Immunotherapy based on influenza virosomes and recombinant Semliki Forest virus de Mare, Arjan

Transcriptie

1 University of Groningen Immunotherapy based on influenza virosomes and recombinant Semliki Forest virus de Mare, Arjan IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below. Document Version Publisher's PDF, also known as Version of record Publication date: 2007 Link to publication in University of Groningen/UMCG research database Citation for published version (APA): de Mare, A. (2007). Immunotherapy based on influenza virosomes and recombinant Semliki Forest virus: novel strategies for the treatment of cervical cancer s.n. Copyright Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons). Take-down policy If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim. Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum. Download date:

2 Chapter 11 Samenvatting

3

4 Chapter 11 Inleiding Het doel van de preklinische studies beschreven in dit proefschrift was het ontwikkelen en optimaliseren van immunotherapeutische strategieën tegen baarmoederhalskanker gebaseerd op influenza virosomen en recombinant Semliki Forest virus (rsfv). Zoals beschreven in de algemene inleiding (Hoofdstuk 1) behelst immunotherapie of therapeutisch vaccineren tegen kanker het opwekken of herstimuleren van een immunologische reactie tegen maligne cellen. Er bestaan verscheidene (veelal experimentele) immunotherapeutische strategieën voor de inductie van antitumor-immuunresponsen. Deze strategieën zijn gebaseerd op passieve of actieve immunisatie. Virosomen en rsfv zijn twee potente systemen voor specifieke actieve immunotherapie. Influenza virosomen zijn lege virusmembranen, die worden gemaakt door influenza virus te ontdoen van het virale genetische materiaal. Virosomen behouden echter wel de receptorbindings- en membraanfusie-eigenschappen van influenza virus. Influenza virosomen kunnen daardoor worden opgenomen door professionele antigeen-presenterende cellen (APC) via endocytose na receptorbinding. Vervolgens kunnen ze, door te fuseren met het membraan van het endosoom, eiwitantigenen die tijdens de preparatieprocedure zijn ingesloten in het lumen van de virosomen, afleveren aan het cytoplasma van de APC. Hoofdstuk 2 beschrijft uitgebreid de procedures voor de bereiding van virosomen en ook het gebruik van virosomen als systeem voor het afleveren van bijvoorbeeld medicijnen of genetisch materiaal. In het bijzonder het afleveren van eiwitantigenen voor immunotherapeutische of vaccinatie toepassingen wordt beschreven. Recombinant SFV is een replicatiedefectieve virale vector. De vector is opgebouwd uit een RNA molecuul, dat is ingepakt in een recombinant virusdeeltje. Infectie van cellen door rsfv leidt tot RNA replicatie en synthese van een door het recombinante virale genoom gecodeerd heteroloog eiwit. Uiteindelijk sterven de geïnfecteerde cellen door middel van apoptose. De apoptotische cellen kunnen vervolgens worden opgenomen door professionele APC. Dit maakt het mogelijk dat peptiden van het heterologe eiwit worden gepresenteerd in de context van major histocompatibility complex (MHC) klasse I moleculen op deze APC. Presentatie van de peptiden in MHC klasse I leidt tot de inductie van een specifieke immuunreactie tegen het heterologe eiwit. Verscheidene immunisatiestudies hebben het vermogen van rsfv om immuunresponsen op te wekken tegen infectieziekten of maligniteiten reeds aangetoond. Hoofdstuk 3 bevat een uitgebreid overzicht van SFV en de aan SFV gerelateerde virussen die samen het genus van de alfavirussen vormen. Het geeft ook een overzicht van de structuur en de levenscyclus van deze virussen en van de mogelijkheden van recombinante alfavirussen om specifieke immuunresponsen te induceren. Het merendeel van het onderzoek beschreven in dit proefschrift richt zich op de inductie van (E6- en) E7-specifieke immuunresponsen. E6 en E7 zijn eiwitten van het humane papillomavirus (HPV). Na 222

5 Samenvatting infectie van keratinocyten van de baarmoederhals door hoogrisico HPV-typen, zoals HPV16 en HPV18 zijn E6 en E7 verantwoordelijk voor de potentiële oncologische transformatie van deze cellen. Een dergelijke transformatie kan leiden tot premaligne afwijkingen van de baarmoederhals en uiteindelijk tot baarmoederhalskanker. Wereldwijd wordt baarmoederhalskanker vastgesteld bij ongeveer een half miljoen vrouwen per jaar. Baarmoederhalskanker is dus een belangrijk probleem binnen de gezondheidszorg. Een overzicht van de epidemiologie van baarmoederhalskanker, van de etiologische rol van HPV en andere milieu- en patiëntgerelateerde risicofactoren in het ontstaan van baarmoederhalskanker, alsmede de huidige maatregelen ter voorkoming en behandeling van baarmoederhalskanker staan beschreven in het tweede deel van Hoofdstuk 1. Het opwekken van cytotoxische T lymfocyt responsen door virosomen Het eerste onderzoekshoofdstuk van dit proefschrift (Hoofdstuk 4) beschrijft een studie naar de inductie van cytotoxische T lymfocyt (CTL) responsen door virosomen. Immunisatie van muizen met virosomen, die het modelantigeen ovalbumine (OVA) bevatten, bleek te resulteren in een efficiënte inductie van CTLresponsen tegen het OVA antigeen. Een immunisatie met minder dan 1 μg OVA ingepakt in virosomen resulteerde al in een CTL-respons, terwijl immunisatie met 100 μg vrij OVA geen detecteerbare respons teweeg bracht. CTL-inductie werd waargenomen na immunisatie via verschillende routes, waarbij de intramusculaire of intraperitoneale toediening iets beter leek te werken dan subcutane injectie. Verder bleek een immunisatie met fusie-actieve virosomen te resulteren in een sterkere CTL-respons dan een immunisatie met fusie-inactieve virosomen. De hoge effectiviteit van virosomen vergeleken met andere systemen die antigenen kunnen afleveren is waarschijnlijk te danken aan enkele unieke eigenschappen van virosomen. Ten eerste binden virosomen aan siaalzuurresiduen op het celmembraan. Deze siaalzuurresiduen komen ook voor op dendritische cellen (DC). Dit resulteert in een efficiënte opname van virosomen door deze cellen. Ten tweede kunnen virosomen hun inhoud direct afleveren in het cytoplasma van cellen dankzij een door het virale hemagglutinine (HA) gekatalyseerde fusiereactie tussen het virosomale membraan en het membraan van het endosoom. Deze actieve aflevering in het cytoplasma lijkt efficiënter te zijn dan het intrinsieke proces (betrokken bij cross-priming ) van transport van exogene eiwiten naar het cytoplasma waar DC over beschikken. Ten derde worden niet alleen CD8 + CTL, maar ook CD4 + T helper lymfocyten geactiveerd door een immunisatie met virosomen. CD4 + T helper lymfocyten zijn cruciaal voor het opwekken van een effectieve CTL-respons en voor het induceren van immunologisch geheugen. Tenslotte induceren virosomen opregulering van verschillende co-stimulatoire moleculen op DC. 223

6 Chapter 11 Het in Hoofdstuk 4 beschreven onderzoek is een duidelijke demonstratie van de bijzondere capaciteiten van influenza virosomen voor de inductie van CTL-activiteit. Vooral het vermogen om antigenen actief af te leveren in de MHC klasse I presentatieroute is een belangrijke eigenschap van virosomen. Het effect van immuniteit tegen influenza virus op CTL-inductie door virosomen Een mogelijke limitatie aan het gebruik van virosomen voor CTL-inductie zou immuniteit tegen influenza virus kunnen zijn. Daarom is in Hoofdstuk 5 het effect van influenza-specifieke immuniteit op de capaciteit van virosomen om een CTL-respons te induceren onderzocht. De experimenten uit deze studie laten zien dat CTL-inductie door virosomen niet wordt verhinderd door een pre-injectie van influenza-specifiek serum of door een eerdere infectie met het influenza virus. Onder beide condities was de CTL-inductie slechts in geringe mate gereduceerd vergeleken met CTL-inductie in naïeve muizen. Verder laat dit hoofdstuk duidelijk zien dat de CTL-respons enorm versterkt wordt door een boosterimmunisatie. Dit betekent dat immuniteit tegen influenza virus opgewekt door de eerste immunisatie het boostereffect niet verhindert. Aangezien blootstelling aan influenza virus niet resulteert in een verdere verlaging van de CTL-respons vergeleken met de respons na pre-injectie van influenza-specifiek immuunserum, kan geconcludeerd worden dat de lichte verlaging in de CTL-respons in muizen met anti-influenza virus immuniteit geheel wordt veroorzaakt door neutraliserende antilichamen. Op welke manier virosomen de influenza-specifieke immuunrespons weten te omzeilen blijft onduidelijk. Wij veronderstellen dat antilichamen tegen influenza virus de inductie van een CTL-respons mogelijk maken door de virosomen een andere route voor de aflevering van het antigeen te laten gebruiken. Geopsoniseerde virosomen worden mogelijk naar cellen die Fc-receptoren tot expressie brengen (zoals professionele APC) geleid. Vervolgens worden ze waarschijnlijk via de Fc-receptoren opgenomen door deze cellen. Na opname, fuseren de virosomen onder invloed van de lage zuurgraad van het endosoom met het endosomale membraan en kunnen ze zo hun inhoud afleveren aan het cytoplasma. Concluderend; laat Hoofdstuk 5 zien dat zelfs in aanwezigheid van immuniteit tegen influenza virus, influenza virosomen efficiënt eiwit antigenen kunnen afleveren voor de inductie van CTL-activiteit. 224

7 Samenvatting Het opwekken van een E7-specifieke antitumorrespons door virosomen Het volgende hoofdstuk (Hoofdstuk 6) laat zien dat virosomen, die recombinant E7 eiwit van HPV type 16 bevatten, een CTL-respons tegen door HPV getransformeerde tumorcellen kunnen opwekken. Bij immunisatie van muizen met kleine hoeveelheden E7 eiwit in virosomen werden grote aantallen E7- specifieke CD8 + T lymfocyten opgewekt. Deze CD8 + CTL bleken een hoge cytotoxisch activiteit te hebben. Verder werd in een tumorexperiment gevonden dat immunisatie met E7-bevattende virosomen de groei van een tumor kan voorkomen bij meer dan 70% van de muizen. Het opwekken van E7-specifieke CTL-responsen bleek efficiënter te verlopen wanneer het E7 werd afgeleverd door fusie-actieve virosomen dan wanneer het werd afgeleverd door fusie-inactieve virosomen. Dit komt overeen met eerder onderzoek naar CTL activatie door virosomen. Het suggereert dat de actieve introductie van E7 in het cytoplasma van APC via fusie van de virosomale en endosomale membraan effectiever is dan introductie in het cytoplasma via de intrinsieke route van DC om exogeen eiwit in de MHC klasse I presentatieroute te brengen. Daarbij komt dat virosomen mogelijke ook als adjuvans per se kunnen werken. Immunisaties met fusie-inactieve E7-virosomen of met E7 eiwit gemengd met lege virosomen resulteerden beide in vertraging van de tumorgroei. Voor het opwekken van een sterke E7-specifieke CTL-respons en bescherming tegen tumorgroei met E7-virosomen is veel minder E7 nodig dan bij andere immunotherapieën tegen HPV. Dit hoofdstuk laat zien dat influenza virosomen kunnen dienen als een efficiënt systeem voor de afgifte van eiwitantigenen bij immunotherapie tegen kanker. Virosomen kunnen sterke cellulaire responsen tegen tumorantigen zoals E7 opwekken en E7-virosomen zijn een veelbelovende immunotherapeutische strategie voor de behandeling van baarmoederhalskanker en voorstadia van deze ziekte. Het effect van immuniteit tegen Semliki Forest virus op CTL-inductie door recombinant SFV Het effect van SFV-specifieke immuun responsen op CTL-inductie door rsfv is beschreven in Hoofdstuk 7. In verscheidene muizenstudies is de potentie van rsfv om CTL-activiteit te induceren reeds aangetoond. De effectiviteit van een immunisatie met rsfv wordt mogelijk gelimiteerd door SFV-specifieke immuniteit, opgewekt door een voorgaande immunisatie. Het is een bekend fenomeen dat de werking van virale vectoren (afgeleid van bijvoorbeeld adenovirussen, adeno-associated virussen en pokkenvirussen) sterk kan worden gehinderd door neutralisatie van de vector door antilichamen en/of het opruimen van geïnfecteerde cellen door cellulaire antivector activiteit. Het onderzoek in dit hoofdstuk laat zien dat een boosterimmunisatie met rsfv, dat E6 en E7 tot expressie brengt (SFVeE6,7), de 225

8 Chapter 11 CTL-respons tegen E7, opgewekt door een eerdere immunisatie met SFVeE6,7, versterkt. SFV-specifieke antilichamen verlaagden de expressie van het door SFV gecodeerde heterologe eiwit (het transgen) na pre-injectie van antilichamen of na voorbehandeling met een andere rsfv vector. De activatie van een CTL-respons werd echter alleen geremd in muizen voorbehandeld met de irrelevante vector en niet in muizen die antilichamen geïnjecteerd hadden gekregen. Wanneer de muizen werden voorbehandeld met irrelevant rsfv gemengd met het relevante eiwitantigeen (E7) dan was het remmende effect van de voorbehandeling met irrelevant rsfv geheel verdwenen. Het remmende effect van een voorbehandeling was ook minder sterk na een immunisatie met SFVeE6,7 via een andere injectieroute dan de voorbehandeling. Aangezien CTL activatie niet geremd was in muizen waarbij de transgenexpressie verlaagd was na injectie van antilichamen, kunnen we concluderen dat de verminderde beschikbaarheid van het transgen door neutralisatie van de vector geen limiterende factor is voor CTL-inductie in muizen met SFVspecifieke immuniteit. De resultaten wijzen erop dat een ander mechanisme, T cel competitie, naar alle waarschijnlijkheid de uitkomst van een immunisatie met rsfv in muizen met SFV-specifieke immuniteit bepaalt. T cel competitie werkt als volgt: een pre-injectie met irrelevant rsfv induceert SFV-specifieke T lymfocyten die om activerende signalen van APC competeren met transgen-specifieke T lymfocyten tijdens een volgende immunisatie. Dit leidt tot de exclusie van deze laatste cellen. Echter, door tijdens de pre-injectie het relevante transgen (E7) als eiwitantigeen te mengen met het irrelevant rsfv wordt de exclusie van E7-specifieke CTL door T cel competitie tijdens de tweede immunisatie voorkomen. Verder bewijs voor de rol van T cel competitie in vector-specifieke immuniteit komt van de bevinding dat het remmende effect van vector-specifieke immuniteit minder is na een immunisatie via een andere injectie route dan de pre-injectie. Wanneer geïmmuniseerd werd via een andere route dan is de transgen-presenterende APC:SFV-specifieke T lymfocyten ratio (welke afhankelijk is van T lymfocyten frequentie en die de uitkomst van T cel competitie bepaald) gunstiger aangezien het merendeel van de SFV-specifieke T lymfocyten is gelokaliseerd op de plaats van de pre-injectie. Samenvattend, beschrijft dit hoofdstuk een mechanisme van vector-specifieke immuniteit dat op het niveau van competitie tussen de reagerende T lymfocyten interfereert met transgen-specifieke CTLinductie. Dit mechanisme, T cel competitie, is lastig te detecteren en is mogelijk daardoor over het hoofd gezien in andere studies. Echter bij een immunisatie met een vector die niet zo nadrukkelijk wordt gehinderd door andere mechanismen van vector-specifieke immuniteit (zoals rsfv) wordt T cel competitie zichtbaar. De waarneming dat, in de geteste dosering, CTL activatie niet wordt gehinderd door neutraliserende antilichamen verklaart mogelijk de potentie van rsfv in homologe prime-boost immunisatieschema s. T cel competitie speelt immers geen rol in dit type immunisatieprotocollen. 226

9 Samenvatting Heterologe prime-boost immunisatiestrategieën met virosomen en rsfv In het laatste onderzoekshoofdstuk van dit proefschrift (Hoofdstuk 8) wordt beschreven dat heterologe prime-boost immunisatieprotocollen met virosomen en rsfv geen sterkere CTL-respons induceren dan een homoloog protocol met rsfv. Een heterologe strategie met virosomen en rsfv resulteerde in substantieel hogere aantallen antigeen-specifieke CTL, maar dit correleerde niet met een sterkere cytolytische respons. Heterologe en homologe prime-boost protocollen met E7-virosomen en SFVeE6,7 induceerden CTL die in vitro vergelijkbaar reageerden op stimulatie en dezelfde cytolytische activiteit hadden. Verder werd met homologe en heterologe protocollen in vivo een vergelijkbare antitumor respons opgewekt. De experimenten in dit hoofdstuk laten ook zien dat een virosomen-prime en een rsfv-boost in een hogere CTL frequentie resulteert dan vice versa. Co-inductie van SFV-specifieke immuniteit tijdens de prime-immunisatie met virosomen door deze te mengen met irrelevant rsfv remt de inductie van grote aantallen CTL maar een klein beetje. Het idee dat een heteroloog prime-boost immunisatieprotocol de respons richt op één of meerdere immunodominant epitopen, die worden gedeeld door beide immunisaties, verklaart waarom een dergelijk protocol meer specifieke CTL induceert. Waarom een virosomen-prime gevolgd door een rsfv-boost potenter is dan een immunisatie in de omgekeerde volgorde is onduidelijk. Mogelijk richt een immunisatie met SFVeE6,7 het immuunsysteem op twee antigenen (E6 en E7), terwijl een prime-immunisatie met E7-virosomen alleen een E7-specifieke respons opwekt. Een heterologe booster kan in het laatste geval de immuunrespons verder focusseren en selectief deze respons tegen E7 opstuwen. De belangrijkste bevinding van deze studie is het ontbreken van een correlatie tussen de specifieke CTL frequentie en de cytolytische activiteit. Mogelijk komt dit door verkeerde co-stimulatie, of een suboptimale concentratie van cytokines zoals IL-10 of IL-2 tijdens de boosterimmunisatie. Dit hoofdstuk laat in ieder geval duidelijk zien dat het aantal specifieke CTL, dat wordt opgewekt door een heterologe prime-boost strategie, geen goede maat is voor de uiteindelijke effectiviteit van het immunisatieprotocol. Dat toevoeging van irrelevant rsfv aan de virosomen-prime het aantal specifieke CTL, opgewekt in een heteroloog prime-boost protocol verlaagt, betekent dat vector-specifieke immuniteit wel van invloed is op de boosterimmunisatie. De kracht van een heterologe prime-boost strategie wordt dus gedeeltelijk bepaald door het ontwijken van vector-specifieke immuniteit. Echter op het niveau van de cytotoxische activiteit van de geïnduceerde CTL en dus op het niveau van functionele CTL-inductie speelt vector-specifieke immuniteit geen rol van betekenis. 227

10 Chapter 11 Algemene discussie en een perspectief op de toekomst De experimenten beschreven in dit proefschrift laten zien dat virosomen een potent systeem zijn voor het afleveren van antigenen en het induceren van CTL-activiteit. De potentie van virosomen wordt voor een groot deel bepaald door hun fusieactiviteit. Voor het induceren van CTL-activiteit zijn fusie-inactieve virosomen (net als vele andere systemen voor de afgifte van antigenen) afhankelijk van de intrinsieke capaciteit van DC om exogene antigenen in het MHC klasse I route van antigeenpresentatie te introduceren. Dit proces van cross-presentation blijkt minder effectief te zijn dan actieve aflevering van antigenen in het cytoplasma door virosomen. Een immunisatie met fusie-inactieve virosomen resulteert namelijk in zwakkere CTL-activiteit. Deze studies laten ook zien dat zowel virosomen als rsfv goed in staat zijn een sterke CTL-respons te induceren in aanwezigheid van neutraliserende virosoom- of rsfv-specifieke antilichamen. Antilichamen tegen influenza virus kunnen weliswaar de normale route waarlangs virosomen cellen binnendringen blokkeren, tegelijkertijd maken ze het mogelijk dat via een ander opnamemechanisme CTL-activiteit wordt opgewekt. Het mechanisme waarmee rsfv een CTL-respons induceert verandert vermoedelijk niet in aanwezigheid van SFV-specifieke antilichamen. SFV kan in de geteste dosering nog steeds cellen infecteren en kennelijk genoeg transgenexpressie bewerkstelligen om de inductie van een sterke CTL-respons mogelijk te maken. De meest fascinerende observatie van het onderzoek beschreven in dit proefschrift was de identificatie van een voorheen over het hoofd gezien mechanisme van vector-specifieke immuniteit: T cel competitie. Dit mechanisme remt CTL-inductie door rsfv in muizen met pre-existerende immuniteit op het niveau van de reagerende T lymfocyten. T cel competitie speelt echter geen rol in homologe primeboost immunisatieprotocolen. Wij veronderstellen dat in die situaties waarin T cel competitie de optimale CTL-inductie wel hindert het modificeren van de beschikbaarheid en de gevoeligheid voor MHC klasse I presentatie van het beoogde antigeen en de vectorantigenen het effect van T cel competitie kan verlagen. Op deze manier worden de antigenen namelijk respectievelijk meer of minder immunodominant gemaakt. Een zelfde mechanisme dat de CTL-respons in dieren met een pre-existerende immuunrespons tegen de vector focusseert op de vectorantigenen in plaats van op het beoogde antigeen speelt waarschijnlijk ook een rol in het focusseren van het immuunsysteem in heterologe prime-boost immunisatie protocollen. In theorie zijn zulke protocollen dankzij dit focussen een manier om de CTL-inducerende capaciteit van immunisatiestrategieën met virosomen en rsfv te verbeteren. Helaas resulteert een heteroloog prime-boost protocol met virosomen en rsfv op dit moment alleen in meer specifieke CTL en niet in verbeterde antitumor-activiteit vergeleken met een homoloog protocol met rsfv. 228

11 Samenvatting Vooral de effectiviteit van virosomen en rsfv voor de inductie van HPV16-specifieke immuun responsen in een muizenmodel wordt in dit proefschrift gedemonstreerd. Gecombineerd met het feit dat baarmoederhalskanker erg geschikt zou zijn voor behandeling met immunotherapie, zijn de resultaten beschreven in dit proefschrift een goede basis voor toekomstige klinische studies naar immunisatiestrategieën met virosomen en rsfv tegen baarmoederhalskanker en voorloperstadia hiervan. Ondanks het recent op de markt verschijnen van een profylactisch vaccin tegen HPV infectie en baarmoederhalskanker, kan een therapeutisch vaccin een belangrijke toevoeging zijn bij de behandeling van baarmoederhalskanker. Concluderend kunnen we zeggen dat virosomen en in het bijzonder rsfv veelbelovende systemen zijn voor inductie van cellulaire afweerreacties tegen tumoren. Virosomen en rsfv worden niet of nauwelijks gehinderd door immuunresponzen tegen de virussen waar ze van zijn afgeleid. Mede daardoor, zijn virosomen en rsfv zeer veelbelovend als immunotherapeutische strategieën tegen baarmoederhalskanker of voorstadia van deze ziekte. 229