Bepalen van frequentie infectie met Hepatitis E virus bij normale populatie en bij populatie met gedocumenteerde afwijkende levertesten

Transcriptie

1 FACULTEIT GENEESKUNDE EN GEZONDHEIDSWETENSCHAPPEN Academiejaar Bepalen van frequentie infectie met Hepatitis E virus bij normale populatie en bij populatie met gedocumenteerde afwijkende levertesten Matthias De Boulle Promotor: Prof. Dr. Isabelle Colle Scriptie voorgedragen in de 2 de Master in het kader van de opleiding MASTER IN DE GENEESKUNDE

2

3 Inhoudsopgave ABSTRACT... 1 Doelstelling van deze Masterproef Inleiding Taxonomie en classificatie Moleculaire en genomische opbouw Epidemiologie Geografische spreiding Dierlijke en menselijke bronnen van het virus Transmissie van het virus Seroprevalentie Incidentie en prevalentie van infectie Mortaliteit Kliniek Labogegevens HEV RNA Lever enzymen en bilirubine Incubatieperiode Antilichamen Klinische aspecten Algemeen Symptomen Complicaties Chroniciteit Transplantatie HIV Hematologische maligniteiten Cirrose Diagnostische tests Behandeling Materiaal en Methoden Literatuur Bepaling seroprevalentie Studiedesign en serumstalen Detectie van anti- HEV IgG antilichamen HEV infectie bij populatie met gedocumenteerde afwijkende levertesten Studiedesign en serumstalen Detectie van anti- HEV IgG en anti- HEV IgM antilichamen Detectie van HEV RNA Risicofactoren Statistische analyse...22

4 2.5. Ethische aspecten Resultaten Literatuur Bepaling seroprevalentie Populatie Prevalentie anti- HEV IgG antilichaam positiviteit HEV infectie bij populatie met gedocumenteerde afwijkende levertesten Patiënten Prevalentie anti- HEV IgG antilichaam positiviteit Anti- HEV IgM antilichaam positiviteit en HEV RNA Cases van HEV infectie Klinische, biologische en histologische aspecten Verloop Risicofactoren Discussie Dankwoord Referenties Bijlagen... 49

5 ABSTRACT Inleiding Hepatitis E virus (HEV) infectie wordt steeds vaker herkend als een oorzaak van hepatitis in ontwikkelde landen. Er wordt verondersteld dat zoönotische transmissie via varkens naar de mens de belangrijkste transmissieroute van het HEV is in ontwikkelde landen. HEV infecties kunnen aanleiding geven tot acute en in sommige gevallen tot chronische hepatitis. Vaak verlopen HEV infecties asymptomatisch. Bij personen met onderliggend chronisch leverlijden kunnen HEV infecties echter tot een fulminant klinisch beeld leiden, geassocieerd aan een zeer hoge mortaliteit. Het is niet gekend in welke mate HEV infecties voorkomen in België. Doelstelling Het doel van de studie was om enerzijds een schatting te geven van de seroprevalentie van anti-hev IgG antilichamen in België. Anderzijds werd nagegaan in welke mate HEV infecties een rol spelen bij een populatie patiënten met gedocumenteerde afwijkende levertesten waarvoor geen oorzaak aangeduid kon worden. Materiaal en Methoden Voor het eerste deel werden op willekeurige basis serumstalen van 100 personen geselecteerd die in de periode voorafgaand aan de studie in het Universitair Ziekenhuis Gent (UZ Gent) langs waren gekomen en waarbij toen voor bepaalde redenen een veneuze bloedafname was gebeurd. Stalen van kinderen en personen waarbij de bloedafname was gebeurd in het kader van gastro-enterologische klachten werden niet geïncludeerd. Om de aanwezigheid van anti-hev IgG antilichamen te testen werd gebruik gemaakt van een zeer sensitieve indirecte ELISA (Wantai HEV IgG ELISA (Biorex Diagnostics, Antrim, Verenigd Koninkrijk)) en, in het geval van een borderline resultaat, een strip immunoassay (recomline HEV IgG/IgM test (Mikrogen, Neuried, Duitsland)). Voor het tweede deel werden patiënten geselecteerd die zich in het UZ Gent op de dienst Gastro-enterologie presenteerden met aandoeningen van de lever (gestoorde levertesten), die niet verklaard konden worden door de gekende oorzaken waarvoor routinematig getest wordt. Van 39 patiënten waren de resultaten volledig beschikbaar voor analyse. Anti-HEV IgG/IgM antilichaam status en de aanwezigheid van HEV RNA werden onderzocht. Anti-HEV IgG antilichamen werden opgespoord via de Wantai HEV IgG ELISA (Biorex Diagnostics, Antrim, Verenigd Koninkrijk), Anti-HEV IgM antilichamen via de Wantai HEV IgM ELISA (Biorex Diagnostics, Antrim, Verenigd Koninkrijk). HEV RNA werd opgespoord via real-time PCR (RT-qPCR). Voor detectie van de virale genomen werd gebruik gemaakt van TaqMan probes. Er werd ook steeds een inhibitiecontrole uitgevoerd. 1

6 Resultaten In de willekeurige populatie werd een anti-hev IgG seroprevalentie van 14% gevonden. Anti-HEV IgG seropositiviteit was significant hoger in de groep >50 jaar in vergelijking met de groep 50 jaar. In de populatie patiënten met gedocumenteerde afwijkende levertesten waarvoor geen oorzaak aangeduid kon worden, werd bij 2 patiënten (5.1%) een HEV infectie vastgesteld. Deze twee patiënten waren opgenomen in de studie wegens onverklaarde acute hepatitis of matig gestoorde levertesten, waarvan men vermoedde dat het om toxische hepatitis (veroorzaakt door geneesmiddelen, drugs, andere chemische producten) ging. Beide patiënten waren mannen van middelbare leeftijd (63 en 55 jaar oud). Geen van hen had gereisd in de periode vòòr de infectie. Hieruit werd afgeleid dat het om autochtone gevallen van HEV infectie ging. Beide patiënten aten soms orgaanvlees en frequent varkensvlees dat mogelijks rauw of onvoldoende verhit was. Één patiënt at af en toe hertenvlees dat mogelijks onvoldoende verhit was. Beide patiënten vertoonden een volledig klinisch en biochemisch herstel. Discussie De geobserveerde anti-hev IgG seroprevalentie toont aan dat contact met het HEV niet zelden voorkomt in België. Bij vergelijking met data uit andere landen moet rekening worden gehouden met de wisselende graad van sensitiviteit van de verschillende anti-hev IgG assays. De gevallen van autochtone HEV infectie tonen aan dat men bij een onverklaarde hepatitis of wanneer men een toxische hepatitis vermoedt, maar dit niet met zekerheid kan stellen, altijd de mogelijkheid van een HEV infectie moet overwegen. 2

7 Doelstelling van deze Masterproef Een eerste doelstelling is om op basis van de bestaande literatuur een up-to-date overzicht te geven van wat er tot nu toe bekend is over het onderwerp Hepatitis E virus. Ook wordt getracht die gegevens weer te geven die relevant zijn voor de verdere doelstellingen van dit onderzoek. Een tweede doelstelling is om na te gaan wat de seroprevalentie is van antilichamen tegen het Hepatitis E virus binnen een normale populatie. In de buurlanden van België zijn reeds meerdere soortgelijke studies uitgevoerd. Voor België zelf zijn er tot nu toe echter geen dergelijke gegevens beschikbaar. Een dergelijk onderzoek werd nog niet uitgevoerd in België. Een derde doelstelling is om na te gaan in welke mate Hepatitis E virus infecties een rol spelen bij een populatie patiënten met gedocumenteerde afwijkende levertesten waarvoor geen oorzaak aangeduid kan worden. Verdere beschrijving van de onderzochte patiëntengroepen is te vinden onder het hoofdstuk Materiaal en Methoden. Ook zal verder onderzocht worden of bij patiënten die positief testen eventuele risicofactoren of mogelijks de transmissieroute achterhaald kan worden. 1. Inleiding 1.1. Taxonomie en classificatie Het Hepatitis E virus (HEV) is het enige lid van de genus Hepevirus van de familie Hepeviridae. Het genoom bestaat uit enkelstrengig (ss), lineair, positive sense RNA. Het heeft een totale grootte van 7,2 kilobaseparen. (1) Het viruspartikel (virion) zelf is tussen de 27 en 34 nanometer in diameter. Dit is dus een eerder klein virus. Qua grootte in diameter is dit vergelijkbaar met het Hepatitis A virus (HAV), waarvan de diameter 27 nanometer bedraagt. (2) Het virion is icosahedraal en opgebouwd uit één enkel capside proteïne. (3) Het is een naakt virus, het beschikt niet over een envelop. (1) 1.2. Moleculaire en genomische opbouw Zoals reeds vermeld is het genoom opgebouwd uit ss, (+)-sense RNA. Het bevat een kort 5 end untranslated region (UTR), 3 open reading frames (ORFs: ORF1, ORF2, ORF3) en een kort 3 end untranslated region dat eindigt op een poly(a)sequentie [Figuur 1]. (4) Een untranslated region (UTR) is een niet-coderend deel van het genoom. Een open reading frame (ORF) is deel van het genoom dat de mogelijkheid heeft te coderen voor een polypeptide of proteïne, maar dat niet noodzakelijk doet. 3

8 Het 5 end van het virale genoom bevat een cap structuur dat een rol speelt bij de initiatie van virus replicatie. (5) Het open reading frame 1 (ORF1) ligt bij het 5 end van het genoom. Het codeert voor niet-structurele proteïnes die een rol spelen in de virale replicatie, zoals: methyltransferasen, papain-like cysteine proteasen, RNA helicase, RNA-afhankelijk RNA polymerase. (6) ORF1 bevat ook een proline-rijke hypervariabele regio (HVR). Het biologisch belang van deze hypervariabele regio is nog niet gekend. Het blijkt niet absoluut noodzakelijk voor een succesvolle virusreplicatie. (7) Het open reading frame 2 (ORF2) ligt het dichtst bij het 3 end van het genoom. Het codeert voor het virale capside proteïne. Het open reading frame 3 (ORF3) codeert voor een klein cytoskelet-geassocieerd fosfoproteïne. Dit eiwit is mede verantwoordelijk voor de migratie van het virus uit de geïnfecteerde cellen naar de extracellulaire ruimte. Het is aanwezig op het oppervlak van vrijgekomen HEV partikels. ORF 2 en ORF 3 overlappen, maar geen van beide overlapt met ORF 1. (6) Figuur 1. (3) Genomische organisatie van het Hepatitis E virus. De verschillende open reading frames zijn te zien, hun grootte in kilobaseparen, hun eventuele overlapping met andere open reading frames en de proteïnen waarvoor ze coderen. M =methyltransferase, Y = Y domein, P = papain-like protease, V = proline rijke regio, X = X domein, H = RNA helicase, R = RNA polymerase. Op basis van de verschillen in nucleïnezuursequenties werden de verschillende HEV-genomen opgedeeld in 4 majeure genotypes, waarvan sommige nog eens verder in subgenotypes werden opgedeeld. Er bestaat ook een avian HEV, zijnde de vogelvariant van het Hepatitis E virus. Deze vorm van HEV verschilt op genetisch vlak van de zoogdiervariant en zal daarom in de toekomst waarschijnlijk als een apart genus worden geclassificeerd binnen de familie Hepeviridae. De basisstructuur (de functionele domeinen van het genoom) is echter vrij gelijkaardig aan die van de zoogdiervariant. Voor de geneeskunde is tot nu toe enkel de zoogdiervariant belangrijk gebleken. (6) 4

9 De verschillende genotypes zijn: (3) Genotype 1 o Nog geen nader bepaalde subgenotypes Genotype 2 o Opgedeeld in minstens 2 subgenotypes: Afrikaans subgenotype Mexicaans subgenotype Genotype 3 o Opgedeeld in 10 subgenotypes: 3a 3j Genotype 4 o Opgedeeld in 7 subgenotypes: 4a 4g Zowel de intergenotypische (tussen de genotypes) als de intragenotypische (tussen de subgenotypes) variabiliteit van de nucleïnezuursequenties van de in 2007 gekende en gedocumenteerde HEV genomen is opmerkelijk hoog. Ondanks deze hoge variabiliteit op vlak van nucleïnezuursequentie is de variabiliteit van de afgeleide aminozuursequenties eerder gering. Dit geldt zowel op intra- als intergenotypische vlak. Bij het vergelijken van de afgeleide aminozuursequenties van de delen die coderen voor het viraal capside proteïne merkte men dat er slechts % verschil was tussen de verschillende genotypes. Deze hoge graad van conservatie binnen de aminozuursequentie uit zich in een kleine antigenische variabiliteit. Op antigenisch vlak verschillen de virions behorend tot de verschillende genotypes onderling dus niet zo sterk. Dit heeft als gevolg dat ondanks de uitgebreide genotypische verscheidenheid er maar één enkel serotype is. (3, 8) De term serotype verwijst naar een groep van verwante micro-organismen gekenmerkt door de aanwezigheid van specifieke antigenen op de celmembraan. 5

10 1.3. Epidemiologie Geografische spreiding (3, 9) Elk van de vier genotypes heeft een vrij afgelijnd geografisch distributiegebied [Tabel 1]. Genotype 1 Azië Bangladesh, Cambodja, China, Indië, Kirgizië, Myanmar, Nepal, Pakistan, Oezbekistan, Vietnam Afrika Algerije, Centraal Afrikaanse Republiek, Tsjaad, Djibouti, Egypte, Marokko, Namibië, Zuid-Afrika, Soedan, Tunesië Genotype 2 Afrika Centraal Afrikaanse Republiek, Tsjaad, Congo, Egypte, Namibië, Nigeria Amerika Mexico Genotype 3 Azië Cambodja, Japan, Korea, Kirgizië, Taiwan, Thailand Amerika Argentinië, Canada, Mexico, Verenigde Staten Europa Oostenrijk, Frankrijk, Duitsland, Griekenland, Hongarije, Italië, Nederland, Rusland, Spanje, Verenigd Koninkrijk, België Oceanië Australië, Nieuw Zeeland Tabel 1. Overzicht van de continenten en landen waar humaan HEV teruggevonden is, ingedeeld per genotype. Genotype 4 Azië China, Indië, Indonesië, Japan, Taiwan, Vietnam 6

11 HEV infectie is endemisch in regio s met slechte sanitaire voorzieningen en slechte hygiënische omstandigheden, waaronder grote delen van Azië en Afrika (vooral centrale en noordelijke delen) en Mexico. (8) In deze gebieden zijn de genotypes 1 en 2 de dominante genotypes. In 38 landen waar HEV-isolaten uit geïnfecteerde patiënten werden geanalyseerd, werd vastgesteld dat één enkel genotype voorkwam in 29 van de 38 landen. (3) In Europa speelt genotype 3 de belangrijkste rol. In de buurlanden van België behoort het merendeel van de virussen geïsoleerd uit geïnfecteerde patiënten tot genotype 3. (3) Sporadisch worden hier virussen behorend tot genotype 1 of 2 teruggevonden. Deze zijn echter meest waarschijnlijk afkomstig van infecties opgelopen in het buitenland, in regio s waar genotype 1 of 2 dominant is. Er zijn recent echter twee rapporten gepubliceerd van autochtone infecties in Europa veroorzaakt door genotype 4 varianten van het HEV. (10, 11) In welke mate het genotype 4 verspreid is in Europa, moet nog bepaald worden. Er zijn tot op heden weinig gegevens beschikbaar wat betreft de verschillende genotypes van HEV bij de mens in België. Er werd recent één geval van chronische HEV infectie beschreven in België. De infectie was veroorzaakt door een genotype 3 HEV. (12) Dierlijke en menselijke bronnen van het virus Tot op heden werd nog nooit een HEV behorend tot het genotype 1 of 2 geïsoleerd bij dieren. (8) Ook werd aangetoond dat deze virussen niet in staat zijn dieren te infecteren. (13) Er kan dus gesteld worden dat genotype 1 en 2 enkel voorkomen bij de mens en geen andere dierlijke gastheren hebben. Hepatitis E virussen behorend tot het genotype 3 of 4 werden gevonden bij zowel mens als dier. Interspecies-infectie door deze virussen werd reeds aangetoond. Zo kunnen genotype 3 en 4 varianten van de porciene vorm van het virus zowel resusapen als chimpanzees infecteren. (14, 15) Omgekeerd kunnen genotype 3 en 4 varianten van de humane vorm varkens infecteren. (16-18) Het meest gekende en bestudeerde dierlijke reservoir is het varken. Verspreid over de hele wereld werden porciene Hepatitis E virussen uit varkens geïsoleerd, allen behorend tot genotype 3 of 4. (19) Er werd ook gezien dat de prevalentie van HEV infecties in verschillende varkenspopulaties in verscheidene landen hoog tot zeer hoog was. (20-22) Deze virussen waren genetisch zeer sterk gerelateerd of in sommige gevallen zelfs identiek aan de Hepatitis E virussen die men vond bij mensen afkomstig uit dezelfde regio als de geïnfecteerde varkens. (23-27) In een Belgisch-Nederlandse studie heeft men de faeces onderzocht van 115 varkens uit 23 verschillende Belgische varkensboerderijen. 7% van de varkens werd als HEV positief beschouwd. Wat opviel was dat virussen van zowel genotype 3 als van genotype 4 werden teruggevonden. (18) 7

12 Andere gedocumenteerde bronnen van de genotype 3 of 4 virusvarianten zijn het everzwijn, het hert (sikahert, edelhert, Europese ree), de mangoest, het konijn en weekdieren. (28-33) Het spectrum van potentiële dragers van het virus wordt steeds uitgebreider naarmate onderzoek hiernaar vordert. Zo zijn ook anti-hev antilichamen gevonden bij knaagdieren, (34-39) Transmissie van het virus katten, honden, schapen, verschillende types Verscheidene routes van transmissie zijn gedocumenteerd. De belangrijkste zijn: Faeco-orale overdracht van mens op mens door contaminatie van het drinkwater. Ingestie van besmet vlees. Parenteraal via transfusie van geïnfecteerd bloed of bloedafgeleide producten. Faeco-orale overdracht is de meest voorkomende vorm van overdracht in de regio s waar de ziekte endemisch is (cfr. supra). Epidemieën geassocieerd aan HEV komen vaak voor in deze gebieden, meestal met interval van enkele jaren. (40-42) Meestal komen deze voor na een periode van hevige regenval of overstromingen. Hierdoor ontstaan immers condities waarbij menselijke faeces gemakkelijker gemengd raken met het drinkwater. (40) Op deze manier wordt faeco-orale overdracht gefaciliteerd en kunnen meerdere honderden tot duizenden personen getroffen worden in het verloop van de epidemie. (40-42) Een tweede belangrijke manier van overdracht is via de ingestie van besmet vlees. Bij verschillende groepen patiënten met bewezen HEV infectie in Japan werd aangetoond dat het virus aanwezig in faeces- en serumstalen van de patiënten identiek hetzelfde was als het virus dat werd teruggevonden in vlees dat door de patiënten geconsumeerd werd voorafgaand aan de infectie. Het vlees was afkomstig van everzwijn of hert en werd rauw of onvoldoende verhit geconsumeerd. (43-45) In Frankrijk werd bij twee HEV geïnfecteerde patiënten identiek hetzelfde virus teruggevonden als in varkenslevers die voor consumptie verkocht werden. (27) Verder werd in verscheidene landen waaronder Japan, de Verenigde Staten, Nederland en Frankrijk aangetoond dat bepaalde commercieel verkrijgbare (27, 46- varkenslevers besmet waren met HEV dat bovendien zijn volledige infectieuze capaciteit behield. 48) Een case-control studie uitgevoerd in Duitsland toonde aan dat ook de consumptie van te weinig verhit of rauw orgaanvlees (lever, nier en/of ingewanden) een mogelijke transmissieroute vormt. Consumptie van te weinig verhit of rauw orgaanvlees en everzwijnvlees kwam significant vaker voor bij mensen met HEV infectie dan bij de controlegroep in deze studie (P<0.05 in beide gevallen). (11) Er wordt aangenomen dat ingestie van besmet vlees één van de belangrijkste transmissieroutes is voor (11, 27, 43-45) HEV infectie in regio s waar de ziekte niet endemisch is, waaronder ook West-Europa. 8

13 Een derde gekende manier van transmissie is parenteraal, via transfusie van met Hepatitis E virus besmet bloed of bloedafgeleide producten (plasma). Meerdere gevallen van posttransfusie Hepatitis E virus infectie zijn beschreven, zowel in endemische als niet endemische regio s. (49-53) In de meeste gevallen ging het om case reports. Er wordt aangenomen dat parenterale transmissie geen veelvoorkomende manier van transmissie vormt, maar dat het in individuele gevallen zeker niet uitgesloten mag worden. (11) In de literatuur vindt men argumenten voor nog andere transmissieroutes. Voor sommige bestaat er zeer overtuigende evidentie, voor andere is de argumentatie veel minder aannemelijk. Zo werd aangetoond dat HEV voorkwam in lagunes met varkensdrijfmest (54-56), stedelijke rioleringsnetwerken (57-59) en in het effluent van varkensslachthuizen (57), soms in hoge concentraties. Al deze resultaten zijn gebaseerd op onderzoek verricht op stalen afkomstig uit geïndustrialiseerde landen. In de reeds aangehaalde Belgisch-Nederlandse studie vond men dat er van de 23 onderzochte Belgische varkensboerderijen vijf (21.7%) HEV positief waren. (18) HEV geïsoleerd uit rioolwater en varkensmest heeft de capaciteit om resusapen te infecteren. (56, 59) Op deze manier zou HEV ook de mens kunnen bereiken en aan de oorzaak van infecties kunnen liggen. Mogelijke manieren waarop deze verspreiding zou kunnen gebeuren: via gebruik van besmet water als drinkwater, irrigatie van gewassen met besmette mest, recreationele blootstelling aan besmet water via meren, riviertjes, Er werd nog niet aangetoond in welke mate deze manieren van transmissie van het virus relevant zijn voor infectie bij de mens. Ook beroepsgebonden of recreationele blootstelling aan varkens of andere dierlijke reservoirs wordt beschouwd als een risicofactor voor het oplopen van infectie met HEV. (60-63) In verschillende studies werd gezien dat de anti-hev IgG seroprevalentie hoger lag bij veeartsen en personen werkzaam in de varkensindustrie dan bij referentiepopulaties met gelijkaardige demografische karakteristieken. Zo toonde een in Nederland uitgevoerde studie een significant verschil aan in anti-hev IgG antilichaam positiviteit tussen veeartsen die werkten met varkens enerzijds en een referentiepopulatie anderzijds (11% versus 2% positiviteit, P<0.05). (63) Een studie uit Duitsland toonde een verschil in anti-hev IgG antilichaam positiviteit tussen personen met beroepsmatige blootstelling aan varkens (slachthuiswerkers, vleesinspecteurs, varkensboeren en veeartsen die werkten met varkens) en een referentiepopulatie als controlegroep (28,3% versus 15,5%, P=0.023). (64) Een Franse studie toonde dat jagers ook een hogere anti-hev IgG antilichaam seroprevalentie vertoonden dan de niet-jagers uit dezelfde regio (31% van de jagers was positief versus 15.9% van de niet-jagers, P=0.038). (65) Jagers lopen immers meer risico op contact met het vlees en bloed van besmette everzwijnen en/of herten, en hebben ook meer kans op consumptie ervan. Op basis van dit soort studies werd geconcludeerd dat beroepsgebonden of recreationele blootstelling aan varkens of andere dierlijke reservoirs een 9

14 risicofactor is voor het oplopen van infectie. Sluitend bewijs van deze manier van transmissie is echter niet beschikbaar, met uitzondering van enkele case-reports. (66) Toch wordt dit ook als een mogelijks belangrijke manier van transmissie beschouwd. Nog een andere manier van transmissie is het eten van besmette schaaldieren. In Japan heeft men de aanwezigheid van het virus kunnen aantonen in een lokale soort van schaaldieren, verzameld uit een rivier. (31) Er zijn ook gevallen van HEV infectie bij de mens bekend waar het eten van rauwe schaaldieren als oorzaak werd aangeduid. (67) De bron van het virus in de schaaldieren is niet gekend. Op basis van wat in het verleden reeds aangetoond werd op vlak van besmetting van schaaldieren met HAV (68), vermoedt men dat schaaldieren op een soortgelijke manier met HEV besmet kunnen worden. Bepaalde schaaldieren (zoals bijvoorbeeld de mossel) voeden zich door het water in hun omgeving op te zuigen en de voedzame stoffen eruit te filteren. Als het water virussen bevat die zich via water kunnen verspreiden, zoals onder meer het HEV, dan kan het schaaldier op deze manier besmet raken. Belangrijk is dat in veel sporadische gevallen van HEV infectie, zowel in endemische als niet endemische regio s, de transmissieroute niet gekend is Seroprevalentie De prevalentie van anti-hev specifieke antilichamen varieert sterk. Tussen endemische en niet endemische regio s, maar ook tussen landen onderling waar de ziekte niet endemisch is, worden grote verschillen in anti-hev antilichaam seroprevalentie waargenomen. In endemische regio s zijn er prevalenties waargenomen gaande van 15% tot 60% en soms tot 70% in bepaalde gebieden. (69-72) In een studie uitgevoerd in Vietnam vond men anti-hev IgG antilichamen bij 42% van de bestudeerde populatie. (71) In Nepal toonden men anti-hev IgG antilichaam positiviteit aan bij 16% tot 31% bij verschillende populaties. (70) In bepaalde rurale gebieden in Egypte vond men tot 67.7% anti-hev IgG seropositiviteit. (72) In regio s waar de ziekte niet endemisch is, bestaat er een grote variatie in de waargenomen anti-hev antilichaam seroprevalentie. In West-Europese landen merkt men zowel tussen de landen onderling als tussen verschillende metingen binnen eenzelfde land belangrijke verschillen op. In een studie uitgevoerd in Zuid-West Frankrijk werd een seroprevalentie van 16.6% gevonden (65), terwijl een studie uitgevoerd op een populatie afkomstig uit meer noordelijk gelegen gebieden in Frankrijk een seroprevalentie van 3.2% (73) aantoonde. Beide bestudeerde populaties vertoonden gelijkaardige demografische kenmerken. In Zuid-West Engeland vond men dat 16% van een populatie van bloeddonoren anti-hev IgG antilichamen vertoonden. (74) Andere studies uit het Verenigd Koninkrijk toonden seroprevalenties aan van 5.3% (75) en 3.5% (76). In Nederland vond men seroprevalenties 10

15 gaande van 2% (63) tot 6% (77) ; in Spanje 2.8% (78) tot 7.3% (79). In Duitsland toonde een studie een anti- HEV IgG seropositiviteit van 15.5% aan. (64) Twee zeer uitgebreide epidemiologische studies, uitgevoerd in de Verenigde Staten (80) en Japan (81), toonden de demografische kenmerken van anti-hev antilichaam positiviteit aan. Deze kenmerken zijn van toepassing op populaties uit niet endemische regio s. Het aandeel van anti-hev IgG seropositieve personen in een populatie stijgt met de leeftijd, zowel bij mannen als bij vrouwen. Het aandeel van kinderen dat IgG seropositief is, is dus vrij klein. In elke leeftijdscategorie ziet men een hoger percentage IgG seropositieve mannen dan vrouwen Incidentie en prevalentie van infectie Net zoals bij de anti-hev antilichaam seroprevalentie moet er bij de incidentie en prevalentie van infectie en klinische ziekte een onderscheid gemaakt worden tussen endemische en niet endemische regio s. In de endemische regio s komt acute hepatitis E geassocieerd met infectie in twee verschillende situaties voor. Een eerste situatie is die van de hepatitis E epidemieën. Er bestaan verschillende rapporten van epidemieën van hepatitis E in onder meer Indië (41, 82, 83), Zuid-Oost Azië met landen als Vietnam (84) en Indonesië (85) ; China (86) ; Afrika met landen als Somalië (87), Botswana (88), Namibië (89) en Algerije (90) en ten slotte Mexico (91). Het aantal getroffen personen tijdens deze epidemieën varieerde van 1% tot 15% van de blootgestelde populatie. (8) Tijdens epidemieën wordt het grootste deel van de gevallen van hepatitis E gezien bij adolescenten en jonge volwassenen (40, 42, 92), met leeftijd van 15 tot 35 jaar oud. In deze situatie bedraagt de man-vrouwverhouding meer dan één. Een tweede situatie in endemische regio s is die van de sporadische gevallen van acute hepatitis E. Men heeft vastgesteld dat infectie met het HEV de belangrijkste oorzaak is van acute hepatitis bij volwassenen in verschillende landen in Centraal en Zuidoost Azië en de tweede belangrijkste oorzaak, na infectie met Hepatitis B virus (HBV), in verschillende landen in het Midden-Oosten en Noord- Afrika. (93-98) Sporadische gevallen worden dus veel frequenter gezien in endemische regio s dan in niet endemische regio s. De demografische aspecten van de sporadische gevallen komen bijna volledig overeen met die van de gevallen gezien in het kader van epidemieën. Ook hier ligt de piekleeftijd bij adolescenten en jonge volwassenen en worden meer mannen dan vrouwen getroffen. Omtrent incidentie en prevalentie in niet endemische regio s zijn weinig exacte gegevens bekend. Er bestaat vaak een opmerkelijk verschil tussen het aantal klinische gevallen dat men observeert en de anti-hev IgG seroprevalentie in dezelfde regio s. In een recent uitgevoerde studie in de Verenigde Staten met een aanzienlijke onderzoekspopulatie (n=18695) werd een incidentie van ongeveer 7 per 1000 persoonsjaren teruggevonden. Dit wil zeggen dat per jaar ongeveer 7 personen uit een groep van 11

16 1000 personen vatbaar voor infectie van een status van seronegativiteit (géén anti-hev IgG antilichamen) naar seropositiviteit converteren (anti-hev IgG antilichamen ontwikkelen). Of dit ook gepaard ging met het ontwikkelen van symptomen, werd niet vermeld. (99) De autochtone gevallen van klinisch acute hepatitis E geassocieerd met infectie (veroorzaakt door genotypes 3 of 4) worden vooral gezien bij patiënten van het mannelijk geslacht en van middelbare tot oudere leeftijd. (58, 74, ) Met middelbare leeftijd wordt een leeftijd tussen 40 en 60 jaar bedoeld. Met oudere leeftijd wordt een leeftijd van ouder dan 60 jaar bedoeld Mortaliteit In endemische regio s worden mortaliteitscijfers gerapporteerd van 0.5% tot 4%. Deze cijfers zijn echter gebaseerd op studies met patiënten die tijdens HEV epidemieën gehospitaliseerd dienden te worden. In deze studies werd geen rekening gehouden met personen die een minder ernstig klinisch beeld (cfr. infra) ontwikkelden en niet werden gehospitaliseerd tijdens de epidemieën. Men vermoedt daarom dat deze cijfers een overschatting van de mortaliteit weergeven. (8, 107, 108) Bij het uitvoeren van meer grootschalige onderzoeken in endemische regio s vond men mortaliteitscijfers van 0.07% tot (41, 109) 0.6%. In niet endemische regio s ligt het mortaliteitscijfer hoger. Hier worden cijfers gerapporteerd van 8% (74, 110, 111) tot 11%. Het is niet goed gekend waarom het mortaliteitscijfer hoger ligt dan in de endemische regio s. De ziekte komt hier vooral voor bij mannen van middelbare tot oudere leeftijd (cfr. supra), die ook frequent vooraf bestaande comorbiditeit vertonen. (112) (8, 113) gekende factoren, dragen deze ongetwijfeld bij tot het hoger mortaliteitscijfer. Naast andere nog niet Een belangrijk punt is de mortaliteit van HEV infecties bij zwangere vrouwen. In endemische regio s stelde men vast dat zwangere vrouwen die tijdens epidemieën met HEV geïnfecteerd raakten frequent een ernstig klinisch beeld ontwikkelden. De zwangere vrouwen liepen veel meer kans om na infectie fulminant leverfalen (cfr. infra) te ontwikkelen in vergelijking met mannen of niet zwangere vrouwen uit hetzelfde gebied. (114) Studies over andere epidemieën toonden gelijkaardige resultaten. (41, 115) Deze hogere kans op het ontwikkelen van fulminant leverfalen brengt met zich mee dat er bij HEV (108, 116) geïnfecteerde zwangere vrouwen een mortaliteitscijfer bestaat van ongeveer 20%. Waarom zwangere vrouwen zo vatbaar zijn voor het ontwikkelen van een ernstig klinisch beeld en zo een hoge mortaliteit vertonen na HEV infectie, is niet gekend. In niet endemische regio s zijn er zeer weinig gevallen bekend van HEV infecties tijdens de zwangerschap. (117, 118) Er zijn in deze regio s nog geen gevallen van fulminant leverfalen na HEV infectie bij zwangere patiënten gedocumenteerd. 12

17 Een ander belangrijk punt is de mortaliteit van HEV infecties bij patiënten met onderliggend chronisch leverlijden. Men heeft vastgesteld dat, zowel in endemische als niet endemische regio s, een acute HEV infectie bij patiënten met vooraf bestaand chronisch leverlijden een mortaliteit van ongeveer 70% met zich mee kan brengen. ( ) 1.4. Kliniek Labogegevens [Figuur 2] HEV RNA HEV RNA wordt detecteerbaar in het bloed, faeces en/of gal vanaf 6 à 40 dagen na blootstelling aan het virus (2), meestal enkele dagen vòòr de stijging van transaminasen en het verschijnen van anti-hev antilichamen in het bloed. (123, 124) Het blijft detecteerbaar in het serum tot 7 à 40 dagen na de het verschijnen van klinische symptomen, met een gemiddelde van 21 dagen. (123) Uitscheiding van het virus via de stoelgang kan echter nog 2 weken doorgaan na de klaring van het virus uit het bloed. (125, 126) Leverenzymen en bilirubine De concentratie van leverenzymen in het serum verhoogt en bereikt een piek na ongeveer 6 weken na infectie. Men ziet vooral een stijging van de transaminasen. De waarden normaliseren gemiddeld terug rond de tiende week na infectie. (127) Het spectrum van de transaminasewaarden kan op verschillende tijdstippen zeer breed zijn; de concentraties kunnen ook tussen patiënten onderling sterk verschillen. (74, 111) Ook voor bilirubine geldt dat de concentraties tussen patiënten onderling sterk kunnen verschillen. Qua stijging en piek volgt de bilirubineconcentratie ongeveer hetzelfde patroon in de tijd als die van (74, 111, 125) de transaminasen Incubatieperiode De periode tussen infectie door contact met het viraal agens en het eerst optreden van symptomen of tekens van de ziekte wordt de incubatieperiode genoemd. De duur tussen infectie met het HEV en het optreden van bilirubinestijging met of zonder icterus en/of transaminasestijging bedraagt tussen de 2 à (112, 113, 127) 9 weken Antilichamen De antilichaam respons op een HEV infectie volgt een vrij klassiek verloop. (128, 129) Eerst treedt er een specifieke anti-hev IgM respons op. Deze specifieke IgM antilichamen worden meestal detecteerbaar op hetzelfde moment als het verschijnen van symptomen of wanneer er leverfunctiestoornissen 13

18 optreden. (127) De concentratie van specifieke IgM antilichamen piekt kort na het verschijnen ervan. (123) De duur van anti-hev IgM positiviteit varieert van patiënt tot patiënt, maar sterk positieve waarden (123, 128, 129) worden zelden nog na 3 maand gezien. Kort na het verschijnen van de anti-hev IgM antilichamen volgt de specifieke IgG respons. Hoe lang de anti-hev IgG antilichamen blijven circuleren, is niet goed gekend. Er zijn verschillende rapporten van patiëntengroepen waarbij men 8 (124), 12 (130) of 14 (131) jaar na infectie nog anti-hev IgG antilichamen kon detecteren. Het is niet gekend wat de ondergrens is van concentratie waarboven een patiënt beschermd is tegen herinfectie. Men kan dus niet met zekerheid zeggen of deze patiënten na 8, 12 of 14 jaar nog over protectieve hoeveelheden antilichamen beschikken. De mogelijkheid van herinfectie met HEV kan dus niet uitgesloten worden. (131) Figuur 2. (127) Schematische voorstelling van het verloop van een acute HEV infectie. Naarmate onderzoek naar het HEV verder zal evolueren, kan het zijn dat dergelijke schema s aangepast zullen moeten worden. Op basis van wat tot nu toe gekend is over het verloop van acute HEV infecties, is dit echter een representatieve voorstelling. 14

19 Klinische aspecten Algemeen De klinische aspecten van HEV infecties kunnen zeer uiteenlopend zijn. De infectie kan volledig asymptomatisch verlopen, een ziektebeeld geven van milde tot ernstige hepatitis of aan de oorzaak liggen van acuut leverfalen. (58, 74, 101, 103, 105, 106, 112, 132) Men heeft gezien dat HEV infecties in het (107, 127) merendeel van de gevallen asymptomatisch verlopen. In deze gevallen wordt de diagnose meestal gesteld in het kader van de toevallige vondst van een transaminasestijging. (74) Meestal verloopt de ziekte zelf als een zelflimiterende acute hepatitis gepaard gaande met icterus. (11, 102, 112) Dit geldt zowel voor de endemische regio s als de niet endemische regio s Symptomen In een studie uitgevoerd in Zuidwest Engeland werden 40 patiënten met een autochtone hepatitis E onderzocht. (74) Uit deze groep van 40 patiënten hadden er 30 (75%) icterus als initieel teken van de ziekte. 10 patiënten waren niet icterisch en bleven vrij van icterus gedurende het hele verloop van de ziekte. Symptomen als donkere urine en gedepigmenteerde faeces werden ook onder de noemer icterus geplaatst. Andere symptomen waren minder specifiek. Deze waren, in dalende volgorde van frequentie; anorexie (n=15), malaise/lethargie (n=15), abdominale pijn (n=14), nausea (n=13), koorts (n=8), braken (n=7), myalgie (n=5), pruritus (n=4), gewichtsdaling (n=3), hoofdpijn (n=3), rugpijn (n=2), artralgie (n=2), huiduitslag (n=1), paresthesieën (n=1). Twee van de 40 patiënten waren asymptomatisch. Bij hen werd de diagnose gesteld na de toevallige vondst van een transaminasestijging tijdens een routine onderzoek of screening. Andere studies uitgevoerd in Zuidwest Frankrijk (133), Duitsland (11) en Nederland (112), bevestigen eerdere observaties dat icterus het meest voorkomende symptoom is. Icterus werd gerapporteerd bij 67.7 tot 78.9% in de verschillende patiëntengroepen. Naast icterus kwamen minder specifieke klachten als asthenie, koorts, artralgie, myalgie en abdominale pijn ook frequent voor. Minder frequent, maar toch voorkomend, waren klachten van hoofdpijn, nausea en braken, gewichtsdaling, anorexie en huideruptie onder de vorm van purpura. (107) Complicaties Zoals reeds beschreven, verloopt de ziekte zelf meestal als een acute zelflimiterende hepatitis. In sommige gevallen kunnen er echter complicaties optreden. In de reeds aangehaalde studie uit Zuidwest Engeland wordt vermeld dat 34 van de 40 patiënten een volledig klinisch en biochemisch herstel vertoonden binnen de vier a zes weken. Zes patiënten (15%) ontwikkelden echter belangrijke 15

20 complicaties: drie hepatische en drie niet hepatische complicaties. Na het uitvoeren van leverbiopsieën bleken drie van de zes patiënten levercirrose te hebben. Twee van deze patiënten met onderliggend cirrotisch leverlijden ontwikkelden subacuut leverfalen en overleden hier ook aan. De andere patiënt met onderliggend cirrotisch leverlijden ontwikkelde een transiënte encephalopathie. (74) In een Franse studie werden 7 gevallen beschreven van patiënten die na een lokaal opgelopen infectie met HEV fulminant leverfalen ontwikkelden, gedefinieerd als leverfalen met encephalopathie en een protrombine kleiner dan of gelijk aan 50%. Zes van deze patiënten vertoonden onderliggend chronisch leverlijden van verschillende oorsprong. Vijf van de zeven patiënten decompenseerden verder en overleden. (119) Een HEV infectie kan zich dus ook manifesteren onder de vorm van een ernstige tot fulminante hepatitis met leverfalen. Voornamelijk patiënten met onderliggend chronisch leverlijden hebben bij (74, 119, 121, een acute HEV infectie een groter risico op het ontwikkelen van een ernstiger klinisch beeld. 122) Chroniciteit Er werd vroeger aangenomen dat een infectie met het HEV hoogstens aanleiding kon geven tot een acute zelflimiterende hepatitis. Zeer recente studies geven echter aan dat een HEV infectie in bepaalde patiëntenpopulaties tot een chronische infectie kan evolueren. (134) In alle tot nu toe gedocumenteerde gevallen van chronische infectie werd het HEV genotype 3 als verantwoordelijk infectieus agens aangetoond. (107) Transplantatie In Frankrijk werden, uit een grote groep van orgaantransplantatiepatiënten, 14 patiënten gediagnosticeerd met een HEV infectie. Bij zes van de 14 patiënten werd het virus na een korte periode spontaan geëlimineerd. Bij acht van de 14 patiënten (57%) werd het virus niet geëlimineerd. Hier evolueerde de acute infectie tot een chronische infectie met ook een chronische hepatitis tot gevolg. De chronische hepatitis werd vastgesteld op basis van persistent verhoogde leverenzymen en detecteerbaar HEV RNA in het serum en/of de stoelgang tot minstens zes maanden na de diagnose van de acute infectie. De diagnose van chronische virale hepatitis werd ook bevestigd door middel van herhaaldelijk uitgevoerde leverbiopsieën, waarop duidelijk inflammatie en fibrose gezien werd. (135) Er zijn nog verschillende andere gevallen beschreven waar een HEV infectie aanleiding gaf tot een chronische hepatitis bij transplantatiepatiënten. ( ) Soms werd bij deze patiënten tot 60% evolutie tot chroniciteit gezien. (137) 16

21 De immunologische status en de graad van immuunsuppressie door immunosuppressieve therapie na transplantatie blijken een rol te spelen in het al dan niet evolueren naar chroniciteit. ( ) Vermindering van de immunosuppressieve therapie liet patiënten met chronische infectie immers toe het virus sneller te elimineren. (137) HIV Chronische HEV infectie werd beschreven bij patiënten geïnfecteerd met het Human Immunodeficiency Virus (HIV) (138, 139), al komt het minder frequent voor dan bij orgaantransplantatiepatiënten. (107) Een HIV infectie is een pathologie geassocieerd aan een progressief dalende immuniteit. Dit onderstreept nogmaals de associatie tussen de immunologische status van de patiënt en de evolutie naar chronische HEV infectie Hematologische maligniteiten Bij patiënten met hematologische maligniteiten zijn er verschillende gevallen van chronische HEV infectie beschreven. ( ) Net zoals bij HIV geïnfecteerde patiënten, wordt ook hier verondersteld dat chronische HEV infectie minder frequent voorkomt dan bij orgaantransplantatiepatiënten. Men neemt aan dat ook bij deze patiënten de gewijzigde immunologische status en de kankertherapie bijdragen tot (107, 141) de ontwikkeling van chronische HEV infectie en chronische hepatitis Cirrose Bij enkele van de chronisch geïnfecteerde patiënten werd gezien dat er een progressieve fibrosering van de lever plaatsvond naarmate de infectie bleef aanhouden. In sommige gevallen werd zelfs (136, 143, 144) progressie tot levercirrose gezien, minder dan drie jaar na het begin van de infectie Diagnostische tests Een HEV infectie kan gediagnosticeerd worden via detectie van viraal RNA in het serum of plasma tijdens de periode van viremie of in de faeces tijdens de periode van faecale excretie. (127, 134) Detectie van HEV RNA gebeurt via de Reverse-Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) techniek. In vergelijking met de klassieke PCR en de nested PCR biedt de real-time of kwantitatieve PCR (qpcr) techniek verschillende voordelen: er wordt normaal gezien een hogere sensitiviteit bereikt, de uitvoering van de test is minder arbeidsintensief en er bestaat een lagere kans op kruiscontaminatie. Mede gezien deze voordelen zijn er reeds verschillende real-time PCR tests ontwikkeld en gebruikt om HEV infecties te diagnosticeren. (145) Binnen de RT-qPCR techniek kan verder nog gekozen worden op welke manier de detectie van de virale genomen gebeurt. Er kan gebruik worden gemaakt van een kleurstof zoals SYBR Green (niet-specifieke methode) enerzijds of van een probe zoals de TaqMan probes (specifieke methode) anderzijds. In vergelijking met het gebruik van SYBR Green resulteert 17

22 het gebruik van TaqMan probes doorgaans in een hogere specificiteit. De probe technieken, zoals de TaqMan assay, genieten daarom in meerdere studies de voorkeur. (145) Een andere manier om een HEV infectie te diagnosticeren is via de detectie van anti-hev antilichamen in het serum. De detectie van anti-hev IgM antilichamen en/of het aantonen van seroconversie van anti-hev IgG negativiteit naar anti-hev IgG positiviteit bevestigt de diagnose. (134, 146) Voor de detectie van anti-hev IgM antilichamen zijn er verschillende Enzyme Linked Immunosorbent Assays (ELISA) beschreven, zowel in het eigen labo ontwikkelde als commercieel (2, 123, 146) verkrijgbare. De waargenomen specificiteit en sensitiviteit varieert soms sterk tussen verschillende assays. ( ) Voor de detectie van anti-hev IgG antilichamen zijn er ook verschillende in het eigen labo ontwikkelde en commercieel verkrijgbare assays beschreven. (2, 150) Uit vergelijkende studies is ook hier gebleken dat de specificiteit en sensitiviteit tussen verschillende assays sterk kan ( , 151) variëren. Er bestaan ook assays voor detectie van anti-hev IgA antilichamen. (2, 123) Bij het vermoeden van een HEV infectie blijkt het zoeken naar IgA specifieke antilichamen op diagnostisch vlak echter weinig relevant te zijn. (152) 1.6. Behandeling Aangezien een acute hepatitis E meestal een zelflimiterende ziekte is (cfr. supra), is vaak geen (107, 113) specifieke behandeling nodig. Dan volstaat een symptomatische behandeling van de klachten. Zoals reeds beschreven hebben patiënten met onderliggend chronisch leverlijden bij een HEV infectie meer kans op het ontwikkelen van ernstige complicaties. Ook is reeds beschreven dat bij immuungecompromitteerde patiënten een chronische hepatitis kan ontwikkelen en een vroegtijdige evolutie naar levercirrose kan gebeuren. Bij deze patiënten wordt een meer specifieke behandeling aangeraden. Bij patiënten waar het mogelijk en ook van toepassing is, kan een vermindering van de dosis immunosuppressiva overwogen worden. (107, 113, 153) Bij orgaantransplantatiepatiënten met chronische hepatitis E onder immunosuppressieve therapie heeft vermindering van de dosis geleid tot eliminatie van het virus in het bloed en regressie van de hepatitis. (137) Bij patiënten waar vermindering van de dosis immunosuppressiva op zich onvoldoende effect heeft of bij andere patiënten waar meer specifieke behandeling aangeraden wordt, kan een behandeling met antivirale middelen overwogen worden. (107, 113) Er zijn verschillende reeksen met immuungecompromitteerde patiënten beschreven waar behandeling met ofwel ribavirine (154, 155) ofwel gepegyleerd interferon-alfa-2a/2b (153, 156, 157) tot een adequate reductie van de infectie heeft geleid. 18

23 Voor ribavirine bedroeg de dosis mg/dag, gespreid over twee toedieningen. Voor gepegyleerd interferon-alfa-2a/2b bedroeg de dosis respectievelijk 135 µg en µg per week, één keer per week toegediend. De optimale duur van behandeling is nog niet gekend en varieerde in de (153, 154, 156) studies van 3 tot 12 maanden. 2. Materiaal en Methoden 2.1. Literatuur Voor het overzicht van de literatuur werd gebruik gemaakt van de online zoekmachine PubMed om wetenschappelijke artikels op te zoeken. Volgende zoektermen werden gebruikt: Hepatitis E virus, Hepatitis E virus epidemiology, Hepatitis E virus transmission en Hepatitis E virus serology. Er werden geen restricties op de zoekopdrachten toegepast. Initieel werden enkele review artikels geselecteerd om als leidraad te dienen bij het zoeken naar verdere relevante artikels. Bij het selecteren van review artikels werd rekening gehouden met de datum van publicatie en de impact factor van het tijdschrift waarin de review gepubliceerd werd. In het geval er twee of meer publicaties dezelfde materie beschreven, werd gekozen voor het meest recente en/of het tijdschrift met de hoogste impact factor binnen zijn vakgebied. Verder werd gebruik gemaakt van referenties uit de verschillende bekomen artikels, alsook uit de review artikels. Op deze manier konden steeds de originele studies waarop de review artikels gebaseerd zijn, teruggevonden en geanalyseerd worden. Ook via de functie Related Citations van PubMed werden verschillende artikels bekomen Bepaling seroprevalentie Studiedesign en serumstalen Er werd gebruik gemaakt van reststalen van 100 patiënten. Het betrof patiënten die in een periode voorafgaand aan de studie in het Universitair Ziekenhuis Gent aanwezig waren en waarbij toen voor bepaalde redenen een veneuze bloedafname is gebeurd. In het Universitair Ziekenhuis Gent worden bloedstalen per protocol nog een bepaalde tijd na de bloedafname als reststaal bewaard. Na een bepaalde periode, indien ze niet verder nodig blijken te zijn, worden deze reststalen normaal vernietigd. Voor deze studie werden willekeurig 100 van deze reststalen geselecteerd, waarvan 50 reststalen van mannen en 50 van vrouwen afkomstig. Reststalen van patiënten waarbij de bloedafname gebeurd was in het kader van klachten mogelijks geassocieerd aan hepatologisch lijden werden geëxcludeerd. Ook reststalen van kinderen werden geëxcludeerd. De reststalen werden verder anoniem verwerkt. Elke vorm van identificatie die terug naar de patiënt zou kunnen koppelen werd verwijderd. De stalen werden bewaard op -20 Celsius tot op het moment van analyse. 19

24 Detectie van anti-hev IgG antilichamen Voor de detectie van anti-hev IgG antilichamen in het serum werd gebruik gemaakt van een HEV IgG ELISA kit. Er bestaan verschillende commercieel verkrijgbaar HEV IgG ELISA kits. Op basis van een recent verschenen vergelijkende studie werd voor de Wantai HEV IgG ELISA (Biorex Diagnostics, Antrim, Verenigd Koninkrijk) gekozen. Hierbij wordt gebruik gemaakt van de indirecte ELISA techniek op een met HEV antigen gecoate plaat (solid phase). Deze kit bleek zeer specifiek te zijn (99.6%) en tegelijk ook een hoge sensitiviteit te hebben (98%) voor de detectie van anti-hev IgG antilichamen. (151) Dit houdt enerzijds in dat bij personen die over anti-hev IgG antilichamen beschikken de kans op een negatief testresultaat zeer klein is (hoge sensitiviteit) en anderzijds dat personen die een positief testresultaat hebben zo goed als zeker over de antilichamen beschikken (hoge specificiteit). De test bleef ook nog lang positief na acute infectie. (151) Dus ook bij lage concentraties aan circulerende anti-hev IgG antilichamen blijft de test positief, wat nogmaals de hoge sensitiviteit benadrukt. Wanneer via bovenstaande techniek een borderline positief of borderline negatief testresultaat bekomen werd, werd gebruik gemaakt van een confirmatie assay voor verdere bevestiging van het resultaat. De test die hiervoor gebruikt werd, was de recomline HEV IgG/IgM test (Mikrogen, Neuried, Duitsland): een strip immunoassay die gebruik maakt van recombinante antigenen afkomstig van twee verschillende HEV genotypes (genotype 1 en genotype 3). Op basis van de resultaten van deze test kon met meer zekerheid bepaald worden of borderline negatieve of positieve resultaten echt negatief of positief waren HEV infectie bij populatie met gedocumenteerde afwijkende levertesten Studiedesign en serumstalen Het doel van het andere deel van de studie was het belang van HEV infecties bij een patiëntenpopulatie met gedocumenteerde afwijkende levertesten te bekijken. Eerst en vooral moest specifiek bepaald worden welke populatie verder onderzocht zou worden. Er werd besloten om volgende patiënten te includeren, met name: patiënten die zich in het Universitair Ziekenhuis Gent op de dienst Gastro-enterologie presenteerden met aandoeningen van de lever (gestoorde levertesten), die niet verklaard konden worden door de gekende oorzaken waarvoor routinematig getest wordt. Meer bepaald werden volgende groepen van patiënten gedefinieerd: Patiënten die in het verleden een transplantatie hebben ondergaan (als orgaan acceptor) en nu onverklaard verhoogde levertesten ontwikkelen. [Categorie A] 20

25 Patiënten met onverklaarde acute hepatitis of patiënten met matig gestoorde levertesten, waarvan men vermoedt dat het om toxische hepatitis gaat (veroorzaakt door geneesmiddelen, drugs, andere chemische producten) maar dit niet met zekerheid kan stellen. [Categorie B] Patiënten met gestoorde levertesten zonder duidelijke etiologie. [Categorie C] Patiënten met bewezen cirrose, ongeacht de oorzaak van de cirrose, die een acute on chronic exacerbatie vertonen. [Categorie D] Patiënten die aan een of meer van bovenstaande voorwaarden voldeden, werden geselecteerd voor de studie. Toestemming tot deelname aan de studie werd via informed consent verkregen van de patiënt. Vervolgens werden per patiënt eenmalig via veneuze bloedafname twee extra serumbuizen afgenomen. Deze serumstalen werden gebruikt voor de detectie van een eventuele HEV infectie. Vanaf het begin van maart 2011 werden geschikte patiënten geselecteerd. Tot nu toe gaven 48 patiënten hun consent om opgenomen te worden in de studie. Op het moment waarop deze eerste tussentijdse analyse van de data gebeurde, waren de resultaten van 39 van deze 48 patiënten (81.3%) beschikbaar Detectie van anti-hev IgG en anti-hev IgM antilichamen Voor de detectie van anti-hev IgG antilichamen in het serum werd gebruik gemaakt van dezelfde kit als de eerder beschreven kit gebruikt voor de bepaling van de seroprevalentie bij een normale populatie (cfr ). Voor de detectie van anti-hev IgM antilichamen in het serum werd gebruik gemaakt van de Wantai HEV IgM ELISA (Biorex Diagnostics, Antrim, Verenigd Koninkrijk) kit. Een positieve anti-hev IgM test houdt in dat er bij die patiënt op dat ogenblik een HEV infectie gaande is of dat die patiënt zeer recent een HEV infectie heeft doorgemaakt. Indien er bij dezelfde patiënt tegelijkertijd een positieve anti-hev IgG test is, wordt de kans dat het om een vals positief resultaat gaat nog kleiner. De serumstalen van alle onderzochte patiënten werden getest op de aanwezigheid van zowel anti-hev IgM als anti-hev IgG antilichamen Detectie van HEV RNA Voor de detectie van viraal HEV RNA in het serum werd gebruik gemaakt van een Reverse- Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR). Op basis van de literatuur werd, gezien de voordelen van de techniek (cfr. 1.5.), gekozen voor een real-time of kwantitatieve PCR techniek (RT-qPCR). Om de virale genomen na amplificatie te detecteren, werd gebruik gemaakt van een TaqMan assay. Hierbij gebeurt de genoomdetectie via probes. Deze methode wordt in verschillende studies toegepast om HEV RNA te detecteren en geeft doorgaans een hogere specificiteit dan de 21

26 SYBR Green kleurstof methode. Via deze assay kunnen ook alle vier de HEV genotypes gedetecteerd worden. (145) Er werd ook steeds een inhibitiecontrole uitgevoerd. Dit is een techniek waarmee kan nagegaan worden of een negatief RT-qPCR resultaat wijst op een afwezigheid van het te onderzoeken RNA (terecht negatief resultaat) of dat de amplificatie van het viraal genoom geïnhibeerd wordt (vals negatief resultaat). Als de test wees op een inhibitie van genoom amplificatie, werd de RT-qPCR herhaald. De serumstalen van alle onderzochte patiënten werden op deze manier getest op de aanwezigheid van HEV RNA. Een positief HEV RNA resultaat betekent dat die patiënt op dat ogenblik een HEV infectie doormaakt Risicofactoren Patiënten waarbij een HEV infectie vastgesteld was, werden verder ondervraagd om na te gaan of er risicofactoren voor transmissie van het virus aanwezig waren. Dit gebeurde op basis van een vragenlijst [Bijlage 1]. De vragen werden gebaseerd op de huidige gekende risicofactoren voor transmissie van HEV infecties, zoals die in de literatuur beschreven werden (cfr ). De vragenlijst werd telefonisch aan de patiënten voorgelegd Statistische analyse Voor de verwerking, onderlinge vergelijking en weergave van de gegevens werd gebruik gemaakt van het statistisch programma SPSS (SPSS Inc., Chicago, Ill, V.S.). Voor de vergelijking van categorische variabelen werd gebruik gemaakt van de χ²-test of de Fisher s Exact-test. Voor de vergelijking van continue variabelen werd gebruik gemaakt van de niet-parametrische Mann-Whitney U test. Een resultaat werd als significant beschouwd zodra de P waarde kleiner dan 0.05 was Ethische aspecten Beide delen van deze studie, zoals beschreven onder 2.2. en 2.3, werden goedgekeurd door een onafhankelijke Commissie voor Medische Ethiek verbonden aan het Universitair Ziekenhuis Gent. 3. Resultaten 3.1. Literatuur Een overzicht van de relevante gegevens uit de literatuur wordt beschreven in de inleiding (cfr. 1.). 22

27 3.2. Bepaling seroprevalentie Populatie De groep van 100 willekeurig gekozen personen bestond uit 50 vrouwen (50%) en 50 mannen (50%). De gemiddelde leeftijd bedroeg 44.8 ± 17.2 jaar [gemiddelde ± standaarddeviatie], de mediaan bedroeg 39.0 jaar. De minimum leeftijd bedroeg 17 jaar, de maximum leeftijd 82 jaar [Figuur 3]. Binnen deze populatie was er geen significant verschil in leeftijd tussen de groep vrouwen en de groep mannen (P=0.073). Figuur 3. De verdeling van de willekeurig gekozen populatie volgens leeftijd. Zoals reeds eerder werd vermeld, werden geen kinderen opgenomen in de onderzoekspopulatie Prevalentie anti-hev IgG antilichaam positiviteit Van de 100 reststalen die onderzocht werden, waren er 14 die positief testten, 85 negatief en 1 borderline. Het ene staal dat borderline testte, werd verder geëvalueerd via de recomline HEV IgG/IgM strip immunoassay. Na het uitvoeren van de strip immunoassay bleek het om een negatief resultaat te gaan. Het uiteindelijke resultaat was dat er bij 14% (n=14) van de onderzochte personen anti-hev IgG antilichamen gevonden werden. De personen die positief testten voor anti-hev IgG antilichamen, hadden een gemiddelde leeftijd van 53.5 ± 19.5 jaar, de mediaan bedroeg 57.0 jaar. De 23

28 minimum leeftijd bedroeg 21 jaar, de maximum leeftijd 77 jaar. In de onderstaande tabel en grafiek wordt de verdeling van de anti-hev IgG positieve personen getoond per leeftijdscategorie. Zoals kan afgeleid worden uit de tabel was de leeftijdscategorie 28 tot 38 jarigen de grootste categorie [Tabel 2]. 40 van de 100 personen (40%) vielen binnen deze categorie. Anti-HEV IgG Leeftijdscategorieën 17 27j 28 38j 39 49j 50 60j 61 71j 72 82j Totaal Negatief Positief Totaal Tabel 2. Aantal personen die anti-hev IgG positief testten, anti-hev IgG negatief testten en het totaal aantal personen per leeftijdscategorie. Bij het bekijken van de percentages anti-hev IgG positieve personen binnen een bepaalde leeftijdscategorie werd gezien dat de categorie 50 tot 60 jarigen het hoogste percentage anti-hev IgG positieve personen bevatte [Figuur 4]. 37.5% van de 50 tot 60 jarigen testte positief voor anti-hev IgG antilichamen. Figuur 4. Aantal anti-hev IgG positieve personen uitgedrukt als percent van het totaal aantal personen binnen dezelfde leeftijdscategorie. Het totaal aantal personen per leeftijdscategorie is terug te vinden in Tabel 2. 24

29 Er werd geen verschil gezien tussen anti-hev IgG positiviteit bij de man en anti-hev IgG positiviteit bij de vrouw. Bij beide groepen was het aantal anti-hev IgG positieven even groot. Bij de mannelijke onderzoekspersonen (n=50) werden 7 positieve resultaten gevonden (14%). Bij de 50 vrouwelijke onderzoekspersonen (n=50) werden ook 7 positieve resultaten gevonden (14%). Ook bij het vergelijken van anti-hev IgG positiviteit tussen vrouwen en mannen per leeftijdscategorie kon geen significant verschil aangetoond worden. De onderstaande tabel geeft een overzicht van de man/vrouw verdeling binnen de onderzoekspopulatie [Tabel 3] j 28 38j 39 49j 50 60j 61 71j 72 82j Totaal Anti-HEV IgG Negatief Positief Totaal Man Vrouw Totaal Man Vrouw Totaal Man Vrouw Totaal Man Vrouw Totaal Man Vrouw Totaal Man Vrouw Totaal Man Vrouw Totaal Tabel 3. Het aantal mannen en vrouwen in functie van de anti-hev IgG status, per leeftijdscategorie. Bij het onderling vergelijken van de groep jongere personen (17 50 jaar) met de groep oudere personen (51 82 jaar) werd opgemerkt dat bij personen > 50 jaar het aandeel dat positief testte op anti-hev IgG antilichamen significant groter was dan bij personen 50 jaar (P=0.011). Ook bij vrouwen werd opgemerkt dat het aandeel dat positief testte op anti-hev IgG antilichamen significant groter was bij de oudere vrouwen (51 82 jaar) (P=0.009). Bij mannen kon geen significant verschil in seropositiviteit aangetoond worden tussen de groep oudere en de groep jongere mannen (P=0.404). 25

30 Bij het analyseren van het risico werd gevonden dat de oudere groep 4.93 keer meer kans had om positief te testen op anti-hev IgG antilichamen dan de jongere groep (OR=4.930; [95%BI]) HEV infectie bij populatie met gedocumenteerde afwijkende levertesten Patiënten De groep van 39 patiënten van wie de resultaten volledig beschikbaar waren bestond uit 16 vrouwen (41%) en 23 mannen (59%). De gemiddelde leeftijd bedroeg 51.6 ± 15.4 jaar, de mediaan bedroeg 55.0 jaar. De minimum leeftijd bedroeg 17 jaar, de maximum leeftijd 75 jaar [Figuur 5]. Er kon geen significant verschil in leeftijd tussen de groep mannen en de groep vrouwen aangetoond worden (P=0.641). Figuur 5. De verdeling van de onderzochte patiënten volgens leeftijd. De twee outliers (voorgesteld als holle cirkels in de grafiek) hebben als waarden: 17 en 18 jaar. Qua klinische context waarin de serumstalen van de patiënten onderzocht werden, was de categorie patiënten die in het verleden een transplantatie hebben ondergaan (als orgaan acceptor) en nu onverklaard verhoogde levertesten ontwikkelen het grootst (n=13). De categorie patiënten met bewezen cirrose, ongeacht de oorzaak van de cirrose, die een acute on chronic exacerbatie vertonen bevatte het minst aantal patiënten (n=2). Bij één van de 39 patiënten werd de categorie waartoe de 26

31 patiënt behoorde niet vermeld. Gezien de soms overlappende criteria van de categorieën werden sommige patiënten ingedeeld in meerdere categorieën [Figuur 6]. Figuur 6. De verdeling van het totaal aantal patiënten per categorie. Categorie A: transplantatie patiënten met onverklaard verhoogde levertesten. Categorie B: patiënten met onverklaarde acute hepatitis of matig gestoorde levertesten, waarvan men vermoedt dat het om toxische hepatitis gaat. Categorie C: patiënten met gestoorde levertesten zonder duidelijke etiologie. Categorie D: patiënten met cirrose die een acute on chronic exacerbatie vertonen. Categorie B + C: patiënten die zowel tot categorie B als tot categorie C behoren. Voor volledige beschrijving van de categorieën, zie Bij één van de 39 patiënten werd de categorie waartoe de patiënt behoorde niet vermeld (cfr. supra) Prevalentie anti-hev IgG antilichaam positiviteit Van de 39 patiënten van wie de resultaten volledig beschikbaar waren, waren er 5 die positief testten voor anti-hev IgG antilichamen (12.8%) [Figuur 7]. De patiënten die positief testten voor anti-hev IgG antilichamen hadden een gemiddelde leeftijd van 52.2 ± 16.9 jaar, de mediaan bedroeg 55.0 jaar. De minimum leeftijd bedroeg 24 jaar, de maximum leeftijd 67 jaar. De 5 patiënten die positief testten voor anti-hev IgG antilichamen waren allen van het mannelijk geslacht. Van de 23 mannelijke patiënten testten er dus 5 positief (21.7%). Van de 16 vrouwelijke patiënten testten er 0 positief (0%). Er kon echter geen significant verschil aangetoond worden tussen het aandeel mannen en het aandeel vrouwen dat positief testte (P=0.066). 27

32 Figuur 6. Het aantal patiënten dat positief testte voor anti-hev IgG antilichamen per categorie. De percentages geven weer hoe groot het aandeel van positieve patiënten is binnen dezelfde categorie. Voor volledige beschrijving van de categorieën, zie Anti-HEV IgM antilichaam positiviteit en HEV RNA Van de 39 patiënten van wie de resultaten volledig beschikbaar waren, waren er twee die positief testten voor anti-hev IgM antilichamen (5.1%). Één van de patiënten testte ook positief voor HEV RNA in het serum (2.6%). Een overzicht van alle resultaten van de virologische testen wordt weergeven in de onderstaande tabel [Tabel 4]. Anti-HEV IgM Anti-HEV IgG HEV RNA Positief Negatief Tabel Cases van HEV infectie Klinische, biologische en histologische aspecten Binnen de groep van 39 patiënten zijn er tot nu toe 2 gevallen van Hepatitis E virus infectie ontdekt (5.1%). Beide patiënten waren van het mannelijke geslacht. De leeftijd van patiënt A bedroeg 63 jaar, 28

33 van patiënt B 55 jaar. Beide patiënten behoorden tot categorie B; de aanvraag voor de HEV testen gebeurde op basis van een klinische context van onverklaarde acute hepatitis of matig gestoorde levertesten, waarvan men vermoedde dat het om toxische hepatitis ging (veroorzaakt door geneesmiddelen, drugs, andere chemische producten) maar dit niet met zekerheid kon stellen. Bij patiënt A en patiënt B werd de aanwezigheid van zowel anti-hev IgM als anti-hev IgG antilichamen aangetoond. Bij patiënt B werd er ook HEV RNA in het serum teruggevonden. Dit was niet het geval bij patiënt A. De belangrijkste laboresultaten staan beschreven in onderstaande tabel [Tabel 5]. Patiënt A 63j Patiënt B 55j Anti-HEV IgM + + Anti-HEV IgG + + HEV RNA - + Aspartaat aminotransferase (U/l) Alanine aminotransferase (U/l) Gamma-glutamyltransferase (U/l) Alkalisch fosfatase (U/l) Totaal bilirubine (mg/dl) Direct bilirubine (mg/dl) Indirect bilirubine (mg/dl) Prothrombine index (%) INR Albumine (g/dl) NG 4.6 Serum creatinine (mg/dl) Glycemie (g/l) Leukocyten (x10 3 /µl) Thrombocyten (x10 3 /µl) Tabel 5. De laboresultaten van patiënt A en patiënt B, gebaseerd op stalen die werden verzameld op het moment dat de patiënt zich voor het eerst met de klacht meldde op de dienst Gastro-enterologie of Gastro-enterologie Hepatologie van het Universitair Ziekenhuis Gent. NG = Niet Gekend. INR = International Normalized Ratio. Patiënt A werd naar de dienst Gastro-enterologie Hepatologie van het Universitair Ziekenhuis Gent verwezen op basis van gestoorde levertesten. Deze waren een week eerder vastgesteld geweest na een bloedafname in het kader van een dermatologisch consult. De initiële klachten waren gering. De patiënt gaf zelf aan enkele dagen nausea en braken vertoond te hebben in dezelfde periode als de gestoorde levertesten. Er werd geen arts geraadpleegd voor deze klachten. Er werden geen andere klachten aangegeven in de periode na de initiële klachten van nausea en braken. Op het moment van 29

34 consultatie op de dienst Gastro-enterologie Hepatologie van het Universitair Ziekenhuis Gent had de patiënt geen belangrijke klachten. Bij de klinische evaluatie werden geen abnormaliteiten gevonden. Er was geen sprake van ascites. De patiënt ontwikkelde geen encephalopathie of andere tekens van leverfalen. Op basis van beeldvorming werden geen aanwijzingen gevonden voor belangrijke fibrose of cirrose van de lever. Er werd geen leverbiopsie uitgevoerd. In de periode vòòr de consultatie op de dienst Gastro-enterologie Hepatologie van het Universitair Ziekenhuis Gent nam de patiënt volgende medicatie: omeprazole 20 mg één maal per dag, amitriptyline 10 mg één maal per dag en simvastatine 10 mg één maal per dag. Patiënt B werd naar de dienst Gastro-enterologie Hepatologie van het Universitair Ziekenhuis Gent verwezen op basis van gestoorde levertesten en klachten van malaise, gedepigmenteerde faeces en donkergekleurde urine. Deze klachten en gestoorde levertesten waren twee weken eerder vastgesteld geweest door de huisarts. In de periode na de initiële klachten ontwikkelde de patiënt ook anorexie, braken en nachtzweten zonder koorts of koude rillingen. Op het moment van opname op de dienst Gastro-enterologie Hepatologie van het Universitair Ziekenhuis Gent vertoonde de patiënt deze klachten nog steeds. Bij de klinische evaluatie werden, buiten de aanwezigheid van icterus, verder geen abnormaliteiten gevonden. Er was geen sprake van ascites. De patiënt ontwikkelde geen encephalopathie of andere tekens van leverfalen. Op basis van beeldvorming werden geen aanwijzingen gevonden voor belangrijke fibrose of cirrose van de lever. Er werd bij deze patiënt een leverbiopsie uitgevoerd. Deze toonde tekens van acute inflammatie aan maar afwezigheid van belangrijke fibrose of cirrose. In de periode vòòr de opname op de dienst Gastro-enterologie Hepatologie van het Universitair Ziekenhuis Gent nam de patiënt volgende medicatie: simvastatine 10 mg één maal per dag. De inname van simvastatine werd twee weken vòòr opname stopgezet. De patiënt gaf ook aan sporadisch paracetamol te gebruiken, maximaal vier maal 500 mg per dag Verloop Patiënt A vertoonde een beeld van acute hepatitis met initieel gestegen transaminasen. Gezien de gunstige evolutie van de laboresultaten en het mild klinisch verloop werd de patiënt verder klinisch opgevolgd. De patiënt vertoonde een volledig herstel met normalisatie van de levertesten binnen de vier weken na het initieel consult. Patiënt B vertoonde een beeld van acute hepatitis met sterk gestegen transaminasen en bilirubine. Op basis van het klinisch beeld en de beslissing om onder andere een leverbiopsie uit te voeren werd de patiënt gedurende een periode van vijf dagen opgenomen. De patiënt vertoonde een volledig herstel met normalisatie van de levertesten binnen de vier weken na het begin van de hospitalisatie. Géén van beide patiënten ontwikkelde complicaties of overleed in het kader van de HEV infectie. 30

35 Risicofactoren Beide patiënten hadden niet gereisd in de periode voorafgaand aan hun infectie. Beide gaven aan nooit contact te hebben gehad met onvoldoende verhit of rauw everzwijnvlees. Met contact werd zowel het opeten als het bereiden van het vlees bedoeld. Patiënt A at soms hertenvlees dat mogelijks onvoldoende verhit was. Patiënt B gaf aan nooit in contact te komen met onvoldoende verhit of rauw hertenvlees. Beide patiënten aten soms orgaanvlees in een verwerkte vorm (paté) en aten frequent varkensvlees dat rauw of onvoldoende verhit was (gehakt, broodbeleg, vlees bereid op bepaalde bakwijze,...). Géén van de patiënten kwam in contact met varkens, noch op professioneel (varkensboer, veearts, arbeider in een slachthuis, slager,...) noch op recreationeel vlak (varkens houden als hobby). Géén van beide patiënten woonde in de omgeving van een plaats waar varkens gekweekt of verwerkt werden. Ook had geen van beide ooit gejaagd. Beide patiënten hadden nog nooit een bloedtransfusie ontvangen [Tabel 6]. Patiënt A 63j Patiënt B 55j Recent gereisd - - Contact met rauw of onvoldoende verhit vlees: Everzwijn - - Hert ± - Orgaan ± ± Varken + + Contact met varkens (professioneel/recreationeel) - - Wonen nabij plaats waar varkens gekweekt/verwerkt worden - - Jagen - - Bloedtransfusie ontvangen - - Tabel 6. Overzicht van de belangrijkste risicofactoren voor infectie bij twee patiënten met bewezen HEV infectie. - = nee/nooit, ± = misschien/soms, + = ja/frequent. 4. Discussie Het doel van deze studie was om na te gaan in welke mate het Hepatitis E virus voorkomt in België. In het eerste deel van de studie werd onderzocht wat de seroprevalentie van IgG antilichamen tegen het HEV was in een willekeurige populatie. In het tweede deel werd gekeken in welke mate HEV infecties voorkwamen in een risicopopulatie. Tegelijk werd ook onderzocht wat de seroprevalentie van IgG antilichamen tegen het HEV was in diezelfde risicopopulatie. 31

36 De seroprevalentie van anti-hev IgG antilichamen in een willekeurige Belgische populatie bedroeg 14%. Dit komt in grote lijnen overeen met bepaalde seroprevalenties teruggevonden in naburige West- Europese landen ( %). (64, 65, 74) Andere studies uit naburige landen gaven dan weer veel lagere seroprevalenties aan (2-7.3%). (63, 73, 76, 79) De resultaten van studies omtrent seroprevalenties in verschillende landen variëren soms sterk, zowel tussen landen onderling als tussen verschillende populaties binnen hetzelfde land. Waarschijnlijk kan deze variatie deels verklaard worden door een verschillende blootstelling aan HEV of door verschillen in de demografische kenmerken van de onderzochte populaties (leeftijd, geslacht, ). Men veronderstelt echter dat de belangrijkste factor voor deze variatie het verschil is in sensitiviteit en specificiteit tussen de verschillende diagnostische assays gebruikt in de studies. (151) Op basis van een vergelijkende studie werd gekozen voor een assay (Wantai HEV IgG ELISA (Biorex Diagnostics, Antrim, Verenigd Koninkrijk)) die een superieure sensitiviteit had ten opzichte van een andere frequent gebruikte commercieel beschikbare assay. (151) Door gebruik te maken van een assay met zeer hoge sensitiviteit werd verzekerd dat iemand die over anti-hev IgG antilichamen beschikte zeker niet negatief zou testen. De hoge specificiteit van de test sloot ook uit dat iemand die niet over anti-hev IgG antilichamen beschikte positief zou testen. De onderzochte populatie bestond uit 100 personen. Om te compenseren voor de minder uitgebreide steekproefgrootte werden de onderzoekspersonen op een willekeurige manier geselecteerd. Op deze manier werd getracht een zo realistisch mogelijke representatie van een normale populatie weer te geven. Over de seroprevalentie van anti-hev IgG antilichamen in België waren tot op heden geen gegevens beschikbaar. De resultaten van deze studie representeren dan ook de eerste gedocumenteerde schatting van anti-hev IgG antilichaam positiviteit in België. Deze resultaten werden voorgesteld tijdens de 24th Belgian Week of Gastroenterology (February 9 11, 2012) [Bijlage 2] en gepubliceerd in Acta Gastro-Enterologica Belgica Vol. 75 Nr. 1 Maart 2012, met als titel: Hepatitis E seroprevalence in Belgium. F. Van Hoecke, T. Van Maerken, M. De Boulle, A. Geerts, H. Van Vlierberghe, I. Colle, E. Padalko. Universitair Ziekenhuis Gent. Gent, Belgium. [Bijlage 3]. De demografische kenmerken van anti-hev IgG positieve personen komen grotendeels overeen met wat in andere studies werd vastgesteld. Het aandeel anti-hev IgG positieve personen was significant groter bij de groep >50 jaar in vergelijking met de groep 50 jaar. Iemand ouder dan 50 jaar had bijna 5 keer zoveel kans om over anti-hev IgG antilichamen te beschikken dan iemand jonger dan 50 jaar. Ook in studies uit andere landen werd gezien dat het aandeel anti-hev IgG positieve personen groter was in de hogere leeftijdscategorieën. (80, 81) Het mechanisme van de hogere anti-hev IgG antilichaam positiviteit in de hogere leeftijdscategorieën kan dubbel zijn. Het is mogelijk dat de kans om aan HEV blootgesteld te zijn stijgt naarmate de persoon ouder wordt. Er kan echter niet uitgesloten worden dat infecties met het virus vroeger frequenter voorkwamen dan nu. (73) Er werd geen verschil gevonden in anti-hev IgG antilichaam positiviteit tussen mannen en vrouwen, terwijl in andere studies het aantal 32

37 positieve mannen meestal significant groter was dan het aantal positieve vrouwen, ongeacht de leeftijd. (80, 81) Waarom mannen meer kans hebben om aan het Hepatitis E virus blootgesteld te worden en zo anti-hev IgG antilichamen te ontwikkelen, is niet gekend. Om te onderzoeken in welke mate het HEV voorkwam in een risicopopulatie, moest eerst en vooral gedefinieerd worden welke patiënten als risicopatiënten beschouwd konden worden. Het criterium dat werd gehanteerd voor inclusie van de patiënt in de studie was: patiënten die zich in het Universitair Ziekenhuis Gent op de dienst Gastro-enterologie presenteerden met aandoeningen van de lever (gestoorde levertesten), die niet verklaard konden worden door de gekende oorzaken waarvoor routinematig getest werd. De gekende oorzaken waarvoor routinematig getest werd, waren: actieve infectie met Hepatitis A virus (HAV), Hepatitis B virus (HBV), Hepatitis C virus (HCV), Cytomegalovirus (CMV) of Epstein-Barrvirus (EBV). Voor verdere beschrijving van de inclusiecriteria, zie Binnen de groep van 39 patiënten van wie de resultaten volledig beschikbaar waren, waren er vijf die over anti-hev IgG antilichamen beschikten (12.8%). Er werd geen significant verschil gevonden in anti-hev IgG antilichaam positiviteit tussen de willekeurige populatie en de groep risicopatiënten (P=0.856). Het aantal mannelijke patiënten die anti-hev IgG antilichaam positief waren, was groter dan het aantal vrouwelijke patiënten, al was het geen significant verschil. Bij twee van de 39 patiënten werd een HEV infectie vastgesteld (5.1%). De diagnose werd bevestigd door de aanwezigheid van HEV RNA en/of anti-hev IgM antilichamen in het serum. Patiënt A, een man van 63 jaar, was naar de dienst Gastro-enterologie Hepatologie van het Universitair Ziekenhuis Gent verwezen op basis van gestoorde levertesten. Hij bleef over het volledige verloop van de episode anicterisch. De symptomen beperkten zich tot enkele dagen nausea en braken. Patiënt B, een man van 55 jaar, was naar de dienst Gastro-enterologie Hepatologie van het Universitair Ziekenhuis Gent verwezen op basis van gestoorde levertesten en klachten van malaise, gedepigmenteerde faeces en donkergekleurde urine. Deze patiënt was bij opname icterisch met een aanzienlijk gestegen bilirubinemie. Bijkomende symptomen waren anorexie, braken en nachtzweten zonder koorts of koude rillingen. Men heeft gezien dat een groot deel van de HEV infecties asymptomatisch en/of anicterisch verloopt. (134) In deze gevallen wordt de diagnose meestal gesteld in het kader van de toevallige vondst van een transaminasestijging. (74) Dit was het geval bij Patiënt A. Men heeft ook gezien dat de klinische presentatie van een HEV infectie zeer variabel kan zijn. (134) Zoals hierboven is beschreven, werd ook tussen Patiënt A en Patiënt B een duidelijk verschil gemerkt in klinische presentatie. Patiënt A en Patiënt B waren beiden van het mannelijk geslacht en respectievelijk 63 en 55 jaar oud. In niet endemische regio s wordt acute hepatitis E (veroorzaakt door een autochtone HEV infectie) 33

38 vooral gezien bij patiënten van het mannelijk geslacht en van middelbare tot oudere leeftijd. ( ) Ook bij de patiënten in deze studie was dit het geval. Waarom dit zo is, is niet gekend. Beide patiënten behoorden tot patiëntenpopulatie B: de aanvraag voor de HEV testen gebeurde op basis van een klinische context van onverklaarde acute hepatitis of matig gestoorde levertesten, waarvan men vermoedde dat het om toxische hepatitis ging (veroorzaakt door geneesmiddelen, drugs, andere chemische producten) maar dit niet met zekerheid kon stellen. In verschillende studies uit andere landen werd ook al vermeld dat HEV infecties niet herkend werden als oorzaak van acute hepatitis omdat hiervoor niet werd getest of omdat de hepatitis werd bestempeld als toxische hepatitis. (127) In een retrospectieve studie uitgevoerd in het Verenigd Koninkrijk onderzocht men een groep van 28 patiënten die eerder de diagnose van toxisch-medicamenteuze hepatitis hadden gekregen. Er werd gevonden dat bij zes van de 28 patiënten (21.4%) een HEV infectie aan de oorsprong van hun leverlijden lag in plaats van een toxisch-medicamenteuze oorzaak. (158) Een HEV infectie kan dus mogelijks verantwoordelijk zijn voor leverlijden bij patiënten met gestoorde levertesten zonder duidelijke oorzaak of waarvan men vermoedt dat het om toxische hepatitis gaat. Het is dus zeker aan te raden in deze situaties een mogelijke HEV infectie op te sporen. Géénn van beide patiënten had gereisd in de periode vòòr de infectie. Hieruit werd afgeleid dat het om autochtone gevallen van HEV infectie ging. Over welk genotype van het HEV bij de mens voorkomt in België, zijn tot op heden weinig gegevens beschikbaar. Er werd onlangs één geval van chronische HEV infectie beschreven in België. De infectie was veroorzaakt door een genotype 3 HEV. (12) In Europa speelt genotype 3 de belangrijkste rol. Ook in de buurlanden van België behoort het merendeel van de virussen geïsoleerd uit autochtoon geïnfecteerde patiënten tot genotype 3. (3) Er zijn recent echter twee rapporten gepubliceerd van autochtone infecties in Europa veroorzaakt door genotype 4 varianten van het HEV. (10, 11) Ook heeft men in de faeces van varkens in België HEV van zowel genotype 3 als genotype 4 teruggevonden. (18) Rekening houdend met deze twee gegevens, kan men veronderstellen dat autochtone HEV infecties in België veroorzaakt kunnen worden door zowel genotype 3 als genotype 4 varianten van het HEV. Op basis van een vragenlijst werd nagegaan of er bij de twee patiënten risicofactoren aanwezig waren voor transmissie van het virus. Beide patiënten gaven aan soms orgaanvlees en frequent varkensvlees te eten dat mogelijks rauw of onvoldoende verhit was. Ook gaf Patiënt A aan soms in contact te komen met hertenvlees dat mogelijks onvoldoende verhit was. Er wordt aangenomen dat ingestie van besmet vlees één van de belangrijkste transmissieroutes is van het Hepatitis E virus in regio s waar de ziekte niet endemisch is. (11, 27, 43-45) Men kan niet met zekerheid stellen dat deze twee gevallen van HEV infectie op basis van dergelijke transmissie gebeurden. Maar aangezien geen van de andere gekende 34

39 risicofactoren aanwezig waren, is transmissie via het eten van besmet vlees momenteel de meest voor de hand liggende verklaring. De conclusie luidt dat deze studie een eerste beeld geeft van de prevalentie van HEV infecties in België. De anti-hev IgG seroprevalentie van 14% uit deze studie toont aan dat contact met het HEV niet zelden voorkomt. Studies met grotere populaties zullen een nog meer accuraat beeld kunnen geven van de anti-hev IgG seroprevalentie in de Belgische populatie. In een populatie patiënten met gestoorde levertesten waarvan men de oorzaak niet met zekerheid kon stellen, werd bij 5.1% een acute HEV infectie vastgesteld als oorzaak van de gestoorde levertesten. De transmissieroute kon niet met zekerheid vastgesteld worden, al zou transmissie via de consumptie van besmet vlees mogelijk zijn. Bij alle patiënten met acuut gestoorde levertesten waarvan men de oorzaak niet met zekerheid kan stellen, is het aangeraden om te testen op de aanwezigheid van een HEV infectie. 5. Dankwoord Graag had ik Prof. Dr. Isabelle Colle bedankt voor het sturen en begeleiden van mijn opzoekingswerk en resultaten en voor de finale revisie en correctie van mijn masterproef. Graag had ik ook Prof. Dr. Elizaveta Padalko, Dr. Tom Van Maerken en Dr. Frederik Van Hoecke bedankt voor het bezorgen van de resultaten van de diagnostische tests. Ook wil ik hen bedanken voor het co-auteurschap in het artikel Hepatitis E seroprevalence in East and West Flanders, Belgium, dat geaccepteerd is voor publicatie in Acta Gastro-Enterologica Belgica. Graag had ik ook nog Prof. Dr. Hans Van Vlierberghe, Dr. Anja Geerts en Prof. Dr. Isabelle Colle bedankt voor het rekruteren en selecteren van kandidaat patiënten voor de studie. 6. Referenties 1. Emerson S, Anderson D, Arankalle A, Meng X, Purdy M, Schlauder G, et al. Hepevirus. In: Fauquet C, Mayo M, Maniloff J, al. e, editors. Virus Taxonomy: VIIIth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. London: Elsevier/Academic Press; p Mushahwar IK. Hepatitis E virus: Molecular virology, clinical features, diagnosis, transmission, epidemiology, and prevention. J Med Virol. 2008;80(4): Okamoto H. Genetic variability and evolution of hepatitis E virus. Virus research. 2007;127(2): Epub 2007/03/ Tam AW, Smith MM, Guerra ME, Huang CC, Bradley DW, Fry KE, et al. Hepatitis E virus (HEV): molecular cloning and sequencing of the full-length viral genome. Virology. 1991;185(1): Epub 1991/11/01. 35

40 5. Kabrane-Lazizi Y, Meng XJ, Purcell RH, Emerson SU. Evidence that the genomic RNA of hepatitis E virus is capped. J Virol. 1999;73(10): Epub 1999/09/ Meng XJ. Recent advances in Hepatitis E virus. Journal of viral hepatitis. 2010;17(3): Epub 2009/12/ Pudupakam RS, Huang YW, Opriessnig T, Halbur PG, Pierson FW, Meng XJ. Deletions of the hypervariable region (HVR) in open reading frame 1 of hepatitis E virus do not abolish virus infectivity: evidence for attenuation of HVR deletion mutants in vivo. J Virol. 2009;83(1): Epub 2008/10/ Aggarwal R, Naik S. Epidemiology of hepatitis E: current status. Journal of gastroenterology and hepatology. 2009;24(9): Epub 2009/08/ Purcell RH, Emerson SU. Hepatitis E: an emerging awareness of an old disease. Journal of hepatology. 2008;48(3): Epub 2008/01/ Tesse S, Lioure B, Fornecker L, Wendling MJ, Stoll-Keller F, Bigaillon C, et al. Circulation of genotype 4 hepatitis E virus in Europe: First autochthonous hepatitis E infection in France. Journal of clinical virology : the official publication of the Pan American Society for Clinical Virology Epub 2012/03/ Wichmann O, Schimanski S, Koch J, Kohler M, Rothe C, Plentz A, et al. Phylogenetic and case-control study on hepatitis E virus infection in Germany. J Infect Dis. 2008;198(12): Epub 2008/11/ Halleux D, Kanaan N, Kabamba B, Thomas I, Hassoun Z. Hepatitis E virus: an underdiagnosed cause of chronic hepatitis in renal transplant recipients. Transplant infectious disease : an official journal of the Transplantation Society. 2012;14(1): Epub 2011/11/ Meng XJ, Halbur PG, Haynes JS, Tsareva TS, Bruna JD, Royer RL, et al. Experimental infection of pigs with the newly identified swine hepatitis E virus (swine HEV), but not with human strains of HEV. Archives of virology. 1998;143(7): Epub 1998/09/ Arankalle VA, Chobe LP, Chadha MS. Type-IV Indian swine HEV infects rhesus monkeys. Journal of viral hepatitis. 2006;13(11): Epub 2006/10/ Meng XJ, Halbur PG, Shapiro MS, Govindarajan S, Bruna JD, Mushahwar IK, et al. Genetic and experimental evidence for cross-species infection by swine hepatitis E virus. J Virol. 1998;72(12): Halbur PG, Kasorndorkbua C, Gilbert C, Guenette D, Potters MB, Purcell RH, et al. Comparative pathogenesis of infection of pigs with hepatitis E viruses recovered from a pig and a human. Journal of clinical microbiology. 2001;39(3): Epub 2001/03/ Feagins AR, Opriessnig T, Huang YW, Halbur PG, Meng XJ. Cross-species infection of specific-pathogen-free pigs by a genotype 4 strain of human hepatitis E virus. Journal of medical virology. 2008;80(8): Epub 2008/06/14. 36

41 18. Hakze-van der Honing RW, van Coillie E, Antonis AF, van der Poel WH. First isolation of hepatitis E virus genotype 4 in Europe through swine surveillance in the Netherlands and Belgium. PloS one. 2011;6(8):e Epub 2011/08/ Meng XJ. Hepatitis E virus: animal reservoirs and zoonotic risk. Veterinary microbiology. 2010;140(3-4): Epub 2009/04/ McCreary C, Martelli F, Grierson S, Ostanello F, Nevel A, Banks M. Excretion of hepatitis E virus by pigs of different ages and its presence in slurry stores in the United Kingdom. The Veterinary record. 2008;163(9): Epub 2008/09/ Banks M, Heath GS, Grierson SS, King DP, Gresham A, Girones R, et al. Evidence for the presence of hepatitis E virus in pigs in the United Kingdom. The Veterinary record. 2004;154(8): Epub 2004/03/ Arankalle VA, Chobe LP, Joshi MV, Chadha MS, Kundu B, Walimbe AM. Human and swine hepatitis E viruses from Western India belong to different genotypes. Journal of hepatology. 2002;36(3): Epub 2002/02/ Mizuo H, Suzuki K, Takikawa Y, Sugai Y, Tokita H, Akahane Y, et al. Polyphyletic strains of hepatitis E virus are responsible for sporadic cases of acute hepatitis in Japan. Journal of clinical microbiology. 2002;40(9): Epub 2002/08/ Yazaki Y, Mizuo H, Takahashi M, Nishizawa T, Sasaki N, Gotanda Y, et al. Sporadic acute or fulminant hepatitis E in Hokkaido, Japan, may be food-borne, as suggested by the presence of hepatitis E virus in pig liver as food. J Gen Virol. 2003;84(Pt 9): Epub 2003/08/ Takahashi M, Nishizawa T, Yoshikawa A, Sato S, Isoda N, Ido K, et al. Identification of two distinct genotypes of hepatitis E virus in a Japanese patient with acute hepatitis who had not travelled abroad. J Gen Virol. 2002;83(Pt 8): Epub 2002/07/ Nishizawa T, Takahashi M, Mizuo H, Miyajima H, Gotanda Y, Okamoto H. Characterization of Japanese swine and human hepatitis E virus isolates of genotype IV with 99 % identity over the entire genome. The Journal of general virology. 2003;84(Pt 5): Epub 2003/04/ Bouquet J, Tesse S, Lunazzi A, Eloit M, Rose N, Nicand E, et al. Close similarity between sequences of hepatitis E virus recovered from humans and swine, France, Emerging infectious diseases. 2011;17(11): Epub 2011/11/ Zhao C, Ma Z, Harrison TJ, Feng R, Zhang C, Qiao Z, et al. A novel genotype of hepatitis E virus prevalent among farmed rabbits in China. Journal of medical virology. 2009;81(8): Epub 2009/06/ Takahashi K, Kitajima N, Abe N, Mishiro S. Complete or near-complete nucleotide sequences of hepatitis E virus genome recovered from a wild boar, a deer, and four patients who ate the deer. Virology. 2004;330(2): Epub 2004/11/30. 37

42 30. Nakamura M, Takahashi K, Taira K, Taira M, Ohno A, Sakugawa H, et al. Hepatitis E virus infection in wild mongooses of Okinawa, Japan: Demonstration of anti-hev antibodies and a fullgenome nucleotide sequence. Hepatology research : the official journal of the Japan Society of Hepatology. 2006;34(3): Epub 2006/01/ Li TC, Miyamura T, Takeda N. Detection of hepatitis E virus RNA from the bivalve Yamato- Shijimi (Corbicula japonica) in Japan. Am J Trop Med Hyg. 2007;76(1): Epub 2007/01/ Rutjes SA, Lodder-Verschoor F, Lodder WJ, van der Giessen J, Reesink H, Bouwknegt M, et al. Seroprevalence and molecular detection of hepatitis E virus in wild boar and red deer in The Netherlands. Journal of virological methods. 2010;168(1-2): Epub 2010/06/ Forgach P, Nowotny N, Erdelyi K, Boncz A, Zentai J, Szucs G, et al. Detection of hepatitis E virus in samples of animal origin collected in Hungary. Veterinary microbiology. 2010;143(2-4): Epub 2009/12/ Arankalle VA, Joshi MV, Kulkarni AM, Gandhe SS, Chobe LP, Rautmare SS, et al. Prevalence of anti-hepatitis E virus antibodies in different Indian animal species. Journal of viral hepatitis. 2001;8(3): Epub 2001/05/ He J, Innis BL, Shrestha MP, Clayson ET, Scott RM, Linthicum KJ, et al. Evidence that rodents are a reservoir of hepatitis E virus for humans in Nepal. Journal of clinical microbiology. 2006;44(3):1208. Epub 2006/03/ Hirano M, Ding X, Li TC, Takeda N, Kawabata H, Koizumi N, et al. Evidence for widespread infection of hepatitis E virus among wild rats in Japan. Hepatology research : the official journal of the Japan Society of Hepatology. 2003;27(1):1-5. Epub 2003/09/ Hirano M, Ding X, Tran HT, Li TC, Takeda N, Sata T, et al. Prevalence of antibody against hepatitis E virus in various species of non-human primates: evidence of widespread infection in Japanese monkeys (Macaca fuscata). Japanese journal of infectious diseases. 2003;56(1):8-11. Epub 2003/04/ Mushahwar IK, Dawson GJ, Bile KM, Magnius LO. Serological studies of an enterically transmitted non-a, non-b hepatitis in Somalia. Journal of medical virology. 1993;40(3): Epub 1993/07/ Smith HM, Reporter R, Rood MP, Linscott AJ, Mascola LM, Hogrefe W, et al. Prevalence study of antibody to ratborne pathogens and other agents among patients using a free clinic in downtown Los Angeles. J Infect Dis. 2002;186(11): Epub 2002/11/ Khuroo MS. Study of an epidemic of non-a, non-b hepatitis. Possibility of another human hepatitis virus distinct from post-transfusion non-a, non-b type. The American journal of medicine. 1980;68(6): Epub 1980/06/01. 38

43 41. Naik SR, Aggarwal R, Salunke PN, Mehrotra NN. A large waterborne viral hepatitis E epidemic in Kanpur, India. Bulletin of the World Health Organization. 1992;70(5): Epub 1992/01/ Sanyal MC. Epidemic of infectious hepatitis amongst personnel of the armed forces, Delhi ( ): epidemiology. The Indian journal of medical research. 1957;45(Suppl.):91-9. Epub 1957/01/ Matsuda H, Okada K, Takahashi K, Mishiro S. Severe hepatitis E virus infection after ingestion of uncooked liver from a wild boar. J Infect Dis. 2003;188(6):944. Epub 2003/09/ Tamada Y, Yano K, Yatsuhashi H, Inoue O, Mawatari F, Ishibashi H. Consumption of wild boar linked to cases of hepatitis E. Journal of hepatology. 2004;40(5): Epub 2004/04/ Tei S, Kitajima N, Takahashi K, Mishiro S. Zoonotic transmission of hepatitis E virus from deer to human beings. Lancet. 2003;362(9381): Epub 2003/08/ Banks M, Grierson S, Fellows HJ, Stableforth W, Bendall R, Dalton HR. Transmission of hepatitis E virus. The Veterinary record. 2007;160(6):202. Epub 2007/02/ Bouwknegt M, Lodder-Verschoor F, van der Poel WH, Rutjes SA, de Roda Husman AM. Hepatitis E virus RNA in commercial porcine livers in The Netherlands. Journal of food protection. 2007;70(12): Epub 2007/12/ Feagins AR, Opriessnig T, Guenette DK, Halbur PG, Meng XJ. Detection and characterization of infectious Hepatitis E virus from commercial pig livers sold in local grocery stores in the USA. The Journal of general virology. 2007;88(Pt 3): Epub 2007/02/ Boxall E, Herborn A, Kochethu G, Pratt G, Adams D, Ijaz S, et al. Transfusion-transmitted hepatitis E in a 'nonhyperendemic' country. Transfusion medicine. 2006;16(2): Epub 2006/04/ Khuroo MS, Kamili S, Yattoo GN. Hepatitis E virus infection may be transmitted through blood transfusions in an endemic area. Journal of gastroenterology and hepatology. 2004;19(7): Epub 2004/06/ Matsubayashi K, Nagaoka Y, Sakata H, Sato S, Fukai K, Kato T, et al. Transfusiontransmitted hepatitis E caused by apparently indigenous hepatitis E virus strain in Hokkaido, Japan. Transfusion. 2004;44(6): Epub 2004/05/ Matsubayashi K, Kang JH, Sakata H, Takahashi K, Shindo M, Kato M, et al. A case of transfusion-transmitted hepatitis E caused by blood from a donor infected with hepatitis E virus via zoonotic food-borne route. Transfusion. 2008;48(7): Epub 2008/07/ Colson P, Coze C, Gallian P, Henry M, De Micco P, Tamalet C. Transfusion-associated hepatitis E, France. Emerging infectious diseases. 2007;13(4): Epub 2007/06/ Fernandez-Barredo S, Galiana C, Garcia A, Vega S, Gomez MT, Perez-Gracia MT. Detection of hepatitis E virus shedding in feces of pigs at different stages of production using reverse transcription-polymerase chain reaction. Journal of veterinary diagnostic investigation : official 39

44 publication of the American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians, Inc. 2006;18(5): Epub 2006/10/ Rutjes SA, Lodder WJ, Bouwknegt M, de Roda Husman AM. Increased hepatitis E virus prevalence on Dutch pig farms from 33 to 55% by using appropriate internal quality controls for RT- PCR. Journal of virological methods. 2007;143(1): Epub 2007/02/ Kasorndorkbua C, Opriessnig T, Huang FF, Guenette DK, Thomas PJ, Meng XJ, et al. Infectious swine hepatitis E virus is present in pig manure storage facilities on United States farms, but evidence of water contamination is lacking. Applied and environmental microbiology. 2005;71(12): Epub 2005/12/ Clemente-Casares P, Pina S, Buti M, Jardi R, MartIn M, Bofill-Mas S, et al. Hepatitis E virus epidemiology in industrialized countries. Emerging infectious diseases. 2003;9(4): Epub 2003/04/ Pina S, Buti M, Cotrina M, Piella J, Girones R. HEV identified in serum from humans with acute hepatitis and in sewage of animal origin in Spain. Journal of hepatology. 2000;33(5): Epub 2000/11/ Pina S, Jofre J, Emerson SU, Purcell RH, Girones R. Characterization of a strain of infectious hepatitis E virus isolated from sewage in an area where hepatitis E is not endemic. Applied and environmental microbiology. 1998;64(11): Epub 1998/10/ Drobeniuc J, Favorov MO, Shapiro CN, Bell BP, Mast EE, Dadu A, et al. Hepatitis E virus antibody prevalence among persons who work with swine. J Infect Dis. 2001;184(12): Epub 2001/12/ Meng XJ, Wiseman B, Elvinger F, Guenette DK, Toth TE, Engle RE, et al. Prevalence of antibodies to hepatitis E virus in veterinarians working with swine and in normal blood donors in the United States and other countries. Journal of clinical microbiology. 2002;40(1): Epub 2002/01/ Galiana C, Fernandez-Barredo S, Garcia A, Gomez MT, Perez-Gracia MT. Occupational exposure to hepatitis E virus (HEV) in swine workers. Am J Trop Med Hyg. 2008;78(6): Epub 2008/06/ Bouwknegt M, Engel B, Herremans MM, Widdowson MA, Worm HC, Koopmans MP, et al. Bayesian estimation of hepatitis E virus seroprevalence for populations with different exposure levels to swine in The Netherlands. Epidemiology and infection. 2008;136(4): Epub 2007/06/ Krumbholz A, Mohn U, Lange J, Motz M, Wenzel JJ, Jilg W, et al. Prevalence of hepatitis E virus-specific antibodies in humans with occupational exposure to pigs. Medical microbiology and immunology Epub 2011/07/21. 40

45 65. Mansuy JM, Legrand-Abravanel F, Calot JP, Peron JM, Alric L, Agudo S, et al. High prevalence of anti-hepatitis E virus antibodies in blood donors from South West France. Journal of medical virology. 2008;80(2): Epub 2007/12/ Perez-Gracia MT, Mateos ML, Galiana C, Fernandez-Barredo S, Garcia A, Gomez MT, et al. Autochthonous hepatitis E infection in a slaughterhouse worker. Am J Trop Med Hyg. 2007;77(5): Epub 2007/11/ Koizumi Y, Isoda N, Sato Y, Iwaki T, Ono K, Ido K, et al. Infection of a Japanese patient by genotype 4 hepatitis e virus while traveling in Vietnam. Journal of clinical microbiology. 2004;42(8): Epub 2004/08/ Fiore A. Hepatitis A: Transmitted by Food 2004 April ]. Available from: Arankalle VA, Tsarev SA, Chadha MS, Alling DW, Emerson SU, Banerjee K, et al. Agespecific prevalence of antibodies to hepatitis A and E viruses in Pune, India, 1982 and J Infect Dis. 1995;171(2): Epub 1995/02/ Clayson ET, Shrestha MP, Vaughn DW, Snitbhan R, Shrestha KB, Longer CF, et al. Rates of hepatitis E virus infection and disease among adolescents and adults in Kathmandu, Nepal. J Infect Dis. 1997;176(3): Epub 1997/09/ Tran HT, Ushijima H, Quang VX, Phuong N, Li TC, Hayashi S, et al. Prevalence of hepatitis virus types B through E and genotypic distribution of HBV and HCV in Ho Chi Minh City, Vietnam. Hepatology research : the official journal of the Japan Society of Hepatology. 2003;26(4): Epub 2003/09/ Stoszek SK, Engle RE, Abdel-Hamid M, Mikhail N, Abdel-Aziz F, Medhat A, et al. Hepatitis E antibody seroconversion without disease in highly endemic rural Egyptian communities. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 2006;100(2): Epub 2005/11/ Boutrouille A, Bakkali-Kassimi L, Cruciere C, Pavio N. Prevalence of anti-hepatitis E virus antibodies in French blood donors. Journal of clinical microbiology. 2007;45(6): Epub 2007/04/ Dalton HR, Stableforth W, Thurairajah P, Hazeldine S, Remnarace R, Usama W, et al. Autochthonous hepatitis E in Southwest England: natural history, complications and seasonal variation, and hepatitis E virus IgG seroprevalence in blood donors, the elderly and patients with chronic liver disease. Eur J Gastroenterol Hepatol. 2008;20(8): Epub 2008/07/ Bernal W, Smith HM, Williams R. A community prevalence study of antibodies to hepatitis A and E in inner-city London. Journal of medical virology. 1996;49(3): Epub 1996/07/01. 41

46 76. Ijaz S, Vyse AJ, Morgan D, Pebody RG, Tedder RS, Brown D. Indigenous hepatitis E virus infection in England: more common than it seems. Journal of clinical virology : the official publication of the Pan American Society for Clinical Virology. 2009;44(4): Epub 2009/02/ Herremans M, Vennema H, Bakker J, van der Veer B, Duizer E, Benne CA, et al. Swine-like hepatitis E viruses are a cause of unexplained hepatitis in the Netherlands. Journal of viral hepatitis. 2007;14(2): Epub 2007/01/ Mateos ML, Camarero C, Lasa E, Teruel JL, Mir N, Baquero F. Hepatitis E virus: relevance in blood donors and other risk groups. Vox sanguinis. 1998;75(4): Epub 1999/01/05 21: Buti M, Dominguez A, Plans P, Jardi R, Schaper M, Espunes J, et al. Community-based seroepidemiological survey of hepatitis E virus infection in Catalonia, Spain. Clinical and vaccine immunology : CVI. 2006;13(12): Epub 2006/10/ Kuniholm MH, Purcell RH, McQuillan GM, Engle RE, Wasley A, Nelson KE. Epidemiology of hepatitis E virus in the United States: results from the Third National Health and Nutrition Examination Survey, J Infect Dis. 2009;200(1): Epub 2009/05/ Takahashi M, Tamura K, Hoshino Y, Nagashima S, Yazaki Y, Mizuo H, et al. A nationwide survey of hepatitis E virus infection in the general population of Japan. Journal of medical virology. 2010;82(2): Epub 2009/12/ Clayson ET, Vaughn DW, Innis BL, Shrestha MP, Pandey R, Malla DB. Association of hepatitis E virus with an outbreak of hepatitis at a military training camp in Nepal. Journal of medical virology. 1998;54(3): Epub 1998/03/ Dilawari JB, Singh K, Chawla YK, Ramesh GN, Chauhan A, Bhusnurmath SR, et al. Hepatitis E virus: epidemiological, clinical and serological studies of north Indian epidemic. Indian journal of gastroenterology : official journal of the Indian Society of Gastroenterology. 1994;13(2):44-8. Epub 1994/04/ Corwin AL, Khiem HB, Clayson ET, Pham KS, Vo TT, Vu TY, et al. A waterborne outbreak of hepatitis E virus transmission in southwestern Vietnam. Am J Trop Med Hyg. 1996;54(6): Epub 1996/06/ Sedyaningsih-Mamahit ER, Larasati RP, Laras K, Sidemen A, Sukri N, Sabaruddin N, et al. First documented outbreak of hepatitis E virus transmission in Java, Indonesia. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 2002;96(4): Epub 2002/12/ Zhuang H, Cao XY, Liu CB, Wang GM. Epidemiology of hepatitis E in China. Gastroenterologia Japonica. 1991;26 Suppl 3: Epub 1991/07/ Bile K, Isse A, Mohamud O, Allebeck P, Nilsson L, Norder H, et al. Contrasting roles of rivers and wells as sources of drinking water on attack and fatality rates in a hepatitis E epidemic in Somalia. Am J Trop Med Hyg. 1994;51(4): Epub 1994/10/01. 42

47 88. Byskov J, Wouters JS, Sathekge TJ, Swanepoel R. An outbreak of suspected water-borne epidemic non-a non-b hepatitis in northern Botswana with a high prevalence of hepatitis B carriers and hepatitis delta markers among patients. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 1989;83(1): Epub 1989/01/ Isaacson M, Frean J, He J, Seriwatana J, Innis BL. An outbreak of hepatitis E in Northern Namibia, Am J Trop Med Hyg. 2000;62(5): Epub 2001/04/ Belabbes EH, Bouguermouh A, Benatallah A, Illoul G. Epidemic non-a, non-b viral hepatitis in Algeria: strong evidence for its spreading by water. Journal of medical virology. 1985;16(3): Epub 1985/07/ Velazquez O, Stetler HC, Avila C, Ornelas G, Alvarez C, Hadler SC, et al. Epidemic transmission of enterically transmitted non-a, non-b hepatitis in Mexico, JAMA : the journal of the American Medical Association. 1990;263(24): Epub 1990/06/ Wong DC, Purcell RH, Sreenivasan MA, Prasad SR, Pavri KM. Epidemic and endemic hepatitis in India: evidence for a non-a, non-b hepatitis virus aetiology. Lancet. 1980;2(8200): Epub 1980/10/ Chadha MS, Walimbe AM, Chobe LP, Arankalle VA. Comparison of etiology of sporadic acute and fulminant viral hepatitis in hospitalized patients in Pune, India during and Indian journal of gastroenterology : official journal of the Indian Society of Gastroenterology. 2003;22(1):11-5. Epub 2003/03/ Hyams KC, Purdy MA, Kaur M, McCarthy MC, Hussain MA, el-tigani A, et al. Acute sporadic hepatitis E in Sudanese children: analysis based on a new western blot assay. J Infect Dis. 1992;165(6): Epub 1992/06/ Das K, Agarwal A, Andrew R, Frosner GG, Kar P. Role of hepatitis E and other hepatotropic virus in aetiology of sporadic acute viral hepatitis: a hospital based study from urban Delhi. European journal of epidemiology. 2000;16(10): Epub 2001/05/ Ghabrah TM, Stickland GT, Tsarev S, Yarbough P, Farci P, Engle R, et al. Acute viral hepatitis in Saudi Arabia: seroepidemiological analysis, risk factors, clinical manifestations, and evidence for a sixth hepatitis agent. Clinical infectious diseases : an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 1995;21(3): Epub 1995/09/ Gomatos PJ, Monier MK, Arthur RR, Rodier GR, el-zimaity D, Hassan NF, et al. Sporadic acute hepatitis caused by hepatitis E virus in Egyptian adults. Clinical infectious diseases : an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 1996;23(1): Epub 1996/07/ Arankalle VA, Chobe LP, Jha J, Chadha MS, Banerjee K, Favorov MO, et al. Aetiology of acute sporadic non-a, non-b viral hepatitis in India. Journal of medical virology. 1993;40(2): Epub 1993/06/01. 43

48 99. Faramawi MF, Johnson E, Chen S, Pannala PR. The incidence of hepatitis E virus infection in the general population of the USA. Epidemiology and infection. 2011;139(8): Epub 2010/09/ Lewis HC, Boisson S, Ijaz S, Hewitt K, Ngui SL, Boxall E, et al. Hepatitis E in England and Wales. Emerging infectious diseases. 2008;14(1): Epub 2008/02/ Dalton HR, Fellows HJ, Gane EJ, Wong P, Gerred S, Schroeder B, et al. Hepatitis E in new zealand. Journal of gastroenterology and hepatology. 2007;22(8): Epub 2007/05/ Dalton HR, Thurairajah PH, Fellows HJ, Hussaini HS, Mitchell J, Bendall R, et al. Autochthonous hepatitis E in southwest England. Journal of viral hepatitis. 2007;14(5): Epub 2007/04/ Mansuy JM, Peron JM, Abravanel F, Poirson H, Dubois M, Miedouge M, et al. Hepatitis E in the south west of France in individuals who have never visited an endemic area. Journal of medical virology. 2004;74(3): Epub 2004/09/ Peron JM, Danjoux M, Kamar N, Missoury R, Poirson H, Vinel JP, et al. Liver histology in patients with sporadic acute hepatitis E: a study of 11 patients from South-West France. Virchows Archiv : an international journal of pathology. 2007;450(4): Epub 2007/03/ Sainokami S, Abe K, Kumagai I, Miyasaka A, Endo R, Takikawa Y, et al. Epidemiological and clinical study of sporadic acute hepatitis E caused by indigenous strains of hepatitis E virus in Japan compared with acute hepatitis A. Journal of gastroenterology. 2004;39(7): Epub 2004/08/ Widdowson MA, Jaspers WJ, van der Poel WH, Verschoor F, de Roda Husman AM, Winter HL, et al. Cluster of cases of acute hepatitis associated with hepatitis E virus infection acquired in the Netherlands. Clinical infectious diseases : an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 2003;36(1): Epub 2002/12/ Aggarwal R. Clinical presentation of hepatitis E. Virus research. 2011;161(1): Epub 2011/04/ Emerson SU, Purcell RH. Running like water--the omnipresence of hepatitis E. The New England journal of medicine. 2004;351(23): Epub 2004/12/ Zhuang H, Cao X, Liu C, Wang GM. Enterically transmitted non-a, non-b hepatitis in China. In: Shikata T, Purcell R, Uchida T, editors. Viral Hepatitis C, D and E. Amsterdam: Excerpta Medica; p Okamoto H, Takahashi M, Nishizawa T. Features of hepatitis E virus infection in Japan. Internal medicine. 2003;42(11): Epub 2003/12/ Peron JM, Mansuy JM, Poirson H, Bureau C, Dupuis E, Alric L, et al. Hepatitis E is an autochthonous disease in industrialized countries. Analysis of 23 patients in South-West France over a 44

49 13-month period and comparison with hepatitis A. Gastroenterologie clinique et biologique. 2006;30(5): Epub 2006/06/ Borgen K, Herremans T, Duizer E, Vennema H, Rutjes S, Bosman A, et al. Non-travel related Hepatitis E virus genotype 3 infections in the Netherlands; a case series BMC infectious diseases. 2008;8:61. Epub 2008/05/ Aggarwal R, Jameel S. Hepatitis E. Hepatology. 2011;54(6): Epub 2011/09/ Khuroo MS, Teli MR, Skidmore S, Sofi MA, Khuroo MI. Incidence and severity of viral hepatitis in pregnancy. The American journal of medicine. 1981;70(2): Epub 1981/02/ Hla M, Myint Myint S, Tun K, Thein-Maung M, Khin Maung T. A clinical and epidemiological study of an epidemic of non-a non-b hepatitis in Rangoon. Am J Trop Med Hyg. 1985;34(6): Epub 1985/11/ Khuroo MS, Kamili S. Aetiology, clinical course and outcome of sporadic acute viral hepatitis in pregnancy. Journal of viral hepatitis. 2003;10(1):61-9. Epub 2003/02/ Andersson MI, Hughes J, Gordon FH, Ijaz S, Donati M. Of pigs and pregnancy. Lancet. 2008;372(9644):1192. Epub 2008/10/ Anty R, Ollier L, Peron JM, Nicand E, Cannavo I, Bongain A, et al. First case report of an acute genotype 3 hepatitis E infected pregnant woman living in South-Eastern France. Journal of clinical virology : the official publication of the Pan American Society for Clinical Virology Epub 2012/02/ Peron JM, Bureau C, Poirson H, Mansuy JM, Alric L, Selves J, et al. Fulminant liver failure from acute autochthonous hepatitis E in France: description of seven patients with acute hepatitis E and encephalopathy. Journal of viral hepatitis. 2007;14(5): Epub 2007/04/ Dalton HR, Hazeldine S, Banks M, Ijaz S, Bendall R. Locally acquired hepatitis E in chronic liver disease. Lancet. 2007;369(9569):1260. Epub 2007/04/ Ramachandran J, Eapen CE, Kang G, Abraham P, Hubert DD, Kurian G, et al. Hepatitis E superinfection produces severe decompensation in patients with chronic liver disease. Journal of gastroenterology and hepatology. 2004;19(2): Epub 2004/01/ Hamid SS, Atiq M, Shehzad F, Yasmeen A, Nissa T, Salam A, et al. Hepatitis E virus superinfection in patients with chronic liver disease. Hepatology. 2002;36(2): Epub 2002/07/ Takahashi M, Kusakai S, Mizuo H, Suzuki K, Fujimura K, Masuko K, et al. Simultaneous detection of immunoglobulin A (IgA) and IgM antibodies against hepatitis E virus (HEV) Is highly specific for diagnosis of acute HEV infection. Journal of clinical microbiology. 2005;43(1): Epub 2005/01/ Tokita H, Harada H, Gotanda Y, Takahashi M, Nishizawa T, Okamoto H. Molecular and serological characterization of sporadic acute hepatitis E in a Japanese patient infected with a genotype III hepatitis E virus in The Journal of general virology. 2003;84(Pt 2): Epub 2003/02/01. 45

50 125. Chauhan A, Jameel S, Dilawari JB, Chawla YK, Kaur U, Ganguly NK. Hepatitis E virus transmission to a volunteer. Lancet. 1993;341(8838): Epub 1993/01/ Clayson ET, Myint KS, Snitbhan R, Vaughn DW, Innis BL, Chan L, et al. Viremia, fecal shedding, and IgM and IgG responses in patients with hepatitis E. J Infect Dis. 1995;172(4): Epub 1995/10/ Dalton HR, Bendall R, Ijaz S, Banks M. Hepatitis E: an emerging infection in developed countries. The Lancet infectious diseases. 2008;8(11): Epub 2008/11/ Koshy A, Grover S, Hyams KC, Shabrawy MA, Pacsa A, al-nakib B, et al. Short-term IgM and IgG antibody responses to hepatitis E virus infection. Scand J Infect Dis. 1996;28(5): Epub 1996/01/ Bendall R, Ellis V, Ijaz S, Thurairajah P, Dalton HR. Serological response to hepatitis E virus genotype 3 infection: IgG quantitation, avidity, and IgM response. Journal of medical virology. 2008;80(1): Epub 2007/11/ Chadha MS, Walimbe AM, Arankalle VA. Retrospective serological analysis of hepatitis E patients: a long-term follow-up study. Journal of viral hepatitis. 1999;6(6): Epub 1999/12/ Khuroo MS, Kamili S, Dar MY, Moecklii R, Jameel S. Hepatitis E and long-term antibody status. Lancet. 1993;341(8856):1355. Epub 1993/05/ Ijaz S, Arnold E, Banks M, Bendall RP, Cramp ME, Cunningham R, et al. Non-travelassociated hepatitis E in England and Wales: demographic, clinical, and molecular epidemiological characteristics. J Infect Dis. 2005;192(7): Epub 2005/09/ Mansuy JM, Abravanel F, Miedouge M, Mengelle C, Merviel C, Dubois M, et al. Acute hepatitis E in south-west France over a 5-year period. Journal of clinical virology : the official publication of the Pan American Society for Clinical Virology. 2009;44(1):74-7. Epub 2008/11/ Pavio N, Mansuy JM. Hepatitis E in high-income countries. Current opinion in infectious diseases. 2010;23(5): Epub 2010/08/ Kamar N, Selves J, Mansuy JM, Ouezzani L, Peron JM, Guitard J, et al. Hepatitis E virus and chronic hepatitis in organ-transplant recipients. The New England journal of medicine. 2008;358(8): Epub 2008/02/ Haagsma EB, van den Berg AP, Porte RJ, Benne CA, Vennema H, Reimerink JH, et al. Chronic hepatitis E virus infection in liver transplant recipients. Liver transplantation : official publication of the American Association for the Study of Liver Diseases and the International Liver Transplantation Society. 2008;14(4): Epub 2008/04/ Kamar N, Abravanel F, Selves J, Garrouste C, Esposito L, Lavayssiere L, et al. Influence of immunosuppressive therapy on the natural history of genotype 3 hepatitis-e virus infection after organ transplantation. Transplantation. 2010;89(3): Epub 2010/02/11. 46

51 138. Dalton HR, Bendall RP, Keane FE, Tedder RS, Ijaz S. Persistent carriage of hepatitis E virus in patients with HIV infection. The New England journal of medicine. 2009;361(10): Epub 2009/09/ Kaba M, Richet H, Ravaux I, Moreau J, Poizot-Martin I, Motte A, et al. Hepatitis E virus infection in patients infected with the human immunodeficiency virus. Journal of medical virology. 2011;83(10): Epub 2011/08/ Mansuy JM, Huynh A, Abravanel F, Recher C, Peron JM, Izopet J. Molecular evidence of patient-to-patient transmission of hepatitis E virus in a hematology ward. Clinical infectious diseases : an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 2009;48(3): Epub 2009/01/ Ollier L, Tieulie N, Sanderson F, Heudier P, Giordanengo V, Fuzibet JG, et al. Chronic hepatitis after hepatitis E virus infection in a patient with non-hodgkin lymphoma taking rituximab. Annals of internal medicine. 2009;150(6): Epub 2009/03/ le Coutre P, Meisel H, Hofmann J, Rocken C, Vuong GL, Neuburger S, et al. Reactivation of hepatitis E infection in a patient with acute lymphoblastic leukaemia after allogeneic stem cell transplantation. Gut. 2009;58(5): Epub 2009/04/ Gerolami R, Moal V, Colson P. Chronic hepatitis E with cirrhosis in a kidney-transplant recipient. The New England journal of medicine. 2008;358(8): Epub 2008/02/ Kamar N, Mansuy JM, Cointault O, Selves J, Abravanel F, Danjoux M, et al. Hepatitis E virus-related cirrhosis in kidney- and kidney-pancreas-transplant recipients. American journal of transplantation : official journal of the American Society of Transplantation and the American Society of Transplant Surgeons. 2008;8(8): Epub 2008/06/ Gyarmati P, Mohammed N, Norder H, Blomberg J, Belak S, Widen F. Universal detection of hepatitis E virus by two real-time PCR assays: TaqMan and Primer-Probe Energy Transfer. Journal of virological methods. 2007;146(1-2): Epub 2007/09/ Seriwatana J, Shrestha MP, Scott RM, Tsarev SA, Vaughn DW, Myint KS, et al. Clinical and epidemiological relevance of quantitating hepatitis E virus-specific immunoglobulin M. Clinical and diagnostic laboratory immunology. 2002;9(5): Epub 2002/09/ Myint KS, Endy TP, Gibbons RV, Laras K, Mammen MP, Jr., Sedyaningsih ER, et al. Evaluation of diagnostic assays for hepatitis E virus in outbreak settings. Journal of clinical microbiology. 2006;44(4): Epub 2006/04/ Herremans M, Bakker J, Duizer E, Vennema H, Koopmans MP. Use of serological assays for diagnosis of hepatitis E virus genotype 1 and 3 infections in a setting of low endemicity. Clinical and vaccine immunology : CVI. 2007;14(5): Epub 2007/03/16. 47

52 149. Zhang J, Ge SX, Huang GY, Li SW, He ZQ, Wang YB, et al. Evaluation of antibody-based and nucleic acid-based assays for diagnosis of hepatitis E virus infection in a rhesus monkey model. Journal of medical virology. 2003;71(4): Epub 2003/10/ Zhou YH, Purcell RH, Emerson SU. An ELISA for putative neutralizing antibodies to hepatitis E virus detects antibodies to genotypes 1, 2, 3, and 4. Vaccine. 2004;22(20): Epub 2004/06/ Bendall R, Ellis V, Ijaz S, Ali R, Dalton H. A comparison of two commercially available anti- HEV IgG kits and a re-evaluation of anti-hev IgG seroprevalence data in developed countries. Journal of medical virology. 2010;82(5): Epub 2010/03/ Herremans M, Duizer E, Jusic E, Koopmans MP. Detection of hepatitis E virus-specific immunoglobulin a in patients infected with hepatitis E virus genotype 1 or 3. Clinical and vaccine immunology : CVI. 2007;14(3): Epub 2007/02/ Haagsma EB, Riezebos-Brilman A, van den Berg AP, Porte RJ, Niesters HG. Treatment of chronic hepatitis E in liver transplant recipients with pegylated interferon alpha-2b. Liver transplantation : official publication of the American Association for the Study of Liver Diseases and the International Liver Transplantation Society. 2010;16(4): Epub 2010/04/ Kamar N, Rostaing L, Abravanel F, Garrouste C, Lhomme S, Esposito L, et al. Ribavirin therapy inhibits viral replication on patients with chronic hepatitis e virus infection. Gastroenterology. 2010;139(5): Epub 2010/08/ Mallet V, Nicand E, Sultanik P, Chakvetadze C, Tesse S, Thervet E, et al. Brief communication: case reports of ribavirin treatment for chronic hepatitis E. Annals of internal medicine. 2010;153(2):85-9. Epub 2010/06/ Kamar N, Rostaing L, Abravanel F, Garrouste C, Esposito L, Cardeau-Desangles I, et al. Pegylated interferon-alpha for treating chronic hepatitis E virus infection after liver transplantation. Clinical infectious diseases : an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 2010;50(5):e30-3. Epub 2010/02/ Kamar N, Abravanel F, Garrouste C, Cardeau-Desangles I, Mansuy JM, Weclawiak H, et al. Three-month pegylated interferon-alpha-2a therapy for chronic hepatitis E virus infection in a haemodialysis patient. Nephrology, dialysis, transplantation : official publication of the European Dialysis and Transplant Association - European Renal Association. 2010;25(8): Epub 2010/05/ Dalton HR, Fellows HJ, Stableforth W, Joseph M, Thurairajah PH, Warshow U, et al. The role of hepatitis E virus testing in drug-induced liver injury. Alimentary pharmacology & therapeutics. 2007;26(10): Epub 2007/09/14. 48

53 Bijlage 1 Risicofactoren: vragenlijst 1) Consumptie (transmissie via voeding) - Heeft de patiënt in de periode voorafgaand aan de episode één of meerdere van volgende vleeswaren geconsumeerd, en dan vooral mogelijke consumptie ervan rauw of onvoldoende verhit: o Everzwijn o Hert o Orgaanvlees (lever, nier, ingewanden) puur of verwerkt -> pâté, andouillette, leverworst, o Varkensvlees 2) Blootstelling aan mogelijke dierlijke reservoirs - Is de patiënt op professioneel of recreationeel vlak in contact geweest met varkens? Professioneel: varkensboer, veearts, werken in een slachthuis Recreationeel: varkens houden als hobby - - Woont de patiënt dicht bij een plek waar varkens gekweekt of verwerkt worden? Gaat de patiënt soms jagen (en zo contact met everzwijn en/of hert en het vlees hiervan mogelijk makend)? 3) Parenterale transmissie - Heeft de patiënt in de periode voor de episode één of meerdere bloedtransfusies gehad? 49

54 Bijlage 2 HEPATITIS E SEROPREVALENCE IN BELGIUM Frederik Van Hoecke 1,*, Tom Van Maerken 1,*, Matthias De Boulle 2, Anja Geerts 2, Hans Van Vlierberghe 2, Isabelle Colle 2, Elizaveta Padalko 1 1 Department of Clinical Chemistry, Microbiology and Immunology, Ghent University Hospital, Ghent, Belgium 2 Department of Hepatology and Gastroenterology, Ghent University Hospital, Ghent, Belgium * Equally contributing authors INTRODUCTION Hepatitis E virus (HEV) is a small, non-enveloped and single-stranded RNA virus. It is the sole member of the genus Hepevirus in the family of Hepeviridae. The virus has four genotypes with one serotype: genotypes 1 and 2 only infect humans, whereas genotypes 3 and 4 also infect animals, particularly pigs (1). HEV typically causes waterborne outbreaks of acute hepatitis in parts of the world with poor sanitation. These cases are usually due to genotype 1 or 2 and are predominantly caused by feco-oral transmission, mainly through contaminated drinking water. Another variant of the infection, usually due to genotype 3, is increasingly being recognized in industrialized countries. This genotype 3 has been shown to have a high prevalence in pig populations worldwide in which the virus is apathogenic, and is the cause of what is now called autochthonous hepatitis E. This disease mainly affects older people and may be transmitted zoonotically (2). In Western countries, the incidence of HEV infection and the resulting seroprevalence, reflecting previous exposure to HEV, are uncertain because published estimates of seroprevalence in these populations show great variability (3). The goal of this study is to establish the seroprevalence of HEV in Belgium, since no data have hitherto been published for this country. Since Belgium is part of Western Europe, where the occurrence of HEV genotype 3 has been clearly documented (1), a seroprevalence comparable to that in the adjacent countries would be expected. MATERIALS and METHODS A total of 50 male and 50 female patients presenting to our hospital between June 29 th and July 2 nd 2011 and without clear evidence of hepatitis nor gastroenterological problems were randomly selected. These individuals were between 17 and 82 years old with a mean age of 45 years. Anti-HEV IgG antibodies were determined using the HEV-IgG ELISA kit (Biorex, Antrim, United Kingdom). This assay was performed on a BEP III automated microplate processor (Siemens, Munich, Germany). Further testing of borderline results was done using a strip immunoassay with purified recombinant HEV antigens, the recomline HEV IgG/IgM assay (Mikrogen, Neuried, Germany). We thank R. De Kimpe for technical assistance. RESULTS From the 100 serum samples, 14 were clearly positive and 85 were unequivocally negative for anti-hev IgG. One result was considered borderline and therefore evaluated with the recomline strip immunoassay. This case was found to be negative for anti-hev IgG. Taken together, the anti-hev IgG seroprevalence was 14% in this study. There was no significant difference in anti-hev IgG seroprevalence according to sex, since cases were equally distributed between the 50 men (n=7) and the 50 women (n=7). Patients positive for anti-hev IgG were aged between 21 and 77 years old. DISCUSSION Previous studies in Western Europe have yielded widely differing estimates of seroprevalence of HEV (Table 1). This variability may partly be due to differences in the population studied, but the most important source of variation is probably the analytical performance of the assay used for detection of anti-hev antibodies (3, 9). In this study we have used an anti-hev IgG ELISA test for which a superior diagnostic sensitivity compared to another commercial assay has been demonstrated (3). This study does not allow us to determine whether seroconversion has occurred in the context of autochthonous or travel-associated hepatitis E, but based on observations in neighboring countries to Belgium we expect a large proportion of these cases to be locally acquired (10-12). As pigs may serve as a reservoir for HEV infection in humans, we calculated pig/inhabitant ratios by dividing the number of pigs by the number of inhabitants in these countries (Table 1) (data from the UK government, Dept. for the Environment, Food and Rural Affairs, 2009 and from the United Nations, Dept. of Economics and Social Affairs, Population Division, 2009). It is clear from these data that a simple linear correlation between the seroprevalence of HEV and the pig/inhabitant ratio does not exist. However, it should be kept in mind that HEV seroprevalence rates from different studies are difficult to compare due to large differences in the analytical sensitivity of the available anti-hev IgG assays (3, 9). Table 1. Comparison of the seroprevalence of HEV in Western European countries. P/I ratio, Pig/Inhabitant ratio. Country Seroprevalence (%) P/I ratio References Belgium This study France ,5 Germany Spain The Netherlands U.K ,11,20,21 REFERENCES 1: J Gastroenterol Hepatol 2009, 24: : Lancet infect Dis 2008, 8: : J Med Virol 2010, 82: : J Clin microbiol 2007, 45: : J Med Virol 2008, 80: : Beitr Infusionther Transfusionmed 1994, 32: : Med Microbiol Immunol 2011, in press. Doi: /s : Z Gastroenterol 2011, 49: : Hepatology 1998, 27: : Gastroenterol Clin Biol 2006, 30: : Eur J Gastroenterol Hepatol 2008, 20: : J Med Virol 2008, 80: : Clin Vaccine Immunol 2006, 13: : Enferm infecc Microbiol Clin 2007, 25: : Vox Sang 1998, 75: : Epidemiol Infect 2008, 136: : J Viral Hepat 2007, 14: : J Clin Virol 2005, 33: : Lancet 1993, 341: : J Med Virol 1996, 49: : J Clin Virol 2009, 44: CONCLUSION The observed seroprevalence rate (14%) suggests that HEV infection is not an uncommon event in Belgium. This seems to be similar to what has been reported for other Western European countries, but a robust comparison is hampered by a lack of standardization of the various anti-hev IgG assays used in individual studies. 50