Cover Page. The handle holds various files of this Leiden University dissertation.

Transcriptie

1 Cover Page The handle holds various files of this Leiden University dissertation. Author: Wilson, Erica Georgina Title: Contributions to the quality control of two crops of economic importance: hops and yerba mate Date:

2 ! samenvatting In dit proefschrift worden oplossingen beschreven die zijn ontwikkeld voor twee problemen die rechtstreeks te maken hebben met kwaliteitsaspecten van plantaardige grondstoffen, hop en Ilex paraguariensis, die worden gebruikt bij de bereiding van de massaconsumptie producten bier en Yerba mate. Voor het brouwen van bier worden verschillende typen extract van de vrouwelijk bloemen (bellen) van hop, Humulus lupulus (Cannabinaceae), gebruikt om de typische bier bitterheid te verkrijgen, maar ook vanwege hun schuimstabiliserende eigenschappen. Deze activiteiten zijn afkomstig van de iso-!-zuren die tijdens het brouwproces zijn ontstaan door isomerisatie van de hop bitterzuren (!-zuren), humulon, cohumulon en adhumulon, waaruit respectievelijk 3 paar stereo-isomeren ontstaan, trans/cisisohumulon, -isocohumulon en -isoadhumulon. Hoewel het duidelijk is dat deze verbindingen rechtstreeks verantwoordelijk zijn voor de bitterheid van bier, is niet helemaal duidelijk in welke mate de individuele componenten hieraan bijdragen. De enige manier om dit te kunnen onderzoeken is de beschikking hebben over voldoende hoeveelheden van de zuivere individuele isomeren. Deze componenten zijn echter niet commercieel verkrijgbaar. De enig beschikbare iso-!-zuren standaarden zijn mengsels van de dicyclohexylamine (DCHA) zouten van de trans-iso-!-zuren, die vanzelfsprekend niet geschikt zijn voor sensorische smaakpanels. Wij hebben daarom methoden ontwikkeld om deze voor sensorische kwaliteitsonderzoek van bier zo belangrijke verbindingen te produceren. De methoden zijn gebaseerd op de combinatie van een krachtige preparatieve chromatografische scheidingsmethode, Centrifugal Partition Chromatography (CPC), en selectieve precipitatie van cis/trans verbindingen. Onze eerste inspanningen richtten zich op de CPC scheiding van de drie bitter-!- zuren, humulon, cohumulon en adhumulon, met de methode ontwikkeld door Hermans-Lokkerbol et al. (1997), gevolgd door magnesium-gekatalyseerde alkalische isomerisatie met een enigszins aangepaste methode van Koller (1968) en selectieve precipitatie van trans-iso-!-zuur met DCHA (Thornton et al.1993). Hiermee kunnen alle zes de isomeren gescheiden worden, maar de opbrengst was extreem laag door de lage recovery bij het regenereren van de trans-isomeren uit het DCHA-zout en de vrijwel absolute verwijdering van het giftige en ongewenste DCHA. Echter, met deze methode was het wel mogelijk om de individuele DCHA-trans-iso-!-zuren, die commercieel niet

3 238 verkrijgbaar zijn, te produceren. De zuivere cis-verbindingen konden ook als referentie verbindingen in methanolische oplossing worden aangeboden. (Hoofdstuk 3) De tweede strategie was vooral gebaseerd op CPC-scheidingen. Van een commercieel gepre-ïsomeriseerd hop extract, danwel een CO 2 hop extract dat eerst werd geïsomeriseerd, scheidden we de trans/cis isomeren en werden met behulp van DCHA all- trans- of all- cis- mengsels verkregen. Van deze monsters werden vervolgens CPC scheidingen uitgevoerd. De beste scheiding werd verkregen met een ph-zone refining methode met een ternair oplosmiddelensysteem van n-hexane: methanol: water (10:5:5) +2% TFA in de bovenste organische laag als stationaire fase, en 0.05% ammonia in de waterige onderlaag als mobile fase. Na 1.5 uur werd de hoeveelheid ammonia verhoogd tot 0.1%. De flow bedroeg 2.0 ml/min, de rotatiesnelheid was 900 rpm en het eluaat werd gemonitord bij 270 nm. Op deze manier werd tijdens de CPC scheiding vrijwel alle DCHA verwijderd en werden zuivere isomeren verkregen. Toepassing van dezelfde methode op een geïsomeriseerd hop extract om alle 6 de isomeren in één chromatografische run te scheiden, resulteerde in zuivere componenten voor 3 van de 6 isomeren: cis-isohumulon, cis-isoadhumulon and transisohumulon. Trans-isoadhumulon dat samen met cis-isoadhumulon in lage concentraties aanwezig was, kon op deze manier niet in significante hoeveelheden worden verkregen, terwijl een klein deel van het trans-isohumulon gedurende een uur langzaam elueerde en zodoende het trans-isocohumulon en het cis-isocohumulon, hoewel ook gedeeltelijk gescheiden, contamineerde (Hoofdstuk 4) De methode die als beste werd bevonden was gebaseerd op de CPC scheiding van een CO 2 hop extract, gevolgd door base-gekatalyseerde isomerisatie van de!-zuren en complexering van de iso-!-zuren met #-cyclodextrine (#-CD), waarbij uitsluitend transiso-!-zuur/#-cyclodextrine insluitings complexen werden gevormd. De cis-iso-!-zuren die in de oplossing achterbleven konden worden teruggewonnen door extractie met een apolair oplosmiddel en bewaard worden als oplossing in ethanol. Het witte, poedervormige #-cyclodextrine complex met de trans-iso-!-zuren bleek zeer stabiel te zijn. Door toepassen van deze methode op een geïsomeriseerd hop extract kon een all-trans-iso-!-zuren extract worden verkregen. Complexering werd verkregen met en oplossing van 1.8 g (equivalent aan 1.58 x.10-3 mols) van #-CD in 18 ml ethanol:water 1:2 v/v) en verwarming tot 50 C. Monsters werden bereid door circa 0.5 g iso-!-zuren (equivalent aan 1,57 x 10-3 mol, uitgaande van een gemiddeld MW=326 da) in 6.5 ml ethanol in 30 minuten druppelsgewijs onder roeren toe te voegen aan 18 ml van de #-CD oplossing op 50 C. Het mengsel werd gedurende 3 dagen in het donker

4 239 bewaard op 4 C, waarbij de trans-iso-!-zuren-complexen als grauw witte kristallijne stoffen precipiteerden, uit een kleurloos en helder supernatant.(chapter 5) Het tweede deel van het proefschrift handelt over Ilex paraguariensis, een plant die gebruikt wordt voor het maken van de zeer populaire Zuid-amerikaanse thee, Yerba mate, Het lokale economische belang en de snelle groei van het gebruik van deze plant in kruidenthee is beschreven in hoofdstuk 6. Het feit dat industrialisatie van Yerba mate van recente datum is, verklaart de noodzaak tot het ontwikkelen van betere kwaliteitsparameters, die kunnen helpen om de processen voor het vervaardigen van een veilig en sensorisch consistent eindproduct te verbeteren. Vanwege de grote interesse van de functional food sector voor Yerba mate, is het belangrijk om consistente standaarden te ontwikkelen. In hoofdstuk 7 wordt een overzicht van de chemische samenstelling en de bioactiviteit besproken. De voornaamste secondaire metabolieten in Ilex paraguariensis zijn xanthines, hoofdzakelijk caffeine en in kleinere hoeveelheden theobromine, caffeoylquinic acid derivaten (hoofdzakelijk neo-chlorogeenzuur en chlorogeen zuur) en saponinen. De meeste onderzoeken aan Ilex soorten dateert uit de 1980 s maar de resultaten zijn, hoewel dus nog tamelijk recent, opmerkelijk inconsistent. Variaties in het xanthine gehalte, zelfs met tegenstrijdigheden over de aanwezigheid van theophylline en het polyfenolen gehalte, zijn moeilijk anders te verklaren dan door tekortkomingen van oudere HPLC instrumenten, waarmee bijvoorbeeld componenten uitsluitend werden geïdentificeerd op basis van hun retentietijden. Nieuwe methoden zoals LC/MS en 1 H NMR kunnen bij dragen aan de opheldering van deze tegenstrijdigheden, waardoor het zinvol is om al het eerder uitgevoerde werk kritisch te herzien. In geval van vermeende bio-activiteit is het duidelijk dat meer onderzoek gedaan moet worden, of dat tenminste de beschikbare resultaten objectief en met goede standaarden opnieuw geïnterpreteerd moeten worden, aangezien veel activiteiten zijn gerapporteerd in doseringen of op niveaus waarvan geen activiteit verondersteld mag worden (bv. antimicrobiële activiteit). Deze aspecten zijn belangrijk gezien het feit dat Yerba mate en zijn derivaten als zodanig worden gebruikt voor medicinale doeleinden en is opgenomen in de Argentijnse en Braziliaanse Farmacopee, zowel als in de Duitse als de Franse farmacopee. Er bestaat ook een monograph van de Europese Unie over Mate folium. Zoals besproken in Hoofdstuk 7, hebben alle Ilex soorten een zelfde kwalitatieve samenstelling en zijn alle andere planten stoffen hetzelfde, hoewel I. paraguariensis hierop de uitzondering vormt met een hoog xantine gehalte. In hoofdstuk 8 beschrijven we een mogelijke oplossing voor één van de vele aspecten die van invloed zijn op de kwaliteit van kruidenthee, nl. een methode om vervalsing, door vervanging van Yerba

5 240 mate bladeren door soortgelijke Ilex soorten, te detecteren. Typische kwaliteitscontrole methoden die gebaseerd zijn op de detectie van specifieke verbindingen of markers zijn onbruikbaar gebleken. Wij maken in plaats daarvan gebruik van een holistische aanpak door een methode toe te passen die zoveel metabolieten detecteert als mogelijk is. Een 1 H NMR metabolomics methode toegepast om 11 Ilex soorten, I. paraguariensis, I. dumosa, I. argentina, I. taubertiana, I. pseudobuxus, I. microdonta, I. theezans, I. brasiliensis, I. dumosa var dumosa en I. intergerrima, te analyseren, maakte het mogelijk de 11 soorten te onderscheiden. De voornaamste onderscheidende metabolieten waren polyfenolen en saponinen. Tegelijkertijd werd in de 1 HNMR data ook de aanwezigheid van arbutine vastgesteld, in een range van % (dw). Arbutine, een glycoside dat wordt gehydrolyseerd voordat het wordt geabsorbeerd in het maag-darmkanaal onder vorming van hydroquinone, heeft onder andere een sterke desinfecterend werking in de urineweg, en is bijvoorbeeld de actieve verbinding in Uva ursi, dat vergelijkbare hoeveelheden bevat als I.brasilliensis. Deze stof was nooit eerder gedetecteerd in Ilex soorten. Deze resultaten konden worden bevestigd met een HPLC methode met een C18 kolom (Inertsil ODS-3 (4.6 x 250 mm-5µ)), die gedurende 4 minuten isocratisch werd geëlueerd met AcOH/H 2 O 1% : AcOH/MeOH 1% (90:10), en vervolgens met een lineaire gradient naar 30:70 in 26 minuten. Arbutine werd gedetecteerd bij 282 nm en elueerde, bij een flow van 1.0 ml/min, op 4.83 ± 0.5 min. De volledig gevalideerde methode staat beschreven in Hoofdstuk 9. Concluderend kan gezegd worden dat voor de problemen zoals beshreven in de inleiding oplossingen zijn gevonden. Voor de hopbitterstoffen zijn geheel nieuwe scheidingsmethodes ontwikkeld, die gebruikt kunnen worden om de individuele iso-!- zuren zuiver in handen te krijgen. Voor de kwaliteitscontrole van yerba mate is aangetoond dat NMR-metabolomics een gecshikte methode is om de verschillende Ilex soorten te onderscheiden.