Cel- & weefselcultuur

Transcriptie

1 Cel- & weefselcultuur Prof. Maria Cornelissen Examenvragen -Schema van evolutie van een celcultuur vertrekkend van geïsoleerde cellen uit vers materiaal - Weefselcultuur vs histotypische cultuur - Kan UV licht worden gebruikt om contaminatie tegen te gaan? - Je hebt BW-cellen en gladde spiercellen. Hoe ga je te werk om zuivere spiercultuur te bekomen? Je beschikt over een antilichaam tegen actine van de gladde spiercellen en AL tegen oppervlaktemoleculen van de BW-cellen. - Er worden 50 cellen geteld in haemocytometer: opp is 1 vierkante mm. Hoeveel cellen zitten er in de oorspronkelijke suspensie? Er is een viabiliteitstest uitgevoerd met trypaanblauw. Druk uit in cellen/ml - Beschrijf kort procedure om lymfocyten te isoleren uit bloedstaal. Welke cellen bevinden zich tussen de lymfocyten en hoe kan je die verwijderen? - Welke cellen vertonen contactinhibitie in vitro? a) fibroblasten b) keratinocyten c) vasculair endotheel d) epitheelcellen e) endotheel van longblaasjes - Buffering met NaHCo3: Wat gebeurt er wanneer culturen onder de laminaire flow gemanipuleerd worden? Welke ph verandering treedt er op? Geef mechanisme en verklaar. - Hoe worden subculturen gemaakt? a) van cellen in suspensie b) van adherente culturen - Fibroblastcellen worden losgemaakt met trypsine a) hoe terug desactivatie? Hoe was je de cellen? b) de fibroblasten worden in 2 verschillende multiwellplaten gebracht. In de eerste wordt monolayer gevormd, in de tweede vormen aggregaten. Verklaar. - Hoe zou je te werk gaan om een botdefect van kraakbeen te herstellen mbv. celtherapie? - Wat versta je onder scenescence van een cultuur? + grafiek - Hoe komt het dat je fibroblasten kan kweken in gesloten recipiënten? - Leg uit : a) contactinhibitie b) artificiële matrix c) mycoplasma d) type II veiligheidskabinet e) dedifferentiatie f) HEPA-filter g) Mycoplasma h) feederlayer i) laminaire flow, type 2 j) differentiatie k) vivo/vitro l) isoenzymanalyse - Functie van trypsine-edta p. 1/5

2 - Cellen kweken in warme kamer die al dan niet CO2 nodig hebben, kan dit? - Tabel vgl MACS easy en immunorosette plus minst gebruiksmogelijksheden - Kan je chondrocyten kweken plus toelichting - Trypaanblauw bij vroeg apoptotische cellen : ja of nee en waarom - 2 toep van fasecontrastmicroscoop - Uitrekenen van hoeveel cellen in suspensie (haemocytometer) - Vraagjes over kipembryo: 7 of 20 dagen, welk enzyme,wat toevoegen na digestie en welke cellen zorgen voor groei... - Scheiding van lymfocyten: a) welk medium? b) waar zitten de lymfocyten na centrifuge c) zitten er nog andere cellen in die laag - Contactinhibitie, hybridoma en anchorage dependente cellen, leg uit en geef een voorbeeld - Endotheelcellen worden gekweekt in een CO2 incubator met 5% CO2. Voor manipulatie worden ze in een laminaire flow gebracht. Verversen van medium is een arbeidsintensief proces. Welke substantie houdt de ph neutraal. Licht toe. - Wanneer een kippe-ei wordt geopend kan je meteen zien of het bevrucht is of niet, ook bij vroege ontwikkeling van het embryo, hoe zie je dit?? - MTT-testen: waarop gebaseerd en verwacht je voor alle celtypes hetzelfde resultaat? - Een fasecontrastmicroscoop is onontbeerlijk in een steriele kamer. Geef twee redenen waarom. - Een fibroblastencultuur wordt opgestart en in een cultuurfles gebracht. Na een nacht zie je wat?? Licht toe. - Welke van volgende begrippen zou je best gebruiken om een cultuur als osteogeen te beschouwen: alkalische fosfatase, calciumfosfaat neerslag, expressie osteocalcine, expressie osteopontine, naaldvormige... in de matrix, expressie van collageen type I (denk dat er nog waren maar kan ze mij niet meer herinneren) - MACS multisort: in welke situatie toepassen en licht toe. - Vraag over collageen, dit is een niet steriel poeder. Hoe kan men dit in een cultuur toch gebruiken. - leg uit + voorbeeld: a) Dedifferentiatie b) organotypisch c) densiteitsinhibitie - situeer in celcultuurlabo (korte uitleg). a) CO2incubator b) mitomycin c) veligheidkabinet type3 d) haemocytometer e) propidiumiodide f) fenolrood g) Hanks medium h) miliporie filter i) omkeermicroscoop j) agarose - Hoe scheid je lymfocyten uit het perifere bloed? Welke cellen zitten er dan bij die lymfocyten? p. 2/5

3 - Je hebt gegeven: stukje tunica media van een arterie, medium, trypsine, MACS, AL tegen bindweefsel, AL tegen spieractine, foetaal kalfsserum. Vraag: hoe leg je een cultuur aan van enkel de gladde spiercellen (dus m.a.w. hoe scheidt je het bindweefsel van het spierweefsel?) - Leg uit hoe NaHCO3-buffer werkt. FAQ S VAN OP HET FORUM Wat wil w/v (bij de beschrijving van de verschillende media mbt densiteitsgradiëntcentrifuge) precies zeggen? subconfluenten: ik weet het niet zeker, maar ik vermoed wanneer na opsplitsing van een confluente cultuur de bodem van het recipiënt opnieuw volledig ingenomen is door de cellen en alle cellen in contact liggen met elkaar, men over een subconfluent spreekt. subconfluentie= ik denk dat men over subconfluent spreekt net vooraleer er confluentie optreedt, dus nog geen complete celbezetting. Ik heb op 't einde zo'n blaadje opgeschreven ivm osteogene inductie, met alkalische fosfatase, osteocalcine, osteoadherine enz... op maar ik snap niet waar dit bij hoort en wat het verband met de leerstof nu eigenlijk is. Alkalische fosfatasen, osteocalcine, ostepontine, osteoadherine, mineralisatie,... zijn typsiche karakteristieken voor de expressie van osteoblasten. Ze heeft dat gezegd bij het protocol van de osteoblasten: dat dat specifieke parameters zijn voor botvorming. Vooral dat osteocalcine is een belangrijke merker voor osteoblasten. En dan heeft ze in verband hiermee ook nog iets gezegd over Von Kossa kleuring: ik denk dat je daarmee die parameters kan aantonen, want heb opgeschreven dat Calciumneerslag te zien is als zwarte neerslag bij Von Kossa kleuring. ( opm: Von Kossa is niet specifiek voor botvorming, ook in bloedvaten en in hartkleppen kan men Von Kossa neerslag zien.) In het begin staat zo'n figuur van differentiation pathways. In de onderste helft: de fibroblasten die redifferentiëren bij trauma bv. hartinfarct, worden die dan macrofagen om het necrotisch hartspierweefsel te gaan opruimen? Over die figuur: ik ging er van uit dat fibroblasten na redifferentiatie terug fibroblasten zijn?? ivm die figuur: ik vermoed dat die dedifferentiatie van hartspierweefsel optreedtonder invloed van een bepaald trauma: de spiercellen dedifferentiëren totbindweefselcellen en gaan het defect gaan opvullen. figuur: deel b (onderste deel) we gaan uit van al gedifferentieerde cellen dus fibroblast is al een fibrocyt en wacht op een opdracht. Als er nu plots iets veranderd (vb ongeluk: trauma) zullen de fibrocyten eerst dedifferentiëren (metverloren gaan van bep. kenmerken), zich ontwikkelen tot het soort cellen die zemoeten vervangen. (Dit kan niet in elk soort weefsel vb niet in zenuwweefsel,spiercel). Nadat trauma over is zullen de cellen terug redifferentiëren. Normaalmoeten ze terug fibrocyten worden. Het kan ook zijn dat ze niet meer redifferentiëren omdat het weefsel die ze vervangen niet herstelt of terug komt. MAAR ze kunnen ook redifferentiëren tot tumorcellen. Op blz 15 van de cursus bij de opmerking over antibiotica: Er staat daar... een mengsel van peniciline ( 100 IU/ml)... Ik had graag es geweten wat dat die IU is. IU = International Unit. (p.15) Dit is eigenlijk een verouderde benaming, wordt nog weinig gebruikt. Vandaar waarschijnlijk dat dit in onze cursus enkel bij penicilline geschreven wordt en de anderen reeds in µg/ml weergegeven worden. p. 3/5

4 w/v (box8, p.28) = weight to volume. ik denk niet dat dit echt belangrijk is, maar ik veronderstel dat het aangeeft in welke verhouding bv. ficoll moet toegvoegd worden. Isopyknische centrifuge: is dat hetzelfde als densiteitsgradientcentrifuge of een specifieke vorm van densiteitsgradientcentrifuge? Even ter verduidelijking: het verschil tss gewone densiteitsgradiëntcentrifuge en isopyknische centrifuge: in het practicum hebben we de "gewone" uitgevoerd: het scheidingsmiddel Lymphoprep heeft 1 welbepaalde dichtheid, nl g/ml. Die densiteit is zeer speciaal gekozen om de mononucleairen van de rest (granulocyten, plaatjes,...) te scheiden. Bij centrifugatie nestelt die Lymphoprep zich als het ware tussen die 2 lagen waardoor de mononucleairen beter weg te halen zijn. In een middel als percol zijn verschillende densiteiten aanwezig. Daar zou je (fictief vb.) én de mononucleairen én de plaatjes én de granulocyten kunnen scheiden omdat uw Percol zélf verschillende densiteiten bevat. Bij het protocol van chondrocyten: Ik heb daar zo'n tekening bijgetekend over agarosegel, maar die is zo onduidelijk dat ik het niet goed meer begrijp wat ik getekend heb. Mag die tekening mij als volgt voorstellen: eerst een laag van 3%agarose als substraat, dan de cellen erboven en daarboven nog eens agarose, maar nu verdund met DMEM en FCS en vit C? ivm die onduidelijke tekening van chondrocyten: 1. laag 3%agarose 2. laag met je cellen in 1,5% agarose (die agarose moet artificiële matrix vormen, maar 3% is te agressief) 3. laag DMEM, AB, VitC, FCS [Veerle] Bij het protocol van chondrocyten: ik denk ook dat het zo is. De bovenste laag dient om een matrix aan te maken had ik er nog bij. En (waarschijnlijk had je dat al maar:) de onderste laag dient om te verhinderen dat de cellen zich zouden vasthechten aan de bodem en beginnen met delen en differentïeren Von Kossa: positief bij P en Ca (neerslag). Celbiologie Fig. 12: Ik heb een streep door die figuur getrokken, volgens het voorbeeld van een medestudent. Cornelissen moest iets nakijken ofzo? Laat ik die streep staan of leg ik die figuur bij op de hoop "nog te bekijken"? Ik heb daar geen streep door in tegenstelling ik heb een paar dingen bijgeschreven. NaHCO 3 buffer glucose: Energie Phenol red: indicator In rij Hanks': NaHCO 3 en gasfase: cellen moeten zelf voor CO 2 zorgen, maar ik heb wel de rij van Dulbecco' tussen haakjes gezet want daar had ze iets gezegd dat dat niet helemaal klopte en dat ze dat nog eens moest bekijken. Chondrocytencultuur (fig.37a): enzymatische behandeling. Men voegt eerst hyaluronidase en pronase toe zonder serum (omdat deze anders de enzymactiviteit zou inhiberen?) en vervolgens collagenase. Waarom wordt er hier wel FCS toegevoegd? Is er dan geen inhibitie of wordt FCS hier voor een andere functie toegevoegd? protocols zijn vaak het eindresultaat van het uitproberen van verschillende mogelijkheden, vaak met wisselend succes, om uiteindelijk de meest succesvolle als standaard in een bepaald labo toe te passen (hier het protocol toegepast op de dienst Reumatologie en Histologie).; hyaluronidase en pronase blijven slechts korte tijd bij het weefsel (telkens 1 uur) vandaar geen toevoeging van serum; collagenase kan, afhankelijk van de leeftijd van het uitgangsmateriaal, zeer lang (soms zelfs meer dan 6 uur) bij het weefsel gevoegd blijven; indien er dan geen FCS p. 4/5

5 toegevoegd blijft, wat een beschermende rol voor de cellen heeft, zouden een veel groter aantal niet-viabele cellen aanwezig zijn na de digestie. Tussen pronase en collagenase voegt men FSC (ik veronderstel FCS) toe, is dit dan om beideenzymactiviteiten te inhiberen? Ja en ook om cellen viabel te houden, daar men vaak tot de volgende dag wacht om de collagenase behandeling te starten, omdat men deze behandeling in de tijd moet kunnen volgen. p. 5/5