopteerd om hiermee verder te werken. Na DNA-extractie volgt een bisulfietbehandeling, waardoor ongemethyleerde cytosine basen omgezet worden in thymine basen en gemethyleerde cytosine basen ongewijzigd blijven. Voor de methylatie-specifieke PCR worden primers gebruikt, waarvan de ligging zo gekozen is dat ze zich bevinden in de proximale regio in de promotor van het MLH1 gen. Het is aangetoond dat methylatie van de CpG-eilanden in deze regio geassocieerd is met verlies van expressie van het MLH1 gen.

4 Op fragmentanalyse kan de methylatie van de CpG-eilanden worden gedetecteerd. Een piek bij 186 bp wijst erop dat er geen methylatie is, terwijl een piek bij 183 bp wel methylatie aanduidt. Het gebruik van 100% gemethyleerd controle DNA is van cruciaal belang tijdens het experiment. Het DNA dient als positieve controle om na te gaan of de bisulfietconversie volledig is doorgegaan. In totaal werd voor dit onderzoek DNA geïsoleerd uit tumormateriaal en ingebed in paraffine onderzocht van 35 patiënten. Selectie van de patiënten gebeurde op basis van een MSI-high fenotype en/of immunohistochemisch defect gedetecteerd in de tumor voor MLH1, MSH2, MSH6 of PMS2. Van deze patiënten werd eveneens DNA geïsoleerd uit bloed geanalyseerd. Er werd bij geen enkele van de onderzochte patiënten methylatie teruggevonden in het DNA geëxtraheerd uit bloed, wat betekent dat er geen germinale epimutaties aanwezig zijn. Voor vier patiënten (11.4%) werden geen interpreteerbare resultaten bekomen op DNA geïsoleerd uit paraffinemateriaal. Dit percentage is in de lijn van de verwachtingen en stemt overeen met andere analyses die gebeuren in het CMGG op DNA geïsoleerd uit paraffinemateriaal. In 32% van de onderzochte colontumoren werd hypermethylatie van de MLH1 promotor vastgesteld. Het percentage methylatie verschilt, gaande van 5% methylatie tot 60% methylatie. De laagste percentages methylatie werden vastgesteld in tumoren van twee patiënten met een germinale MLH1 mutatie. In de overige patiënten lag het methylatie percentage hoger, wat er op wijst dat dit zeer waarschijnlijk sporadische tumoren zijn. Dit betekent dat zij niet geassocieerd zijn met een germinale mutatie en bijgevolg niet erfelijk zijn. In 68% van het onderzochte tumormateriaal werd geen DNA-methylatie waargenomen. In deze patiënten is dus nog geen oorzaak gevonden voor het MSI-high fenotype en/of immunohistochemisch defect in de colontumor. Wegens de positieve resultaten van dit onderzoek zal in de toekomst in het CMGG de methylatiespecifieke PCR toegepast worden in de diagnostiek om een onderscheid te maken tussen erfelijke en sporadische vormen van colonkanker. Voor patiënten met een hoog percentage hypermethylatie van de MLH1 promotor, is een grondig mutatie-onderzoek van de mismatch herstelgenen geassocieerd met HNPCC weinig zinvol.

5 Lijst met afkortingen en symbolen A AFAP AP APC gen Bp Adenine Attenuated FAP Antarctic phosphatase Adenomateuze polyposis coli gen Base pair

6 C CMGG CpG CRC CT-waarde DNA DNMT dntp EDTA Exo I FAM FAP G GSU HNPCC HRMCA IBD IHC MethyQESD MLH1 gen MLPA MMR genen MS MSH2 gen MSH3 gen MSH6 gen MSI MSI-H MSI-L MSP MSS MUTYH gen NaOAc Cytosine Centrum voor Medische Genetica Gent Cytosinefosfaatguanine Colorectaal carcinoom Threshold cycle-waarde Desoxyribonucleïnezuur DNA-methyltransferase Deoxyribonucleotide trifosfaat Ethyleendiaminetetra-azijnzuur Exonuclease I Carboxyfluoresceïne Familiale adenomateuze polyposis Guanine Genetic Service Unit Hereditair, non-polyposis, colorectaal carcinoom High resolution melting curve analyse Inflammatory bowel disease Immunohistochemie Methylation-quantification of endonuclease-resistant DNA MutL homoloog 1 gen Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification Mismatch repair genen Microsatellite MutS homoloog 2 gen MutS homoloog 3 gen MutS homoloog 6 gen Microsatellite instability Microsatellite instability High Microsatellite instability Low Methylation specific PCR Microsatellite stable MutY homoloog gen Natriumacetaat

7 OD PCR PMS2 gen Q-PCR RER RNA RR-mix SAM SDS SSR T TACSTD 1 gen Taq TBE TE TSG U UV V Optische densitiet Polymerase chain reaction Postmeiotic segregation increased 2 gen Quantitatieve PCR Replication errors Ribonucleïnezuur Ready reaction-mix S-adenosylmethionine Sodiumdodecylsulfaat Simple sequence repeats Thymine Tumor-associated calcium signal transducer 1 gen Thermus aquaticus Tris boraat EDTA Tris EDTA Tumorsuppressorgen Uracil Ultraviolet Volt

8 Verklarende woordenlijst Adenocarcinoom Klierkanker Adenoom Goedaardig klierweefsel gezwel Carcinoom Kanker, kwaadaardig gezwel van epitheliaal weefsel Colectomie Gehele of gedeeltelijke excisie van het colon Colitis ulcerosa Met koorts en zweervoming gepaard gaande ontsteking van het colon waarbij etter en vaak ook bloed wordt afgescheiden Colorectaal carcinoom Carcinoom van het colon en/of rectum (endeldarm) CpG-eilanden DNA-regio s die relatief veel CpG s in hun sequentie bevatten Cytogenetica Onderdeel van de erfelijkheidsleer met betrekking tot structuur (speciaal van de chromosomen) en functie van de cel De novo mutatie Aanleg voor een erfelijke aandoening was niet aanwezig bij de ouders, maar wordt wel bij het kind gevonden Deaminatie Onttrekken van een aminogroep (NH 2 ) Deletie Afwezigheid van de erfelijke informatie voor één of meerdere aminozuren DNA-mismatch repair Herstelmechanisme om onvermijdelijke fouten (mismatches) bijvoorbeeld bij de replicatie van DNA, te kunnen herstellen, waardoor uiteindelijk het aantal fouten wordt beperkt DNA-replicatie Verdubbeling van DNA tijdens de celdeling Duodenumkanker Kanker van de twaalfvingerige darm Dysplasie Misvorming, abnormale vorming en groei van weefsel Endometriumkanker Kanker van het baarmoederslijmvlies Endonuclease Enzym dat een nucleïnezuur molecuul kan splitsen waardoor fragmenten ontstaan Epigenetica Studie van omkeerbare erfelijke veranderingen in de genfunctie die optreden zonder wijzigingen in de sequentie (volgorde van de basenparen) van het DNA in de celkern Exon Een coderend stukje DNA Frameshift Mutatie met verschuiving van genetisch leesraam Gain-of-function mutatie Leidt tot een verhoogde activiteit of een totaal nieuwe functie van het genproduct

9 Genomic imprinting Germinale mutatie Histon-modificatie Housekeeping genen Hypertrofie Immunohistochemie Inflammatoir bowel disease Insertie Kanker Kiembaan mutatie Loss-of-function mutatie Maligne Medullablastoom Melanoom Microsatelliet Mosaïcisme Mutatie Oncogenen Proces waardoor een bepaald allel van een gen alleen tot expressie komt, wanneer het van één specifieke ouder (de vader of de moeder) afkomstig is Mutatie in de geslachtscellen, wordt doorgegeven aan het nageslacht Wijziging van histonen, specifieke eiwitten die samen met het DNA in de celkern het chromatine vormen Genen betrokken in de basisfuncties, nodig voor het onderhoud van de cel Sterke ontwikkeling van weefsels of organen (zonder toename van het aantal cellen) Het aantonen van antigenen in cellen en weefsels door middel van specifieke antistoffen Verzamelnaam voor darmziekten, gekenmerkt door chronische ontstekingsprocessen waarvan de oorzaak niet geheel duidelijk is, hiertoe behoren de ziekte van Crohn en colitis ulcerosa Invoegen van een stukje DNA in het reeds aanwezige DNA Kwaadaardige gezwelvorming, neoplasma Mutatie in de geslachtscellen, wordt doorgegeven aan het nageslacht Leidt tot een vermindering of volledig verlies van activiteit van het eiwit Kwaadaardig Maligne gezwel in het cerebellum (kleine hersenen) Gezwel uit melanocyten (pigmentcellen) in moedervlekken Korte, repeterende DNA-sequentie die in het gehele genoom kan gevonden worden Het voorkomen van genetische verschillende cellen in aan elkaar grenzend weefsel ten gevolge van onvolkomenheden in de kerndelingen Plotselinge blijvende en overerfbare verandering in het genetisch materiaal en dus in de erfelijke informatie Genen, betrokken bij het ontstaan van tumoren

10 Oppervlaktespanning Ovariumkanker Penetrantie Poliep Promotor Puntmutatie Retina Sigmoïdoscopie Somatische mutatie Tumorsuppressorgenen X-chromosoom inactivatie Ziekte van Crohn Verschijnsel dat het oppervlak van een vloeistof aan een vloeistofgas overgang zich gedraagt als een veerkrachtige laag Kanker van de eierstokken De mate van manifest worden van een erfelijke eigenschap Gesteeld goedaardig gezwel, komt voornamelijk voor in de neus, darm en blaas DNA, gelegen voor een gen, dat de werking van het gen reguleert. Het wordt niet afgelezen bij de transcriptie Mutagene vervanging van een aminozuur in een molecuul door een afwijkend ander aminozuur Netvlies van het oog Inwendig onderzoek van het sigmoïd, het laatste S-vormig deel van het colon Mutatie in de lichaamscellen, wordt niet doorgegeven aan het nageslacht Genen, betrokken bij het ontstaan van tumoren, remmen de groei of activeren apoptose (geprogrammeerde celdood) Inactivatie van één van beide X-chromosomen in vrouwelijke cellen Chronische ontsteking van een deel van de dunne darm en/of het colon met zweervorming, waardoor onder andere sterk functieverlies van het resorberend darmoppervlak kan ontstaan Lijst van tabellen en figuren Lijst van figuren Figuur 1 Een lijst met de meest voorkomende kankers in België volgens de Stichting Kankerregister Figuur 2 Leeftijd specifieke incidentie van colonkanker volgens het geslacht... 21

11 Figuur 3 Van adenoom tot carcinoom Figuur 4 De 'two hit'-hypothese van Knudson Figuur 5 Percentage sporadische colonkanker, IBD ( Inflammatory bowel disease ), FAP (familiale adenomateuze polyposis), HNPCC (hereditair non-polyposis colorectaal carcinoom) en FH (positieve familie geschiedenis) Figuur 6 Autosomaal dominant overervingspatroon Figuur 7 Het colon met adenomateuze poliepen Figuur 8 Het APC gen Figuur 9 MLH1 gen Figuur 10 Strategie bij de diagnose van HNPCC Figuur 11 Detectie van microsatellietinstabiliteiten Figuur 12 Een immunohistochemische kleuring van een MSI-H patiënt Figuur 13 Principe van HRMCA Figuur 14 Principe van MLPA Figuur 15 Het mechanisme van DNA-methylatie Figuur 16 Het proces van DNA-isolatie Figuur 17 De Nanodrop Figuur 18 Laden van het DNA-staal Figuur 19 Het staal wordt samengedrukt en vormt als het ware een kolom Figuur 20 DNA-sequencing resultaten na bisulfietbehandeling Figuur 21 De drie stappen tijdens PCR: denaturatie, annealing en extensie Figuur 22 Het principe van methylatie specifieke PCR Figuur 23 Overzicht van het fragment uit de MLH1 promotor regio dat wordt geamplificeerd Figuur 24 Het principe van agarosegelelektroforese Figuur 25 De MultiNA Figuur 26 Fluorescent gelabelde DNA-fragmenten bewegen door het capillair Figuur 27 Detectie van de fluorescent gelabelde DNA-fragmenten Figuur 28 Figuur A toont geen methylatie, figuur B vertoont 50 % methylatie. 100% methylatie wordt getoond in figuur C Figuur 29 Principe van MethyQESD Figuur 30 DNA, dat na behandeling met CpG-methyltransferase wordt geprecipiteerd voor bisulfietconversie Figuur 31 DNA dat niet wordt neergeslaan voor bisulfietconversie... 70

12 Figuur 32 Figuur A toont fragmentanalyse na behandeling met EZ DNA Methylation-Direct Kit. Figuren B en C tonen fragmentanalyse van dezelfde patiënt na behandeling met EZ DNA Methylation Kit na respectievelijk 16u en 3u incubatie bij 50 C Figuur 33 Een regio van de MLH1 promotor Figuur 34 PCR-amplificatie gebruik makend van primers P344/P345 gevisualiseerd met de MultiNA Figuur 35 PCR-amplificatie gevisualiseerd met de MultiNA Figuur 36 PCR-amplificatie met primers P344/P345 op commercieel aangekocht gemethyleerd controle DNA na bisulfietconversie. DNA-sequenties na opzuivering via ethanol precipitatie Figuur 37 PCR-amplificatie met primers P344/P345 op commercieel aangekocht gemethyleerd controle DNA na bisulfietconversie. DNA-sequenties na opzuivering met beads Figuur 38 Uit paraffine geëxtraheerd DNA vertoont op fragmentanalyse een piek bij 186 bp Figuur 39 Sequentie van uit paraffine geïsoleerd DNA waarin geen van de CpG eilanden gemethyleerd is. Alle cytosine basen zijn omgezet naar thymines, ook in de CG-nucleotiden Figuur 40 DNA geëxtraheerd uit paraffine vertoont op fragmentanalyse een piek bij 183 bp en 186 bp Figuur 41 Sequentie van DNA geïsoleerd uit paraffine Figuur 42 DNA geëxtraheerd uit paraffine vertoont op fragmentanalyse een piek bij 183 bp Figuur 43 Sequentie van uit paraffine geïsoleerd DNA Figuur 44 Donkergrijs=staal30bloed geknipt met DraI en XbaI; wit=commercieel gemethyleerd DNA geknipt met Hin6I; Grijs=staal30paraffine geknipt met Hin6I; Lichtgrijs=staal30bloed geknipt met Hin6I Lijst van tabellen Tabel 1 Een lijst met de verschillende genen die kunnen betrokken zijn bij kanker 21 Tabel 2 Klinische criteria voor hereditair non-polyposis colorectaal carcinoom 29 Tabel 3 Aan ten minste één van deze Bethesda criteria moet worden voldaan 30 Tabel 4 Criteria voor MSI-H, MSI-L en MSS 31 Tabel 5 Patiëntenmateriaal 38 Tabel 6 Een lijst met de primersets 49 Tabel 7 Een lijst met de primersets 60 Tabel 8 DNA-concentraties, OD 260/280 en OD 260/ Tabel 9 DNA-concentraties van vijf stalen na opzuivering met beads 71 Tabel 10 DNA-concentraties van vijf stalen na verdubbeling producten 71 Tabel 11 Verschil tussen EZ DNA Methylation Kit en EZ DNA Methylation-Direct Kit 71

13 Tabel 12 Standaard PCR-mix met een totaal reactievolume van 20 µl 73 Tabel 13 PCR-mix met een totaal volume van 20 µl 73 Tabel 14 Patiëntenmateriaal en percentage methylatie 80 Tabel 15 Lijst met de uitgevallen DNA-stalen 83 Tabel 16 Lijst met patiënten voor MLPA 86

14 Inhoudsopgave Voor akkoord verklaring... 1 Woord vooraf... 2 Samenvatting... 3 Lijst met afkortingen en symbolen... 5 Verklarende woordenlijst... 8 Lijst van tabellen en figuren Inhoudsopgave Inleiding, situatieschets en probleemstelling Situering Inleiding en doelstelling Literatuurstudie Inleiding tot kanker Algemene inleiding tot colonkanker Colonkanker in cijfers Risicofactoren Erfelijke en sporadische colonkanker Colonkanker syndromen: familiale adenomateuze polyposis en hereditaire non-polyposis colorectaal carcinoom Familiale adenomateuze polyposis Situering Pathologische karakteristieken Genetische achtergrond Moleculaire diagnostiek Hereditaire non-polyposis colorectaal carcinoom Situering Pathologische karakteristieken Genetische achtergrond... 28

15 2.4.4 Moleculaire diagnostiek De Amsterdam en Bethesda criteria Microsatellietinstabiliteiten-onderzoek Immunohistochemisch-onderzoek Mutatie-onderzoek Methylatie Epigenetica Methylatie van DNA DNA-methylatie en tumorvorming Detectie van DNA-methylatie Materialen en methoden Onderzoek naar de methylatiestatus van de MLH1 promotor Patiëntenmateriaal DNA-isolatie en DNA-concentratie bepaling Principe DNA-isolatie Materiaal Werkwijze DNA-concentratie bepaling Bisulfietconversie Principe Materiaal Werkwijze Polymeraseketting reactie Principe Materiaal Werkwijze Agarosegelelektroforese Principe... 50

16 Materiaal Werkwijze MultiNA Principe Materiaal Werkwijze Fragmentanalyse Principe Materiaal Werkwijze Sequeneren Principe Materiaal Werkwijze MethyQESD Principe Materiaal Werkwijze Gemethyleerd controle DNA Principe Materiaal Werkwijze MLPA Principe Materiaal Werkwijze Resultaten en bespreking... 67

17 4.1 Optimalisatie van het onderzoek naar de methylatiestatus van de MLH1 promotor in colontumoren DNA-isolatie Zoektocht naar kwaliteitsvol gemethyleerd controle DNA Aanmaak van gemethyleerd controle DNA Optimalisatie van de methylatie-specifieke PCR Optimalisatie bisulfietconversie Optimalisatie van de PCR-reactie Correlatie tussen resultaten bekomen met fragmentanalyse en sequenering Overzicht resultaten op patiëntenmateriaal Germinale epimutaties Robuustheid van de test Frequentie van MLH1 hypermethylatie in het onderzochte patiëntenmateriaal MethyQESD Patiëntenmateriaal Resultaten MLPA Patiëntenmateriaal Resultaten Discussie Conclusie Literatuurlijst Bijlagen 96 Bijlage 1 De volledige sequentie van de MLH1 regio met aanduiding van de in het onderzoek gebruikte primers... 96

18 Inleiding, situatieschets en probleemstel l ing 1 Inleiding, situatieschets en probleemstelling 1.1 Situering Het Centrum voor Medische Genetica Gent (CMGG), onder leiding van Professor Dr. A. De Paepe, is een afdeling van het Universitair Ziekenhuis Gent. Het vertegenwoordigt één van de acht genetische centra in België (waarvan vier in Vlaanderen) waar erfelijkheidsonderzoek wordt uitgevoerd. Het CMGG heeft drie grote taken: dienstverlening: het verrichten van genetische testen en inrichten van poliklinische consultaties voor personen met vragen rond erfelijkheid; wetenschappelijk onderzoek: voornamelijk rond verschillende kankers, oogafwijkingen, groeistoornissen, mentale retardatie; onderwijs. Het CMGG heeft twee verschillende laboratoriumafdelingen: de afdeling cytogenetica, waar zowel het klassiek cytogenetisch onderzoek als het moleculair cytogenetisch onderzoek worden uitgevoerd, in diagnostisch en onderzoeksverband; de afdeling moleculaire genetica, die verder ingedeeld is in het bindweefsel labo, die instaat voor de moleculaire diagnostiek en onderzoek naar erfelijke bindweefsel-, cardiovasculaire- en skeletale aandoeningen en het DNA-labo, waar de moleculaire diagnostiek van erfelijke aandoeningen verzorgd wordt en onderzoek gevoerd wordt naar onder andere erfelijke oogaandoeningen en familiale kankersyndromen. 1.2 Inleiding en doelstelling Eén van de meest voorkomende, levensbedreigende vormen van kanker in de westerse wereld is colonkanker. Momenteel sterven hieraan jaarlijks meer dan mensen in België alleen al. Colonkankers kunnen sporadisch, familiaal of erfelijk voorkomen. Door preventief onderzoek zou men de patiënten met een verhoogd risico op colonkanker kunnen identificeren, monitoren en zodoende snel behandelen, om zo het aantal sterfgevallen te verminderen. Op de afdeling moleculaire genetica wordt onderzoek gedaan naar de erfelijke colonkankersyndromen: familiale adenomateuze polyposis (FAP) en hereditair non-polyposis colorectaal carcinoom (HNPCC). In dit eindwerk 18

19 Inleiding, situatieschets en probleemstel l ing worden deze twee syndromen dan ook uitvoerig besproken in het onderdeel literatuurstudie. Het onderzoek zelf betreft echter enkel HNPCC. In het CMGG wordt voor colonkanker microsatellietinstabiliteiten-onderzoek en mutatieonderzoek aangeboden. Het doel van dit eindwerk is de optimalisatie van onderzoek naar de methylatiestatus van de MLH1 promotor in colontumoren. Er worden twee methodes geselecteerd om uit te testen: de methylatie-specifieke PCR en methyqesd, een combinatie van methylatiegevoelige digestie en real-time PCR. 19

20 Literatuurstudie 2 Literatuurstudie 2.1 Inleiding tot kanker Kanker is samen met hart- en vaatziekten de belangrijkste doodsoorzaak in Europa (1). Jaarlijks worden er in België ongeveer mensen geconfronteerd met de diagnose kanker, waarvan mannen en vrouwen (2). In 2004 stierven Belgen ten gevolge van deze ziekte. Voornamelijk oudere personen worden getroffen door kanker: ongeveer tweederde van alle vrouwen en drie kwart van alle mannen, waarbij kanker werd geregistreerd, is 60 jaar of ouder op het ogenblik van de diagnose (3). Figuur 1 Een lijst met de meest voorkomende kankers in België volgens de Stichting Kankerregister. Prostaatkanker is de meest voorkomende kwaadaardige tumor bij mannen, gevolgd door longkanker en kanker van de dikke darm. Bij vrouwen is borstkanker de meest voorkomende kanker, gevolgd door colonkanker en longkanker (3). Kanker is een genetische afwijking die veroorzaakt wordt door mutaties in bepaalde genen die leiden tot een afwijkende celgroeiregulatie (4). De mutaties kunnen spontane mutaties zijn, bijvoorbeeld ontstaan tijdens de DNA-replicatie. Daarnaast kunnen ook geïnduceerde mutaties, door bijvoorbeeld UV-straling, chemische stoffen en radioactiviteit, aan de basis liggen voor het ontstaan van kanker. Daarnaast heeft vijf tot tien procent van alle kankers een duidelijk erfelijk karakter (5). Verschillende types van genen kunnen betrokken zijn bij het ontstaan van kanker, zoals de belangrijke oncogenen en tumorsuppressorgenen (tabel 1). Proto-oncogenen zijn betrokken bij het stimuleren van de normale celdeling. In tumoren zijn deze genen, nu oncogenen genoemd, echter op abnormale wijze geactiveerd door gain-of-function mutaties. Oncogenen zijn dominant, daar één mutant allel reeds voldoende is om het abnormale fenotype te veroorzaken. Tumorsuppressorgenen inhiberen de processen die kunnen leiden tot de ontwikkeling van kanker. In tumoren zijn deze genen op abnormale wijze geïnactiveerd door loss-of-function mutaties. Inactivering van beide 20

21 Literatuurstudie allelen van een tumorsuppressorgen is nodig om het gedrag van een cel te veranderen, op moleculair niveau zijn deze genen dus recessief (6). Tabel 1 Een lijst met de verschillende genen die kunnen betrokken zijn bij kanker (5) - Oncogenen - Tumorsuppressorgenen - DNA- mismatch herstelgenen - Genen die betrokken zijn bij het metabolisme - Genen die betrokken zijn bij de hormoonhuishouding 2.2 Algemene inleiding tot colonkanker Colonkanker in cijfers Colorectale kanker of colonkanker is in de westerse wereld één van de meest voorkomende, levensbedreigende vormen van kanker zowel bij vrouwen als bij mannen. In 2005 werd in België bij mannen en bij vrouwen de diagnose colorectale kanker vastgesteld. In 2004 stierven hieraan mensen. Het risico op het krijgen van colorectale kanker vóór de leeftijd van 75 jaar is vijf procent bij mannen en ongeveer drie procent bij vrouwen. De ziekte komt het vaakst voor rond de leeftijd van 70 jaar (2) (figuur 2). In de toekomst wordt een daling van overlijden door colorectale kanker verwacht, dit door meer preventief onderzoek, waardoor vroegtijdige diagnose mogelijk is met een betere prognose (7). Figuur 2 Leeftijd specifieke incidentie van colonkanker volgens het geslacht 21

22 Literatuurstudie Risicofactoren Meerdere factoren kunnen aan de basis liggen voor het ontstaan van colorectale kanker, enerzijds omgevingsfactoren, inclusief de rol van de individuele levensstijl (roken, voeding, weinig lichaamsbeweging), en anderzijds erfelijke risicofactoren (8). Een aantal aandoeningen zoals darmpoliepen (adenomen) en bepaalde chronische darmontstekingen (ziekte van Crohn en colitis ulcerosa) verhogen het risico op het ontstaan van een colorectaal carcinoom. Darmpoliepen zijn meestal goedaardig, maar kunnen uitgroeien tot een kwaadaardig gezwel (figuur 3). Mensen met colorectale kanker in de familie hebben eveneens een verhoogd risico (3). Figuur 3 Van adenoom tot carcinoom Erfelijke en sporadische colonkanker Bij een individu treedt erfelijke kanker reeds op jongere leeftijd op met een hogere kans op meerdere tumoren, dit vanwege de germinale mutatie. Vaak ontstaan ook in andere weefsels en organen kwaadaardige gezwellen. De sporadische vorm komt daarentegen over het algemeen pas op latere leeftijd tot uiting (5). Knudson formuleerde in 1971 de two-hit -hypothese voor tumorvorming (figuur 4). Deze stelde dat alle kankers in twee vormen voorkomen: erfelijk en sporadisch. Daarnaast beweerde Knudson dat er voor de ontwikkeling van een tumor twee mutaties ( hits ) nodig zijn. In het geval van erfelijke of familiale kanker heeft het individu reeds bij de geboorte één mutatie overgeërfd van vader of moeder, waardoor één allel van een tumorsuppressorgen werd geïnactiveerd. Dit noemt men een kiembaan of germinale mutatie. Slechts één bijkomende somatische mutatie is nodig voor de ontwikkeling van een tumor. Bij sporadische tumoren moeten er twee somatische mutaties (deleties of puntmutaties) optreden die leiden tot de inactivatie van beide allelen van een tumorsuppressorgen, vooraleer een tumor zich kan ontwikkelen (11). 22

23 Literatuurstudie Figuur 4 De 'two hit'-hypothese van Knudson. Figuur A toont sporadische kanker, hier zijn twee somatische mutaties in het TSG (tumorsuppressorgen) nodig voor het ontwikkelen van een tumor. Figuur B toont een erfelijk kankermodel, waarbij reeds één mutatie werd overgeërfd bij de geboorte. Een tweede somatische mutatie zorgt voor het ontstaan van een tumor (12). De meeste colorectale kankers zijn sporadische kankers. Vijftien tot twintig procent kent een familiaal voorkomen, terwijl ongeveer vijf procent erfelijk is (figuur 5)(9). Bij sporadische colonkanker heeft de patiënt geen andere familieleden met de ziekte. Bij familiaal voorkomen vertonen enkele familieleden van de patiënt een voorgeschiedenis van colonkanker. Bij patiënten met erfelijke colonkanker wordt een sterke familiale voorgeschiedenis van de ziekte waargenomen aan één zijde van de familie, waarbij veel familieleden zijn gestorven ten gevolge van deze ziekte (10). 23

24 Literatuurstudie Figuur 5 Percentage sporadische colonkanker, IBD ( Inflammatory bowel disease ), FAP (familiale adenomateuze polyposis), HNPCC (hereditair non-polyposis colorectaal carcinoom) en FH (positieve familie geschiedenis) (9) Colonkanker syndromen: familiale adenomateuze polyposis en hereditaire non-polyposis colorectaal carcinoom Twee belangrijke erfelijke vormen van colonkanker zijn gekend, familiale adenomateuze polyposis (FAP) en hereditaire non-polyposis colorectaal carcinoom (HNPCC). Deze twee syndromen worden in detail besproken in hoofdstukken 2.3 en 2.4. Bij de erfelijke colonkanker syndromen FAP en HNPCC kan een autosomaal dominante mutatie overgeërfd zijn van de vader of moeder. Alle cellen in het lichaam van dit individu zullen dan een normaal en een abnormaal gen bezitten. Het normale gen kan na verloop van tijd ook beschadigd geraken, waardoor kanker zich ontwikkelt. Anderzijds kan het zijn dat geen van beide ouders de mutatie in het gen draagt, maar dat het kind een nieuwe mutatie wel heeft gekregen op het moment van de bevruchting. Dit noemt men een de novo mutatie (13). Figuur 6 Autosomaal dominant overervingspatroon (14) 24

25 Literatuurstudie Het is belangrijk te begrijpen dat bij HNPCC, wanneer een mutant gen wordt overgeërfd, een verhoogd risico op colonkanker wordt doorgegeven. Niet alle mensen die een mutant gen overerven ontwikkelen colorectale kanker. FAP daarentegen is 100% penetrant. 2.3 Familiale adenomateuze polyposis Situering Familiale adenomateuze polyposis (FAP) is een eerder zeldzame autosomaal dominante aandoening waarbij talrijke adenomateuze poliepen ontstaan (4). De diagnose is duidelijk te stellen door de aanwezigheid van deze poliepen (15). FAP wordt veroorzaakt door een mutatie in het adenomateuze polyposis coli (APC) gen, die in punt besproken wordt (16). Het syndroom is verantwoordelijk voor één procent van alle colorectale kankers (9) Pathologische karakteristieken FAP wordt gekenmerkt door de ontwikkeling van talrijke adenomateuze poliepen in de dikke darm en het rectum. De poliepen kunnen zich al op kinderleeftijd gaan ontwikkelen en op de leeftijd van 40 jaar zijn er vaak honderden poliepen aanwezig. De adenomen kunnen bloedverlies via de anus veroorzaken, maar blijven meestal jarenlang asymptomatisch. Rond de leeftijd van 45 jaar ontwikkelt één van deze poliepen zich meestal tot een invasief adenocarcinoom, een tumor die ontstaat uitgaande van het slijmvlies. Een adenocarcinoom kan enkel worden voorkomen door regelmatige screening door middel van sigmoïdoscopie en tijdige colectomie (15). Tevens neemt bij FAP het risico op de ontwikkeling van andere soorten kankers, zoals maag- en duodenumkanker, toe. Andere afwijkingen, geassocieerd met FAP, zijn hypertrofische pigmentafwijkingen in de retina en epidermoïdcysten in de huid (18). Figuur 7 Het colon met adenomateuze poliepen (19) 25

26 Literatuurstudie Naast de beschreven klassieke FAP bestaat er ook een mildere vorm, atypische of attenuated FAP (AFAP). Deze aandoening wordt gekenmerkt door een kleiner aantal adenomateuze poliepen. De poliepen en dus ook de kanker ontwikkelen zich over het algemeen op latere leeftijd dan bij de klassieke FAP (15) Genetische achtergrond Zowel FAP als AFAP worden veroorzaakt door een mutatie in het APC gen. Dit gen bevindt zich op de lange arm van chromosoom 5 (5q21-q22) (figuur 8). Het is een groot gen met 15 exonen (16). Het APC gen is een tumorsuppressorgen en werkt als een gatekeeper (19). Het genproduct speelt een belangrijke rol in verschillende cellulaire processen die bepalen of een cel zich ontwikkelt in een tumorcel. Figuur 8 Het APC gen (aangeduid met pijl) is gelegen op de lange arm van chromosoom 5 (20) Meer dan 700 mutaties, verspreid over het volledige genoom, werden reeds ontdekt in families met het klassieke FAP of AFAP-syndroom. De meeste van deze mutaties leiden tot het ontstaan van een abnormaal kort, niet functioneel APC proteïne. Dit korte proteïne kan de cellulaire overgroei, die leidt tot het maken van poliepen (die maligne kunnen worden), niet onderdrukken (20) Moleculaire diagnostiek Voor de diagnose van FAP wordt een stamboom opgemaakt die uitleg geeft over de aanwezigheid van colorectale poliepen en kanker in de familie. De meerderheid (ongeveer 60 procent) van de patiënten met FAP hebben het gemuteerd gen geërfd van één van de ouders. Ongeveer 30 procent van de patiënten hebben echter geen familiale voorgeschiedenis voor FAP. De oorzaak ligt dan meestal bij een de novo mutatie. Bijgevolg hebben de volgende generaties wel het risico het gemuteerd gen over te erven (21). Daarnaast valt ook een deel te verklaren door mosaïcisme en door mutaties in het MUTYH gen. Mutaties in het MUTYH gen veroorzaken autosomale recessieve familiale adenomateuze polyposis. Wanneer dit gen gemuteerd is kunnen cellen 26

27 Literatuurstudie fouten, die gemaakt worden tijdens de DNA-replicatie, niet meer verbeteren. Op deze manier kunnen darmpoliepen ontstaan, met eventueel colorectale kanker tot gevolg (17). Er wordt bij voorkeur een bloedstaal afgenomen bij een persoon met FAP. DNA wordt uit het bloed geëxtraheerd en vervolgens wordt mutatie-onderzoek van het APC gen opgestart. Bij ongeveer 80 procent van de mensen met de klinische diagnose van FAP wordt een APC mutatie geïdentificeerd. Eens de familiale mutatie geïdentificeerd is, kan presymptomatisch onderzoek bij familieleden worden opgestart. Bij de overige 20 procent wordt de abnormaliteit van het gen niet gedetecteerd met een bloedtest. Belangrijk om op te merken is dat genetische testen geen kanker of poliepen detecteren, ze geven enkel de informatie dat een persoon de genmutatie gekregen heeft (21). 2.4 Hereditaire non-polyposis colorectaal carcinoom Situering Hereditaire non-polyposis colorectaal carcinoom (HNPCC), ook wel het Lynch syndroom genoemd, is een relatief frequent voorkomende autosomaal dominante aandoening, die gekenmerkt wordt door de ontwikkeling van colon-, endometrium- en andere carcinomen op relatief jonge leeftijd (22). HNPCC komt vaker voor dan FAP. De diagnose verloopt echter moeilijker dan bij FAP, omdat er geen of slechts een beperkt aantal adenomateuze poliepen worden gevormd. HNPCC wordt veroorzaakt door een defect in één van de DNA- mismatch herstelgenen, zoals bijvoorbeeld MSH2, MLH1 en MSH6 (22). Mensen met HNPCC hebben 80 procent kans om colorectale kanker te ontwikkelen (23). Tweederde van deze kankers doen zich voor in het proximale deel van het colon (24). Vrouwen hebben bovendien 71 procent kans om endometriumkanker te ontwikkelen (23). HNPCC is verantwoordelijk voor vijf procent van alle colorectale kankers (9) Pathologische karakteristieken HNPCC gaat gepaard met het optreden van één of enkele adenomateuze colonpoliepen (minder dan vijf) die een grote kans hebben te ontaarden in een kwaadaardige tumor. De poliepen kunnen, net zoals bij FAP, bloedverlies via de anus veroorzaken (15). Vaak zijn er echter geen symptomen tot het carcinoom groot en zelfs al uitgezaaid is. Daarnaast is er ook een verhoogd risico op de ontwik- 27

28 Literatuurstudie keling van andere kankers zoals endometrium-, maag-, dunnedarm-, lever-, huid-, prostaat-, ovariumkanker, kanker in de hersenen en urinewegen (22) Genetische achtergrond HNPCC wordt veroorzaakt door een mutatie in één van de DNA- mismatch herstelgenen (MMR genen). MMR genen coderen voor eiwitten die betrokken zijn bij het herstel van fouten, gemaakt gedurende de DNA-replicatie. Deze fouten kunnen deleties, inserties en foute incorporaties van basen zijn. De eiwitten vormen verschillende eiwitcomplexen die verantwoordelijk zijn voor de herkenning en het herstel van fouten (bijvoorbeeld een complex van het genproduct van MSH2 met het genproduct van MSH3 en MSH6). Als één eiwit in het complex niet goed functioneert of ontbreekt als gevolg van een mutatie in één van de genen, leidt dit tot de verstoring van het DNAherstel en een accumulatie van fouten in het DNA (22). De MMR genen zijn dus 'caretakers' die indirect tumorvorming kunnen promoten en HNPCC kunnen veroorzaken (4). Minstens vier MMR genen zijn reeds ontdekt die HNPCC kunnen veroorzaken. MLH1 bevindt zich op de korte arm van chromosoom 3 (3p21.3), MSH6 en MSH2 op korte arm van chromosoom 2 (2p21) en PMS2 op chromosoom 7 (7p22). Slechts bij 40 tot 60 procent van alle HNPCC-patiënten konden germinale mutaties worden aangetoond. MSH2 en MLH1 zijn verantwoordelijk voor de meerderheid (respectievelijk 40 en 50 procent) van deze mutaties in HNPCC-families, terwijl MSH6 verantwoordelijk is voor minder dan tien procent van de mutaties. Mutaties in het MSH6 gen zorgen meestal voor een atypische vorm van HNPCC, die gekenmerkt wordt door de aanwezigheid van endometriumkanker en de afwezigheid van colorectale kanker (16). Figuur 9 MLH1 gen is gelegen op chromosoom 3 (aangeduid met een pijl) (25) Moleculaire diagnostiek Bij de diagnose van HNPCC worden eerst de Amsterdam I/II criteria ( ) overlopen. Wanneer aan deze criteria voldaan is, wordt mutatie-onderzoek van de MMR genen uitgevoerd ter bevestiging van HNPCC. Wanneer niet voldaan is aan de Amsterdam I/II criteria worden de Bethesda 28

29 Literatuurstudie criteria ( ) overlopen. Wordt aan één van deze criteria voldaan, dan volgen immunohistochemisch-onderzoek (IHC) en microsatelliet-instabiliteiten-onderzoek (MSI). Zijn de MSI/IHCtesten positief, dan wordt er alsnog mutatie-onderzoek uitgevoerd. Figuur 10 Strategie bij de diagnose van HNPCC (26) De Amsterdam en Bethesda criteria Om families met HNPCC te kunnen onderscheiden van families met toevallige clustering van colorectale carcinomen zijn internationale criteria opgesteld door de International Collaborative Group on HNPCC (ICG-HNPCC). Deze klinische criteria zijn bekend als de Amsterdam I criteria (27). Ze hebben als doel de uniformiteit in de terminologie van HNPCC te bevorderen en internationale studies mogelijk te maken. De Amsterdam I criteria werden echter aangepast naar de Amsterdam II criteria toen bleek dat HNPCC ook geassocieerd is met andere buiten het colon gelegen maligne tumoren (24) (tabel 2). Tabel 2 Klinische criteria voor hereditair non-polyposis colorectaal carcinoom (22) - Histologisch bevestigd colorectaal carcinoom of een andere HNPCC-geassocieerde tumor (urineleider, endometrium, dunnedarm en nierbekken) bij tenminste drie familieleden in tenminste twee generaties. Één van de familieleden moet in de eerste graad verwant zijn met de andere twee; - Bij tenminste één van hen moet de diagnose zijn gesteld voor het vijftigste levensjaar; - De aandoening familiale adenomateuze polyposis moet zijn uitgesloten. Uit verschillende studies is echter gebleken dat deze criteria mogelijk te strikt zijn, waardoor patiënten met een defect in de DNA- mismatch herstelgenen kunnen worden gemist (27). De Amsterdam criteria zijn vervolgens aangepast tot de Bethesda criteria (tabel 3) (28). 29

30 Literatuurstudie Tabel 3 Aan ten minste één van deze Bethesda criteria moet worden voldaan (24) - Patiënten met synchrone kankers (twee of meer tumoren zijn aanwezig op hetzelfde moment) en metachrone kankers (eerste tumor wordt opgevolgd door een tweede tumor op een later moment) of HNPCC-geassocieerde kankers; - Patiënten met colorectale kanker (CRC) en een eerstegraads familielid met CRC en/of HNPCC-gerelateerde kanker en/of colorectale adenomen; - Eén van de kankers is gediagnosticeerd voor de leeftijd van 45 jaar en de adenoom voor de leeftijd van 40 jaar; - CRC of endometriumkanker is gediagnosticeerd voor de leeftijd van 45 jaar; - CRC aan de rechter zijde van het colon met een ongedifferentieerd patroon wat betreft histopathologie is gediagnosticeerd voor de leeftijd van 45 jaar. Wanneer voldoende aanwijzingen zijn voor HNPCC wordt genetisch onderzoek verricht. Omdat mutatie-onderzoek arbeidsintensief en duur is, wordt eerst een pre-screening verricht. MSI en IHCanalyse kunnen worden gebruikt om patiënten te identificeren met een hoge waarschijnlijkheid van de aanwezigheid van een MMR gendefect (24) Microsatellietinstabiliteiten-onderzoek In het DNA bevinden zich microsatellieten of Simple Sequence Repeats (SSR). Het zijn korte, repeterende DNA-sequenties van minder dan 150 basenparen lang, die in het gehele genoom gevonden kunnen worden. De samenstelling van de repeat is vaak zeer eenvoudig en bestaat uit een herhaling van één tot vier nucleotiden (bijvoorbeeld CACACACACA ) (24). Door het repetitief karakter worden tijdens de DNA-replicatie van deze microsatellieten vrij frequent fouten gemaakt, die normaal hersteld worden door de DNA- mismatch herstelgenen. In de kankercellen van HNPCC tumoren is deze controle op de replicatie beschadigd geraakt (de MMR genen functioneren niet meer goed). Hierdoor stapelen fouten (voornamelijk frameshifts ) zich op in de microsatellieten en worden de sequenties langer of korter. Dit fenomeen van abnormaal lange of korte microsatellieten noemt men microsatelliet instabiliteit (MSI) of replication errors (RER) (22). Over het algemeen worden bij MSI-analyse de internationale richtlijnen gehanteerd, die vastgelegd zijn op een workshop van de International Collaborative Group for HNPCC National Cancer Institute. Een panel van vijf microsatellietmarkers (referentie MS) wordt aanbevolen. Als twee van de vijf markers instabiliteit vertonen, wordt de tumor beschouwd als MSI-high (MSI-H). Als één 30

31 Literatuurstudie van de markers instabiliteit laat zien, wordt de tumor beschouwd als MSI-low (MSI-L). Een tumor zonder een instabiele marker wordt beschouwd als MS-stable (MSS). Als naast de vijf microsatellietmarkersets andere markers worden gebruikt, gelden de criteria hieronder weergegeven in tabel 4 (24). Tabel 4 Criteria voor MSI-H, MSI-L en MSS (24) MSI-H High microsatellite instability 30% van de markers vertonen instabiliteit MSI-L Low microsatellite instability < 30% van de markers vertonen instabiliteit MSS Microsatellite stability Geen enkele marker vertoont instabiliteit De lengte van de microsatellieten in tumorweefsel wordt vergeleken met de lengte van de microsatellieten in gezond weefsel (meestal bloed). MSI kan enkel als betrouwbaar geïnterpreteerd worden wanneer het tumorweefsel uit minimum 80 procent tumorcellen bestaat (28). Figuur 11 Detectie van microsatellietinstabiliteiten. Tumor-DNA (T) wordt vergeleken met DNA uit normaal weefsel (N) van dezelfde patiënt. De gebruikte markers voor de detectie van de instabiliteiten zijn internationaal vastgelegd. Figuur A toont een MSS-patroon, terwijl figuur B een MSI-H beeld weergeeft (28). Bijna alle colorectale carcinomen van patiënten met HNPCC vertonen een MSI-H beeld (meer dan 90 procent). MSI-analyse kan dus helpen bij de diagnose van dit syndroom. De analyse is echter niet specifiek voor HNPCC, daar het ook voorkomt bij tien tot vijftien procent van de sporadische colorectale en andere tumoren (24). 31

32 Literatuurstudie Immunohistochemisch-onderzoek Een andere snelle en goedkope techniek om MMR defecten op te sporen is immunohistochemie (IHC) van de MMR eiwitten in de tumoren (24). Door middel van immunohistochemisch-onderzoek kan de eiwitexpressie van de MMR genen bepaald worden. Dit onderzoek wordt toegepast op materiaal van tumorcellen en op normaal celmateriaal. Indien het betreffend eiwit niet meer tot expressie komt als gevolg van een mutatie, vindt geen aankleuring van het betreffende tumorweefsel voor dat specifieke eiwit plaats. Er kan aangetoond worden om welk gendefect het gaat door toepassing van IHC met antilichamen gericht tegen de verschillende MMR genen (28). Immunohistochemie is beschikbaar voor de detectie van de eiwitten gecodeerd door MLH1, MSH2 en MSH6 (28). Verlies van kleur voor het MSH2 eiwit is het gevolg van een germinale mutatie in het MSH2 gen. Ook voor MSH6 ligt een germinale mutatie aan de basis van het kleurverlies. Voor het MLH1 eiwit kan verlies van kleuring het resultaat zijn van hypermethylatie van de MLH1 promotor of van een germinale mutatie in het MLH1 gen. Figuur 12 Een immunohistochemische kleuring van een MSI-H patiënt. Figuur A toont kleuring van MLH1 en figuur B van MSH2. Er is duidelijk te zien dat de tumorcellen geen expressie vertonen voor MSH2. De tumorcellen tonen wel expressie voor MLH1. Het zou hier dus mogelijk kunnen gaan om een HNPCC-patiënt met een germinale MSH2-mutatie (28). Immunohistochemische kleuring is dus richtinggevend en een hulpmiddel bij de diagnose van HNPCC Mutatie-onderzoek Indien MSI-onderzoek en/of IHC-onderzoek een defect in één van de MMR genen suggereert, kan het onderzoek worden uitgebreid met mutatie-onderzoek (22). 32

33 Literatuurstudie In klinische diagnostische settings wordt meestal een bloedstaal getest op germinale mutaties in MLH1, MSH2 en MSH6. De mutaties in deze genen liggen verspreid over de gehele coderende sequenties. Bovendien blijkt dat HNPCC in de meeste families berust op een unieke germinale mutatie. Het onderzoek naar mutaties vereist daarom dat alle exonen onderzocht worden. Mutatieanalyse is hierdoor zeer arbeidsintensief en neemt een zestal maanden in beslag (22). De genetische test gebeurt bij voorkeur op een familielid waarbij colorectale kanker reeds is vastgesteld. Wanneer de familiale mutatie gevonden wordt in een welbepaald gen, kan presymptomatisch onderzoek worden uitgevoerd bij de rest van de familie (29). Honderden verschillende mutaties werden reeds gevonden. Het zijn voornamelijk kleine mutaties, maar er worden ook grote deleties gevonden bij MSH2 en MLH1. Kleine mutaties worden in het CMGG opgespoord via de op fluorescentie gebaseerde techniek High Resolution Melting Curve Analyse (HRMCA) (figuur 13). Afwijkingen in de smeltcurves wijzen op de aanwezigheid van een mutatie (30). Figuur 13 Principe van HRMCA. Door blootstelling aan stijgende temperaturen zal het DNA ultrasmelten. Hierbij komt de vooraf ingebouwde fluorescente dye vrij, wat resulteert in een typische smeltcurve (30). Indien een heterozygote mutatie in het amplicon aanwezig is, zal het DNA uitsmelten bij een andere temperatuur en een andere smeltcurve genereren. De X-as stelt de temperatuur voor, terwijl de Y-as de hoeveelheid fluorescentie in beeld brengt. Grote deleties worden opgespoord via Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) (figuur 14). MLPA is een multiplex-pcr methode die het mogelijk maakt om een abnormaal aantal kopieën te detecteren in wel 50 verschillende genomische DNA (of RNA)-sequenties. 33

34 Literatuurstudie De techniek van MLPA is gebaseerd op het feit dat de MLPA-probes hybridiseren aan de doelsequentie. In tegenstelling tot een standaard multiplex-pcr wordt slechts één paar PCR-primers gebruikt voor MLPA-amplificatie. De bekomen amplificatieproducten hebben een lengte tussen de 130 en 480 nucleotiden en kunnen geanalyseerd worden door middel van capillaire elektroforese. Het vergelijken van de verkregen pieken met een referentiestaal kan een indicatie geven omtrent de amplicons met een afwijkend aantal kopieën. Vier stappen worden gevolgd tijdens de MLPA-reactie (figuur 14) (31). Eerst gebeurt denaturatie van het DNA en overnacht incubatie met een mix van MLPA-probes. MLPA-probes bestaan uit twee gescheiden oligonucleotiden, die elk één van de PCR-primersequenties bevatten. De twee probe-oligonucleotides hybridiseren aan direct aangrenzende doelsequenties. Enkel wanneer de twee probe-oligonucleotiden beiden gehybridiseerd zijn aan hun aangrenzende doelsequenties, kan er ligatie optreden tijdens de ligatie reactie. Doordat enkel geligeerde probes exponentieel geamplificeerd zullen worden tijdens de PCR-reactie, zal het aantal probe-ligatieproducten een maat zijn voor de hoeveelheid doelsequenties in het staal. De amplificatieproducten worden gescheiden door middel van capillaire elektroforese. Figuur 14 Principe van MLPA (31) In de toekomst wil het CMGG methylatie-onderzoek van de MLH1 promotor invoeren vóór mutatie-onderzoek. 34

35 Literatuurstudie 2.5 Methylatie Epigenetica Ons genoom bestaat uit ongeveer drie miljard basenparen, waarvan minder dan twee procent codeert voor eiwitten (de genen). Fouten in de genen, zoals mutaties, deleties en inserties kunnen leiden tot het ontstaan van kwaadaardige tumoren. Niet alleen fouten in het DNA zelf, maar ook veranderingen in de structuur van het DNA, de zogenaamde epigenetische processen, beïnvloeden in belangrijke mate de activiteit van de genen (32). Epigenetica is letterlijk en figuurlijk een laag bovenop het DNA. Deze laag, die bestaat uit eiwitten en andere chemische moleculen, wijzigt niets aan de DNA-sequentie, maar bepaalt soms het onderscheid tussen ziek en gezond en ze controleert mee de eigenschappen van het organisme (33). In tegenstelling tot de klassieke genetische mutaties is een epigenetische verandering omkeerbaar. De twee meest bestudeerde epigenetische onderwerpen zijn DNA-methylatie en histon-modificatie. In het kader van mijn onderwerp wordt hieronder de DNA-methylatie verder besproken (34) Methylatie van DNA DNA-methylatie is één van de belangrijkste epigenetische processen. De term methylering beschrijft de toevoeging van een methylgroep aan een cytosine, waardoor een 5-methylcytosine gevormd wordt (figuur 15). Deze vorming van 5-methylcytosine gebeurt onder invloed van het enzym DNA-methyltransferase (DNMT), waarbij S-adenosylmethionine (SAM) de methyldonor is (32). Het enzym DNA-methyltransferase herkent de replicatievork, waar het efficiënt de CGdinucleotiden methyleert, waar de reeds bestaande streng ook gemethyleerd was. Dit mechanisme wordt de postreplicatieve onderhoudsmethylatie of maintenance methylation genoemd. Andere DNA-methyltransferases (zoals DNMT3a en DNMT3b) kunnen de overdracht van methylgroepen op naakt, ongemethyleerd DNA katalyseren. Deze de novo methylatie gebeurt onafhankelijk van de replicatie (33). Na de overdracht van de methylgroep volgt een spontane deaminatie, waardoor de base thymine ontstaat (34). 35

36 Literatuurstudie Figuur 15 Het mechanisme van DNA-methylatie In de regel gebeurt DNA-methylatie slechts als de cytosine base gevolgd wordt door een guanine base, de zogenaamde cytosinefosfaatguanine (CpG)-dinucleotiden (32). CpG-eilanden zijn DNAregio s die relatief veel CpG s in hun sequentie bevatten. Deze CG rijke gebieden zijn hoofdzakelijk terug te vinden in de promotorregio en het eerste exon van genen (35). Zo zijn ze tevens een goede indicator van waar een gen precies begint, aangezien ongeveer zestig procent van de promotors geassocieerd zijn met een CpG-eiland. Dit gegeven wordt dan ook gebruikt bij de voorspellingen omtrent de ligging van genen. De meeste CpG-eilanden blijven normaal vrij van methylatie en zijn geassocieerd met de zogenaamde housekeeping genen die vrijwel altijd transcriptioneel actief zijn (33). Het DNA is dus toegankelijk voor transcriptiefactoren en transcriptie kan plaatsvinden (32). Andere CpG-eilanden zijn dan in normale toestand wel weer gemethyleerd, zoals de genen die een rol spelen bij X- chromosoominactivatie bij vrouwen, weefselspecifieke expressie en genomic imprinting (33) DNA-methylatie en tumorvorming Promotorhypermethylering speelt een belangrijke rol in tumorontwikkeling. In tumorcellen wordt op grote schaal hypermethylering van coderende gebieden gevonden. Dit leidt tot transcriptionele inactivatie van tumorsuppressorgenen. Promotorhypermethylering onderdrukt dus de transcriptie van het gen door het voorkomen van de binding van de transcriptiefactoren die nodig zijn om de eiwitsynthese op gang te brengen. Methylering vormt op deze manier een alternatief voor mutaties op de weg naar maligne ontaarding als first of second hit in de two-hit -hypothese van Knudson. Er is een groot aantal genen geïdentificeerd, waarvan promotorhypermethylering een belangrijke rol speelt bij tumorgenese en tumorprogressie (32). Eén van de genen die het meest bestudeerd wordt in kanker is MLH1. Zoals reeds besproken in punt maakt dit gen deel uit van de DNA- mismatch herstelgenen (36). Inactivering van deze genen zorgt ervoor dat fouten in de DNAsequentie niet meer kunnen worden hersteld (35). 36

37 Literatuurstudie Detectie van DNA-methylatie Twee methoden worden tijdens het onderzoek gebruikt om de methylatiestatus van de MLH1 promotor te bepalen: methylatie-specifieke PCR (MSP) en methyqesd, een combinatie van methylatie-gevoelige digestie en real-time PCR. Deze twee methoden worden gedetailleerd besproken in hoofdstuk 3, materialen en methoden. 37

38 Mater ia len en methoden 3 Materialen en methoden 3.1 Onderzoek naar de methylatiestatus van de MLH1 promotor Patiëntenmateriaal DNA die geïsoleerd wordt uit bloed heeft andere kenmerken en afwijkingen dan DNA geïsoleerd uit weefsel ingebed in paraffine. Voor nazicht van somatische hypermethylatie, moet tumormateriaal beschikbaar zijn. Aangezien vers of diepgevroren tumormateriaal zeer schaars is, moet een beroep gedaan worden op tumorweefsel ingebed in paraffine. Nadeel van deze inbedding is echter dat er door de fixatie, inbedding en opslag van het tumorweefsel, schade kan aangebracht worden aan het DNA. De paraffineblokken met het tumormateriaal worden opgestuurd naar het DNA-labo van het CMGG, voor verder MSI-onderzoek. Na afwerken van dit onderzoek worden de blokken gewoonlijk teruggestuurd naar de laboratoria van anatome pathologie waar ze opgevraagd worden. Tumorblokken met een MSI-high fenotype of een afwijkend immunohistochemisch resultaat (literatuurstudie en ) werden bewaard met het oog op de studie beschreven in deze thesis. In totaal wordt de methylatiestatus van tumorweefsel van 35 patiënten onderzocht. Met behulp van een microtoom worden paraffinerolletjes van 20 µm gesneden. Uit deze paraffinerolletjes wordt DNA geëxtraheerd. Tabel 5 Patiëntenmateriaal Staal MSIfenotype IHC DNA-nummer paraffine DNA-nummer bloed 1 MSI-H D B.C. / 2 MSI-H D1 D D MSI-H D1-2 D D MSI-H D1-2-P D D D1-2 D D MSS D-P D / 7 MSI-H D1-2 D D DP D / 9 MSI-H D1-P D D MSI-H D1-P D D MSI-H D.R

39 Mater ia len en methoden 12 MSI-H D1 D / 13 MSS D1 D / 14 MSI-H D1-2 D / 15 MSI-H D2 D D MSI-H D1 D / 17 MSI-H D2 D / 18 MSI-H D1-P D D MSI-H D1-2 D / 20 MSI-H D1 D D MSS D1 D / 22 MSI-H D1-2 D D MSI-H D1 D D MSI-H D D MSI-H D / 26 MSI-H D D D MSI-H D2 D D MSI-H D1-P D D MSI-H D1 D / 30 MSI-H D1-P D D MSI-H D1 D / 32 MSI-H D1 D D MSI-H D D D MSI-H D D / 35 MSI-H D2-P V.D.P. D D1 is een defect in MLH1, D2 in MSH2 en DP in PMS DNA-isolatie en DNA-concentratie bepaling Principe DNA-isolatie DNA-isolatie is een cruciale stap in dit onderzoek, want contaminerende proteïnen en andere moleculen die DNA-degradatie veroorzaken, hebben een grote impact op de efficiëntie van de verder beschreven DNA-bewerkingen zoals bisulfietconversie, PCR-amplificatie en sequenering (37). Algemeen kan worden gesteld dat DNA-isolatie de extractie van DNA uit celkernen inhoudt. Verschillende protocols zijn in de literatuur beschikbaar. Drie basisstappen worden hierbij steeds doorlopen (figuur 16) (38) : 39

40 Mater ia len en methoden 1. Cellyse 2. Eiwit precipitatie 3. DNA-opzuivering Figuur 16 Het proces van DNA-isolatie (40) Bij cellyse worden de cellen opengebroken zodat het DNA vrijkomt. Enzymen, beads en detergenten kunnen hiervoor gebruikt worden. Fenol is bijvoorbeeld efficiënt voor het vernietigen van cellulaire membraaneiwitten en sodiumdodecylsulfaat (SDS) kan gebruikt worden voor het verwijderen van de membraanlipiden (38). Proteïnasen, zoals proteïnase K, zorgen voor de afbraak van gedenatureerde eiwitten en geven een betere vrijstelling van het DNA. Incubatie van de oplossing bij een temperatuur van 56 C voor 4 tot 24 uren inhibeert de degradatie van DNA door DNasen. De proteïnase K activiteit wordt uitgeschakeld door incubatie bij 95 C gedurende 5 minuten. Het neerslaan van proteïnen gebeurt met behulp van een zout zoals ammonium of natriumacetaat (38, 39). De laatste stap is de DNA-opzuivering. Dit kan onder andere gebeuren met behulp van een kolom met glasvezels. In het experiment wordt hiervoor gebruik gemaakt van de High Pure PCR Product Purification Kit van de firma Roche. De Binding Buffer zorgt, vanwege zijn hoge ph en zoutconcentratie, dat het DNA gebonden wordt aan het oppervlak van de glasvezels. Deze Binding Buffer kan ook een denaturerend reagens, zoals guanidinehydrochloride, bevatten. Daarna wordt de kolom gewassen met Washing Buffer om de resterende contaminanten (proteïnen, zouten) te verwijderen. Elueren gebeurt met behulp van de Elution Buffer, die een lage zoutconcentratie heeft (41) Materiaal 1.5 ml epjes (Eppendorf) Cell Lysis Solution (Qiagen cat ) Centrifuge 5415D (Eppendorf) 40

41 Mater ia len en methoden Ethanol pro analysi (Merck cat K ) Filtertips (Sorenson-10µL en Molecular BioProducts µL) High Pure PCR Product Purification Kit (Roche cat ) Binding Buffer Washing Buffer Inhibitor Removal Buffer Elution Buffer High Pure Filter tubes en collection tubes Paraffinerolletjes Pipetten (HTL Labmate) Proteïn Precipitation Solution (Qiagen cat ) Proteïnase K Solution (Qiagen cat 19131) Spectrofotometer ND 1000 V3.5.2 (NanoDrop) Thermomixer compact (Eppendorf) Vortex Reax 2000 (Heidolph) Werkwijze Cellyse: 1. Breng afhankelijk van de grootte van het tumormateriaal in de paraffineblok vier of vijf rolletjes paraffine met een steriel pincet in een 1.5 ml epje; 2. Voeg 300 µl Cell Lysis Solution toe en vortex; 3. Verhit 15 minuten bij 90 C in de thermomixer; 4. Maal het materiaal fijn met een schaar; 5. Voeg 30 µl Proteïnase K Solution (20 mg/ml) toe aan het epje en vortex; 6. Incubeer overnacht bij 56 C in de thermomixer; 7. Incubeer 5 minuten bij 95 C in de thermomixer; 8. Vortex en laat het epje afkoelen. Eiwit precipitatie: 1. Voeg 100 µl Proteïn Precipitation Solution toe aan het epje en vortex kort; 2. Zet het epje 5 minuten op ijs en vortex het epje daarna gedurende 20 seconden; 3. Centrifugeer het epje op maximum snelheid gedurende 3 minuten; 4. Neem het supernatans (bevat het DNA) af en pipetteer dit in een ander epje. 41

42 Mater ia len en methoden DNA-opzuivering: 1. Voeg 300 µl Binding Buffer (opgelet: bevat de irriterende stof guanidinehydrochloride) toe aan het supernatans en mix goed door op en neer te pipetteren; 2. Breng alles over op een kolom. Centrifugeer 1 minuut op 8000 g snelheid; 3. Plaats de kolom op een andere tube. Voeg 500 µl Inhibitor Removal Buffer toe. Centrifugeer 1 minuut op 8000 g snelheid; 4. Plaats de kolom op een andere tube. Voeg 500 µl Washing Buffer toe. Centrifugeer 1 minuut op 8000 g snelheid; 5. Plaats de kolom op een andere tube. Voeg 500 µl Washing Buffer toe. Centrifugeer 1 minuut op 8000 g snelheid; 6. Verwijder het supernatans en centrifugeer 10 seconden op maximum snelheid; 7. Breng de kolom over op een 1.5 ml epje en voeg 50 µl voorverwarmde (70 C) Elution Buffer toe aan de kolom. Centrifugeer 1 minuut op 8000 g snelheid; 8. Bewaar bij direct gebruik bij 4 C (anders bij -80 C) DNA-concentratie bepaling Na DNA-isolatie wordt de concentratie van het staal DNA gemeten met een spectrofotometer. Hiervoor wordt in deze thesis de Nanodrop gebruikt (figuur 17). Slechts een kleine hoeveelheid staal (1 µl) is nodig voor de meting en het gebruik van cuvetten is overbodig. Tevens wordt er met de Nanodrop gemeten met een hoge nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid. Figuur 17 De Nanodrop (43) De concentratie van het DNA wordt uitgedrukt in ng/µl en is gebaseerd op de absorbantie bij 260 nm. Daarnaast worden ook de ratio s 260/280 en 260/230 berekend. De 260/280 ratio is de verhouding van de absorbanties bekomen na meting bij een golflengte van 260 nm en 280 nm. DNA absorbeert namelijk UV-licht bij 260 en 280 nm. De waarde moet tussen de 1.8 en 2 liggen. Bij een ratio van 1.8 kan het DNA als zuiver beschouwd worden. De 260/230 ratio is de verhouding van de absorbanties bekomen na meting bij een golflengte van 260 nm en 230 nm. Dit is een tweede me- 42

43 Mater ia len en methoden ting voor de zuiverheid van DNA. Deze verhouding heeft meestal een waarde tussen de 1.8 en 2.2. Wanneer de ratio lager is, kan dit wijzen op de aanwezigheid van mogelijke contaminanten. Het uitvoeren van een meting op het nanodrop toestel is zeer eenvoudig. Eén µl staal wordt gepipetteerd op het toestel (figuur 18). Het toestel wordt gesloten zodat de druppel wordt samengedrukt. Op deze manier vormt het staal als het ware een kolom die door oppervlaktespanning op zijn plaats gehouden wordt (figuur 19). Figuur 18 Laden van het DNA-staal (42) Figuur 19 Het staal wordt samengedrukt en vormt als het ware een kolom (42) Een xenonlamp wordt gebruikt als lichtbron. Deze lamp zendt zichtbaar licht en UV-licht uit. Het licht wordt geanalyseerd nadat het door het staal is gegaan. Een speciaal softwareprogramma wordt gebruikt om de gegevens te verwerken (42) Bisulfietconversie Principe Een veel gebruikte techniek voor het detecteren van gemethyleerd DNA is de bisulfietbehandeling. Tijdens deze studie wordt gebruik gemaakt van de EZ DNA Methylation-Direct TM Kit. Genomisch DNA wordt eerst behandeld met het CT Conversion Reagent die ervoor zorgt dat de cytosine basen gesulfoneerd worden met behulp van natriumbisulfiet. De gesulfoneerde DNAoplossing wordt vervolgens geneutraliseerd met M-Binding Buffer, zodat het DNA kan binden aan de kolom. Door de behandeling van het DNA met M-Desulphonation Buffer worden de cytosine basen met de gesulfoneerde groep geconverteerd in uracil (uracil heeft in een PCR-reactie de eigenschap van thymine). De gemethyleerde cytosines worden echter beschermd tegen sulfoneren door de aanwezigheid van een methylgroep, waardoor deze cytosine basen onveranderd blijven. Na de omzetting kan het methylatieprofiel van het DNA bepaald worden, bijvoorbeeld via methylatiespecifieke PCR (43). 43

44 Mater ia len en methoden Figuur 20 DNA-sequencing resultaten na bisulfietbehandeling (43) Materiaal 1.7 ml epje (Sorenson, BioScience,Inc. cat 11510) Centrifuge 5415D (Eppendorf) DNA (500 ng) Ethanol pro analysi (Merck cat K ) EZ DNA Methylation-Direct TM Kit (Zymo Research cat D5020) CT Conversion Reagent (poeder) M-Dilution Buffer M-Binding Buffer M-Wash Buffer M-Desulphonation Buffer M-Elution Buffer M-Solubilization Buffer M-Reaction Buffer Zymo-Spin TM IC kolommen (met deksel) en collection tubes Filtertips (Sorenson-10µL en Molecular BioProducts µL) Mini Vortexer (VWR International) PCR-epje (ThermoScientific cat AB-0620) Pipetten (HTL Labmate) Thermocycler PTC-200 (MJ Research) Water (VWR International cat ) Werkwijze Bereiding van de reagentia: 44

45 Mater ia len en methoden CT Conversion Reagent : 1. Voeg 790 µl M-Solubilization Buffer en 300 µl M-Dilution Buffer toe aan het CT Conversion Reagent poeder. Vortex goed gedurende 10 minuten; 2. Voeg 160 µl M-Reaction Buffer toe en vortex opnieuw gedurende 1 minuut; Opmerking: de CT Conversion Reagent is lichtgevoelig, dus minimaliseer de blootstelling met licht. De beste resultaten worden verkregen wanneer de CT Conversion Reagent onmiddellijk na de bereiding wordt gebruikt. M-Wash Buffer : 1. Voeg 24 ml 100% ethanol toe aan 6 ml M-Wash Buffer (enkel bij eerste gebruik van de kit). Bisulfietconversie van het DNA: 1. Voeg 130 µl CT Conversion Reagent bij 20 µl DNA-staal (500 ng) in een PCR-epje; 2. Plaats het PCR-epje in de thermocycler; PCR-programma: Temperatuur Tijd 98 C 8 minuten 64 C 3.5 uren 4 C Bewaren tot 20 uren 3. Zet een tube met kolom klaar. Voeg 600 µl M-Binding Buffer toe aan de kolom; 4. Voeg het DNA-staal toe. Sluit het deksel, meng door enkele keren om te draaien; 5. Centrifugeer gedurende 30 seconden op maximum snelheid; 6. Breng 100 µl M-Wash Buffer in de kolom en centrifugeer gedurende 30 seconden op maximum snelheid. Opmerking: verwijder het supernatans (wanneer nodig) om contaminatie van de kolom te voorkomen; 7. Breng 200 µl M-Desulphonation Buffer in de kolom en incubeer 15 minuten op kamertemperatuur (20 C 30 C). Na incubatie, centrifugeer gedurende 30 seconden op maximum snelheid; 8. Breng 200 µl M-Wash Buffer in de kolom en centrifugeer gedurende 30 seconden op maximum snelheid. Breng opnieuw 200 µl M-Wash Buffer in de kolom en centrifugeer gedurende 30 seconden op maximum snelheid; 9. Breng de kolom over in een 1.7 ml epje en breng 10 µl M-Elution Buffer op de kolom matrix. Centrifugeer gedurende 30 seconden op maximum snelheid. Opmerking: naast M- 45

46 Mater ia len en methoden Elution Buffer kunnen ook water en Tris-EDTA (TE) buffer (ph 6.0) gebruikt worden om te elueren; 10. Het DNA is klaar voor analyse of kan bewaard worden bij -20 C voor later gebruik Polymeraseketting reactie Principe Het doel van Polymerase chain reaction (PCR)-amplificatie is het maken van een groot aantal kopieën van een welbepaalde doelwitsequentie. Tijdens de PCR-reactie worden telkens drie stappen doorlopen (figuur 21): 1. Denaturatie van de twee DNA-strengen; 2. Annealing van de primers op de DNA-streng; 3. Extensie van de nieuwgevormde DNA-streng. De eerste stap, de denaturatie, bestaat uit het opwarmen van het DNA-mengsel tot 94 C. Hierdoor worden de waterstofbruggen van de dubbelstrengige helix verbroken en verkrijgt men enkelstrengige templaten. Deze enkelstrengen zijn zowel nodig voor de vasthechting van de primers (forward en reverse) als voor de vasthechting van DNA-polymerase. Daarnaast worden ook alle enzymatische reacties hier gestopt. Vervolgens wordt de temperatuur verlaagd tot ongeveer 54 C (deze temperatuur wordt in het experiment gebruikt) om de primers te laten binden op de complementaire plaatsen van het enkelstrengig DNA. Bij de laatste stap wordt de temperatuur opnieuw verhoogd tot 72 C. Dit is de optimale temperatuur voor het thermostabiele DNA-polymerase. Deze temperatuur blijft enkele minuten constant zodat de DNA-synthese kan doorgaan. Hierna wordt opnieuw verhit tot 94 C zodat de nieuw gemaakte strengen loskomen van de oorspronkelijke templaten. De enkelstrengige DNA-ketens dienen dan weer als matrijs voor de primers en zo wordt een nieuwe cyclus begonnen (44). 46

47 Mater ia len en methoden Figuur 21 De drie stappen tijdens PCR: denaturatie, annealing en extensie (44) Heel belangrijk tijdens het proces van PCR zijn de primers die gebruikt worden. Deze zijn het best exact complementair met het templaat-dna. Tegenwoordig zijn goede softwareprogramma s beschikbaar voor primerdesign. Alamut wordt in het labo gebruikt. Voor de DNA-synthese wordt gebruik gemaakt van een thermostabiel DNA-polymerase, zoals Taq-polymerase, die zorgt voor de inbouw van de bouwstenen, de dntp s (een algemene term voor de vier deoxyribonucleotides, datp, dttp, dgtp en dctp). Tot slot dient ook een hoeveelheid buffer en MgCl 2 te worden toegevoegd. Mg 2+ -ionen vormen een oplosbaar complex met de dntp s, wat belangrijk is voor de dntp-incorporatie. Daarnaast stimuleren ze ook de polymeraseactiviteit en verhogen ze de smelttemperatuur van het dubbelstrengig DNA (45). Naast de basistechniek zijn intussen al ontelbare varianten in gebruik. Voor de experimenten beschreven in dit eindwerk wordt gebruik gemaakt van een variant op de methylatie specifieke PCR (MSP). Bij de MSP worden twee verschillende primerparen gebruikt (MSP-methylated en MSPunmethylated). De MSP-methylated primers zijn zo ontworpen dat ze kunnen hybridiseren met potentieel gemethyleerde cytosines. In de primer combinatie voor amplificatie van nietgemethyleerd DNA (MSP-unmethylated) zijn de cytosines vervangen door thymines (sense primer) of adenines (antisens primer) (figuur 22) (46). 47

48 Mater ia len en methoden Figuur 22 Het principe van methylatie specifieke PCR (47) Het protocol dat uitgevoerd wordt tijdens dit eindwerk voor nazicht van methylatie van de MLH1 promotor werd verkregen via Dr. Marjolein Ligtenberg, KGCN, Afdeling Anthropogenetica, Nijmegen en is eigenlijk een variant op de MSP. De primers zijn zodanig gekozen dat ze geen CpGeilanden bevatten. Na bisulfietbehandeling van het patiënten DNA, gebeurt een amplificatie met fluorescent gelabelde primers en scheiding met behulp van fragmentanalyse. Eén fragment uit de MLH1 promotor regio wordt geamplificeerd (figuur 23). De volledige sequentie van de MLH1 regio is terug te vinden in bijlage 1. De primersets die gebruikt worden tijdens dit experiment zijn P344/P345 (amplificatie van DNA na bisulfietbehandeling) en P352/P353 (zouden in theorie geen amplificatie mogen geven na bisulfietconversie) (tabel 6). GAGGTATATAAGTTCGGTTTCGGTATTTTTGTTTTTATTGGTTGGATATTTCGTATTTTT CTCCATATATTCAAGCCAAAGCCATAAAAACAAAAATAACCAACCTATAAAGCATAAAAA CGAGTTTTTAAAAACGAATTAATAGGAAGAGCGGATAGCGATTTTTAACGCGTAAGCGTA GCTCAAAAATTTTTGCTTAATTATCCTTCTCGCCTATCGCTAAAAATTGCGCATTCGCAT TATTTTTTTAGGTAGCGGGTAGTAGTCGTTTTAGGGAGGGACGAAGAGATTTAGTAATTT ATAAAAAAATCCATCGCCCATCATCAGCAAAATCCCTCCCAGCTTCTCTAAATCATTAAA ATAGAGTTGAGAAATTTGATTGGTATTTAAGTTGTTTAATTAATAGTTGTCGTTGAAGGG TATCTCAACTCTTTAAACTAACCATAAATTCAACAAATTAATTATCAACAGCAACTTCCC Figuur 23 Overzicht van het fragment uit de MLH1 promotor regio dat wordt geamplificeerd; de primers zijn aangeduid in het paars. Na bisulfietbehandeling van het patiënten DNA zijn de cytosines gewijzigd in thymines. In geval van methylatie zijn de cytosines in de CpG-dinucleotiden (grijs) echter niet omgezet. De primerset P344/P345 zal amplificatie opleveren na PCR, terwijl de primerset P352/P353 dit (in theorie) niet doet. Op basis van de lengtes die bekomen worden bij fragmentanalyse kan een onderscheid gemaakt worden tussen gemethyleerde en niet-gemethyleerde allelen (zie 3.1.7). 48

49 Mater ia len en methoden Tabel 6 Een lijst met de primersets (46) Primer Forward/ Reverse primer Label Primer sequentie (5 3 ) P344 Forward primer FAM TAT TTT TGT TTT TAT TGG TTG GAT A P345 Reverse primer geen AAT ACC AAT CAA ATT TCT CAA CTC T P352 Forward primer FAM CAT CTC TGC TCC TAT TGG CTG GAT ATT T P353 Reverse primer geen AAT GCC AGT CAA ATT TCT CAA CTC T Materiaal 10x PCR rxn Buffer (-MgCl 2 ) (Invitrogen TM cat P/N Y02028) Centrifuge 5415D (Eppendorf) dntp s (Healthcare) Filtertips (Sorenson-10µL en Molecular BioProducts µL) Forward en reverse primer (Invitrogen TM ) Magnesiumchloride (Invitrogen TM cat P/N Y02016) Mini Vortexer (VWR International) Pipetten (HTL Labmate) Platinum Taq DNA-polymerase (Invitrogen TM cat ) Template-DNA Thermocycler PTC-200 (MJ Research) Water (VWR International cat ) Werkwijze Pre-PCR, amplificatie en post-pcr moeten goed gescheiden worden van elkaar. Er wordt steeds gewerkt in aparte ruimten en laboschorten dienen verwisseld te worden. Dit is een noodzaak om contaminatie te vermijden. Daarnaast wordt in pre-pcr gewerkt met filtertips. De amplificatie mix wordt gemaakt in pre-pcr. Component Volume (20 µl reactie) Water 9.42 MgCl 2 (50 mm) 1.4 dntp s (1 mm) 5 10x PCR Rxn Buffer 2 Forward primer (gelabeld) (100 µm) 0.05 Reverse primer (100 µm) 0.05 Platinum Taq DNA-polymerase (5 U/µL) 0.08 Template-DNA (100 ng) 2 PCR-programma: 49

50 Mater ia len en methoden Stap Temperatuur Tijd Aantal cycli Initiële denaturatie 94 C 10 minuten Denaturatie Annealing 92 C 56 C 45 seconden 45 seconden 59 Elongatie 72 C 45 seconden Finale elongatie 72 C 30 minuten Het PCR-product kan gedurende lange tijd bewaard worden bij 4 C Agarosegelelektroforese Principe Agarosegelelektroforese is de gemakkelijkste en meest gebruikte manier om DNA te scheiden en te analyseren. Een agarosegel met geschikte concentratie wordt in een elektroforesebak, gevuld met Tris-boraat- EDTA (TBE)-buffer, geplaatst. Aan beide zijden van de gel bevinden zich elektroden die zorgen voor een constante stroom doorheen de gel (figuur 24). De TBE-buffer zorgt voor een goede geleiding van de stroom. Van zodra de stroom wordt ingeschakeld, verplaatsen de negatief geladen DNA-fragmenten (omwille van de fosfaatgroepen) zich van de negatieve elektrode (kathode) naar de positieve elektrode (anode). Figuur 24 Het principe van agarosegelelektroforese. Een elektroforesebak met elektroden aan beide zijden en een stroombron. De gelmatrix is te vergelijken met een zeef. Kleinere DNA-fragmenten bewegen vlugger doorheen de poriën in vergelijking met de grote fragmenten. 50

51 Mater ia len en methoden Omdat DNA niet zichtbaar is, wordt een laadbuffer toegevoegd, die één of meerdere kleurstoffen en sucrose bevat. De sucrose dient als densiteitsverhoger, zodat het DNA niet wegdrijft in de elektroforesebuffer, maar zakt in de wells. Het zichtbaar maken van de DNA-fragmenten kan gebeuren met behulp van ethidiumbromide. Deze kleuring is de snelste, gevoeligste en meest reproduceerbare manier om DNA zichtbaar te maken. Ethidiumbromide is echter mutageen, waardoor er zeer voorzichtig en steeds met handschoenen moet worden gewerkt. De bandjes zijn zichtbaar onder UV-licht (45). Na de elektroforese kan het DNA geïdentificeerd worden aan de hand van een merker met een gekend moleculair gewicht Materiaal 1x TBE buffer; deze buffer wordt gemaakt vertrekkende van een 10x TBE UltraPure TM buffer (Invitrogen TM cat ) Bovenweger (Navigator TM ) Elektroforesebak en elektroden (Sub-cell GT, Bio-Rad) Erlenmeyer Ethidiumbromide (1 druppel/50 ml) Fototoestel (Canon) Kammetjes en gietvorm Microtiterplaat (Greiner bio-one) PCR-product Pipet (HTL Labmate) ReddyRun Gel Loading Buffer (laadbuffer) (ThermoScientific cat N/A) Stroombron (Bio-Rad) Superladder-Low 100bp Ladder with ReddyRun TM (merker) (ABgene) UltraPure TM Agarose (Invitrogen cat ) UV-plaat (Syngene) Werkwijze Bereiden van een 1% agarosegel: 1. Weeg 2.5 g agarose af op een weegvlo en breng over in een erlenmeyer; 2. Voeg 250 ml 1x TBE buffer toe aan de erlenmeyer en roer goed; 3. Laat opkoken in de magnetron gedurende 2 minuten; 4. Roer goed en laat verder opkoken in de magnetron gedurende 1 minuut; 51

52 Mater ia len en methoden 5. Laat afkoelen tot minimum 50 C; 6. Voeg 5 druppels ethidiumbromide toe aan de erlenmeyer. Opgelet: ethidiumbromide is carcinogeen, dus ga heel voorzichtig te werk. Roer goed; 7. Plaats de kammetjes in de gietvorm; 8. Giet de gel in de gietvorm en verwijder de aanwezige luchtbellen; 9. Laat de gel stollen gedurende 30 minuten. Laden van de PCR-stalen: 1. Breng de gel over naar een elektroforesebak die gevuld is met 1x TBE buffer (de gel moet ondergedompeld zijn in TBE buffer); 2. Breng 2 µl laadbuffer en 5 µl PCR-product in microtiterplaat en meng goed door op en neer te pipetteren; 3. Laadt steeds 2 µl merker in de eerste laan van de gel; 4. Breng alle product van de microtiterplaat over in de well van de gel. Gel laten lopen: 1. Plaats het deksel op de elektroforesebak en steek de stekker in de stroombron; 2. Steek de stroombron aan en zet op 135 V. Klik op Run; 3. Kijk of er luchtbelletjes gevormd worden aan de polen; 4. Laat gedurende 30 tot 45 minuten de gel lopen. Fotograferen van de gel: 1. Leg de gel op de UV-plaat en fotografeer de gel MultiNA Principe Tijdens de loop van de stage werd de agarosegelelektroforese in het CMGG vervangen door een microchip elektroforese systeem voor DNA/RNA-analyse, de MultiNA (figuur 25). Deze techniek kent verschillende voordelen tegenover klassieke agarosegelelektroforese: 1. Lagere kosten; 2. Sneller (75 seconden per analyse); 3. Minder arbeidsintensief; 4. Hogere gevoeligheid (tien maal gevoeliger dan met ethidiumbromide); 5. Hogere resolutie en hogere reproduceerbaarheid; 52

53 Mater ia len en methoden 6. Heel gemakkelijk in gebruik. Voor het experiment wordt gebruik gemaakt van de DNA-500 kit (48). Figuur 25 De MultiNA (48) Materiaal Aluminium tape (Greiner bio-one) Centrifuge 5804 (Eppendorf) DNA-500 Kit (Shimadzu cat ) Marker Solution Separation Buffer Milli-Q water (Millipore cat TANKPE 060) MultiNA (Shimadzu) PCR-plaat (ThermoScientific) PCR-product Pipetten (HTL Labmate) Size Ladder (Invitrogen TM cat ) SYBR Gold (Invitrogen TM ) TE Buffer (Invitrogen TM cat ) Vortex-genie 2 (Scientific Industries) Water (VWR International cat ) 53

54 Mater ia len en methoden Werkwijze Maken van de reagentia: 1. Maak een 1/100 verdunning van SYBR Gold met TE Buffer en vortex; 2. Maak de Separation Buffer, door bij 990 µl Separation Buffer (DNA-500 kit) 10 µl verdund SYBR Gold toe te voegen en vortex. Breng in de daartoe bestemde vial ; 3. Breng de nodige hoeveelheid Marker Solution in de daartoe bestemde vial ; 4. Verdun de Size Ladder 1/50 met TE Buffer, vortex en breng in een epje; 5. Plaats alle reagentia op de juiste plaats in de MultiNA; 6. Vul de washing solution bij en leeg het afvalvat. Klaarmaken van het staal: 1. Voeg 5 µl PCR-product en 5 µl water in een well van een PCR-plaat; 2. Breng op de plaat een aluminiumfolie om verdamping te voorkomen; 3. Vortex de plaat en centrifugeer. Er mogen geen luchtbellen aanwezig zijn; 4. Plaats de plaat in de MultiNA. Maken van het analyseprogramma op de computer: 1. Start het softwareprogramma op; 2. Klik het juiste analyseprogramma aan; 3. Klik op de start knop. Opmerking: na het klaarmaken van het staal wordt de plaat afgegeven aan de persoon die bevoegd is voor het werken met de MultiNA Fragmentanalyse Principe Capillaire elektroforese is een techniek die gebruikt wordt om fluorescent gelabelde DNAfragmenten te scheiden volgens grootte. Hiervoor wordt gebruik gemaakt van een op fluorescentie gebaseerd detectiesysteem. Tijdens de capillaire elektroforese worden de producten geïnjecteerd (elektrokinetisch) in capillairen die gevuld zijn met een polymeer. Een hoge spanning wordt gebruikt zodat negatief geladen DNA-fragmenten door het polymeer in de capillairen bewegen naar de positieve elektrode (figuur 26). 54

55 Mater ia len en methoden Figuur 26 Fluorescent gelabelde DNAfragmenten bewegen door het capillair (49) Figuur 27 Detectie van de fluorescent gelabelde DNA-fragmenten (49) Voor het bereiken van de positieve elektrode passeren de fluorescent gelabelde DNA-fragmenten (die gescheiden zijn volgens grootte) een laser die ervoor zorgt dat de DNA-fragmenten fluoresceren. Deze fluorescentie wordt gedetecteerd en omgezet in een digitaal signaal. Omdat elke dye licht uitzendt bij een verschillende golflengte (na excitatie door laser), worden vier verschillende kleuren en dus ook de vier verschillende basen gedetecteerd en gescheiden (figuur 27) (49). In het labo wordt de ABI3130xl of ABI3730xl Genetic Analyser gebruikt. Het is belangrijk dat voor dit proces DNA gebruikt wordt die geamplificeerd is via PCR door gebruik te maken van primers specifiek voor de regio van interesse. Minstens één van de primers, forward of reverse, moeten gelabeld zijn. Een met FAM gelabelde forward primer wordt gebruikt tijdens het onderzoek. Het PCR-product wordt geanalyseerd met de ABI3130 of ABI3730. Bij gemethyleerd DNA ontstaat een piek bij 183 bp en bij ongemethyleerd DNA ontstaat een piek bij 186 bp (figuur 28). ROX-500 size standard wordt gebruikt als interne lengtestandaard om fragmenten aan te tonen van 35 tot 500 bp. Hi-Di formamide is een stof die gebruikt wordt om het DNA te denatureren en de oplossing te hersuspenderen. 55

56 Mater ia len en methoden Figuur 28 Figuur A toont geen methylatie, figuur B vertoont 50 % methylatie. 100% methylatie wordt getoond in figuur C Materiaal 1.7 ml epje (Sorenson, BioScience, Inc.) ABI3130xl (of ABI3730xl) Genetic Analyzer (Applied Biosystems) ABI-plaat Centrifuge 5415D (Eppendorf) Centrifuge 5804 (Eppendorf) GeneScan TM -500 ROX TM Size Standard (Applied Biosystems cat P/N401734) Hi-Di TM Formamide (Applied Biosystems cat ) Pipetten (HTL Labmate) Septa Vortex Reax 2000 (Heidolph) Vortex-genie 2 (Scientific Industries) Werkwijze 1. Breng 9.5 µl Hi-Di formamide en 0.5 µl ROX 500 in een 1.7 ml epje. Opmerking: er wordt in een trekkast gewerkt omdat Hi-Di een schadelijk stof is; 2. Vortex het epje goed en centrifugeer; 3. Pipetteer 9 µl mix en 1 µl PCR-product in een well van de ABI-plaat; 4. Breng een septa op de ABI-plaat; 5. Vortex de plaat en centrifugeer; 6. Geef de plaat af aan de Genetic Service Unit (GSU) voor verdere fragmentanalyse 56

57 Mater ia len en methoden De gegevens worden ingegeven via het softwareprogramma Run Editor. GeneMapper wordt gebruikt voor het bekijken van de resultaten van de fragmentanalyse Sequeneren Principe Het doel van sequeneren bestaat erin de precieze basenvolgorde van een DNA-fragment te ontrafelen. De populairste methode voor het sequeneren is de Sanger methode. Twee enzymen die gebruikt worden tijdens het sequeneringsproces zijn Exonuclease I en Antarctic phosphatase. Exonuclease I katalyseert het verwijderen van enkelstrengig DNA in de 3 5 richting. Antarctic phosphatase katalyseert de verwijdering van 5 fosfaatgroepen van DNA en RNA. De sequenerings-reactie komt overeen met de eerder besproken PCR-reactie (50). Deze wordt manueel uitgevoerd. Daarna wordt het staal op de ABI3130xl of ABI3730xl Genetic Analyser gestoken. Het principe is hetzelfde als bij fragmentanalyse. Het opzuiveren van de sequeneringsproducten kan gebeuren via ethanol precipitatie of met magnetische beads Materiaal ABI3130xl (of ABI3730xl) Genetic Analyzer (Applied Biosystems) ABI-plaat Antarctic Phosphatase (AP) (5000 U/mL) (New England BioLabs cat #M0289S) Beads (Agencourt CleanSEQ - cat ) Centrifuge 5415D (Eppendorf) Centrifuge 5804 (Eppendorf) Ethanol 70%, 85% en 95% (verdunning gemaakt uitgaande van ethanol pro analysi) Exonuclease I (ExoI) (20000 U/mL) (New England BioLabs cat #M023S) Hi-Di TM Formamide (Applied Biosystems cat ) Magnetisch veld Natriumacetaat (1.5 M; ph 4.5) PCR-product Pipetten (Labmate) Primer (Invitrogen TM ) Ready Reaction Mix (Applied Biosystems) 57

58 Mater ia len en methoden Septa Sequencing buffer (Applied Biosystems) Sticker (ThermoScientific) Thermocycler PTC-200 (MJ Research) Vortex Reax 2000 (Heidolph) Vortex-genie 2 (Scientific Industries) Water (VWR International cat ) Werkwijze Werk op ijs! Opzuiveren van het PCR-product met behulp van enzymen: 1. Meng voor elke PCR-reactie: µl water; µl AP; µl ExoI; 2. Voeg 5 µl PCR-product toe aan 1 µl Exo-AP mix; 3. Incubeer in de thermocycler; PCR-programma: Temperatuur Tijd 37 C 15 minuten 80 C 20 minuten 4 C 1 minuut Sequeneringsreactie: 1. Maak sequeneringsreactie mix: - 2 µl sequencing buffer (5x); - 2 µl primer (1 µm); - 1 µl RR; - 1 µl PCR-product; µl water; 2. Incubeer in de thermocycler; PCR-programma: Temperatuur Tijd Aantal cycli 92 C 10 seconden 58

59 Mater ia len en methoden 55 C 5 seconden 25 cycli 60 C 4 minuten Precipitatie: De sequeneringsreactie kan op twee manieren opgezuiverd worden: Met behulp van ethanol 1. Maak een mix van: - 3 µl natriumacetaat (NaOAc) 1.5 M; µl ethanol 95%; µl water; 2. Vortex en centrifugeer; 3. Voeg 40 µl mix toe aan PCR-epje met DNA en vortex; 4. Laat 15 minuten incuberen op kamertemperatuur; 5. Centrifugeer gedurende 20 minuten op maximum snelheid; 6. Verwijder het supernatans; 7. Voeg 75 µl ethanol 70% toe en vortex; 8. Centrifugeer gedurende 10 minuten op maximum snelheid; 9. Verwijder het supernatans; 10. Plaats het epje 1 minuut op 90 C; 11. Voeg 10 µl Hi-Di toe aan het epje. Meng goed door op en neer te pipetteren en breng over in een well van een ABI-plaat; 12. Plaats septa op de plaat en denatureer 5 minuten bij 95 C; 13. Centrifugeer de plaat en geef de plaat af aan de GSU voor een just run. Met behulp van magnetische beads 1. Resuspendeer de beads en voeg 10 µl beads toe aan elk sequence product; 2. Voeg 45 µl ethanol 85% toe en meng goed door op en neer te pipetteren; 3. Plaats de plaat met de sequence producten 3 minuten op een magnetisch veld; 4. Verwijder het supernatans; 5. Voeg 100 µl ethanol 85% toe en plaats de plaat 30 seconden op het magnetisch veld; 6. Verwijder het supernatans; 7. Droog gedurende 10 minuten op 37 C; 8. Voeg 40 µl water toe en meng goed door op en neer te pipetteren; 9. Laat 3 minuten staan en plaats de plaat daarna weer op het magnetisch veld; 10. Pipetteer 30 µl in een well van een ABI-plaat; 59

60 Mater ia len en methoden 11. Breng een sticker op de plaat en geef de plaat af aan de GSU voor een just run. De gegevens worden ingegeven via het software programma Finch. Sequencing Analysis 5.2 wordt gebruikt voor het bekijken van de sequenties MethyQESD Principe De techniek is gebaseerd op een combinatie van een methylatie-gevoelige digestie en real-time PCR. Twee digesties worden hierbij uitgevoerd op elk DNA-staal: een digestie met het methylatiegevoelige restrictie endonuclease HinP1I dat enkel ongemethyleerde CGCG knipt in het amplicon en een digestie met de endonucleases XbaI en DraI die knippen buiten het amplicon (figuur 29). De overnacht incubatie bij 37 C zorgt voor de digestie van het DNA. De incubatie bij 70 C voor 20 minuten inactiveert nadien de endonucleasen. De real-time PCR of q-pcr wordt uitgevoerd zodat de hoeveelheden PCR-producten kunnen bepaald worden (51). Primers die bij de amplificatie van de MLH1 promotor gebruikt worden zijn prox en dist (tabel 7). De ligging van deze primers is terug te vinden in bijlage 1. Tabel 7 Een lijst met de primersets Primer Primer sequentie (5 3 ) Prox up CGGCATCTCTGCTCCTATTG Prox down TGCCCGCTACCTAGAAGGAT Dist up AAGTCGCCCTGAC.GCAGAC Dist down ACTACGAGGCTGAGCACGAA 60

61 Mater ia len en methoden Figuur 29 Principe van MethyQESD. Eerst gebeurt een restrictie met het methylatie-gevoelige HinP1I en de enzymen DraI en XbaI in humaan DNA. Daarna volgt ampificatie met behulp van real-time PCR (51) Materiaal 10x NEBuffer 4 (New England BioLabs cat #B7004S) Centrifuge 5804 (Eppendorf) DNA DraI (20000 U/mL) (New England BioLabs cat #R01295) Forward en reverse primer HinP1I (10000 U/mL) (New England BioLabs cat #R0124S) Human Genomic DNA LightCycler (Roche) LightCycler 480 Multiwell plaat (Roche) Master mix PCR-epje (ThermoScientific cat AB-0620) Pipetten (HTL Labmate) Purified 100x BSA (New England BioLabs cat #B9001S) RNase vrij water (Sigma- cat W4502) Sealing Foil (Roche) Thermocycler PTC-200 (MJ Research) XbaI (20000 U/mL) (New England BioLabs cat #R01455) 61

62 Mater ia len en methoden Werkwijze Uitvoeren van een digestie: 1. Maak een mix met het enzym HinP1I: - 3 µl HinP1I; - 2 µl 10x NEBuffer 4; - 5 µl DNA (100 ng); - 10 µl water; 2. Maak een mix met de enzymen DraI en XbaI: µl DraI; µl XbaI; - 2 µl 10x NEBuffer 4; - 5 µl DNA (100 ng); µl BSA; µl water; 3. Incubeer overnacht bij 37 C; 4. Incubeer gedurende 20 minuten bij 70 C; 5. Bewaar bij 4 C. Uitvoeren van een real-time PCR: 1. Maak mixen per amplicon: µl RNase vrij water; - 5 µl master mix; µl forward primer; µl reverse primer; Opmerking: de twee huishoudgenen ZNF80 en GPR15 worden meegenomen; 2. Verdeel 9 µl mix uit in een plaat; 3. Voeg 1 µl DNA (gedigesteerd) toe. Een blanco en genomisch DNA worden steeds meegenomen; 4. Plak een sticker op de plaat en centrifugeer de plaat; 5. Plaats de plaat in de LightCycler; 6. Open het softwareprogramma van de LightCycler en laat lopen met het geschikte programma; 7. Analyseer de resultaten met een excel file. 62

63 Mater ia len en methoden Gemethyleerd controle DNA Principe Om na te gaan of de uitgevoerde werkwijze de methylatie detecteert, wordt gemethyleerd DNA gebruikt als positieve controle. Het CpG-methyltransferase methyleert alle cytosine basen in de dubbelstrengige dinucleotide sequentie 5 CG 3. S-adenosyltransferase helpt bij de overdracht van de methylgroepen. Na de behandeling met CpG-methyltransferase volgt de opzuivering van het DNA via ethanol precipitatie. Dit is nodig om aanwezige buffers en andere contaminanten te verwijderen (50) Materiaal 10x NEBuffer 2 (New England BioLabs cat #B7002S) Centrifuge 5415D (Eppendorf) CpG-methyltransferase (4000 U/mL) (New England BioLabs cat #M0226S) DNA (100 ng/µl) Ethanol 70% en 95% (verdunning gemaakt uitgaande van ethanol pro analysi) Natriumacetaat (1.5 M; ph 4.5) S-adenosylmethionine (SAM) (New England BioLabs cat #B9003S) TE Buffer (Invitrogen TM cat ) Thermocycler PTC-200 (MJ Research) Water (VWR International cat ) Werkwijze Maken van gemethyleerd DNA: 1. Meng in een PCR-epje: - 10 µl DNA; - 2 µl NEBuffer 2; µl methyltransferase; µl SAM (32 mm); 2. Incubeer 1 uur bij 37 C; 3. Incubeer 20 minuten bij 65 C. Neerslaan van het DNA: 63

64 Mater ia len en methoden 1. Maak een mix: - 6 µl NaOAc (1.5 M); µl ethanol 95%; µl water; 2. Voeg 80 µl mix toe aan het gemethyleerd DNA; 3. Laat 15 minuten incuberen op kamertemperatuur; 4. Centrifugeer 20 minuten op maximum snelheid; 5. Verwijder het supernatans; 6. Voeg 100 µl ethanol 70% toe; 7. Centrifugeer 10 minuten op maximum snelheid; 8. Verwijder het supernatans en los het pellet op in 10 µl TE Buffer. 3.2 MLPA Principe Het principe wordt uitgelegd in Materiaal 1.7 ml epje (Sorenson, BioScience, Inc.) ABI3130xl (of ABI3730xl) Genetic Analyzer (Applied Biosystems) ABI-plaat Centrifuge 5415D (Eppendorf) Centrifuge 5804 (Eppendorf) DNA (100 ng/µl) GeneScan TM -500 ROX TM Size Standard (Applied Biosystems cat P/N401734) Hi-Di TM Formamide (Applied Biosystems cat ) Ligase-65 Buffer A en Ligase-65 Buffer B PCR-epje (ThermoScientific cat AB-0620) Pipetten (HTL Labmate) PMS2-MSH6 P008 probemix SALSA enzyme dilution buffer SALSA FAM PCR-primers SALSA ligase-65 SALSA MLPA-buffer 64

65 Mater ia len en methoden SALSA PCR-buffer SALSA polymerase Septa TE Buffer (Invitrogen TM cat ) Thermocycler PTC-200 (MJ Research) Vortex Reax 2000 (Heidolph) Vortex-genie 2 (Scientific Industries) Water (VWR International cat ) Werkwijze Werk op ijs! DNA denaturatie en hybridisatie van de SALSA MLPA probes: 1. Voeg in een PCR-epje bij 1 µl DNA (100 ng/µl) 4 µl TE Buffer; 2. Verhit 5 minuten bij 98 C en laat dan afkoelen tot 25 C voor openen van de thermocycler; 3. Voeg een mix van 1.5 µl SALSA probemix (geel) en 1.5 µl MLPA-buffer (zwart) toe; 4. Meng goed door op en neer te pipetteren en incubeer 1 minuut bij 95 C en daarna overnacht incubatie bij 60 C (ongeveer 16 uur). Ligatie reactie: 1. Verminder de temperatuur naar 54 C; 2. Voeg 32 µl Ligase-65 mix toe aan elk staal en meng goed door op en neer te pipetteren. Opmerking: de Ligase-65 mix wordt gemaakt door 3 µl Ligase-65 Buffer A, 3 µl Ligase- 65 Buffer B, 25 µl water en 1 µl Ligase-65 samen te brengen in een epje; 3. Incubeer 15 minuten bij 54 C. PCR-reactie: 1. Maak een PCR-mix: µl water; - 2 µl SALSA FAM PCR-primers; - 4 µl SALSA PCR-buffer; - 2 µl SALSA enzyme dilution buffer; µl SALSA polymerase; 2. Voeg 40 µl PCR-mix bij 10 µl PCR-product; 3. Start de PCR-reactie: 65

66 Mater ia len en methoden Temperatuur Tijd Aantal cycli 95 C 30 seconden 60 C 30 seconden 35 cycli 72 C 60 seconden Fragmentanalyse: Zie

67 Resul ta ten en besprek ing 4 Resultaten en bespreking 4.1 Optimalisatie van het onderzoek naar de methylatiestatus van de MLH1 promotor in colontumoren Tijdens het onderzoek naar de methylatiestatus van de MLH1 promotor werden twee technieken uitgetest, namelijk een variant op de methylatie-specifieke PCR (protocol bekomen via Dr. Marjolein Ligtenberg, KGCN, Afdeling Anthropogenetica, Nijmegen) en de methyqesd, een combinatie van methylatie-gevoelige digestie en real-time PCR (51) DNA-isolatie DNA-isolatie uit tumorweefsel, ingebed in paraffine, werd in het Centrum voor Medische Genetica Gent (CMGG) op punt gesteld voor de start van mijn eindwerk. In het CMGG wordt voor de DNAextractie eerst de Pure Gene methode gebruikt, gevolgd door een behandeling van het DNA-staal met de High Pure PCR Purification Kit van de firma Roche. Deze methode is efficiënt, want de DNA-opbrengst na extractie van de meeste paraffinestalen was voldoende hoog. Bij de meeste stalen werd voor de ratio 260/280 een waarde tussen de 1.8 en 2 bereikt. Dit toont aan dat het geëxtraheerde DNA zuiver was en dus vrij van contaminatie (door bijvoorbeeld proteïnen). Aangezien 260/280 ratio s niet altijd rechtstreeks te correleren zijn met succesvolle PCR-amplificatie, werd ook de 260/230 ratio gemeten, om na te gaan of deze een meer voorspellende waarde heeft voor een geslaagde amplificatie. DNA-isolatie uit bloed is eenvoudiger dan extractie van DNA uit paraffine. Bij bloed worden de cellen namelijk sneller opengebroken. De gebruikte methode voor DNA-isolatie uit paraffine duurt langer dan andere in het DNA-labo gebruikte extractiemethoden. Toch wordt voor deze manier van extraheren gekozen, gezien er bij andere toepassingen op DNA geëxtraheerd uit paraffinemateriaal, via deze methode een goede succes ratio bekomen wordt. Deze methode kan in elk laboratorium worden uitgevoerd. Het enige toestel hiervoor nodig is een thermomixer. De twee technieken (vermeld in en 4.1.5) voor het onderzoek naar DNA-methylatie werden uitgevoerd met DNA geïsoleerd volgens de hierboven vermelde methode. Tabel 8 DNA-concentraties, OD 260/280 en OD 260/230 Staal DNA-nummer Gemeten OD 260/280 OD 260/230 67

68 Resul ta ten en besprek ing paraffine concentratie (ng/µl) 1 B.C D D D D D D D D D D.R D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D V.D.P De DNA-opbrengst na isolatie uit paraffinemateriaal was vrij hoog. In tabel 8 worden de concentraties weergegeven; alle DNA-stalen werden in de laatste stap van het DNA-extractie protocol 68

69 Resul ta ten en besprek ing geëlueerd in een totaal volume van 50 µl. Uit tabel 8 kan worden afgeleid dat een staal met een lage DNA-concentratie meestal ook een lage OD 260/280 en OD 260/230 heeft (zie staal 1, 6, 16 en 20) Zoektocht naar kwaliteitsvol gemethyleerd controle DNA Voor correcte uitvoering van de experimenten is gemethyleerd controle DNA noodzakelijk. Hiervoor zijn twee opties beschikbaar. De goedkoopste optie is om gemethyleerd DNA aan te maken in het laboratorium met behulp van het enzym CpG-methyltransferase. Hiervoor wordt genomisch DNA behandeld met CpG-methyltransferase en S-adenosylmethionine (SAM). De duurdere optie is de aanschaf van commercieel beschikbaar gemethyleerd DNA via de firma Chemicon International Aanmaak van gemethyleerd controle DNA Zoals blijkt uit figuren 30 en 31 is opzuivering van gemethyleerd DNA, na behandeling met CpGmethyltransferase, vereist, vóór de bisulfietconversie zodat interfererende stoffen (bijvoorbeeld NEBuffer 2) worden verwijderd. De opzuivering gebeurt via ethanol precipitatie. Figuur 30 DNA, dat na behandeling met CpG-methyltransferase wordt geprecipiteerd voor bisulfietconversie (met EZ DNA Methylation-Direct Kit - in paragraaf materialen en methoden), vertoont een piek bij 183 bp op fragmentanalyse na amplificatie met de primers en condities zoals beschreven in materialen en methode punt bp is de lengte die verwacht wordt bij een staal met 100% methylatie en 100% bisulfietconversie. 69

70 Resul ta ten en besprek ing Figuur 31 DNA dat niet wordt neergeslaan voor bisulfietconversie vertoont naast de piek van 183 bp nog verschillende bijpieken op fragmentanalyse die de interpretatie kunnen hinderen Bij een eerste analyse werden goede resultaten verkregen met het gemethyleerd DNA en werd bij fragmentanalyse een piek van 183 bp waargenomen (figuur 30). Dit gemethyleerd DNA bleek echter niet stabiel. Bij herhaling van de experimenten na ongeveer één week werden lagere piekhoogtes waargenomen, ondanks het gebruik van dezelfde PCRcondities, wat wijst op een snelle degradatie van het DNA. Bij nameten van de concentraties op de Nanodrop van dit gemethyleerde DNA bleek deze sterk verlaagd. Bovendien werd de intensiteit van de 186 bp piek hoger, wat wijst op terug een omzetting naar niet-gemethyleerd DNA. Verschillende pogingen werden ondernomen om de behandeling van DNA met CpGmethyltransferase te optimaliseren: 1, Verlengen van de incubatietijd bij 37 C van 1u naar 1u30, zodat het methyltransferase langer inwerkt op het DNA, resulteerde niet in betere resultaten. 2, Opzuiveren met beads (Agencourt CleanSeq) in plaats van ethanol precipitatie (zoals ook gebruikt wordt voor de opzuivering van sequeneringsreacties) leverde evenmin een positief resultaat op. Er werden bruine brokken gevormd en de DNA-concentratie was enorm laag (tabel 9). 3, Verhoging van de hoeveelheid methyltransferase van 0.25 µl naar 0.30 µl (er wordt gewerkt in een totaal volume van 20 µl), resulteerde evenmin in een hogere DNA-concentratie. 4, Verdubbeling van de starthoeveelheid DNA, methyltransferase, SAM en NEBuffer 2 verhoogde de DNA-concentratie wel (tabel 10), maar bij fragmentanalyse werd enkel een piek verkregen bij 186 bp, wat overeenstemt met het niet-gemethyleerde DNA. 70

71 Resul ta ten en besprek ing Tabel 9 DNA-concentraties van vijf stalen na opzuivering met beads Concentratie (ng/µl) Tabel 10 DNA-concentraties van vijf stalen na verdubbeling producten Concentratie (ng/µl) Gezien de snelle achteruitgang van de producten gebruikt voor de DNA-methylatie, leek deze methode ons weinig robuust om op termijn in de diagnostiek controle DNA aan te maken en werd overgegaan tot de aankoop van commercieel gemethyleerd DNA van de firma Chemicon International. Dit is een duurdere optie, maar dit commercieel DNA bleek wel stabiel bij gebruik in verschillende opeenvolgende experimenten Optimalisatie van de methylatie-specifieke PCR Aan de hand van het protocol ontvangen via Dr. Marjolein Ligtenberg, KGCN, Afdeling Arthropogenetica, Nijmegen, werd de methylatiestatus onderzocht via methylatie-specifieke PCR. Deze methode vereist een bisulfietvoorbehandeling Optimalisatie bisulfietconversie Voor de bisulfietconversie werd gekozen voor de kits van Zymo Research, vooral omwille van het eenvoudig protocol en de kleine hoeveelheid DNA vereist voor de omzetting (500 ng). Er werden twee kits uitgetest van de firma Zymo Research, namelijk de EZ DNA Methylation Kit (die gebruikt wordt door het labo in Nijmegen) en de EZ DNA Methylation-Direct Kit. Er zijn grote verschillen tussen beide kits. Zo gebeurt het maken van het CT Conversion Reagent op een andere manier en is de incubatiestap ook verschillend (tabel 11). Tabel 11 Verschil tussen EZ DNA Methylation Kit en EZ DNA Methylation-Direct Kit EZ DNA Methylation Kit EZ DNA Methylation-Direct Kit CT Conversion Reagent 750 µl H 2 O 210 µl M-Dilution Buffer 790 M-Solubilization Buffer 300 µl M-Dilution Buffer 160 µl M-Reaction Buffer Incubatiestap 50 C voor 3u of 16u 98 C voor 8 minuten 64 C voor 3u30 71

72 Resul ta ten en besprek ing DNA werd geïsoleerd uit tumormateriaal ingebed in paraffine en behandeld met de EZ DNA Methylation Kit (3u en 16u bij 50 C) en met de EZ DNA Methylation-Direct Kit. Bij de Direct Kit gebeuren de DNA-denaturatie en de bisulfietconversie in één enkele stap. Hierdoor duurt deze methode minder lang. Daarnaast is deze methode gebruiksvriendelijker. Bij fragmentanalyse werd het mooiste piekenpatroon verkregen na behandeling van het staal met de Direct Kit (figuur 32). Met deze kit werd dan ook verder gewerkt. Figuur 32 Figuur A toont fragmentanalyse na behandeling met EZ DNA Methylation-Direct Kit. Figuren B en C tonen fragmentanalyse van dezelfde patiënt na behandeling met EZ DNA Methylation Kit na respectievelijk 16u en 3u incubatie bij 50 C. Aangezien minder bijpieken worden waargenomen in A, werd besloten om verdere experimenten uit te voeren met de EZ DNA Methylation-Direct Kit Optimalisatie van de PCR-reactie Voor de PCR-reactie werd slechts één deel van de MLH1 promotor regio geamplificeerd (figuur 33) door gebruik te maken van de primersets P344/P345 en P352/P353 (exacte sequentie van deze primers zijn terug te vinden in materialen en methoden tabel 6). GAGGCACACAAGCCCGGTTCCGGCATCTCTGCTCCTATTGGCTGGATATTTCGTATTCCC CGAGCTCCTAAAAACGAACCAATAGGAAGAGCGGACAGCGATCTCTAACGCGCAAGCGCA TATCCTTCTAGGTAGCGGGCAGTAGCCGCTTCAGGGAGGGACGAAGAGACCCAGCAACCC ACAGAGTTGAGAAATTTGACTGGCATTCAAGCTGTCCAATCAATAGCTGCCGCTGAAGGG Figuur 33 Een regio van de MLH1 promotor. In het geel worden de forward en reverse primer aangeduid. Ook de CpG-eilanden die deze regio bevat, worden aangeduid. 72

73 Resul ta ten en besprek ing De twee primersets, gebruikt voor de amplificatie, zijn zo gelegen dat ze geen CpG s bevatten. Bij de forward primer P344 zijn de cytosine basen vervangen door thymine basen, zodat het DNA na bisulfietbehandeling kan geamplificeerd worden. De forward primer P352 van de andere primerset bevat echter wel cytosine residus. Amplificatie met deze primer dient als controle om na te gaan of de bisulfietmodificatie is doorgegaan. Tijdens elke PCR werd, als controle, een staal DNA (geïsoleerd uit bloed) meegenomen die niet werd behandeld met de EZ DNA Methylation-Direct Kit. Dit staal vertoont geen amplificatie bij P344/P345, maar wel bij P352/P353 (figuur 35). Alle PCR-producten werden gecontroleerd door middel van agarosegelelektroforese of met de MultiNA. In eerste instantie werd gebruik gemaakt van een standaard PCR-mix, zoals deze gewoonlijk gehanteerd wordt in het CMGG (tabel 12), maar dit leverde slechts weinig amplificatie op bij DNA geïsoleerd uit bloed en totaal geen amplificatie bij DNA geïsoleerd uit paraffine. Verdere optimalisatie was vereist. Deze op puntstelling gebeurde met DNA geëxtraheerd uit bloed. Het PCRprogramma die hier werd gebruikt, is deze uit het protocol van Nijmegen. Tabel 12 Standaard PCR-mix met een totaal reactievolume van 20 µl Component Volume voor 20 µl reactie 10x PCR rxn Buffer 2 MgCl 2 (50 mm) 0.6 dntp (1mM) 4 Forward primer (100 µm) Reverse primer (100 µm) Platinum Taq DNA polymerase (5U/µL) Water DNA (100 ng/µl) 0.8 De PCR-mix werd aangepast aan de hoeveelheden gebruikt in het protocol van Nijmegen (tabel 13). De hoeveelheden van alle gebruikte producten (MgCl 2, dntp s, pl. Taq, primers en DNA) zijn toegenomen. Let op de sterke stijging van de hoeveelheid primers. Tabel 13 PCR-mix met een totaal volume van 20 µl Component Volume voor 20 µl reactie 73

74 Resul ta ten en besprek ing 10x PCR rxn Buffer MgCl 2 (50 mm) dntp (1mM) Forward primer (100 µm) Reverse primer (100 µm) Platinum Taq DNA polymerase (5U/µL) Water DNA (100 ng/µl) Verder werd ook het gebruikte PCR-programma aangepast door het aantal cycli en de annealingstemperatuur te wijzigen. De beste amplificatie werd verkregen met een annealingstemperatuur van 56 C (figuur 34). Er was weinig verschil in amplificatie tussen de 45 cycli en de 60 cycli. Aan de 45 cycli werd de voorkeur gegeven, gezien de kans op contaminatie bij een lager aantal cycli kleiner is. Eénmaal de PCR, voor DNA geïsoleerd uit bloed, op punt stond, moest de optimalisatie van DNA geëxtraheerd uit paraffine gebeuren. De hoeveelheid DNA gebruikt in de PCR-reactie werd verhoogd van 100 ng naar 200 ng, zodat de hoeveelheid input DNA toenam. Ook het aantal cycli in het PCR-programma werd verhoogd naar 60 cycli. Dit verhoogde evenwel de kans op contaminatie. De meeste DNA-stalen, geïsoleerd uit paraffine, vertoonden amplificatie met deze PCR-condities. Voor een beperkt aantal stalen werd geen amplificatie waargenomen. Dit is zeer waarschijnlijk te wijten aan de mindere kwaliteit van de paraffineblokken. 74

75 Resul ta ten en besprek ing Figuur 34 PCR-amplificatie gebruik makend van primers P344/P345 gevisualiseerd met de MultiNA. A1 tot A4 tonen de amplificatie na 45 cycli en met een annealingstemperatuur van 50 C, A5 tot A8 na 45 cycli en bij een annealingstemperatuur van 56 C, A9 tot A12 na 60 cycli en met een annealingstemperatuur van 50 C, B1 tot B4 na 60 cycli en met een annealingstemperatuur van 56 C. A4, A8, A12 en B4 zijn de blanco s. Figuur 35 PCR-amplificatie gevisualiseerd met de MultiNA. A1 tot A6 en A11 tot B4 tonen respectievelijk de amplificatie met primerset P344/P345 en P352/P352 van DNA geïsoleerd uit paraffine na bisulfietconversie met de Direct kit. A9 en B7 tonen een controle staal die niet werd behandeld met bisulfiet. A10 en B8 zijn blanco s. 75

76 Resul ta ten en besprek ing Correlatie tussen resultaten bekomen met fragmentanalyse en sequenering Om na te gaan of de resultaten bekomen met fragmentanalyse in overeenstemming zijn met de resultaten op sequentie niveau, werden een aantal stalen gesequeneerd en werden deze resultaten gecorreleerd met de resultaten bekomen op fragmentanalyse Optimalisatie van de sequeneringsreactie Voor de sequenering werd het CMGG standaardprotocol gebruikt. De opzuivering van de sequentiereactie, kan uitgevoerd worden via ethanol precipitatie of met magnetische beads (Agencourt CleanSEQ). Beide methoden werden uitgetest op dezelfde stalen en gaven een gelijkaardig resultaat (figuren 36 en 37). Het gebruik van magnetische beads is duurder dan ethanol precipitatie. Opzuivering via ethanol precipitatie is echter arbeidsintensiever. Figuur 36 PCR-amplificatie met primers P344/P345 op commercieel aangekocht gemethyleerd controle DNA na bisulfietconversie. DNA-sequenties na opzuivering via ethanol precipitatie. De cytosine basen in de CpG-eilanden werden niet omgezet naar thymines. Andere C s werden wel omgezet. De CpG-eilanden zijn aangeduid en de C s die geconverteerd zijn in T s zijn onderlijnd. 76

77 Resul ta ten en besprek ing Figuur 37 PCR-amplificatie met primers P344/P345 op commercieel aangekocht gemethyleerd controle DNA na bisulfietconversie. DNA-sequenties na opzuivering met beads. De cytosine basen in de CpGeilanden werden niet omgezet naar thymine. Andere C s werden wel omgezet. De CpG-eilanden zijn aangeduid en de C s die geconverteerd zijn in T s zijn onderlijnd Correlatie tussen resultaten bekomen met fragmentanalyse en sequenering a/ staal met 0% methylatie Bij de stalen die geen hypermethylatie van de MLH1 promotor vertoonden werd op fragmentanalyse één piek waargenomen bij 186 bp (figuur 38). Bij de DNA-sequenties, verkregen na sequenering, zijn alle cytosines (C) omgezet naar thymines (T). Ook in de CG-nucleotiden zijn de cytosine basen omgezet in thymine basen (figuur 39). Figuur 38 Uit paraffine geëxtraheerd DNA vertoont op fragmentanalyse een piek bij 186 bp 77

78 Resul ta ten en besprek ing Figuur 39 Sequentie van uit paraffine geïsoleerd DNA waarin geen van de CpG eilanden gemethyleerd is. Alle cytosine basen zijn omgezet naar thymines, ook in de CG-nucleotiden. b/ staal met partiële methylatie Stalen met partiële methylatie vertoonden op fragmentanalyse een piek bij 183 bp en 186 bp (figuur 40). Sequenering toonde aan dat alle cytosines (C) omgezet waren naar thymines (T). In de CG-nucleotiden waren sommige cytosine basen omgezet in thymine basen (figuur 41). Hier worden de resultaten voor staal 7 getoond. Figuur 40 DNA geëxtraheerd uit paraffine vertoont op fragmentanalyse een piek bij 183 bp en 186 bp Figuur 41 Sequentie van DNA geïsoleerd uit paraffine. Alle cytosine basen zijn vervangen door thymine basen, behalve in de CG-nucleotiden. In deze nucleotiden wordt soms een C en soms een T gevonden. 78

79 Resul ta ten en besprek ing c/ controlestaal met 100% methylatie Na fragmentanalyse werd bij gemethyleerd (100%) controle DNA enkel een piek waargenomen bij 183 bp (figuur 42). Uit de DNA-sequenties, verkregen na sequenering, bleek dat alle cytosines (C) omgezet waren naar thymines (T). In de CG-nucleotiden zijn de cytosine basen niet omgezet (figuur 43). Figuur 42 DNA geëxtraheerd uit paraffine vertoont op fragmentanalyse een piek bij 183 bp Figuur 43 Sequentie van uit paraffine geïsoleerd DNA. Alle cytosines basen zijn omgezet in thymine basen, behalve de cytosines in de CG-dinucleotiden. Besluit Uit deze resultaten blijkt dat de resultaten waargenomen met behulp van de fragmentanalyse goed te correleren zijn met de sequeneringsresultaten. Aangezien fragmentanalyse minder arbeidsintensief is, zal geopteerd worden om dit te gebruiken in de diagnostiek Overzicht resultaten op patiëntenmateriaal In totaal werd van 35 patiënten DNA geïsoleerd uit tumormateriaal en ingebed in paraffine onderzocht. Van deze patiënten werd eveneens DNA geïsoleerd uit bloed geanalyseerd, voor zover het beschikbaar was. Na bisulfietconversie werd de hypermethylatie van de MLH1 promotor onderzocht met behulp van PCR-amplificatie en fragmentanalyse. 79

80 Resul ta ten en besprek ing In tabel 14 wordt een overzicht gegeven van de resultaten voor alle patiënten die onderzocht werden. Het percentage methylatie werd berekend aan de hand van volgende formule: hoogte piek 183 bp x % tumorcellen = % methylatie hoogte piek 183 bp + hoogte piek 186 bp Indien het percentage tumorcellen in een paraffinestaal niet gekend was, werd het percentage methylatie berekend uitgaande van een hypothetisch percentage van 50% en 80% tumorcellen. Tabel 14 Patiëntenmateriaal en percentage methylatie Staal MSIfenotypnummenummer IHC DNA- DNA- Germinale % tumorcellen % methylatie mutatie ontvangen tumorcellen paraffine bloed paraffineblokken 1 MSI-H D B.C / Nee, wel UV 80 Methylatie in MLH1 en MSH6 2 MSI-H D1 D D Nee MSI-H D1-2 D D Nee Niet gekend MSI-H D1-2-P D D Nee D1-2 D D Nee Niet gekend Niet interpreteerbaar 6 MSS D-P D / Nee Niet gekend Geen waarneembare methylatie 7 MSI-H D1-2 D D Nee D P D / Nee Niet gekend Niet interpreteerbaar 9 MSI-H D1-P D D Ja (MLH1) 50 Niet interpreteerbaar 10 MSI-H D1-P D D Nee Niet gekend MSI-H D.R Nee Niet gekend Niet interpreteerbaar 12 MSI-H D1 D / Nee, wel UV Niet gekend in MSH2 13 MSS D1 D / Nee Niet gekend Geen waarneembare methylatie 80

81 Resul ta ten en besprek ing 14 MSI-H D1-2 D / Nee Niet gekend Geen waarneembare methylatie 15 MSI-H D2 D D Nee Niet gekend Geen waarneembare methylatie 16 MSI-H D1 D / Nee Niet gekend Geen waarneembare methylatie 17 MSI-H D2 D / Nee Niet gekend Geen waarneembare methylatie 18 MSI-H D1-P D D Ja (MLH1) en Niet gekend UV in MLH1 en MSH6 19 MSI-H D1-2 D / Nee Niet gekend Geen waarneembare methylatie 20 MSI-H D1 D D Nee Niet gekend Geen waarneembare methylatie 21 MSS D1 D / Nee Niet gekend Geen waarneembare methylatie 22 MSI-H D1-2 D D Nee MSI-H D1 D D Ja (MLH1) Niet gekend Geen waarneembare methylatie 24 MSI-H D D Nee 40 Geen waarneembare methylatie 25 MSI-H D / Nee 50 Geen waarneembare methylatie 26 MSI-H D D D Nee Niet gekend Geen waarneembare methylatie 27 MSI-H D2 D D Nee 80 Geen waarneembare methylatie 81

82 Resul ta ten en besprek ing 28 MSI-H D1-P D D Ja (MLH1) Niet gekend Geen waarneembare methylatie 29 MSI-H D1 D / Nee Niet gekend Geen waarneembare methylatie 30 MSI-H D1-P D D Nee Niet gekend Geen waarneembare methylatie 31 MSI-H D1 D / Nee Niet gekend Geen waarneembare methylatie 32 MSI-H D1 D D Ja (MLH1) Niet gekend MSI-H D D D Nee 60 Geen waarneembare methylatie 34 MSI-H D D / Nee Niet gekend Geen waarneembare methylatie 35 MSI-H D2-P V.D.P. D Nee Niet gekend Geen waarneembare methylatie UV= variant met onduidelijke klinische betekenis Germinale epimutaties Er werd bij geen enkele van de onderzochte patiënten methylatie teruggevonden in het DNA geëxtraheerd uit bloed. In geen van de onderzochte patiënten werd een germinale epimutatie vastgesteld Robuustheid van de test Voor 4/35 patiënten (11.4%) werden geen interpreteerbare resultaten bekomen op DNA geïsoleerd uit paraffinemateriaal. Dit percentage is in de lijn van de verwachtingen en stemt overeen met andere analyses die gebeuren in het CMGG op paraffinemateriaal. De concentratie van de stalen die geen interpreteerbare resultaten gaven zijn niet lager dan de andere stalen (tabel 15). Ook de OD-waarden zijn niet verschillend van de andere stalen. Bijgevolg zijn de DNA-concentraties en OD-waarden niet bruikbaar om te voorspellen of de analyse zal lukken. 82

83 Resul ta ten en besprek ing Eén uit bloed geëxtraheerd DNA-staal (staal 5) is uitgevallen. De reden van deze uitval is mogelijks een fout tijdens het pipetteren. Tabel 15 Lijst met de uitgevallen DNA-stalen Staal DNA-nummer Gemeten concentratie OD 260/280 OD 260/230 paraffine (ng/µl) 5 D D D D.R Frequentie van MLH1 hypermethylatie in het onderzochte patiëntenmateriaal Selectie van de patiënten gebeurde op basis van een MSI-high fenotype en/of immunohistochemisch defect gedetecteerd in de tumor voor MLH1, MSH2, MSH6 of PMS2. In 68% (21/31) van het onderzochte tumormateriaal werd geen DNA-methylatie waargenomen. Bij 32% van de onderzochte patiënten werd DNA-methylatie vastgesteld. Het percentage methylatie verschilt, gaande van 5% methylatie tot 60% methylatie. Er kan een correlatie gemaakt worden tussen het immunohistochemisch defect, MSI-fenotype en de methylatie. Alle stalen die DNA-methylatie vertonen, hebben een MLH1 defect en een MSI-high fenotype. Sommige stalen hebben naast dit MLH1 defect ook een defect in MSH2 of PMS2. De methylatiestatus van de MLH1 promotor werd ook nagegaan voor colontumoren van enkele patiënten waarin reeds een germinale mutatie werd aangetoond. Opmerkelijk is dat 2 van de 10 stalen die methylatie vertoonden, een mutatie heeft. In de literatuur wordt nochtans beschreven dat in aanwezigheid van een germinale MLH1 mutatie, geen MLH1 hypermethylatie in de promotor regio wordt waargenomen. Patiënt 18 is de zoon van patiënt 1. Staal 18 heeft een pathogene MLH1 mutatie geërfd van zijn vader. Zijn moeder, patiënt 1, heeft een variant in MLH1 en in MSH6 waarvan de klinische betekenis niet duidelijk is, die ze ook heeft doorgegeven aan haar zoon. Zowel in moeder als zoon werd methylatie aangetroffen. Op basis van het feit dat bij patiënt 1 hypermethylatie werd aangetroffen, zouden we geneigd zijn te besluiten dat de MLH1 variant bij haar aanwezig is, dus eerder niet pathogeen is. Het blijft echt wel verbazend dat de MLH1 promotor bij haar zoon, die drager is van een germinale MLH1 splice site mutatie, gemethyleerd is. 83

84 Resul ta ten en besprek ing MethyQESD Naast de methylatie-specifieke PCR werd een real-time PCR protocol geëvalueerd zoals recent beschreven door Bettstetter et al (2008) (51) (zie materialen en methode 3.1.9). De techniek is gebaseerd op een combinatie van een restrictie met een methylatie gevoelig enzym en real-time PCR. Twee restricties werden uitgevoerd op elk DNA-staal: een restrictie met het methylatie-gevoelige restrictie endonuclease HinP1I dat enkel ongemethyleerde CGCG knipt en een digestie met de endonucleases XbaI en DraI die knippen buiten het amplicon. Na uitvoering van de real-time PCR worden CT-waarden bekomen. Deze CT-waarden geven het aantal PCR-cycli aan, noodzakelijk om de oorspronkelijke in het staal aanwezige DNA-kopieën te vermenigvuldigen, zodat de concentratie boven de detectiegrens uitkomt. De optimalisatie voor de methyqesd gebeurde op een beperkt aantal stalen. DNA-extractie gebeurde volgens het protocol beschreven in materialen en methoden Patiëntenmateriaal Staal MSIfenotype IHC DNA-nummer Gemeten concen- DNA-nummer % tumorcellen paraffine tratie (ng/µl) bloed 7 MSI-H D1-2 D D MSI-H D1-P D D Niet gekend Commercieel gemethyleerd controle DNA, staal 7 en 30 werden behandeld met het methylatiegevoelige restrictie endonuclease Hin6I en met de methylatie-ongevoelige endonucleasen XbaI en DraI zoals beschreven in van materialen en methoden. Na real-time PCR werden CTwaarden berekend Resultaten De CT-waarden, bekomen na real-time PCR werden bekeken voor commercieel gemethyleerd DNA, staal 7 en staal 30. De real-time PCR uitgevoerd met primersets prox en dist (tabel 7 uit materialen en methoden) gaven volgende CT-waarden (dit getal is het gemiddelde van vier resultaten): Staal CT-waarde (prox) CT-waarde (dist) Hin6I gemethyleerd DNA DraI en XbaI gemethyleerd DNA Hin6I staal7bloed DraI en XbaI staal7bloed

85 Resul ta ten en besprek ing Hin6I staal7paraffine DraI en XbaI staal7paraffine Hin6I staal30bloed DraI en XbaI staal30bloed Hin6I staal30paraffine DraI en XbaI staal30paraffine De real-time PCR werd ook uitgevoerd met twee huishoudgenen (ZNF80 en GPR15) zodat normalisatie mogelijk is. De CT-waarden kunnen een aanwijzing geven of het DNA gemethyleerd is. Deze waarden werden in een Excel-bestand geplaatst. Hieronder wordt het resultaat van staal 30 weergegeven. Figuur 44 Donkergrijs=staal30bloed geknipt met DraI en XbaI; wit=commercieel gemethyleerd DNA geknipt met Hin6I; Grijs=staal30paraffine geknipt met Hin6I; Lichtgrijs=staal30bloed geknipt met Hin6I. Volgens dit resultaat (figuur 44) zou het uit paraffine geëxtaheerde DNA partieel gemethyleerd zijn. Uit de eerder gehanteerde methode (methylatie-specifieke PCR) blijkt dat dit echter niet het geval is. Een verklaring voor dit vals positieve resultaat is dus vermoedelijk partiële restrictie in het DNA geëxtraheerd uit paraffinemateriaal. Aangezien het protocol voor de MSP goed verloopt, zal geopteerd worden om dit verder te gebruiken MLPA Deleties van het poly-a signaal van het TACSTD1 gen, gelegen vlak voor het MSH2 gen, kunnen gerelateerd worden met HNPCC. Door deze deletie ontstaat immers een transcriptionele read- 85

86 Resul ta ten en besprek ing through van het TACSTD1 gen, wat leidt tot een silencing van het downstream gelegen MSH2 gen. Deze germinale deleties kunnen gedetecteerd worden met de SALSA MLPA P008 kit omdat aan deze kit recent ook twee probes voor het TACSTD gen werden toegevoegd Patiëntenmateriaal Patiënten met een immunohistochemisch defect in het MSH2 en/of MSH6 gen werden onderzocht met de SALSA MLPA kit P008 op de aanwezigheid van een mutatie in het TACSTD1 gen (tabel 16). Nadien werd via het softwareprogramma Coffalyser nagegaan of er eventueel een deletie kon aanwezig zijn. Tabel 16 Lijst met patiënten voor MLPA Staal MSI IHC DNA-nummer bloed 1 MSI-H D1-2-P D D6 D D1-2 D MSS D6 D MSI-H D2-6 D MSS D2-6 D Resultaten Hieronder worden de resultaten, bekomen met Coffalyser, van staal 5 weergegeven. De twee letters c die aangeduid zijn geven de twee fragmenten van het TACSTD1 gen weer. Een waarde beneden 0.6 duidt op een deletie. Hier is bij beide fragmenten geen sprake van een deletie. 86

87 Resul ta ten en besprek ing Er werd bij geen enkele patiënt een deletie gevonden in de fragmenten van het TACSTD1 gen. Momenteel blijft het dus onduidelijk waarom deze patiënten een immunohistochemisch MSH2/MSH6 defect vertonen en er geen germinale mutatie in deze genen wordt aangetroffen. 87

88 Resul ta ten en besprek ing 5 Discussie De optimalisatie van het onderzoek naar de methylatiestatus van de MLH1 promotor in colontumoren start bij een goede methode voor DNA-isolatie van tumormateriaal ingebed in paraffine. Dit is een belangrijke stap om het aantal niet-interpreteerbare analyses te beperken. De kwaliteit van de ontvangen paraffineblokken is niet altijd optimaal. In het CMGG werd een methode ontwikkeld die weliswaar langer duurt dan andere DNA-extractiemethoden, maar wel resulteert in een goede succes ratio. Ook de OD260/280 en 260/230-waarden, die een maat zijn voor de kwaliteit van het DNA, werden bekeken voor de uit paraffine geïsoleerde DNA-stalen. Er is echter geen verband gevonden tussen de DNA-concentraties, OD-waarden en niet-interpreteerbare resultaten. Vermoedelijk bevatten deze DNA-stalen dus inhiberende stoffen die niet gedetecteerd worden met licht met een golflengte van 260, 280 en 230. Het gebruik van 100% gemethyleerd controle DNA is van cruciaal belang tijdens het experiment. Het DNA dient als positieve controle om na te zien of de bisulfietconversie volledig is doorgegaan. Aanvankelijk werd gepoogd om gemethyleerd DNA aan te maken met behulp van het enzym CpGmethyltransferase en van S-adenosylmethionine. Dit gemethyleerd DNA bleek echter niet stabiel en kan dus niet gebruikt worden in een diagnostische setting'. Commercieel aangekocht gemethyleerd DNA bleek veel stabieler bij gebruik in verschillende opeenvolgende experimenten. Bijgevolg zal in de diagnostiek geopteerd worden voor dit commercieel beschikbaar DNA. Voor de methylatie-specifieke PCR werden primers gebruikt, waarvan de ligging zo gekozen is dat ze zich bevinden in de proximale regio (dit is -248 tot -178 bp ten opzichte van de transcriptie start site) in de promotor van het MLH1 gen. Het is aangetoond dat methylatie van de CpG-eilanden in deze regio geassocieerd is met verlies van expressie van het MLH1 gen (52). Belangrijk om te weten is dat methylatie in de regio -711 tot -577 niet steeds resulteert in verlies van MLH1 expressie. De distale primer, gebruikt voor de real-time PCR, is dus niet echt relevant voor de bepaling van de methylatiestatus. De proximale primer daarentegen wel, want deze bevindt zich in de proximale regio. Bij het uitvoeren van de MSP werd steeds een DNA-staal, niet behandeld met bisulfiet, meegenomen als controle op amplificatie. Dit controle staal vertoonde geen amplificatie bij de primerset P344/P345, maar wel bij de primerset P352/P

89 Resul ta ten en besprek ing In het protocol bekomen via Dr. Marjolein Ligtenberg uit Nijmegen, worden enkel de PCRproducten geamplificeerd met primerset P344/P345 aan fragmentanalyse onderworpen. Ook bij ons werden met deze primerset duidelijk interpreteerbare resultaten bekomen. Voor primerset P352/P353 werden ook signalen in bisulfiet behandeld DNA geëxtraheerd uit paraffinemateriaal bekomen. Dit is ook wat de mensen uit Nijmegen signaleren. Mogelijks geraakt een klein deel van DNA niet behandeld omwille van inhiberende stoffen in het DNA bereid uit paraffinemateriaal, wat leidt tot amplificatie tijdens de PCR-reactie met 60 cycli. Aangezien het aantal stalen waarvoor geen resultaten werd bekomen minder dan 10% bedraagt, kunnen we stellen dat de MSP een robuuste techniek is voor gebruik in diagnostiek. Bij DNA geëxtraheerd uit paraffinemateriaal dient men steeds rekening te houden met een bepaald percentage niet interpreteerbare analyses. Epimutaties zijn gewoonlijk somatische mutaties die een belangrijke rol spelen in kankercellen. In de recente literatuur worden echter verschillende patiënten met germinale epimutaties gerapporteerd. Momenteel zijn er reeds 25 gevallen van germinale epimutaties in het MLH1 gen beschreven. Vandaar werd tijdens het onderzoek, naast DNA geëxtraheerd uit tumormateriaal ingebed in paraffine, ook het DNA geëxtraheerd uit bloed onderzocht op methylatie. Er werden geen germinale epimutaties vastgesteld. Er is een correlatie tussen het MSI-fenotype, immunohistochemisch defect en de methylatiestatus. Alle stalen die methylatie van de CpG-eilanden in MLH1 vertonen, hebben een immunohistochemisch defect in MLH1 en een MSI-high fenotype. In de literatuur wordt over het algemeen aanvaard dat in tumoren van patiënten met een germinale MLH1 mutatie geen hypermethylatie plaatsvindt. We detecteerden echter partiële methylatie in de colontumoren van twee patiënten (18 en 32) met een pathogene germinale MLH1 mutatie. Het betreft echter een laag percentage van mosaïcisme. Dit werd eerder reeds beschreven door Bettstetter et al (2007) (53). Zij gebruiken een cut-off waarde van 18%. De percentages gedetecteerd in de onderzochte colontumoren van patiënten met een pathogene mutatie liggen onder deze waarde, terwijl in de tumoren van patiënten zonder germinale mutatie deze mutaties over het algemeen iets hoger lagen. 89

90 Resul ta ten en besprek ing Onderzoek naar hypermethylatie van de MLH1 promotor in colontumoren kan dus een sterke bijdrage leveren in de diagnostiek naar HNPCC. Enerzijds, wanneer in een colontumor een MSIhigh fenotype wordt vastgesteld in combinatie met een immunohistochemisch MLH1 defect, wijst dit eerder op een sporadische tumor, niet geassocieerd met een germinale mutatie. Anderzijds kunnen deze studies ook een bijdrage leveren tot de interpretatie van germinale varianten met een onduidelijke klinische betekenis: indien in een patiënt een germinale MLH1 variant wordt aangetoond waarvan de klinische betekenis niet duidelijk is en indien hypermethylatie van de MLH1 promotor in de colontumor wordt vastgesteld, wijst dit eerder op een niet-pathogeen effect van deze mutatie. 90

91 Conc lus ie 6 Conclusie Tijdens het onderzoek naar de methylatiestatus van de MLH1 promotor worden twee technieken uitgetest, namelijk een variant op de methylatie-specifieke PCR (protocol bekomen via Dr. Marjolein Ligtenberg, KGCN, Afdeling Anthropogenetica, Nijmegen) en de methyqesd, een combinatie van methylatie-gevoelige digestie en real-time PCR (artikel MethyQESD, a robust and fast method for quantitative methylation analyses in HNPCC diagnostics using formalin-fixed and paraffin-embedded tissue samples, Laboratory Investigation 2008). De methylatie-specifieke PCR bleek al snel een veel robuustere methode met een hoge specificiteit en sensitiviteit dan de methyqesd. Bijgevolg zal in het CMGG geopteerd worden om deze techniek verder te gebruiken in de diagnostiek voor erfelijke colonkankersyndromen, en in het bijzonder voor HNPCC. 91

92 Literatuurlijst (1) Webmagazine [www], 15 mei 2006, Centraal Bureau voor de Statistiek URL: Gezien d.d. 21 februari 2009 (2) Belgian Cancer Registry, Cancer Incidence in Belgium [www] URL: Gezien d.d. 21 februari 2009 (3) Vlaamse Liga tegen Kanker (VLK) [www], ONE Agency URL: Gezien d.d. 21 februari 2009 (4) Stevens A. en Lowe J. Pathologie, Bohn Stafleu VAN Loghum (Houten 2003) (5) Divisie Medische Genetica, Oncogenetica: Genetische aspecten van kanker en DNA-diagnostiek [www], 11 februari 2002 URL: Gezien d.d. 28 februari 2009 (6) Moleculaire genetica 2000, Verworven aandoeningen: kanker [www] URL: Gezien d.d. 28 februari 2009 (7) Van Cutsem E., Colonkanker, een te voorkomen, te behandelen aandoening [www], 22 oktober 2007 URL: Gezien d.d. 21 februari 2009 (8) Van Muijenbroek M. (Leids Universitair Medisch Centrum), Molecular pathology of colorectal cancer predisposing syndromes [www], 27 november 2008, 2009 LUMC URL: Gezien d.d. 21 februari 2009 (9) Winawer, SJ, Schottenfeld, D, Flehinger, BJ. Colorectal cancer screening. J Natl Cancer Inst 1991; 83:243, Factors associated with annual new cases of colorectal cancer [www], 2009 UpToDate URL: Gezien d.d. 7 maart 2009 (10) Komaromy M.(Genetic Health), How Is Colon Cancer Inherited? [www], 4 augustus 2000, Copyright 2000 URL: Gezien d.d. 14 maart 2009 (11) Moleculaire genetica 2000, Verworven aandoeningen: kanker [www] URL: 92

93 Gezien d.d. 28 februari 2009 (12) Cambridge University Press, Cambridge journals [www], 2001 URL: Gezien d.d. 12 maart 2009 (13) Jagelman D., Inherited Colorectal Cancer Registries [www], 27 juli 2006, Cleveland Clinic Home URL: Gezien d.d. 28 februari 2009 (14) Erfelijkeziekten.be [www] URL: Gezien d.d. 14 maart 2009 (15) C T R M Schrander-Stumpel, L M G Curfs, Klinische genetica, Bohn Stafleu VAN Loghum (16) James F. Holland, Cancer Medicine (17) Genetics Home Reference [www], april 2008 URL: Gezien d.d. 14 maart 2009 (18) Pikaar A., Nortier J.W.R., Griffioen G. en Vasen H.F.A., Destoïdtumoren bij patiënten met familiaire adenomateuze polyposis, Nederlands Tijdschrift Geneeskunde, juli, (19) Lybaert W., De huisarts en familiale kanker [www], 6 februari 2007, URL: Gezien d.d. 28 maart 2009 (20) Genetics Home Reference [www], april 2008 URL: Gezien d.d. 14 maart 2009 (21) Jagelman D., Inherited Colorectal Cancer Registries [www], 27 juli 2006, Cleveland Clinic Home URL: Gezien d.d. 28 februari 2009 (22) Wijnen J.T., Morreau H. en Vasen H.F.A., Van gen naar ziekte; van DNA- mismatch - herstelgenen naar hereditair non-polyposis-colonrectumcarcinoom, Nederlands Tijdschrift Geneeskunde, april, (23) MYRIAD, Lynch Syndrome: HNPCC [www] URL: Gezien d.d. 25 maart 2009 (24) Vasen H.F.A., de Jong A.E. en Morreau H., Het belang van moleculair onderzoek van tumoren bij de opsporing van heriditair non-polyposis colorectaal carcinoom, Nederlands Tijdschrift voor Oncologie, nr , (25) Genetics Home Reference [www], april

94 URL: Gezien d.d. 15 maart 2009 (26) Nat Rev Cancer 2004 Nature Publishing Group URL: Gezien d.d. 4 april 2009 (27) De Leeuw W.J.F. (Leids Universitair Medisch Centrum), Genetic instability in hnpcc related tumors [www], 27 maart 2003 URL: Gezien d.d. 24 maart 2009 (28) Morsink F.H.M., Ezendam C., de Weger R.A. en Offerhaus G.J.A., Moleculaire diagnostiek van erfelijke vormen van dikkedarmkanker, NEDRELANDS Tijdschrift voor Oncologie, vol.4 nr.6, (29) Jagelman D., Inherited Colorectal Cancer Registries [www], 29 oktober 2003, Cleveland Clinic Home URL: Gezien d.d. 28 februari 2009 (30) The University of Utah Department of pathology [www], 28 februari 2008 URL: Gezien d.d. 4 april 2009 (31) MRC-Holland MLPA [www], 2009 MRC Holland URL: Gezien d.d. 4 april 2009 (32) Suijkerbuijk K.P.M., Van der Wall E., Van Laar T.; Vooijs M. en Van Diest P.J., Epigenetische processen in de maligne ontaarding: de rol van DNA-methylering in het ontstaan van kanker, Nederlands Tijdschrift Geneeskunde, april, (33) Eindwerk (verdere gegevens onbekend) (34) Epigenetics and cancer (verdere gegevens onbekend) (35) Van der Auwera I., Epigenetische veranderingen in het inflammatoir borstcarcinoom [www], 15 oktober 2008 URL: Gezien d.d. 14 maart 2009 (36) Capel E., Fléjou J-F. en Hamelin R., Assessment of MLH1 promotor methylation in relation to gene expression requires specific analysis, Oncogene, 2007 (37) Applied Biosystems, Methylation Ananlysis Using FFPE samples Reliable and Reproducible [www] URL: Gezien d.d. 25 april 2009 (38) Rice G., Microbial Life Educational Resources [www] 94

95 URL: Gezien d.d. 25 april 2009 (39) Van Kleef C.E., De diagnostiek van het Lynch syndroom [www], 29 mei 2008, URL: Gezien d.d. 25 april 2009 (40) Facorgen Biotech corp, FavorPrep Bloed/Cultured Cell Genomic DNA Extraction Mini Kit [www], Favorgen Biotech Corp.2008 URL: Gezien d.d. 25 april 2009 (41) Protocol High Pure PCR Product Purification Kit van Roche (42) NanoDrop, ND-1000 Spectrophotometer [www], URL: Gezien d.d. 25 april 2009 (43) Protocol EZ DNA Methylation-Direct Kit van Zymo Research (44) Vierstraete A., Principle of the PCR [www], 8 november 1999 URL: Gezien d.d. 25 april 2009 (45) Demeyere M., Inleidende biotechnologie partim DNA- en RNA technieken, Hogeschool West- Vlaanderen, Departement Simon Stevin, Brugge, 2008 (46) Protocol Centrum voor Medische Genetica Nijmegen (47) Wikipedia, Bisulfite sequencing [www] URL: Gezien d.d. 25 april 2009 (48) Shimadzu, MultiNA [www] URL: Gezien d.d. 25 april 2009 (49) Applied Biosystems, Electrophoresis [www] URL: Gezien d.d. 25 april 2009 (50) NewEngland BioLabs, [www] URL: Gezien d.d. 25 april 2009 (51) Bettstetter M., Dechant S., Ruemmele P., Vogel C., Kurz K., Morak M., Keller G., Holinski-Feder E., Hofstaedter F., Dietmaier W., MethyQESD, a robust and fast method for quantitative methylation analysis in HNPCC diagnostics using formalin-fixed and paraffin-embedded tissue samples, Laboratory Investigation, 2008,

96 (52) Guiren Deng, Ada Chen, Joe Hong, Hiun Suk Chae and Young S. Kim, Methyalion of CpG in a small region of the hmlh1 promotor invariably correlates with the absence of gene expression, Cancer Research, 1999 (53) Rahner N., Friedrichs N., Steinke V., Aretz S., Friedl W., Buettner R., Mangold E., Propping P. and Walldorf C., Coexisting somatic promoter hypermethylation and pathogenic MLH1 germline mutation in Lynch syndrome, Journal of Pathology, 2008, Bijlagen Bijlage 1 De volledige sequentie van de MLH1 regio met aanduiding van de in het onderzoek gebruikte primers TGAGCGCACCAACACTGAAATGATGAGTCAGGTTGATTATGGTCAGAAGATCTTCTTGCA CCTCCAACTCAGGGCCTACACCGCGGGATAAAGACCAGGAGGTAGTTCTCATAGGCCACAA AAGCCTGGTCGTCCAAGGCAAGAGAATAGGCTTTAAAGTCCCTGGCTCGGTTAAAAAGCT 96

97 GGTTGCGTAGATTCCTGTCAATGCTCAGGATCCTCTGCCTTGTGATATCTGGAGATAAGT CAACGCCTTGCAGGACGCTTACATGCTCGGGCAGTACCTCTCTCAGCAACACCTCCATGC ACTGGTATACAAAGTCCCCCTCACCCCAGCCGCGACCCTTCAAGGCCAAGAGGCGGCAGA GCCCGAGGCCTGCACGAGCAGCTCTCTCTTCAGGAGTGAAGGAGGCCACGGGCAAGTCGC CCTGACGCAGACGCTCCACCAGGGCCGCGCGCTCGCCGTCCGCCACATACCGCTCGTAGT ATTCGTGCTCAGCCTCGTAGTGGCGCCTGACGTCGCGTTCGCGGGTAGCTACGATGAGGC GGCGACAGACCAGGCACAGGGCCCCATCGCCCTCCGGAGGCTCCACCACCAAATAACGCT GGGTCCACTCGGGCCGGAAAACTAGAGCCTCGTCGACTTCCATCTTGCTTCTTTTGGGCG TCATCCACATTCTGCGGGAGGCCACAAGAGCAGGGCCAACGTTAGAAAGGCCGCAAGGGG AGAGGAGGAGCCTGAGAAGCGCCAAGCACCTCCTCCGCTCTGCGCCAGATCACCTCAGCA GAGGCACACAAGCCCGGTTCCGGCATCTCTGCTCCTATTGGCTGGATATTTCGTATTCCC CGAGCTCCTAAAAACGAACCAATAGGAAGAGCGGACAGCGATCTCTAACGCGCAAGCGCA TATCCTTCTAGGTAGCGGGCAGTAGCCGCTTCAGGGAGGGACGAAGAGACCCAGCAACCC ACAGAGTTGAGAAATTTGACTGGCATTCAAGCTGTCCAATCAATAGCTGCCGCTGAAGGG TGGGGCTGGATGGCGTAAGCTACAGCTGAAGGAAGAACGTGAGCACGAGGCACTGAGGTG ATTGGCTGAAGGCACTTCCGTTGAGCATCTAGACGTTTCCTTGGCTCTTCTGGCGCCAAA ATGTCGTTCGTGGCAGGGGTTATTCGGCGGCTGGACGAGACAGTGGTGAACCGCATCGCG GCGGGGGAAGTTATCCAGCGGCCAGCTAATGCTATCAAAGAGATGATTGAGAACTGGTAC P344: TAT TTT TGT TTT TAT TGG TTG GAT A P345: AAT ACC AAT CAA ATT TCT CAA CTC T P352: CAT CTC TGC TCC TAT TGG CTG GAT ATT T P353: AAT GCC AGT CAA ATT TCT CAA CTC T Prox_up: GCATCTCTGCTCCTATTG Prox_down: ATCCTTCTAGGTAGCGGGCA Dist_up: AAGTCGCCCTGACGCAGAC Dist_down: TTCGTGCTCAGCCTCGTAGT 97