Risico-analyse van een nieuwe insecticide Coragen bij hommels (Bombus terrestris)

Transcriptie

1 Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen Academiejaar Risico-analyse van een nieuwe insecticide Coragen bij hommels (Bombus terrestris) Janna Deknopper Promotor: Prof. dr. ir. Guy Smagghe Tutor: Veerle Mommaerts Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van Master na Master in de Milieusanering en het Milieubeheer

2 Voorwoord Graag zou ik iedereen willen bedanken die hun bijdrage geleverd heeft tot de verwezenlijking van deze thesis en mij met raad en daad heeft bijgestaan bij de voltooiing ervan. Allereerst betuig ik mijn dank aan mijn promotor Prof Smagghe om mij de mogelijkheid te bieden rond dit onderwerp te kunnen werken. Ook wil ik Prof Smagghe bedanken voor de suggesties en de adviezen die mij hielpen het onderzoek en de thesis tot een goed einde te brengen. Ik bedank Dr. Veerle Mommaerts, mijn tutor en copromotor, voor haar goede opvolging, het delen van haar ervaringen, het verlenen van adviezen en het nalezen van mijn thesis. Verder dank ik Ivan Meeus voor alle hulp en advies tijdens het uitvoeren van de toxiciteitstesten. Graag bedank ik mijn medestudenten Laurens Demeyer en Lore Cheroutre die mij bijstonden met raad en daad gedurende het hele proces. Ook richt ik graag een dankwoord aan mijn ouders omdat ze mij de mogelijkheid gaven deze master na master opleiding te volgen, mij te motiveren en bij te staan zodat ik ook deze opleiding tot een goed einde kon brengen. Verder dank ik Biobest N.V., voor het tijdig ter beschikking stellen van alle hommels en benodigdheden en alle andere personen binnen en buiten de UGent die mij te raad stonden en hulp boden. Mei 2012 Janna Deknopper

3 Inhoudstabel Voorwoord Inhoudstabel... i Lijst van figuren... iii Tabel overzicht... iv Afkortingenlijst... v Samenvatting... 1 Probleemstelling en doelstelling Inleiding Bombus terrestris Algemeen Kolonieontwikkeling Ecologisch en economisch belang Insecticiden Algemeen Coragen Materiaal en methodologie B. terrestris Proefopzet voor de risicoschatting van Coragen op B. terrestris Insecticiden Klassieke toxiciteitsproeven Dataverzameling en verwerking Dataverzameling Verwerking Resultaten Klassieke toxiciteitsproeven Letale effecten Subletale effecten op de reproductie Subletale effecten op het gedrag Discussie en suggesties voor verder onderzoek Letale effecten Acute werkstermortaliteit i

4 4.1.2 Chronische werkstermortaliteit Subletale effecten op de reproductie Subletale effecten op het gedrag Conclusie Referenties... 36

5 Lijst van figuren Figuur 1: Ontwikkeling van B. terrestris tot adult 5 Van links naar rechts: ei, eerste larvale stadium (L1), L2, L3, L4, pop en adult. Figuur 2: Werking van het insecticide Coragen (DuPont, 2008).8 Figuur 3: Werking van de spier (Austin Community College, 2012)..9 (a) Een spier in rust door inhibitie van de binding tussen actine en myosine tot actomyosine doordat het proteïne tropomyosine de myosine bindingplaatsen op de actine moleculen blokkeert. (b) Activatie van de spier door een vrijstelling van calcium die door een binding op tropopyosine een binding tussen myosine en actine toelaat. Figuur 4: Werkingsmechanisme Rynaxypyr (DuPont, 2008).. 9 Rynaxypyr bindt met de ryanodine-receptoren waardoor een ongecontroleerde vrijstelling van calcium in het celcytoplasma wordt veroorzaakt. Hierdoor wordt de spierwerking verstoord en wordt verlamming van het insect geïnduceerd. Figuur 5: Schema van een risk assessment van insecticiden gespoten op bladeren van een gewas (Setac,2011) Figuur 6: Voorstelling van de microkolonies en hun voedselvoorzieningen.15 (a) klok, (b) nestgebied, (c) pol, (d) suikerwater, (e) wiek. Figuur 7: Gemiddeld percentage gecorrigeerde acute werkstermortaliteit ± STDV na 72 uur orale blootstelling via suikerwater aan de MFRC van Coragen en zijn verdunningen. De mortaliteit in de negatieve controle bedroeg 1 % en in de positieve 98 %. De cijfers 1 tot 4 duiden de verschillende toxiciteitsklassen aan zoals gedetermineerd door de IOBC Figuur 8: Gemiddeld percentage gecorrigeerde chronische werkstermortaliteit ± STDV na een orale blootstelling van 7 weken aan een concentratiereeks van Coragen, toegediend via het suikerwater. De mortaliteit in de negatieve controle bedroeg 3 % en in de positieve 100 %. De cijfers 1 tot 4 duiden de verschillende toxiciteitsklassen aan zoals gedetermineerd door de IOBC Figuur 9: De dosis-response curve van de bekomen werkstermortaliteit na 7 weken chronische blootstelling aan de MFRC, 1/2, 1/5, 1/10, 1/100 en 1/1000 van de MFRC van Coragen via het suikerwater. Het snijpunt van de rode lijnen geeft de LC 50 weer of de concentratie (log) waarbij 50% van de populatie sterft. R 2 = Figuur 10: Gemiddeld percentage gecorrigeerde acute werkstermortaliteit ± STDV na 72 uur orale blootstelling via pollen aan de MFRC van Coragen en zijn verdunningen. De mortaliteit in de negatieve controle bedroeg 0 % en in de positieve 19 %. De cijfers 1 tot 4 duiden de verschillende toxiciteitsklassen aan zoals gedetermineerd door de IOBC Figuur 11: Gemiddeld percentage gecorrigeerde chronische werkstermortaliteit ± STDV na een orale blootstelling van 7 weken aan een concentratiereeks van Coragen via pollen. De mortaliteit in de negatieve controle bedroeg 5 % en in de positieve 76 %. De cijfers 1 tot 4 duiden de verschillende toxiciteitsklassen aan zoals gedetermineerd door de IOBC. 24 Figuur 12: Gemiddeld percentage gecorrigeerde acute werkstermortaliteit ± STDV na 72 uur na een dermale (topische) behandeling met de MFRC van Coragen en zijn verdunningen. De mortaliteit in de negatieve controle bedroeg 0 % en in de positieve 100 %. De cijfers 1 tot 4 duiden de verschillende toxiciteitsklassen aan zoals gedetermineerd door de IOBC... 25

6 Figuur 13: Gemiddeld percentage gecorrigeerde chronische werkstermortaliteit ± STDV na een dermale blootstelling van 7 weken aan een concentratiereeks van Coragen. De mortaliteit in de negatieve controle bedroeg 3 % en in de positieve 100 %. De cijfers 1 tot 4 duiden de verschillende toxiciteitsklassen aan zoals gedetermineerd door de IOBC Figuur 14: Effect op de gemiddelde cumulatieve darrenproductie weergegeven vanaf week 4 tot 7 na een orale blootstelling via het suikerwater aan de MFRC en de verschillende verdunning van Coragen. De data werden geanalyseerd met ANOVA en resulteerden voor week 7 in drie groepen (F = 22,249; df = 3; p < 0,00). De gemiddelde waarden gevolgd door een verschillende letter (A-C) zijn significant verschillend na post hoc Tukey met α = Figuur 15: Effect op de gemiddelde cumulatieve darrenproductie weergegeven vanaf week 4 tot 7 na een orale blootstelling aan de MFRC en een verdunningsreeks van Coragen via pollen. De data werden geanalyseerd met ANOVA en resulteerden in week 7 in drie groepen (F= 22,131; df= 5 en p < 0,001). De gemiddelde waarden gevolgd door een verschillende letter ( A-B-C ) zijn significant verschillend na een post hoc Tukey met α = 0, Figuur 16: Effect op de gemiddelde cumulatieve darrenproductie weergegeven vanaf week 4 tot 7 na een dermale blootstelling aan de MFRC en een verdunningsreeks van Coragen. De data werden geanalyseerd met ANOVA en toonde geen significant verschil aan tussen de verscheidene behandelingen...29 Figuur 17: Overzicht van het aantal microkolonies met lethargisch gedrag bij orale blootstelling aan pollen behandeld met de MFRC en 1/100 van de MFRC van Coragen Tabel overzicht Tabel 1: Acute orale en contacttoxiciteit van chloorantraniliprole op honingbijen Legende: LD 50 -waarde is de dosis dat 50 % mortaliteit veroorzaakt. HQ is het risicoquotiënt. Tabel 2: Overzicht van de geteste insecticiden, met inbegrip van hun commerciële naam, het actieve bestanddeel en hun maximum field recommended concentration (MFRC) 16 Tabel 3: Overzicht van de IOBC toxiciteitsklassen Tabel 4: Overzicht van de acute IOBC toxiciteitsklasse per blootstellingsroute voor B. terrestris 31 Tabel 5: Overzicht van de chronische IOBC toxiciteitsklasse per blootstellingroute voor B. terrestris..32

7 Afkortingenlijst a.i. : active ingredient ANOVA: analysis of variance ATP: adenosinetrifosfaat B. terrestris: Bombus terrestris C: graden Celsius EPA: Environmental Protection Agency EPPO: European and Mediterranean Plant Protection Organization GRIs: Insect Growth Regulators HQ: risico quotiënt ICPBR: International Commission for Plant-Bee Relationships IOBC: The International Organisation for Biological Control of Noxious Animals and Plants km: kilometer L1: eerste larvale stadium LD: Lethal dose LD50: Dosis die bij 50% van de populatie mortaliteit veroorzaakt MFRC: maximum field recommended concentration ml: milliliter NOEC: No Observed Effect Concentration PEC: predicted exposure concentration PNEC: predicted no effect concentration STDV: standaard deviatie TER: toxicity exposure ratio u: uur µl: micro liter

8

9 Samenvatting Hommels spelen een belangrijke rol bij de bestuiving van wilde bloemen en gewassen. Tegenwoordig worden hommels ook meer en meer ingezet als bestuivers voor economische doeleinden. Hommels en meer specifiek Bombus terrestris, vormt een aantrekkelijk bestuiver door hun snelle en grote kolonieproductie, hun goed aanpassingsvermogen, hun efficiënte pollenoverdracht, hun goede weerstand tegen de geldende klimaatcondities, de beschikbaarheid van kolonies gedurende het hele jaar door, enz. Om een goed foerageergedrag en de instandhouding van de hommelpopulatie te verzekeren dienen mogelijke bedreigingen van gewasbeschermingsmiddelen geëvalueerd te worden. Het gebruik van gewasbeschermingsmiddelen helpt economische verliezen ten gevolge van schade veroorzaakt door insecten te beheersen en verhoogt de opbrengst, maar kan negatieve gevolgen hebben voor niet doelwitorganismen zoals bestuivers. Om negatieve effecten in te schatten dienen nieuwe insecticiden aan een risicoanalyse onderworpen te worden. Binnen deze thesis werd een risicoschatting uitgevoerd van het nieuwe insecticide Coragen op B. terrestris. Onder sterk gestandaardiseerde omstandigheden werden microkolonies via drie blootstellingsroutes blootgesteld aan een concentratiereeks van Coragen met als eindpunt werkstermortaliteit (letaal effect), darrenproductie en gedrag (subletaal effect). Telkens werden vier microkolonies, bestaande uit vijf werksters, blootgesteld aan de maximum field recommended concentration (MFRC) en een verdunningsreeks van Coragen, met steeds een herhaling van de proef. De letale effecten werden onderverdeeld in acute en chronische effecten. Op basis van de bekomen acute mortaliteit, bij een behandeling van het suikerwater, worden de MFRC en haar 1/2 verdunning gecategoriseerd als acuut toxische stoffen (IOBC klasse 4). De 1/5 verdunning van Coragen wordt beschouwd als zwak toxisch (IOBC klasse 2). Coragen 1/10, 1/100 en 1/1000 bleken niet toxisch (IOBC klasse 1) te zijn. Bij een dermale of pollen behandeling wordt Coragen beschouwd als niet acuut toxisch (IOBC klasse 1). Op basis van de chronische mortaliteit, opgemeten gedurende zeven weken, worden de MFRC en de 1/2 verdunning van de MFRC van Coragen, bij een toediening via het suikerwater, gecategoriseerd als chronisch toxisch (IOBC klasse 4). Coragen 1/5 en 1/10 verdunningen hebben ook toxische eigenschappen bij een blootstelling via het suikerwater. De verdunningen worden beschouwd als respectievelijk chronisch matig toxisch (IOBC klasse 3) en chronisch zwak toxisch (IOBC klasse 2). Bij een blootstelling via pollen worden de MFRC en de 1/2, 1/5 en 1/10 Coragen verdunningen gecategoriseerd als chronisch niet toxisch (IOBC klasse 1). Een blootstelling aan pollen behandeld met Coragen 1/100 veroorzaakte wel chronische mortaliteit en wordt gecategoriseerd als chronisch zwak toxisch (IOBC klasse 2). Bij een dermale blootstelling wordt de MFRC van Coragen gecategoriseerd als chronisch zwak toxisch (IOBC klasse 2). Coragen 1/2, 1/5 en 1/10 zijn dermaal niet chronisch toxisch (IOBC klasse 1). Met betrekking tot subletale effecten bleek een orale blootstelling aan Coragen via het suikerwater en pollen een invloed te hebben op de reproductiviteit van B. terrestris. De gemiddelde darrenproductie van werksters blootgesteld aan suikerwater behandeld met Coragen 1/5 en 1/10 was significant lager (p<0,05) dan deze van de controle groep. Ook een blootstelling aan met Coragen 1/1 behandelde pollen, resulteerde in een significant (p<0,05) lagere darrenproductie. Werksters blootgesteld aan 1

10 Coragen 1/2, 1/5, 1/10 en 1/100 behandelde pollen hadden een significant (p<0,05) verschillende darrenproductie ten opzichte van de negatieve controle. Een ander subletaal eindpunt dat werd nagegaan waren gedragsveranderingen bij B. terrestris. Een blootstelling aan pollen behandeld met Coragen 1/1 en 1/100 resulteerde in lethargisch gedrag bij werksters en darren bij respectievelijk vier en zeven van de acht behandelde microkolonies. Dit gedrag wordt veroorzaakt door Coragen. Coragen werkt namelijk in op de ryanodine- receptoren, waardoor de normale spierwerking wordt verstoord. Op basis van deze resultaten kan geconcludeerd worden dat de effecten van de MFRC en een verdunningsreeks van Coragen op B. terrestris bepaald worden door de blootstellingsroute. De hoogste acute en chronische mortaliteit werd opgemeten bij een behandeling van het suikerwater en neemt af met verdunning van het insecticide. Niet alleen letale effecten zijn een belangrijk eindpunt met betrekking tot de risicoanalyse van Coragen, ook effecten op reproductie en op het gedrag worden veroorzaakt door een blootstelling aan Coragen. Deze studie belicht verschillende nieuwe eindpunten. Hiermee rijzen ook nieuwe vragen zoals: is het transport van Coragen naar de nectar en pollen significant, zullen lethargische darren in veldstudies in staat zijn een koningin te bevruchten, vertonen ook nieuwe koninginnen lethargisch gedrag, Er is dan ook verder onderzoek nodig om de risico s van Coragen op B. terrestris onder praktijk condities te bestuderen. 2

11 Probleemstelling en doelstelling Bombus terrestris speelt een essentiële rol in een goede werking van het ecosysteem. De hommel is een erg belangrijke bestuiver. Bestuivers zorgen voor de overdacht van pollen, dat cruciaal is voor fruit- en zaadproductie. Wilde en gekweekte gewassen zijn afhankelijk van bestuiving, wat de instandhouding van de hommelpopulatie zowel vanuit ecologisch als economisch standpunt belangrijk maakt. In het Unep rapport 2010 wordt gesteld dat de gezondheid en het welzijn van bestuivende insecten cruciaal is voor het leven doordat bestuiving enerzijds habitats in stand houdt en anderzijds een positieve bijdrage levert tot locale en globale economieën. De biodiversiteit en populatiedensiteit van bestuivers wordt bedreigd door habitatfragmentatie, de toename van pathogenen, invasieve soorten en pollutie (inclusief pesticiden). Binnen de landbouwsector is het beheersen van economische verliezen ten gevolge van schade aan gewassen, veroorzaakt door insecten, een erg belangrijk aandachtspunt. Insecticiden zijn er op gericht plaaginsecten te bestrijden, waardoor steeds gezocht wordt naar nieuwe insecticiden met een grotere efficiëntie en effectiviteit. Het is cruciaal om na te gaan of insecticiden ongewenste negatieve effecten hebben op niet doelwitorganismen zoals bestuivers. B. terrestris speelt een belangrijke rol in de bestuiving van gewassen waardoor insecticiden, gericht op de bescherming tegen plaaginsecten een bedreiging kunnen vormen. Bijvoorbeeld het insecticide Coragen, met als actieve bestanddeel chloorantraniliprole of rynaxypyr, voor de bestrijding van plaaginsecten zoals larven van Lepidoptera en Coleoptera. Dit insecticide werkt in op de ryanodinereceptoren met verlamming van het insect tot gevolg. Tot op heden is er weinig bekend met betrekking tot de gevolgen van Coragen op B. terrestris. Op basis van deze informatie kunnen we besluiten dat het erg belangrijk is om negatieve gevolgen van nieuwe insecticiden, met betrekking tot bestuivers, te onderzoeken. Binnen deze thesis wordt, onder sterk gestandaardiseerde omstandigheden, een risk- assessment uitgevoerd gericht op de identificatie van schadelijk gevolgen van omgevingsrelevante concentraties van het insecticide Coragen op B. terrestris. Om de letale en subletale effecten op reproductie en gedrag te onderzoeken wordt gebruik gemaakt van microkolonies. De microkolonies worden blootgesteld aan een concentratiereeks van Coragen via drie verschillende blootstellingsroutes, namelijk oraal via het suikerwater en de pollen en via contact door een dermale toepassing op de thorax. De resultaten stellen ons in staat een overzicht te geven van de compatibiliteit van het nieuwe insecticide Coragen met B. terrestris. 3

12 4

13 1. Inleiding 1.1 Bombus terrestris Algemeen Bombus terrestris of aardhommel, behorend tot de Apidae- Hymenoptera, is een van de 250 gekende hommelsoorten en komt voor in Europa, Noord-Afrika en West- en Centraal Azië (Goulson, 2010) Kolonieontwikkeling B. terrestris doorloopt een jaarlijkse cyclus. De cyclus vangt aan in februari, bij het toenemen van de temperatuur, met het ontwaken van de koningin. Na enkele dagen foerageren voor pollen en nectar gaat de koningin op zoek naar een gepaste ondergrondse nestplaats. De koningin maakt hiervoor gebruik van reeds bestaande ondergrondse holen zoals verlaten knaagdierholen. In dit nest legt ze in een omhulsel van verzamelde pollen, dat later geconsumeerd zal worden door de larven, 8 tot 16 eitjes. Na een tijdspanne van vier dagen komen de eitjes uit (Goulson, 2010). De koningin voedt zich met de gefoerageerde nectar, opgeslagen in een nectarbeker en gefoerageerde pollen die ook door de larven geconsumeerd zullen worden. B. terrestris behoort tot de holometabole insecten, wat impliceert dat een gescheiden larve- en popstadium plaatsvindt. Tijdens de ontwikkeling van ei tot adult doorloopt B. terrestris vier larvale stadia (Figuur 1). Na een periode van 10 tot 14 dagen breekt het popstadium of metamorfose aan. Gedurende 14 dagen bevindt de larve zich in deze pop, maar deze gelegen in de nabijheid van de koningin ontvangen meer warmte waardoor ze sneller groeien en ontpoppen (Goulson, 2010). Het duurt nog eens 24 uur na het ontpoppen vooraleer de nieuwe hommel zijn witte haren inruilt voor zijn definitief geel en zwart kleurenpallet. Figuur 2: Ontwikkeling van B. terrestris tot adult. Van links naar rechts: ei, eerste larvale stadium (L1), L2, L3, L4, pop en adult. Bij de aanvang van de cyclus produceert de koningin uitsluitend vrouwelijke hommels, ook werksters genoemd. De productie van werkers laat een betere rollenverdeling toe. Een deel van de werksters is verantwoordelijk voor het broed, terwijl anderen belast zijn met het verzamelen van pollen en nectar. Deze taakverdeling maakt een snelle toename in populatiedensiteit, tot maar liefst 350 werksters, mogelijk (Goulson, 2010). Bij het bereiken van een voldoende populatiegrootte, treedt een omslagpunt op. Vanaf dit punt staakt de koningin de productie van werksters en vangt aan met de productie van darren (mannetjes), die zich ontwikkelen uit haploïde (onbevruchte) eitjes, en nieuwe koninginnen (Goulson, 2010). 5

14 Vervolgens treed het competitiepunt op, dat gekenmerkt wordt door een verandering in de sociale omgeving van de kolonie. Vanaf dit punt vangen ook werksters aan met de productie van haploïde eitjes en trachten ze de eitjes, geproduceerd door de koningin, te vernietigen (Gösterit et al. 2008). Dit fenomeen, ook aangeduid als kin-selectie, vindt plaats doordat zowel de koningin als de werksters sterker verwant zijn met hun eigen mannelijke nakomelingen (Bourke & Ratnieks, 2001). Enkele dagen na het ontpoppen, verlaten de darren het nest met als eindpunt zich voort te planten met een nieuwe koningin De bevruchte koningin vult vervolgens gedurende enkele dagen haar vetreserves aan waarna ze op zoek gaat naar een gepaste ondergrondse nestplaats om te overwinteren en de cyclus zichzelf herhaalt (Gürel & Gösterit, 2005) Ecologisch en economisch belang Hommels zijn fytofage insecten die zich voeden met nectar en pollen. Bij het foerageren verzamelt B. terrestris pollen en nectar en brengt deze naar het nest. B. terrestris is een generalist of een polylectische foerageerster, wat betekent dat ze voor het verzamelen van pollen en nectar beroep kunnen doen op een grote variëteit aan bloemen (Dafni et al., 2010). Het foerageergebied van B. terrestris is erg groot in vergelijking met andere bestuivers en strekt zich uit tot een straal van meer dan één kilometer rondom het nest. Hierdoor speelt B. terrestris een beduidende rol in de bestuiving van wilde planten (Goulson, 2010). Bestuiving door insecten wint ook aan belang vanuit economisch standpunt. Williams (2002) stelt dat er van de 264 onderzochte gewassen, 84% afhankelijk is van bestuiving door insecten. Klein et al. (2007) bevestigden deze resultaten en toonden aan dat bestuivers een positieve invloed hebben op de productie van 39 van de 57 globaal meest belangrijkste gewassen. Hommels worden meer en meer ingezet als bestuivers voor economische doeleinden. Goulson (2010) stelt dat 95% van de Nederlandse tomatentelers hommels als bestuivers aanwend. De hommels worden aangekocht en vrijgelaten in het landbouwgebied. B. terrestris is een van de vijf meest gebruikte hommels voor commerciële gewasbestuiving (Velthuis & van Doorn, 2006). Enkele eigenschappen die van B. terrestris een commercieel aantrekkelijke bestuiver maakt, zijn een snelle en grote kolonieproductie gedurende het hele jaar en een goed aanpassingsvermogen aan artificiële condities, habitats, gewassen en klimaatcondities. Daarnaast is het lichaam van B. terrestris bedekt met een dicht harennetwerk, wat een efficiënte overdracht van pollen van de ene naar de andere bloem mogelijk maakt. Sommige gewassen, zoals tomaten en bosbessen, zijn voor hun bestuiving zelfs grotendeels afhankelijk van hommels. Dergelijke gewassen beschikken over pollen die enkel vrijgesteld worden tengevolge van thoracale spiervibraties van grote insecten zoals hommels. Dit fenomeen wordt buzz bestuiving genoemd en kan niet plaatsvinden door kleinere bestuivers zoals bijen en kevers (Dupont & Olesen, 2006). Hommels zijn in tegenstelling tot bijen, minder afhankelijk van de geldende klimaatcondities. Als gevolg van hun behaard lichaam en grote massa, zijn ze zelfs in staat te foerageren bij lichte regenval, windsnelheden tot 70 km/u (Biobest N.V., 2012) en temperaturen van 10 C tot 32 C (Winter et al., 2006). Hommels zijn tevens in staat tot een efficiëntere pollenoverdracht, in vergelijking met bijen, als gevolg van hun grotere en behaard lichaam. Bovendien bezoeken ze meer bloemen tijdens een vlucht waardoor er meer crossbestuiving plaatsvindt (Biobest N.V., 2012). 6

15 Het foerageren van B. terrestris is cruciaal om een goede pollinatie van gewassen te verzekeren. Het aanwenden van insecticiden in het foerageergebied van hommels kan er toe leiden dat pollen en nectar insecticiden bevatten. Wanneer deze vervolgens getransporteerd worden naar het nest vormen ze een risico voor de overleving van het nest. Daarnaast kunnen foerageersters ook rechtstreeks in contact komen met insecticiden wanneer de gewassen besproeid worden in de vroege ochtend of avond wanneer de foerageersters het actiefst op zoek zijn naar nectar en pollen. Tot slot kunnen foerageersters ook in contact komen met residu s op plantendelen. Dit kan leiden tot verlies van foerageersters, wat nefaste gevolgen kan hebben voor de hele kolonie doordat de voedselreserves in gedrang komen. 1.2 Insecticiden Algemeen Insecticiden behoren tot de gewasbeschermingsmiddelen en worden onderverdeeld in vier groepen op basis van hun werkingsmechanisme. Een eerste groep betreft de maaggiften. Tot deze groep behoren insecticiden die na orale opname opgenomen worden in het spijsverteringsstelsel. Een tweede groep betreft deze van de contactgiften. Deze insecticiden veroorzaken mortaliteit van het insect doordat de stof bij contact doorheen de huidbarrière dringt. De derde groep, de gasvormige insecticiden, zijn toxisch nadat ze worden opgenomen via de ademhalingswegen van het insect. De laatste groep betreft de systemische insecticiden. Deze verspreiden zich doorheen het plantenweefsel en plantensap en zijn gericht op de bestrijding van ondermeer zuigende en stekende insecten (Fgov, 2012) Coragen Klasse en gebruik Coragen, een selectief insecticide ontwikkeld door DuPont, kan niet uitsluitend tot een van bovenstaande klassen toegewezen worden. Het insecticide behoort zowel tot de maaggiften als de contactgiften. Coragen dringt doorheen het bladweefsel waardoor verlies als gevolg van regenval wordt voorkomen. Bovendien is het actieve ingrediënt van Coragen erg mobiel, wat transport naar onbehandelde plantendelen mogelijk maakt waardoor het insecticide ook als systemische insecticide bestempeld wordt (DuPont, 2008). Deze bijzondere eigenschap draagt bij tot een hoge performantie en een lange gewasbescherming (twee tot drie weken) wat het veelvuldige gebruik van het insecticide verklaart (Bassi et al., 2009). Coragen wordt ingezet bij de bestrijding van insecten in vroege levenstadia. Het insecticide wordt verneveld op gewassen waarna drie werkingen onderscheiden worden (Figuur 2). Een ovicide werking waarbij het embryo in het ei wordt gedood. Een ovi-larvicide werking waarbij de larve wordt gedood kort voorafgaande of tijdens het uitkomen van het ei. Een larvicide werking waarbij de larve wordt gedood tengevolge van contact of vraat (DuPont, 2008). In de praktijk wordt Coragen ingezet bij de bestrijding van onder meer larven van Lepidoptera en Coleoptera, die schade berokkenen bij de teelt van onder andere aardappelen, tomaten, appelen en peren (DuPont, 2008). 7

16 Figuur 2: Werking van het insecticide Coragen (DuPont, 2008) Werkingsmechanisme Coragen werd door het Insecticide Resistance Action Committee (IRAC) toegewezen tot de chemische groep 28 van de Diamides. De werkzame stof betreft chloorantraniliprole dat in 2007 op de markt werd gebracht. Chloorantraniliprole, ook aangeduid als rynaxypyr, gaat na opname een selectieve binding aan met de ryanodine-receptoren. Ryanodine-receptoren, gelegen op het sarcoplasmatisch reticulum van de spier, het endoplasmatisch reticulum van neuronen en andere celtypes, zijn calciumkanalen die de vrijstelling van intracellulaire calcium controleren (Satelle et al., 2008). De vrijstelling van calcium in het cytoplasma is vereist voor spiercontractie. Bij een spier in rust wordt de binding tussen actine en myosine tot actomyosine geïnhibeerd door het proteïne tropomyosine. Tropomysione blokkeert immers de myosine bindingplaatsen op de actine moleculen (Figuur 3a). Wanneer een spier wordt geactiveerd, wordt er calcium vrijgesteld dat bindt op bindingsplaatsen gelegen op het tropomyosine, de zogenaamde troponine-complexen. Als gevolg van deze binding worden de myosine bindingsplaatsen op de actine moleculen niet langer geblokkeerd en treedt er een spiercontractie op door een binding tot actomyosine (Figuur 3b). Door een binding met ATP wordt de binding tussen myosine en actine opnieuw verbroken en keren de calciumionen terug naar het sarcoplasmatisch reticulum tot een volgende activering van de spier plaatsvindt (Chapman, 1998). 8

17 Figuur 3: Werking van de spier (Austin Community College, 2012) (a) Een spier in rust door inhibitie van de binding tussen actine en myosine tot actomyosine doordat het proteïne tropomyosine de myosine bindingplaatsen op de actine moleculen blokkeert. (b) Activatie van de spier door een vrijstelling van calcium die door een binding op tropopyosine een binding tussen myosine en actine toelaat. De binding van ryanodine- receptoren met rynaxypyr veroorzaakt een ongecontroleerde vrijstelling van calcium in het celcytoplasma (Figuur 4) waardoor de spierwerking verstoort wordt en verlamming van het insect wordt geïnduceerd. Een orale opname of direct contact veroorzaakt een onmiddellijk staken van de voedselopname, lethargisch gedrag, regurgitatie, verlamming en ten slotte dood. Mortaliteit van het insect treedt op binnen de 24 tot 72 uur (DuPont, 2008). Figuur 4: Werkingsmechanisme Rynaxypyr (DuPont, 2008). Rynaxypyr bindt met de ryanodine-receptoren waardoor een ongecontroleerde vrijstelling van calcium in het celcytoplasma wordt veroorzaakt. Hierdoor wordt de spierwerking verstoord en wordt verlamming van het insect geïnduceerd. 9

18 Risico voor bestuivers Pesticiden worden in Europa onderworpen aan een risicoanalyse met betrekking tot hun risico voor honingbijen. Bij het uitvoeren van een risicoanalyse volgt men de richtlijnen opgesteld door organisaties zoals de Protection Group van de International Commission for Plant-Bee Relationships (ICPBR) of de European and Mediterranean Plant Protection Organization (EPPO). De richtlijnen van EPPO geven drie noodzakelijke onderzoeksniveaus aan. Een eerste niveau ( tier -1) betreft een oriënterend laboratorium onderzoek. Het tweede niveau ( tier -2) omvat semi-veld studies uitgevoerd in kooien of tunnels. Een laatste niveau ( tier -3) richt zich op de extrapolatie van gegevens door middel van veldstudies voor het evalueren van letale en subletale effecten van pesticiden op de honingbij. Bij een risicoschatting wordt het risico quotiënt (HQ) vergeleken met een zogenaamd trigger criterium. Het trigger criterium of de treshold value definieert het maximale risico dat nog aanvaardbaar is binnen de grenzen van bescherming vastgelegd door de overheid. Acties dienen ondernomen te worden wanneer het risico quotiënt groter is dan het trigger criterium. Voor insecticiden gespoten op bladeren van gewassen bepaalt Europa een trigger criterium van 50. Bij HQ 50 is een verhoogde waakzaamheid met betrekking tot het insecticide vereist (Setac,2011). Systemische insecticiden, toegediend via de bodem, worden op een andere manier behandeld. Er wordt opnieuw onderzoek uitgevoerd op drie niveaus maar bij de risicoschatting wordt gebruik gemaakt van een toxicity exposure ratio (TER) in de plaats van HQ. Deze TER wordt verkregen door de predicted no effect concentration (PNEC) te delen door de predicted exposure concentration (PEC) (Setac, 2011). Coragen wordt voornamelijk toegepast als insecticide dat gespoten wordt op bladeren van gewassen waardoor er voor het uitvoeren van een eerste risicoanalyse voor B. terrestris (niet-apis) gebruik wordt gemaakt van onderstaand schema (Figuur 5). 10

19 Figuur 5: Schema van een risk assessment van insecticiden gespoten op bladeren van een gewas (Setac, 2011) 9

20 Hieronder volgt een bespreking van de risicoschatting volgens het Setac schema zoals voorgesteld in figuur 5. De verschillende punten komen overeen met de punten zoals weergeven in bovenstaande figuur. 1. Details van het product en het gebruikspatroon. Coragen wordt beschouwd als een insecticide dat past binnen geïntegreerde gewasbescherming gericht op een goede rendabiliteit met respect voor de gebruiker, de menselijke gezondheid en het milieu (Bayer Crop Science, 2012). Coragen wordt ingezet bij de bestrijding van insecten in hun vroege levensstadia door het besproeien van de gewassen. Door het Environmental Protection Agency (EPA) wordt het insecticide geregistreerd als een reduced risk product (DuPont, 2008). Toch wordt Coragen als een milieugevaarlijk product gecategoriseerd doordat het bijzonder giftig is voor aquatische organismen (Du Pont, 2012). DuPont (2008) stelt dat Coragen geen tot een zeer lage impact heeft op honingbijen en hommels. Hieruit zou men kunnen afleiden dat Coragen een goed alternatief biedt voor andere insecticiden zonder verlies aan performantie. Toch raadt DuPont het gebruik ervan tijdens het foerageren van bestuivers af. De Federale Overheidsdienst Volksgezondheid, Veiligheid van de Voedselketen en Leefmilieu (2011) geeft daarentegen aan dat het product wel gevaarlijk is voor bijen en raadt gebruik tijdens foerageerperioden af. 2. Is er een reëel risico voor B. terrestris? B. terrestris kan via drie wijzen blootgesteld worden aan Coragen: Een eerste blootstellingswijze betreft dermaal of topisch contact. Foeragerende werksters worden, bij het besproeien van de gewassen of door contact met sproeiresidu s, rechtsreeks blootgesteld aan Coragen. Deze blootstellingswijze is enkel relevant voor volwassen foeragerende B. terrestris. Een tweede belangrijke blootstellingswijze betreft via verzamelde nectar. Belangrijk is dat Coragen tevens een systemische insecticide is waardoor verspreiding naar alle plantendelen en een lange verblijftijd mogelijk is. Deze blootstellingswijze beperkt zich niet enkel tot volwassen B. terrestris, ook jonge darren, werksters en koninginnen komen in contact met de met Coragen besmette nectar. Een laatste blootstellingswijze betreft blootstelling via verzamelde pollen. De verzamelde pollen worden geconsumeerd door de larven waardoor deze blootstellingsroute belangrijk is voor zowel adulten als larven. De larven worden niet enkel blootgesteld aan gecontamineerde pollen via orale opname, maar ook via contact aangezien de eitjes van B. terrestris in pollenbekers (een mengsel van pollen en nectar) worden gelegd. Bij de honingbij zal deze blootstellingsroute minder belangrijk zijn doordat ze haar eitjes op een secretie van nectar en pollen legt en dus niet zoals bij B. terrestris op een laag pollen en nectar zoals deze oorspronkelijk verzameld werden (Setac, 2011). 3./ 4./5. Wat zijn de effecten op Apis en niet-apis? Insecticiden kunnen nadelig zijn voor bestuivers. De nadelige effecten worden enerzijds bepaald door het actieve ingrediënt, de sterkte en samenstelling van het insecticide zelf en anderzijds door het gedrag, de psychologische respons van het target organisme en de blootstellingsroute (Natural Resources Conservation Service, 2008). Insecticiden kunnen zowel letale als subletale effecten veroorzaken. Deze effecten kunnen nog eens onderverdeeld worden in acute en chronische effecten. 12

21 Op tier 1 niveau (niet-apis) worden minstens 30 individuele werksters blootgesteld aan een worst case scenario in een laboratorium toxiciteitstest (Mommaerts et al., 2011). De acute letale orale en contact toxiciteit wordt bepaald door het scoren van het aantal dode Apis of niet-apis na 24-48u. Op basis van deze gegevens wordt de LD 50 of LC 50 berekend. DuPont (2008) berekende de acute toxiciteit van Coragen en stelt dat de acute (48u) LD 50(oraal) >104 µg a.i /honingbij en de acute (48u) LD 50(contact) >4 µg a.i. /honingbij bedraagt. Deze resultaten sluiten aan bij onderzoek verricht door Dinter et al. (2009) die de acute toxiciteit van Coragen, met water versus aceton als solvent en de toxiciteit van het actieve ingrediënt chloorantraniliprole zijn nagegaan. De resultaten worden voorgesteld in onderstaande tabel (Tabel 1). Tabel 1: Acute orale en contacttoxiciteit van chloorantraniliprole op honingbijen (Dinter et al., 2009) LD 50 is de dosis dat 50 % mortaliteit veroorzaakt. HQ is het risicoquotiënt. De chronische toxiciteit ( tier 1 ) uit zich in mortaliteit. In tegenstelling, lethargisch gedrag en verlies van coördinatie wordt bij honingbijen nagegaan via orale of contact testen waarbij het proefobject gedurende 10 tot 14 dagen wordt gevoed met behandelde pollen en/of suikerwater of dermaal wordt behandeld met het insecticide. Op basis van deze gegevens kan een No Observed Effect Concentration (NOEC) berekend worden. Om consistente gegevens te bekomen en replicatie van de testen mogelijk te maken dient hierbij gewerkt te worden met een voedingsprotocol (Setac,2011). 13. Zijn er effecten op niet-apis die niet voorkomen bij Apis? Mommaerts et al. (2011) toonden aan dat er een vergelijkbare sensitiviteitstrend is tussen de honingbij (Apis) en B. terrestris (niet-apis). Toch dienen resultaten van toxiciteitstesten uitgevoerd op Apis met enige voorzichtigheid geëxtrapoleerd te worden naar niet-apis. Onderzoek verricht door Mommaerts et al. (2011) leverde bewijs voor een verschil in sensitiviteit tussen Apis en niet-apis voor Insect Growth Regulators (GRIs) met een larvicide werking. Dit verschil kan te wijten zijn aan gedragsverschillen, een verschillend kolonieleven, van beide bestuivers. Zo zal bijvoorbeeld de larvale blootstelling bij B. terrestris groter zijn dan bij honingbijen. B. terrestris larven worden namelijk blootgesteld aan verzamelde pollen en nectar en niet zoals bij honingbijen aan secreties (Setac, 2011). Er kan dus besloten worden dat de toxiciteitsgegevens van Apis eerder indicatief geïnterpreteerd dienen te worden en dat meer onderzoek naar de letale en subletale effecten op B. terrestris noodzakelijk is om een risico-inschatting van Coragen te maken. 7./8. Is onderzoek op een hoger tier - niveau vereist? Subletale effecten kunnen waarneembaar zijn op de reproductie door een vertraagde larvale ontwikkeling, een verhoogde larvale mortaliteit, een verhoogde darren productie, en/of op het gedrag door een lager aantal gevulde suikerpotten, lethargisch gedrag, enz. Deze effecten zijn allen vast te stellen binnen de sociale context waarin B. terrestris vertroeft. Voor hommels biedt het gebruik van microkolonies dan ook de mogelijkheid om dergelijke effecten reeds op labo-niveau te identificeren (Mommaerts et al., 2006a,b,2010; Wu et al., 2010; Besard et al., 2011). 13

22 9./12. Wat zijn de effecten volgens semi-veldstudies? Wanneer de effecten van het insecticide vastgesteld werden met behulp van tier -1 testen kunnen semi-veldstudies ( tier -2) zekerheid bieden met betrekking tot de relaties tussen de stressor en een negatief effect. Een semi-veldstudie wordt uitgevoerd op een gewas in een ingesloten testsysteem met gecontroleerde of beperkte blootstelling. De eindpunten betreffen mortaliteit, foerageergedrag, reproductie, enz. (Setac, 2011) Bij het uitvoeren van een semi-veldstudie met bijen dienen de Europese protocollen (EPPO and OECD 7513) gevolgd te worden die aanbevelingen geven betreffende de grootte van de testbehuizing, het gewas, de behandeling, de kolonies en de acclimatisatie van de kolonie aan de testbehuizing. Verschillende onderzoekers bestudeerden het potentieel van Coragen op bestuivers via semiveldstudies. Dinter et al. (2009) onderzochten de invloed van Coragen op kleine honingbijkolonies met behulp van vliegtunnels. De honingbijen werden in vliegtunnels besproeid met 52.5 g en 60 g chlorantraniliprole/ha (Coragen). Gedurende zeven dagen na het besproeien, werden de effecten geïdentificeerd. Verschillende eindpunten werden nagegaan. Een eerste eindpunt, mortaliteit, werd nagegaan door het aantal dode honingbijen voor en na de behandeling te tellen. Een tweede eindpunt, effecten op het foerageergedrag, werd op basis van visuele tellingen van het aantal foerageersters/m 2 nagegaan. Een derde eindpunt, effecten op gedrag, werd visueel vastgesteld door het observeren van het gedrag van foerageersters en honingbijen in de buurt van de bijenkorf. Een vierde eindpunt, de invloed op het broed, werd opnieuw visueel nagegaan op basis van de aanwezigheid van een koningin, het aantal eitjes, larven, poppen en adulten. De resultaten toonden geen significant verschil aan tussen de met Coragen behandelde groep en de controle groep met betrekking tot vliegintensiteit, gedrag, koloniesterkte, de aanwezigheid van een koningin, eitjes, larven of poppen (Dinter et al., 2009). 10. Wat zijn de effecten volgens veldstudies? Een veldstudie sluit nog dichter aan bij de realiteit doordat het gewas zich niet langer binnen een ingesloten testsysteem bevindt, wat impliceert dat de hommels zelf kiezen welke voedingsbron ze benuttigen. Er dient met een minimum van tot foeragerende bijen gewerkt te worden om betrouwbare resultaten te bekomen. Een veldstudie levert gegevens met betrekking tot mortaliteit, reproductie, overwinteringssucces, Veldstudies hebben het nadeel dat andere factoren niet kunnen worden uitgesloten. Dit maakt de interpretatie van de resultaten erg moeilijk doordat synergetische of antagonistische werkingen het resultaat mogelijks beïnvloeden. Bovendien bestaan er geen EPPO richtlijnen voor het uitvoeren van veldstudies met niet-apis (Setac, 2011). 14

23 2. Materiaal en methodologie 2.1 B. terrestris De proefobjecten waren B. terrestris werksters, geleverd door Biobest N.V. (Westerlo, België). B. terrestris werd gekozen als proefobject omdat ze eenvoudig te verkrijgen zijn en veelvuldig ingezet worden in de tuinbouw in Europa. De net uit het ei gekomen, nog witte, B. terrestris werksters werden geleverd waarna ze onmiddellijk per vijf in artificiële plastic nestboxen (breedte van 15 cm, een lengte van 15,5 cm en een hoogte van 10 cm), ook klokken genoemd (Figuur 6), werden ondergebracht. Deze kolonies noemt men microkolonies. Figuur 6: Voorstelling van een microkolonie en hun voedselvoorzieningen (a) klok, (b) nestgebied, (c) pollen, (d) suikerwater, (e) wiek. Gedurende de eerste week na de dominantiestrijd ontwikkelt zich in elk nest een werkster als een pseudokoningin. Deze pseudokoningin ontwikkelt haar ovaria en legt onbevruchte eitjes (haploïde) welke resulteren in mannelijke nakomelingen of darren (Goulson, 2003). Centraal in de klok werd het nestgebied gevormd met de eitjes, de poppen en de nectarbekers (Figuur 6). De voedselvoorziening van de hommels bestaat uit commercieel suikerwater (50% siroop, BIOGLUC, Biobest N.V.) en verse pollenkorrels verzameld door honingbijen. De pollen werden na toevoeging van suikerwater en het kneden tot een knikkervormige bol toegediend via een opening bovenaan de klok (Figuur 6). Het suikerwaterreservoir werd onder het nest geplaatst waarna de hommels via een wiek het suikerwater konden benuttigen (Figuur 6). Gedurende alle experimenten werden de B. terrestris microkolonies gehouden in het donker en onder gestandaardiseerde laboratorium condities: C en 60% relatieve vochtigheid. De manipulaties vonden plaats onder rood licht omdat dit buiten het zichtspectrum van de hommels ligt waardoor ze niet konden opvliegen. 15

24 2.2. Proefopzet voor de risicoschatting van Coragen op B. terrestris Om de compatibiliteit na te gaan van Coragen met B. terrestris werd er een concentratiereeks getest van Coragen. De blootstelling gebeurde via drie blootstellingsroutes oraal, via pollen en suikerwater, en topisch Insecticiden De gegevens van het insecticide Coragen en van de positieve controle Confidor worden voorgesteld in Tabel 2. Tabel 2: Overzicht van de geteste insecticiden, met inbegrip van hun commerciële naam, de actieve stof en hun maximum field recommended concentration (MFRC). Commerciële naam Coragen 200SC Confidor 200SL Formulering Actieve stof Producent Startdosis Suspensie in concentraat (SC) Waterige oplossing (SL) MFRC Verdunningen van de startdosis Chloorantraniliprole DuPont 0,02% 1/2-1/1000 Imidacloprid Bayer 0,10% 1/ Klassieke toxiciteitsproeven Blootstelling via het suikerwater De behandelingen werden een week na het opstarten van de microkolonies gestart (na de dominantiestrijd). Elke behandeling werd toegepast op een totaal van vier klokken en werd tweemaal onafhankelijk herhaald. Via het suikerwater werden de werksters oraal blootgesteld aan de maximum field recommended concentration (MFRC) van Coragen en volgende concentratiereeks: 1/2, 1/5, 1/10, 1/100 en 1/1000 van de MFRC. Deze concentratiereeks werd bekomen door de concentratie van Coragen te verdunnen met suikerwater. Zo werd er voor de MFRC van Coragen 180 μl opgelost in 1 liter suikerwater. Voor het maken van de 1/2 verdunning werd een halve liter van de MFRC aangelengd met een halve liter suikerwater. Voor het maken van de 1/5, 1/10, 1/100 en 1/1000 verdunningen werd respectievelijk 200 ml, 100 ml, 10 ml en 1 ml van de MFRC aangelengd met suikerwater tot 1 liter. De gemaakte concentratiereeks werd geschud om een homogene verdeling van Coragen in het suikerwater te bekomen. Vervolgens werd het behandelde suikerwater verdeeld over de suikerwaterreservoirs zodat in elk reservoir ongeveer 200 ml aanwezig was. Confidor werd gebruikt als positieve controle en werd toegediend als de MFRC (200 mg/l) aan vier klokken en werd tweemaal herhaald. Aan de negatieve controle, bestaande uit vier klokken, werd onbehandeld suikerwater toegediend. Ook dit werd tweemaal herhaald. Het suikerwater (onbehandeld/behandeld) werd toegediend via een wiek onderaan het nest. Het goed functioneren van de wiek werd nagegaan, aangezien dit cruciaal is voor de overleving van de werksters. 16

25 Blootstelling via de pollen Een andere groep werksters werd blootgesteld aan Coragen via pollen. De pollen werden voorbereid op eenzelfde wijze als onbehandelde pollen: er werd suikerwater toegevoegd aan de pollenkorrels en er werden knikkervormige bollen gerold. Vervolgens werden de pollen met behulp van een micropipet besprenkeld met een kraantjeswaterverdunning van Coragen tot verzadiging. Telkens werden twee maal vier klokken blootgesteld aan de volgende kraantjeswaterverdunningen van Coragen 1/1, 1/2, 1/5, 1/10 en 1/100 van de MFRC. De MFRC (1/1) werd bekomen door het toedienen van 180 μl Coragen aan 1 liter kraantjeswater. Hieruit kon de 1/2 verdunning gemaakt worden door een halve liter van de MFRC aan te lengen met kraantjeswater tot 1 liter. Voor het maken van de 1/5, 1/10 en 1/100 verdunningen werd respectievelijk 200 ml, 100 ml en 10 ml van de MFRC aangelengd tot 1 liter door het toevoegen van kraantjeswater. Voor de start van de behandeling werd elke verdunning 1 minuut geschud om een homogene verdeling te bekomen waarna de pollen werden behandeld. De positieve controle, bestaande uit vier klokken en een herhaling, werd blootgesteld aan pollen behandeld met Confidor, door de pollen te verzadigen met de MFRC (200 mg/l). De negatieve controle groep, opnieuw vier klokken en een herhaling, werd blootgesteld aan onbehandelde pollen. De pollen werden via een opening bovenaan het nest toegediend en werden om de twee dagen ververst. De oude pollen werden uit het nest verwijderd, tenzij er eileg, suikerpotten of larven op aanwezig waren, dan werd enkel het deel vrij van eitjes, suikerpotten of larven verwijderd Blootstelling via dermaal contact (topisch) Een laatste groep werksters, blootgesteld aan Coragen, werd topisch behandeld. Hierbij werd een druppel van 50 μl suspensie van Coragen en kraantjeswater aangebracht op de thorax van de hommel met behulp van een micropipet. Opnieuw werden vier klokken behandeld met een 1/1, 1/2, 1/5 en 1/10 kraantjeswaterverdunning van de MFRC. Deze verdunningen werd op een analoge wijze verkregen als de kraantjeswaterverdunningen, gemaakt voor het behandelen van de pollen. Het experiment werd tweemaal herhaald. Om te voorkomen dat de hommels op hun rug gingen liggen, werden de manipulaties uitgevoerd onder rood licht. Ook werd tijdens de manipulaties contact met de pincet en pipet vermeden wat bijdroeg tot het behouden van de rust binnen de kolonie. De positieve controle werd behandeld met een suspensie van Confidor (MFRC: 200 mg/l) in kraantjeswater. Deze behandeling werd toegepast op vier klokken en werd tweemaal herhaald. Ook de negatieve controle groep, behandeld met 50 µl water, bestond uit vier klokken en werd tweemaal herhaald. 17

26 2.3.Dataverzameling en verwerking Dataverzameling Werkstermortaliteit Het vormen van microkolonies gaat de eerste week gepaard met een dominantiestrijd. Om werkstermortaliteit als gevolg van deze dominantiestrijd niet valselijk toe te wijzen aan de behandeling, werd de behandeling gestart na 1 week wanneer er zich in het nest een pseudokoningin ontwikkeld heeft en de dominantiestrijd ten einde is. Na de start van de behandeling werd de acute en chronische toxiciteit (werkstermortaliteit) van de behandelingen onderzocht. De acute toxiciteit werd onderzocht door het scoren van de werkstermortaliteit gedurende de eerste drie dagen (72 uur) na het toedienen van de behandeling. Uit elke microkolonie werden de dode werksters verwijderd en gescoord. De chronische toxiciteit werd onderzocht door op eenzelfde wijze, gedurende zeven weken, de werkstermortaliteit wekelijks te scoren. Het opmeten van de mortaliteit gebeurde identiek voor de controle nesten en voor de verschillende blootstellingsroutes. De scores werden wekelijks per microkolonie cumulatief in een Excel bestand ingevoerd Subletale effecten Effecten op reproductie werden nagegaan door het scoren van het aantal dode larven. Deze zijn eenvoudig waar te nemen doordat de hommels dode en zieke larven verplaatsen naar een hoekje binnen de klok. Het scoren gebeurde op een analoge manier aan het scoren van de werkstermortaliteit. Vanaf het toedienen van de behandeling werden de dode larven wekelijks uit het nest verwijderd en cumulatief genoteerd. Effecten op de reproductie werden ook nagegaan door het opvolgen van de darrenproductie. Initiatie van de darrenproductie vond plaats vanaf week 4. Nieuwe darren, gedurende de eerste 24 u herkenbaar aan hun witte kleur en nadien door het ontbreken van de angel aan het eind van het abdomen, werden tweemaal per week met een pincet uit het nest verwijderd. Deze aantallen werden per microkolonie genoteerd en wekelijks als cumulatieve aantallen in Excel opgelijst. Bij het scoren van de mortaliteit, het aantal dode larven en de darrenproductie werd tevens het gedrag opgevolgd. Gedragsveranderingen werden nagegaan door het gedrag van de werksters en darren van de onbehandelde negatieve controle groep te vergelijken met de behandelde microkolonies. B. terrestris behorend tot de negatieve controle groep waren erg actief en reageerden agressief bij het verwijderen van de darren, dode larven en het toedienen van verse pollen. Het aantal nesten met gedragswijzigingen werd wekelijks gescoord en de gegevens werden opgelijst in Excel. 18

27 2.3.2 Verwerking Werkstermortaliteit De cumulatieve data met betrekking tot de acute werkstermortaliteit, verzameld gedurende de eerste 72 u, werd omgezet in een percentage ten opzichte van het aantal levende B. terrestris. Bijvoorbeeld een behandeling, toegediend aan vier klokken (4 x 5 werksters), heeft een acute mortaliteit van 100% wanneer, gedurende de eerste 72 u, 20 B. terrestris stierven. De gegevens van herhaling 1 en herhaling 2 werden op eenzelfde wijze verwerkt. De cumulatieve data betreffende de chronische toxiciteit werd op eenzelfde wijze verwerkt. Om deze resultaten van de acute en chronische werkstermortaliteit op een correcte wijze te kunnen interpreteren dienen deze waarden nog vergeleken te worden met de mortaliteit in de negatieve controle groep. De Schneider-Orelli formule beschouwt dit gegeven en laat toe de gecorrigeerde mortaliteit (%) te berekenen: Op basis van de gecorrigeerde mortaliteit werden de Coragen concentraties ingedeeld in toxiciteitsklassen zoals bepaald door The International Organisation for Biological Control of Noxious Animals and Plants, of kortweg IOBC. Onderstaande tabel geeft een overzicht van de toxiciteitsklassen (Tabel 3) (Hassan, 1992). Tabel 3: Overzicht van de IOBC toxiciteitsklassen (Hassan, 1992) Klasse 1 < 25 % mortaliteit Niet toxisch Klasse % mortaliteit Zwak toxisch Klasse % mortaliteit Matig toxisch Klasse 4 > 75 % mortaliteit Sterk toxisch De werkstermortaliteit werd visueel voorgesteld in Excel grafieken. Deze grafieken werden opgesteld door de gemiddelde gecorrigeerde cumulatieve werkstermortaliteit (%) per behandeling per week weer te geven. Vervolgens werd ook de LC 50 -waarde van de behandeling met bijhorende R 2 berekend met behulp van het softwareprogramma Graph Pad Prism Subletale effecten De data met betrekking tot de darrenproductie werd wekelijks cumulatief opgelijst per nest. De einddata per nest, de cumulatieve aantallen in week 7, werden geanalyseerd in SPSS Voor alle data werd eerst, een Kolmogorov-Smirnov test uitgevoerd met als doel na te gaan of de data normaal verdeeld was. Dit was het geval, waardoor een one-way ANOVA kon worden uitgevoerd. Deze statistische analyse gaf een indicatie voor significante verschillen voor de darrenproductie, waargenomen bij de verschillende behandelingen en de negatieve controle, gebruikmakend van het 19

28 criterium p=0,05. Vervolgens werd een post-hoc Tukey Kramer test uitgevoerd om de verschillende behandelingen te vergelijken met elkaar en de controle (α=0,05). Gedragsveranderingen werden verwerkt door het aantal nesten waar afwijkend gedrag ten opzichte van de negatieve controle werd vastgesteld, een score 1 te geven (nesten met normale gedragingen kregen een score 0 ). Deze score maakte het mogelijk grafisch weer te geven hoeveel nesten per behandeling afwijkend gedrag (lethargisch gedrag) vertoonden, door per behandeling de scores op te tellen. Bijvoorbeeld als een totale score 2 bekomen werd, impliceert dit dat van de acht behandelde nesten, twee nesten afwijkend gedrag vertoonden ( ). 20

29 3.Resultaten 3.1 Klassieke toxiciteitsproeven Letale effecten Blootstelling via het suikerwater Figuur 7 geeft de gemiddelde acute gecorrigeerde werkstermortaliteit (%) van B. terrestris weer, na een via het suikerwater orale blootstelling aan de geteste concentratiereeks van Coragen. De MFRC van Coragen (1/1) resulteerde in een gemiddelde gecorrigeerde mortaliteit van 79 ± 8 % na 72 uur (IOBC klasse 4: toxisch). De 1/2 verdunning van de MFRC van Coragen resulteerde in eenzelfde gemiddelde acute gecorrigeerde mortaliteit van 79 ± 1 % (IOBC klasse 4). De 1/5 verdunning van Coragen veroorzaakte een gemiddelde acute gecorrigeerde mortaliteit van 27 ± 2 % (IOBC klasse 2: zwak toxisch). Coragen 1/10, 1/100 en 1/1000 bleken niet toxisch (IOBC klasse 1) met een gemiddelde acute gecorrigeerde mortaliteit van respectievelijk 3 ± 3 %, 0 ± 0 % en 0 ± 0%. Figuur 7: Gemiddeld percentage gecorrigeerde acute werkstermortaliteit ± STDV na 72 uur orale blootstelling via suikerwater aan de MFRC van Coragen en zijn verdunningen. De mortaliteit in de negatieve controle bedroeg 1 % en in de positieve controle 98 %. De cijfers 1 tot 4 duiden de verschillende toxiciteitsklassen aan zoals gedetermineerd door de IOBC. Vervolgens werd ook de chronische werkstermortaliteit nagegaan. Figuur 8 illustreert de chronisch gemiddelde gecorrigeerde werkstermortaliteit over een periode van 7 weken van de MFRC van Coragen en de verdunningsreeks. De MFRC van Coragen veroorzaakte in week 1 en week 7 respectievelijk 87 ± 4% en 96 ± 2 % mortaliteit, waardoor de MFRC als chronisch toxisch (IOBC klasse 4) wordt bestempeld. Ook een verdunning van 1/2 van de MFRC, met een chronische mortaliteit van 95 ± 7 %, wordt geklasseerd als chronisch toxisch (IOBC klasse 4). Bij verdere verdunningen van de MFRC wordt een dalende werkstermortaliteit waargenomen (Figuur 8). De 1/5, 1/10, 1/100 en 1/1000 verdunningen van de MFRC van Coragen veroorzaakten respectievelijk 51 ± 4 % (IOBC klasse 3), 27 ± 1 % (IOBC klasse 2), 8 ± 0 % (IOBC klasse 1) en 0 ± 4 % (IOBC klasse 1) werkstermortaliteit. 21

30 Figuur 8: Gemiddeld percentage gecorrigeerde chronische werkstermortaliteit ± STDV na een orale blootstelling van 7 weken aan een concentratiereeks van Coragen, toegediend via het suikerwater. De mortaliteit in de negatieve controle bedroeg 3 % en in de positieve 100 %. De cijfers 1 tot 4 duiden de verschillende toxiciteitsklassen aan zoals gedetermineerd door de IOBC. Op basis van de mortaliteitspercentages kon een LC 50 -waarde worden berekend (Figuur 9). De LC 50 - waarde bedraagt 0,182 wat overeenstemt met 1/6 van de MFRC van Coragen. 22

31 Figuur 9: De dosis-response curve van de bekomen werkstermortaliteit na 7 weken chronische blootstelling aan de MFRC en 1/2, 1/5, 1/10, 1/100 en 1/1000 verdunningen van de MFRC van Coragen via het suikerwater. Het snijpunt van de rode lijnen geeft de LC 50 -waarde weer. R 2 = Blootstelling via pollen De gemiddelde acute gecorrigeerde werkstermortaliteit na 72 uur orale blootstelling aan de MFRC van Coragen via pollen bedroeg 3 ± 0 % (Figuur 10). Dit komt overeen met klasse 1 van de IOBC. Ook de geteste verdunningen van de MFRC van Coragen resulteerden in geen acute toxiciteit (klasse 1 van de IOBC). Figuur 10: Gemiddeld percentage gecorrigeerde acute werkstermortaliteit ± STDV na 72 uur orale blootstelling via pollen aan de MFRC van Coragen en zijn verdunningen. De mortaliteit in de negatieve controle bedroeg 0 % en in de positieve controle 19 %. De cijfers 1 tot 4 duiden de verschillende toxiciteitsklassen aan zoals gedetermineerd door de IOBC. 23

32 Figuur 11 geeft een overzicht van de gemiddelde gecorrigeerde chronische werkstermortaliteit (%) van B. terrestris veroorzaakt door de MFRC en een verdunningsreeks van Coragen toegediend via pollen. Figuur 11 toont dat een blootstelling aan de MFRC van Coragen 19 ± 16 % werkstermortaliteit (IOBC klasse 1: niet toxisch) veroorzaakt na 7 weken. Ook de Coragen 1/2, 1/5 en 1/10 verdunningen worden met een mortaliteit van respectievelijk 6 ± 0 %, 12 ± 9 % en 0 ± 4 % beschouwd als niet toxisch (IOBC klasse 1). Een blootstelling aan pollen behandeld met een Coragen 1/100 verdunning resulteerde in een chronische werkstermortaliteit van 33 ± 29 %. Op basis van dit mortaliteitspercentage wordt Coragen 1/100 gecategoriseerd als chronisch zwak toxisch (IOBC klasse 2) bij een blootstelling aan behandelde pollen. Figuur 11: Gemiddeld percentage gecorrigeerde chronische werkstermortaliteit ± STDV na een orale blootstelling van 7 weken aan een concentratiereeks van Coragen via pollen. De mortaliteit in de negatieve controle bedroeg 5 % en in de positieve controle 76 %. De cijfers 1 tot 4 duiden de verschillende toxiciteitsklassen aan zoals gedetermineerd door de IOBC Blootstelling via dermaal contact (topisch) Figuur 12 stelt de gemiddelde acute gecorrigeerde werkstermortaliteit (%) van B. terrestris voor na dermale (topische) blootstelling aan de MFRC en een verdunningsreeks van Coragen. De MFRC en alle geteste concentraties werden geklasseerd als niet toxisch (IOBC klasse 1). 24

33 Figuur 12: Gemiddeld percentage gecorrigeerde acute werkstermortaliteit ± STDV na 72 uur na een dermale (topische) behandeling met de MFRC van Coragen en zijn verdunningen. De mortaliteit in de negatieve controle bedroeg 0 % en in de positieve controle 100 %. De cijfers 1 tot 4 duiden de verschillende toxiciteitsklassen aan zoals gedetermineerd door de IOBC. De chronische werkstermortaliteit waargenomen na een orale blootstelling van 7 weken aan de MFRC en de verschillende verdunningen van Coragen wordt weergegeven door Figuur 13. Een dermale blootstelling aan de MFRC van Coragen veroorzaakte een chronische mortaliteit van 26 ± 14% (IOBC klasse 2) na 7 weken bij B. terrestris werksters. In tegenstelling, verdere verdunningen (1/2, 1/5 en 1/10 van de MFRC) waren niet toxisch (IOBC klasse 1) na 7 weken. 25

34 Figuur 13: Gemiddeld percentage gecorrigeerde chronische werkstermortaliteit ± STDV na een dermale blootstelling van 7 weken aan een concentratiereeks van Coragen. De mortaliteit in de negatieve controle bedroeg 3 % en in de positieve controle 100 %. De cijfers 1 tot 4 duiden de verschillende toxiciteitsklassen aan zoals gedetermineerd door de IOBC Subletale effecten op de reproductie Blootstelling via het suikerwater Figuur 14 geeft een overzicht van het effect van Coragen via het suikerwater op de cumulatieve darrenproductie van B. terrestris werksters na 7 weken blootstelling. Een totale inhibitie van de darrenproductie werd waargenomen bij de MFRC en bij 1/2 van de MFRC. Deze werd veroorzaakt door de hoge chronische werkstermortaliteit. Voor de verdunningen 1/5 en 1/10 van de MFRC was de darrenproductie significant (p<0,05) lager, respectievelijk 10 ± 4 en 148 ± 10 darren ten opzichte van deze van de controle groep (200 ± 4). Bij lagere verdunningen, 1/100 en 1/1000 van de MFRC, bedroeg de gemiddelde darrenproductie respectievelijk 213 ± 5 en 222 ± 6 na 7 weken. Dit was niet significant verschillend (p>0,05) van de controle. 26

35 Figuur 14: Effect op de gemiddelde cumulatieve darrenproductie (± STDV) weergegeven vanaf week 4 tot 7 na een orale blootstelling via het suikerwater aan de MFRC en de verschillende verdunning van Coragen. De data werden geanalyseerd met one-way ANOVA en resulteerden voor week 7 in drie groepen (F = 22,249; df = 3; p < 0,00). De gemiddelde waarden gevolgd door een verschillende letter (A-C) zijn significant verschillend na post hoc Tukey met α = 0, Blootstelling via pollen Figuur 15 geeft een overzicht van de cumulatieve darrenproductie van B. terrestris werksters blootgesteld aan pollen behandeld met een Coragen verdunningsreeks. In de nesten blootgesteld aan pollen behandeld met de MFRC en de verschillende verdunningen van de MFRC van Coragen was de gemiddelde cumulatieve darrenproductie significant (p<0,05) lager dan in de negatieve controle na 7 weken. Bijvoorbeeld tot en met de laagst geteste verdunning, 1/100 van de MFRC, was de gemiddelde cumulatieve darrenproductie significant (p<0,05) lager, 88 ± 4 darren na 7weken. 27

36 Figuur 15: Effect op de gemiddelde cumulatieve darrenproductie (± STDV) weergegeven vanaf week 4 tot 7 na een orale blootstelling aan de MFRC en een verdunningsreeks van Coragen via pollen. De data werden geanalyseerd met one-way ANOVA en resulteerden in week 7 in drie groepen (F= 22,131; df= 5 en p < 0,001). De gemiddelde waarden gevolgd door een verschillende letter ( A-B-C ) zijn significant verschillend na een post-hoc Tukey met α = 0, Blootstelling via dermaal contact (topisch) Figuur 16 geeft een overzicht van de cumulatieve darrenproductie van B. terrestris werksters na dermale blootstelling aan een verdunningsreeks van Coragen. B. terrestris dermaal behandeld met Coragen 1/2 hadden de grootste productiviteit, met een cumulatief aantal van 206 ± 8 darren in week 7. Hommels dermaal behandeld met de MFRC van Coragen hadden met een totaal van 129 ± 7 darren in week 7 de laagste productiviteit. B. terrestris dermaal behandeld met Coragen 1/5 en 1/100 hadden een productiviteit van respectievelijk 169 ± 6 en 176 ± 3 nieuwe darren in week 7. Een one-way ANOVA analyse toonde geen significant verschil (p<0,05) tussen de gemiddelde darrenproductie van de verschillende behandelingen. 28

37 Figuur 16: Effect op de gemiddelde cumulatieve darrenproductie (± STDV) weergegeven vanaf week 4 tot 7 na een dermale blootstelling aan de MFRC en een verdunningsreeks van Coragen. De data van week 7 werden geanalyseerd met one-way ANOVA en resulteerden in 1 groep A (F= 2,219; df= 4 en p= 0,087) Subletale effecten op het gedrag Zoals geïllustreerd in Figuur 17, werd bij microkolonies, gevoed met pollen behandeld met de MFRC en 1/100 van de MFRC van Coragen, lethargisch gedrag vastgesteld. Dit gedrag werd vastgesteld bij zowel de darren als de werksters. Typische kenmerken waren slaperig en futloos gedrag met een zeer lage reactiesnelheid, zelfs bij aanrakingen met een pincet. Bij de MFRC vertoonden de helft van de microkolonies lethargische gedragingen terwijl dit 88% (7 van de 8 microkolonies) was bij een blootstelling aan 1/100 van de MFRC. Bij de controle nesten werd er geen lethargisch gedrag vastgesteld. Ook bij de andere blootstellingsroutes, dermaal en via het suikerwater, werden er geen gedragswijziging waargenomen van de werksters en de darren. 29