1 (~15 minuten; 15 punten)

Transcriptie

1 TENTAMEN Moleculaire Cel Biologie (8A840) Prof. Dr. Ir. L. Brunsveld & Dr. M. Merkx :00 12:00 (totaal 100 punten) 6 opgaven in totaal + 1 bonusvraag! (aangegeven tijd is indicatie) Gebruik geen rode pen! 1 (~15 minuten; 15 punten) Replicatie van DNA is een van de best gecontroleerde processen in de cel. Behalve dat de DNA polymerase zelf bijna geen fouten maakt, zijn er ook nog verschillende processen in de cel om achteraf nog fouten te herstellen of chemische schade aan het DNA te repareren. a. Wat is strand-mediated mismatch repair en wat is het probleem dat met dit proces wordt opgelost? Bij replicatie van DNA door DNA polymerases wordt toch heel af en toe (met een frequentie van 1:10 7 ) een niet complementaire base ingebouwd. Strand-mediated mismatch repair is een controle mechanisme van de cel waarbij het nieuw gedupliceerde DNA alsnog gecontroleerd wordt op bases die niet complementair zijn. Een manier om te bepalen welke strand de nieuw gevormde strand is, is dat de lagging strand nog nicks bevat (gevolg van Okazaki fragmententen). Hoe dit proces bij de leading strand werkt is niet bekend. Van deze strand wordt een klein stukje rond de niet complementaire bases verwijderd, en vervolgens weer opnieuw gedupliceerd door een DNA polymerase. (5 punten) b. In afwezigheid van het telomerase enzym worden de uiteinden van de chromosomen na elke celdeling een klein stukje korter. Leg uit hoe dat komt. DNA replicatie kan niet de-novo beginnen op een stuk single strand DNA maar heeft altijd een primer nodig met een 3 OH groep. Tijdens DNA replicatie kan hierdoor van de leading strand een exacte kopie gemaakt worden, maar voor de lagging strand wordt om de 200 bp opnieuw een RNA primer gebruikt om een nieuw Okazaki te maken. Op het einde van de DNA replicatie is er geen mogelijkheid meer om deze RNA primer te hechten en blijft er dus een stukje ssdna over. (5 punten)

2 c. In DNA wordt de base thymine gebruikt in plaats van de base uracil, welke in RNA voorkomt. Leg uit op welke manier dit bijdraagt aan het vermogen van de cel om DNA schade te herstellen. Een veel voorkomende vorm van DNA schade is deaminering van cytosine, waarbij als product uracil ontstaat. Als DNA net als RNA uracil als een van de 4 basen zou gebruiken zou het product van deze deamineringsreactie dus niet als zodanig kunnen worden herkend. Omdat DNA van nature geen uracil maar thymine gebruikt, kan deze vorm van DNA schade gemakkelijk worden herkend en door base excision repair worden hersteld. (5 punten)

3 2 (~30 minuten; 20 punten) "Wehe dem Kind, das beim Kuß auf die Stirn salzig schmekt, er ist verhext und muss bald sterben," Vertaald in het Nederlands: "Wee het kind dat bij kussen van het voorhoofd zoutig smaakt, want het is gedoemd en zal snel sterven". Met deze woorden werd in de 17 de eeuw in Duitse handboeken gewaarschuwd voor de ziekte cystic fibrose, of wel taaislijmziekte. Cystic fibrose is een erfelijke ziekte die recessief overerft en wordt veroorzaakt door een defect in chloride kanalen in cellen die voor excretie van bijvoorbeeld slijm zorgen. a. Om te weten te komen waar een gen zich bevindt dat de oorzaak is van een genetische ziekte wordt vaak gebruik gemaakt van linkage analyse. Leg uit was deze techniek inhoudt. Bij linkage analysis wordt op het DNA van patiënten en gezonde mensen gekeken naar SNP s die over het hele genoom verspreid liggen. Hoe groter de correlatie is tussen het voorkomen van een bepaald SNP en het hebben van de ziekte, hoe dichter dit SNP zich bij het getroffen gen bevindt. Dit komt omdat voor dit SNP de kans dat SNP en het gen tijdens meiose van elkaar zijn gescheiden het kleinst is. (4 punten) In de genetica worden verschillende soorten mutaties onderscheiden, zoals conditionele mutaties, gain-of-function mutaties, loss-of-function mutaties, en dominant negatieve mutaties. b. Wat is een dominant negatieve mutant? Verklaar waarom mutaties in hemoglobine vaak tot deze categorie behoren. Bij een dominant negatieve mutatie lijdt mutatie van een gen in een van de twee allelen al tot een nadelig fenotype. Hemoglobine is een tetrameer dat bestaat uit 2 alfa en 2 beta subunits. Als 1 van de 2 allelen een inactief beta subunit produceert, leidt dit er daarom toe dat het grootste gedeelte van het hemoglobine minstens een inactieve subunit bevat en dus niet of minder actief is. (4 punten) c. Wat is een conditionele mutant? Leg uit waarom conditionele mutanten erg geschikt zijn om de functies van genen te onderzoeken.

4 Een conditionele mutant is een mutatie die alleen onder bepaalde omstandigheden leidt tot een ander fenotype. Een bekend voorbeeld zijn mutaties die gevoelig zijn voor temperatuur, zoals mutant eiwitten die bij 30 C even actief zijn als het wild type eiwit, maar bij 37 C veel minder actief zijn. Dit soort mutaties zijn in de praktijk erg handig, omdat je een organisme dan kunt bestuderen onder condities waar de mutatie geen effect heeft (ook handig voor het kweken) en condities waar deze mutatie wel een effect heeft. (4 punten) d. Cystic fibrose is een voorbeeld van een loss-of-function ziekte. Je bent geïnteresseerd in de moleculaire oorzaak van deze ziekte. Beschrijf op welke manier je kunt aantonen of de oorzaak van het verlies aan functie ligt -op transcriptie niveau -of op translatie niveau. Als het probleem ligt op transcriptie niveau dan moet dit leiden tot een verminderde productie van mrna, of een verkeerde splicing wat een andere grootte van het mrna tot gevolg heeft. Mogelijke methodes om de hoeveelheid mrna te kwantificeren zijn real-time PCR, micro-arrays, en Northern blotting. Als het probleem op translatie niveau ligt, dan heeft dat gevolgen voor de hoeveelheid eiwit dat geproduceerd wordt, of mogelijk de vouwing en stabiliteit van een eiwit. Een goede methode om de hoeveelheid van een specifiek eiwit te kwantificeren is Western blotting. (4 punten) e. Bepaalde mutanten van het cystic fibrose gen blijken normale transcriptie en translatie te ondergaan, maar het eiwit blijkt niet in het plasmamembraan terecht te komen. In plaats daarvan hoopt het eiwit zich op in het membraan van het endoplasmatisch reticulum. Noem 2 mogelijke mutaties in het eiwit die ervoor kunnen zorgen dat het eiwit niet op de juiste manier naar het plasmamembraan wordt getransporteerd. - mutaties waardoor het eiwit niet meer goed vouwt. Een eiwit dat niet goed gevouwen is zal het ER niet verlaten om door te gaan naar de Golgi en uiteindelijk het plasmamembraan, maar zal in plaats daarvan zich ophopen in het ER en uiteindelijk worden afgebroken in het cytosol - een mutatie waardoor een zogenaamd ER-retentie signaal wordt geïntroduceerd - een mutatie waardoor er geen of andere glycosylering plaatsvindt. (4 punten)

5 3 (20 minuten; 15 punten) Honden hebben geen aparte lichtgevoelige eiwitten voor rood en groen en zijn in dit gebied dus kleurenblind. Voor gewone honden is dat geen probleem, maar het onderscheid tussen rood en groen zou voor blindengeleidenhonden handig kunnen zijn. Je besluit daarom te proberen blindengeleidenhonden genetisch te modificeren en het gen voor het menselijke roodgevoelige eiwit in te brengen. Om te zien of het menselijke eiwit goed tot expressie komt en op de juiste manier in de cellen van de hond wordt ingebouwd, neem je een klein biopt uit de blindengeleide hond en probeert de cellen in het laboratorium te kweken. Deze primaire cellen blijken al snel niet verder te delen. a. Noem 2 redenen waarom deze cellen niet oneindig verder delen. - de cellen hebben niet voldoende telomerase om na elke celdeling de telomerene op de juiste lengte te houden. Na elke celdeling worden de telomeren dus korter, totdat celdeling niet meer mogelijk is. - celdeling staat onder controle van een aantal checkpoints die bijvoorbeeld controleren of er geen DNA schade is opgetreden. Na een aantal celdelingen van normale cellen komen cellen niet meer door deze checkpoints heen. In tumorcellen zijn deze checkpoints vaak uitgeschakeld. (4 punten) Van een collega krijg je de tip om voor je experimenten embryonale stamcellen te gebruiken. De eerste stap is om het DNA dat codeert voor het roodgevoelige eiwit in de stamcel te brengen en die cellen te selecteren die het DNA ergens in een van de chromosomen heeft ingebouwd. b. Op welke manier kun je selecteren op cellen die het DNA stabiel in het genoom hebben ingebouwd? Hoe groot is de kans dat door de inbouw van het nieuwe gen, de functie van een bestaand gen wordt verstoord? Selectie is mogelijk door naast het gen dat codeert voor het rode lichtgevoelige eiwit ook een gen in te bouwen dat codeert voor een eiwit dat zorgt voor resistentie tegen bijvoorbeeld antibiotica. Alleen cellen die het DNA dan hebben ingebouwd zullen resistent zijn. Omdat maar ongeveer 3% van het totale genoom codeert voor eiwitten of gen regulerende sequenties, is de kans dat de functie van een bestaand gen wordt verstoord niet zo groot. (4 punten)

6 c. Om een betere controle te hebben over de positie van het nieuwe gen, adviseert een andere collega om gebruik te maken van zogenaamde zink vinger nucleases, die je kunt gebruiken om heel specifiek op 1 bepaalde plaats in het X- chromosoom te knippen. Op welke manier helpt het creëren van een dsdna breuk op deze plaats de inbouw van een nieuw stuk DNA? Dubbel-strands breuken zijn heel gevaarlijk voor een cel en zullen efficiënt worden gerepareerd, ofwel door niet-homologe end-joining, of wel door homologe recombinatie. Voor dit laatste proces is een DNA sequentie nodig die homoloog is aan de sequentie rond de dsdna breuk. Door het gen van het rode gen te omringen met sequenties die gelijk zijn aan de target site, zal dit DNA tijdens homologe recombinatie kunnen dienen als template en op die manier efficiënt en op een hele specifieke plaats in het genoom worden ingebouwd. (3 punten) d. Welke volgende stappen moet je doen om tot een transgene hond te komen die daadwerkelijk bij een rood stoplicht blijft staan (en niet alleen omdat dit licht bovenaan staat). - DNA op bovenstaande manier stabiel inbouwen in embryonale stamcel van een hond - deze genetisch gemodificeerde stamcel inbrengen in een embryo - als dit embryo uitgroeit tot een gezonde hond zal een gedeelte van de cellen een gen voor het rode lichtgevoelige eiwit met zich meedragen - die honden die het gen ook in hun geslachtscellen hebben ingebouwd worden gekruist en doorgefokt. (4 punten) PS. In de praktijk zijn er nog wel een paar andere hordes te nemen. Het moet bijvoorbeeld ook zo zijn dat activatie van dit roodgevoelige eiwit ook tot een signaal naar de hersenen leidt. En de honden moeten natuurlijk nog getraind worden.

7 4 (~25 minuten; 15 punten) Post-translationale modificaties van serine en lysine spelen een belangrijke rol in de regulatie van histoneiwitten. a. Noem twee verschillende post-translationele modificaties van histonen, benoem op welk aminozuur deze plaatsvinden en verklaar hoe de lading van het aminozuur veranderd. (4P) -Serine phosphorylering van neutraal naar negatief -Lysine acetylering van positief naar neutraal -Lysine methylering blijft positief -Lysine ubiquitylering van positief naar neutraal, maar ubiquitine is ook geladen b. Beschrijf kort de algemene (sequentie onafhankelijke) effecten die de door u beschreven histon modificaties hebben op de interactie van het histon met DNA. (2P) Het verminderen van de positieve lading van de histonen verlaagt de algemene affiniteit van de histoneiwitten (positief) met het DNA (negatief). c. De meeste post-translationele modificaties van histonen bevinden zich op de N-terminus van het histoneiwit. Verklaart u dit. (3P) De N-termini van de histoneiwitten zijn niet gevouwen in een compacte structuur / flexibel en steken uit de nucleosomen uit en zijn daarmee toegankelijk voor enzymen die deze N-termini kunnen modificeren en voor de code-reader complex / eiwitten welke de moleculaire status van een specifiek nucleosoom uitlezen. d. Het patroon van de post-translationele modificaties op de histoneiwitten bevat belangrijke en specifieke moleculaire informatie, bijvoorbeeld voor de chromatine toestand van het gen waaraan het gebonden is. Verklaart u dit. (3P) Dit is de zogenaamde histoncode, waarbij combinaties van bepaalde histonmodificaties op specifieke aminozuren een herkenningspatroon zijn voor andere eiwitten (core-reader complex) welke deze histoncode kunnen uitlezen/herkennen. Dit complex rekruteert weer specifieke eiwitten die de vastgelegde code door geven aan naastliggende nucleosomen en/of chromatine modificaties/remodeling induceren, bijvoorbeeld het chromatine compacteren.

8 e. Histon methylering en ook DNA methylering kunnen ook geïnitieerd worden als gen transcriptie al aan de gang is. Hiervoor wordt de groeiende mrna keten, die uit de RNA polymerase komt, gebruikt als herkenningsmotief. Beschrijf kort hoe dit proces werkt en wat de gevolgen zijn voor de transcriptie van het specifieke gen. (3P) Dit gaat via RNA interference. Dubbelstrengs RNA in de cel (bijvoorbeeld afkomstig van virussen) wordt door het DICER complex geknipt in korte stukjes sirna. Vervolgens worden deze geassembleerd met een andere groep van eiwitten om een zogenaamd RITS (RNA-induced transcriptional silencing) complex te vormen. Met het enkelstrengs RNA as herkenningsmotief bindt dit complex aan het complementaire RNA transcript terwijl deze gesynthetiseerd worden door de RNA polymerase. Hiermee is het RITS complex dichtbij het DNA/chromatine gelokaliseerd van het specifieke gen dat uitgelezen wordt. Het RITS complex rekruteert vervolgens eiwitten die histonmodificaties doorvoeren. Hierdoor kunnen chromatinemodificaties optreden, resulterend in bijvoorbeeld gene silencing.

9 5 (~20 minuten; 15 punten) Biochemische signalen worden vaak op het celmembraan opgevangen en middels transmembraaneiwitten in de cel doorgegeven. Signalering via GPCRs kan uiteindelijk leiden tot activatie van protein kinase C. Hiervoor zijn calcium ionen en diacylglycerol moleculen nodig als secondary messengers. a. Beschrijf algemeen hoe GPCR activatie leidt tot vorming van diacylglycerol en calcium. Ga daarbij in op het phosphoinositide PI(4,5)P 2, welke in de signaalcascade geactiveerd wordt. N.B. U hoeft niet de specifieke namen van de betrokken eiwitten te noemen, maar wel kort de belangrijkste stappen / processen beschrijven welke optreden. (5P) Activatie van de GPCR leidt tot activatie van de intracellulaire trimere G-eiwitten door uitwisseling van GDP voor GTP. Deze G-eiwitten binden en activeren en enzym (phospholipase) welke het PI(4,5)P 2 hydrolyseert in diacylglycerol en inositol (1,4,5)-triphosphate (IP3). Dit IP3 bindt aan een calcium release kanaal in het ER wat leidt tot excretie van Ca2+ in het lumen. Samen met diacylglycerol bindt het Ca2+ aan PKC en activeert deze. Receptor tyrosine kinasen zijn de andere belangrijke klasse van transmembraan receptoren. Zij kunnen onder andere een PI 3-kinase activeren, welke het membraangebonden phosphoinositide PI(4,5)P 2 phosphoryleert tot PI(3,4,5)P 3. b. Welke rol speelt het molecuul PI(3,4,5)P 3 in de signaalcascade en waarom is het van belang dat PI(3,4,5)P 3 membraangebonden is? N.B. U kunt uw antwoord algemeen houden en hoeft niet de specifieke namen van de betrokken eiwitten te noemen. (5P) Het PI(3,4,5)P 3 fungeert als docking site / herkenningsplatform in het celmembraan. Na phosphorylering is het een moleculair herkenningspatroon voor specifieke signaal eiwitten (eg PDK1 en Akt), waardoot deze eiwitten dicht bij elkaar in de buurt komen en signalen (phosphorylering) aan elkaar doorgeven. De membraanlocalisatie verhoogt de lokale concentratie van de eiwitten, lokaliseert het signaleringsproces tot een specifiek compartiment en brengt de juiste interactiepartners bij elkaar.

10 Naast signalering via secondary messengers en fosforylering, kunnen signalen ook in de cel doorgegeven worden door middel van gereguleerde veranderingen in eiwitproteolyse. c. Beschrijf hoe middels gereguleerde proteolyse de activiteit van de transcriptiefactor NF B gereguleerd wordt. Verklaart u iedere stap/pijl van de signaalscascade in het schema hiernaast. (5P) Na activatie van de TNFalfa receptor dmv binding aan TNFalfa, wordt de IkappaB Kinase Kinase (IKK) gephosphoryleerd en daarmee geactiveerd. Deze, nu actieve, kinase phosphoryleert IkappaB, waardoor dit eiwit vervolgens ge-ubiquitinyleerd wordt en afgebroken in het proteasoom. Hiermee wordt de transcriptiefacotr NFkappaB vrijgezet (is niet meer geïnhibeerd) en kan aan DNA binden en de transcriptie van specifieke genen aanzetten.

11 6 (~20 minuten; 20 punten) U bent onlangs benoemd tot afdelingshoofd van de oncologiesectie van een innovatief farmaceutisch bedrijf. U moet met uw afdeling anti-kanker medicijnen op basis van kleine moleculen maken, welke de producten van specifieke kanker-kritische genen blokkeren. a. Zou u inzetten op moleculen die tumor suppressor eiwitten, oncogenen of DNA-reparatie enzymen inhiberen? Legt u uit waarom u wel of niet de bepaalde type eiwitten selecteert. (5P) Alleen de oncogenen zijn in dit geval logische doeleiwitten voor de kleine molecule. Oncogenen hebben een dominant, groeibevorderend effect op cellen. Als dus deze oncogenen worden geblokkeerd, dan kan het zijn dat de cel terugkeert naar een normale toestand. Tumor suppressor genen en DNA-reparatie enzyme zijn geen doeleiwitten voor antikanker medicijnen, want deze twee klassen van eiwitten leiden juist tot kanker als ze afwezig zijn. Hun inhibitie zou dus alleen maar bijdragen aan de tumorgroei. U bent zo succesvol in uw nieuwe positie, dat u nu ook verantwoordelijk bent voor het maken van contrast reagentia voor de detectie van tumoren. Een van de contrastreagentia die u ontwikkeld is gebaseerd of radioactief glucose. (5P) b. Legt u uit waarom gelabeld glucose kan functioneren als marker/detectiemiddel van tumoren. Tumorcellen kenmerken zich door versnelde groei en deling. Hierdoor hebben ze ook een verhoogd metabolisme en daarmee noodzaak tot verhoogde opname en gebruik van bouwstoffen zoals glucose. Tumorweefsel zal dus meer glucose opnemen als gezond omliggend weefsel. De toediening van radioactief glucose zal dus leiden tot een sterker signaal vanuit tumorweefsel. U bent nu echt op dreef en ontwikkeld in de avonduren ook nog een gentherapie welke leidt tot overexpressie van caspase-eiwitten in tumorcellen. c. Legt u uit wat uw rationale achter de overexpressie van caspasen in de tumoren is. (5P) Caspasen zijn de moleculaire uitvoerders van apoptose / celdood. Een verhoogde expressie van caspasen, selectief in tumorcellen (dmv de

12 gentherapie), zal dus leiden tot een veel grotere gevoeligheid / snellere intreding van celdood van de tumorcellen. Als laatste wapenfeit ontwikkelt u een proteasoom-inhibitor voor de behandeling van bepaalde tumoren. Op weg naar huis herinnert u zich aan die twee enthousiaste docenten die de colleges van het vak moleculaire cel biologie verzorgden. U loopt in gedachten nog een keer door de colleges heen en realiseert zich dat u uw proteasoom-inhibitor wellicht ook kan gebruiken voor de behandeling van bepaalde auto-immuun ziekten en ter ondersteuning van orgaan transplantaties. (5P) d. Legt u uit hoe u tot deze conclusie komt. (5P) Zowel auto-immuun ziekten als orgaantransplantaties hebben last van ons eigen immuunsysteem, waarbij ons immuunsysteem onze eigen cellen of die van de orgaandonor herkent en aanvalt. Herkenning van deze cellen door het immuunsysteem gebeurt met behulp van MHC eiwitten van onze cellen die korte stukjes peptide van pathogenen, maar ook van onze eigen cellen aan de buitenkant van de cel tentoonspreiden ter herkenning/screening door T-cellen. Deze korte stukjes peptide worden in de cel gemaakt door afbraak van pathogene en endogene eiwitten in het proteasoom. Inhibitie van het proteasoom voorkomt dus de presentatie van die peptides aan de buitenkant van de cel en daarmee de activatie van het immuunsysteem. Bonusvraag (~5 minuten; 5 punten) Wat is de paradox van Levinthal? De paradox van Levinthal laat zien dat eiwitvouwing niet plaatsvindt doordat een eiwit alle mogelijke conformaties langs gaat op zoek naar de thermodynamisch meest stabiele conformatie. Een eenvoudig rekensommetje laat zien dat dat onmogelijk is. Stel dat je een eiwit hebt met 150 aminozuren, met voor elk aminozuur 3 mogelijke conformaties (conservatieve aanname), dan is het totaal aantal mogelijke conformaties Zelfs als een eiwit extreem snel van conformatie kan veranderen, dan nog zou het heelal al lang zijn opgehouden te bestaan voordat alle mogelijke conformaties zijn bezocht. Aangezien de meeste eiwitten vouwen op een tijdschaal van een seconde, moet eiwitvouwing volgens een bepaald pad verlopen ( folding funnel ).