Monitoring van virulentieontwikkeling van Phytophthora infestans en collectiebeheer

Transcriptie

1 Monitoring van virulentieontwikkeling van Phytophthora infestans en collectiebeheer Resultaten 2004 & 2005 A. Evenhuis, G.B.M. van den Bosch, M.G. Förch, H. van Raaij, H.G. Spits, G.J.T. Kessel & W.G. Flier Nota 443

2

3 Monitoring van virulentieontwikkeling van Phytophthora infestans en collectiebeheer Resultaten 2004 & 2005 A. Evenhuis 1,2, G.B.M. van den Bosch 1, M.G. Förch 1, H. van Raaij 1, H.G. Spits 2, G.J.T. Kessel 1 & W.G. Flier 1, Plant Research International, Postbus 16, 6700 AA Wageningen Praktijkonderzoek Plant & Omgeving, Postbus 430, 8200 AK Lelystad Current Adress: Fine Agrochemicals LTD Hill End House, Whittington Worcester WR5 2RQ UK Plant Research International B.V., Wageningen februari 2007 Nota 443

4 2007 Wageningen, Plant Research International B.V. Alle rechten voorbehouden. Niets uit deze uitgave mag worden verveelvoudigd, opgeslagen in een geautomatiseerd gegevensbestand, of openbaar gemaakt, in enige vorm of op enige wijze, hetzij elektronisch, mechanisch, door fotokopieën, opnamen of enige andere manier zonder voorafgaande schriftelijke toestemming van Plant Research International B.V. Omslag foto : Trudy van den Bosch (PRI) Plant Research International B.V. Adres : Droevendaalsesteeg 1, Wageningen : Postbus 16, 6700 AA Wageningen Tel. : Fax : info.pri@wur.nl Internet :

5 Inhoudsopgave pagina Samenvatting 1 Conclusies en aanbevelingen 3 1. Inleiding 5 2. Materiaal en methoden 7 Vangveldjes 2004 en Paringstype 8 Amplified Fragment Length Polymorfism (AFLP) 8 Virulentie test 9 Statistische analyse 9 3. Resultaten 11 AFLP-analyse 11 Paringstype 17 Virulentie Discussie en conclusies 25 Genetische variatie 25 Virulentie 25 R-gen toetsing 26 Exploitatie resistentiegenen 26 Conclusies Literatuur 29 Bijlage I. AFLP-patronen (# 83), vangveldjes p. Bijlage II. AFLP-patronen (# 84), vangveldjes p. Bijlage III. AFLP-patronen (# 85), vangveldjes p. Bijlage IV. AFLP-patronen (# 89), vangveldjes p. Bijlage V. AFLP-patronen (# 90), vangveldjes p.

6

7 1 Samenvatting Phytophthora infestans, de veroorzaker van de aardappelziekte, is een van de meeste bedreigende pathogenen in de aardappelteelt. Verschillende resistentiegenen tegen P. infestans zijn in aardappelrassen ingekruist. Verwacht wordt dat in de toekomst het inkruisen van nieuwe resistentiegenen een belangrijke bijdrage zal leveren aan de beheersing van P. infestans in de teelt van aardappelen. P. infestans heeft een groot adaptief vermogen waardoor de levensduur van ingekruiste resistenties vaak kort is. Door voortdurende monitoring van P. infestans kan het virulentiespectrum van P. infestans isolaten in de loop van de tijd gevolgd worden. Dit geeft inzicht voor welk van de oude en nieuwe resistentiegenen al virulentie in de P. infestans populatie aanwezig is. Kennis over het virulentiespectrum biedt de mogelijkheid resistentiegenen duurzamer te exploiteren. In 2004 en 2005 werden aardappel genotypen met verschillende resistentiegenen in vangvelden geplant op drie locaties en blootgesteld aan de lokale P. infestans populatie. P. infestans werd geïsoleerd van de geïnfecteerde genotypen. In beide jaren werden meer dan 100 isolaten, afkomstig van de drie locaties toegevoegd aan de isolatencollectie van Plant Research International. De P. infestans isolaten uit Lelystad en Valthermond 2004 waren op AFLP-niveau klonaal. Een jaar later waren de verzamelde isolaten uit Valthermond zeer heterogeen. In Vredepeel was er in beide jaren sprake van een zekere mate van heterogeniteit in de verzamelde isolaten. Voor alle getoetste genotypen was op een of meerdere locaties en jaren virulentie in de P. infestans populatie aanwezig. Virulentie voor R1, R2, R3, R4, R7, R10 & R11 komen in bijna alle isolaten voor. Meestal is er daarnaast ook nog virulentie voor andere R-genen en komen diverse virulenties als regel in combinatie voor. Dit geeft aan dat P. infestans complex is en dat virulenties in de populatie aanwezig blijven. De kosten in termen van fitness voor het handhaven van deze virulentiefactoren in de populatie zijn voor het pathogeen klein of niet aanwezig. Door het grote adaptieve vermogen van P. infestans mag verwacht worden dat bij introductie van enkelvoudige resistentiegenen op grotere schaal mogelijk aanwezige virulentie snel door de populatie verspreid zal worden. Bij introductie van combinaties van resistentiegenen zal adaptatie mogelijk vertraagd worden. Dit mag echter alleen verwacht worden als resistentiegenen ingekruist worden waarvoor virulentie samen gaat met een fitness verlagend effect. Voor de resistenties aanwezig in de getoetste genotypen lijkt dat niet of in beperkte mate het geval. Wel werden de aardappel-genotypen beschikbaar gesteld door veredelingsbedrijven gemiddeld genomen later in de tijd aangetast door P. infestans dan de R-gen differentials R0, R1 en R7. Vaak bleef de aantasting op deze genotypen beperkt tot enkele lesies. Voortdurend toetsen van virulentie voor (nieuwe) resistentiegenen is nodig om strategische keuze te kunnen maken in resistentieverdelingsprogramma s tegen P. infestans. Kennis van het virulentiespectrum en monitoring van de ontwikkeling van dit virulentiespectrum van de Nederlandse P. infestans populatie draagt bij aan een verantwoorde inzet van nieuwe resistentiegenen.

8 2

9 3 Conclusies en aanbevelingen Voor alle getoetste genotypen was op een of meerdere locaties en jaren virulentie in de P. infestans populatie aanwezig. De mate van genetische variatie tussen de verzamelde P. infestans isolaten verschilt per locatie en per jaar. Isolaten uit Lelystad 2004 en Valthermond 2004 waren, op AFLP-niveau, klonaal. Een jaar later waren de isolaten uit Valthermond genetisch zeer heterogeen. In beide jaren en op de meeste locaties komen beide paringstypen (A1 & A2) naast elkaar voor en vormen daarmee een basis voor genetische recombinatie. Hoewel isolaten genetisch identiek kunnen zijn op AFLP-niveau komen verschillen in virulentiespectrum voor. Om inzicht te krijgen in het virulentiespectrum blijft toetsing op genotypen met verschillende genetische achtergrond noodzakelijk. Uitbreiding van het onderzoek met genotypen met nieuwe resistentiegenen, inclusief wilde verwanten is raadzaam. P. infestans isolaten hebben meestal 8 tot 10 virulentiefactoren en zijn daarmee complex als het gaat om het virulentiespectrum. Virulentie voor R1, R2, R3, R4, R7, R10 & R11 komt in bijna alle isolaten voor. Meestal is er daarnaast ook nog virulentie voor andere R-genen. Virulenties blijven in de populatie, ondanks dat ze niet noodzakelijk zijn voor infectie van bepaalde genotypen. Dit wijst erop dat virulentie in dit geval niet gepaard gaat met verlies aan fitness van het pathogeen. Indien virulentie voor resistentiegenen in de P. infestans populatie aanwezig is mag verwacht worden dat na introductie van het resistentiegen in een genotype, aanwezige virulentie snel door de populatie verspreidt zal worden. Bij de introductie van resistentiegenen in aardappelrassen zal nadrukkelijk rekening gehouden moeten worden met aanwezigheid van virulentie in de P. infestans populatie, om snelle erosie van de resistentie te voorkomen. Resistentiegenen waarvoor nog geen virulentie in de Nederlandse P. infestans populatie gevonden is kunnen mogelijk bijdragen aan duurzame beheersing van de aardappelziekte. Monitoring van P. infestans populatie op compatibiliteit met wilde verwanten is nodig om vroegtijdig inzicht te krijgen in het virulentiespectrum aanwezig in de populatie. Hierop moet een verantwoorde inzet van deze nieuwe resistentiegenen in een integrale beheersingsstrategie worden gebaseerd.

10 4

11 5 1. Inleiding In de aardappelteelt wordt waardplantresistentie gezien als het belangrijkste en meest perspectiefvolle alternatief voor of aanvulling op het gebruik van fungiciden voor de beheersing van de aardappelziekte. Veelal berust resistentie tegen P. infestans in aardappel op 1 gen. Het adaptief vermogen van Phytophthora infestans maakt echter dat niet alle resistentiegenen (R-genen) een stabiele en langdurige bescherming bieden tegen het pathogeen (Turkensteen, 1993; Flier et al., 2003a). Introductie van een ras met een nieuw resistentiegen leidt tot selectie voor virulentie in de P. infestans populatie en een geheel of gedeeltelijk verlies van de betreffende resistentie (Van der Plank, 1971; Turkensteen, 1993). Naast de 11 reeds bekende R-genen afkomstig uit S. demissum (Black et al., 1953; Malcolmson & Black, 1966) zijn door veredelingsbedrijven een aantal andere genen in een aardappelachtergrond geïntroduceerd. Voor de 11 bekende R-genen is virulentie in de Nederlandse P. infestans populatie aanwezig. Wel kan een rest-effect van het doorbroken resistentiegen in het ras met het betreffende R-gen aanwezig blijven, maar dat is vaak klein in vergelijking tot het effect van een niet doorbroken resistentie gen of veld-resistentie (Stewart et al., 2003). Adaptatie van P. infestans voor kwantitatieve resistentie is aanwezig (Turkensteen, 1993), maar wordt van weinig belang geacht (James & Fry, 1983; Inglis et al., 1996; Forbes et al., 2005) in een situatie waarbij de P. infestans populatie klonaal is (Flier et al., 2003a). Adaptatie van isolaten voor kwantitatieve resistentie komt waarschijnlijk vaker voor in gebieden waar seksuele reproductie van P. infestans optreedt dan in gebieden waarin het pathogeen zich klonaal vermeerderd (Flier et al., 2003a), zoals in Nederland het geval is (Drenth et al., 1994). In Nederland is P. infestans aangetroffen op S. nigrum, S. dulcamara en S. sisymbriifolium, wat aangeeft dat een uitbreiding van de waardplantenreeks onder Nederlandse omstandigheden mogelijk is. Waarschijnlijk werd dit mogelijk door grote genetische diversiteit in de Nederlandse P. infestans populatie (Flier et al., 2003b). Dit geeft aan dat introductie van nieuwe resistentiegenen in rassen bloot staat aan potentiële adaptatie door het pathogeen. Mogelijk is al virulentie voor deze resistentiegenen in de populatie aanwezig vóór grootschalige introductie. Voor een verantwoorde inzet van deze nieuwe resistentiegenen in een integrale beheersingsstrategie is het van groot belang om de virulentiedynamiek van veldpopulaties P. infestans te monitoren. De doelstelling van het onderzoek is tweeledig. Door het verzamelen van isolaten op genotypen met verschillende (nieuwe) resistentiegenen wordt inzicht verkregen voor welke resistentiegenen al virulentie aanwezig is in de Nederlandse P. infestans populatie. De verkregen P. infestans isolaten worden gekarakteriseerd en toegevoegd aan de isolaten collectie van Plant Research International. Voor veredelingsbedrijven en onderzoek komt op deze manier een goed gekarakteriseerde isolatencollectie (met bijv. isolaten met zeldzame virulenties en/of fungicide resistenties) beschikbaar. Het onderzoek werd gefinancierd door het Ministerie van Landbouw, Natuur & Voedselkwaliteit.

12 6

13 7 2. Materiaal en methoden Vangveldjes 2004 en 2005 Op drie locaties van Praktijkonderzoek Plant & Omgeving werden vangveldjes aangelegd (Figuur 1). Het betreft PPO Proefbedrijf Vredepeel, PPO Proefbedrijf t Kompas in Valthermond en PPO-AGV in Lelystad. De door de kweekbedrijven aangeleverde genotypen inclusief de R-genenset (Black et al., 1953) werd in mei 2004 en mei 2005 gepoot (Tabel 1). Per genotype werden 6 planten gepoot. Rondom het proefveld met de genotypen werden randrijen gepoot met een redelijk resistent ras zoals Remarka (2004), Aziza (Lelystad 2005) en Seresta (Vredepeel & Valthermond 2005). Bruto rand rijen (4 à 5 planten) met Aziza Bruto rand rijen (2 stuk) met Aziza 6 plant plotjes van de diverse genotypen Bruto rand rijen (2 stuk) met Aziza Bruto rand rijen (4 à 5 planten) met Aziza < 1,5 m>< 11,25 m >< 1,5 m > Figuur 1. Schematische weergave van het vangveldje, zoals gelegen in Lelystad Per locatie werd globaal voor dezelfde opzet gekozen. De proefveldjes werden niet met fungiciden behandeld tegen infectie door P. infestans. Wekelijks werden de planten beoordeeld op de aanwezigheid van de aardappelziekte. Aangetaste blaadjes werden verzameld en hieruit werd P. infestans geïsoleerd. Per aardappel-genotype per locatie per jaar werden vier isolatie pogingen gedaan. Per locatie per genotype werden 2 isolaten met het laagste volgnummer aangehouden. De isolaten van aangetast bladmateriaal die het eerst in de tijd werden verzameld zijn zo aangehouden. Deze isolaten werden vervolgens opgeslagen in vloeibare stikstof ter aanvulling van de P. infestans collectie van Plant Research International. Een representatief aantal isolaten per locatie per jaar werd gekarakteriseerd m.b.v. AFLP-fingerprinting, bepaling van paringstypen en het virulentiespectrum.

14 8 Tabel 1. Genotypen die in vangveldjes aangelegd werden op PPO proefbedrijf locaties in Lelystad, Valthermond en Vredepeel Biogold a Biogold HZPC-02 HZPC-02 HZPC-04 HZPC-04 HZPC-05 HZPC-05 KA KA CMK-MCD1 CMK-MCD1 AM AM R 0 R 0 R 1 Black 1085 (6) R 1 Black 1085 (6) R 2 Black 1512c (16) R 2 Black 1512c (16) R 3 Black 1253a (12) R 3 Black 1253a (12) R 4 Black 1506b R 4 Black 1506b R 5 Black R 5 Black R 6 Black XD2-21 R 6 Black XD2-21 R 7 Black 2182 ef R 7 Black 2182 ef R 8 Black 2424 a(5) R 8 Black 2424 a(5) R 9 Black 2573 (2) b R 9 Black 2573 (2) b R 10 Black 3618 ad (1) R 10 Black 3618 ad (1) R 11 Black 5008 ab (6) R 11 Black 5008 ab (6) Spirit VR Axona Mira KA-0001 KA-0002 a Rassen en selecties worden in dit rapport verder aangeduid als genotypen. b R-gen differential R9 heeft ook de resistentiegenen R1, R2 en R3 (Malcomson & Black, 1966). Paringstype Voor 2004 is van 103 isolaten en voor 2005 is van 126 isolaten het paringstype vastgesteld. Het te testen isolaat wordt tegenover een bekend A1 (IPO98014) en een bekend A2 isolaat (IPO655-2A) op erwtenagar aangeënt. De vorming van oösporen wordt microscopisch gecontroleerd voor beide combinaties. Aan de hand van oösporenvorming bij één van de beide combinaties werd vastgesteld wat het paringstype van het te toetsen isolaat was. Oösporenvorming in beide combinaties wijst op een zelf-fertiel isolaat. Amplified Fragment Length Polymorfism (AFLP) AFLP is een DNA fingerprinting techniek, waarmee verschillen in het genomisch DNA worden aangetoond (Vos et al., 1995). Isolaten worden vanaf aardappelschijf op agar gezet. Vervolgens worden zuivere isolaten in vloeibaar erwtenmedium geënt. Na 2 weken incubatie bij 20 C werd het mycelium gevriesdroogd. Van ongeveer 10 mg gevriesdroogd mycelium werd met de PureGene DNA isolatie methode, DNA geïsoleerd. Met dit DNA werd de AFLP uitgevoerd door het DNA met resistrictie-enzymen te knippen en daarna te amplificeren m.b.v. primercombinatie E21/M16.

15 9 Van de isolaten uit 2004 zijn 52 isolaten en uit 2005 zijn 62 isolaten gekarakteriseerd. Aan de hand van AFLPanalyse is een een-nullentabel gemaakt. De aan- of afwezigheid van bandjes op een vaste plaats in de gel (Bijlagen I t/m V) werd respectievelijk aangeduid met een 1 of een 0 (Vos et al., 1995; Abu El-Samen et al., 2003). Voor 78 loci werd zo een waarde toegekend. Aan de een-nullentabel werd per isolaat het paringstype toegevoegd als extra kenmerk voor onderscheidbaarheid van de isolaten. Met deze gezamenlijke gegevens werden dendrogrammen gemaakt en werden verdere analyses uitgevoerd. Dendrogrammen geven een visueel inzicht in de verwantschap tussen isolaten. De dendrogrammen werden berekent volgens Nei & Li (1979) of Link et al. (1994) met behulp van het computerprogramma TREECON versie 1.3b (Van de Peer, Universiteit van Konstanz, Duitsland). Analyse op populatieniveau werd uitgevoerd met Tools For Population Genetic Analysis (TFPGA) versie 1.3 (Miller, Northern Arizona University, VS, 2001). Genetische afstanden werden berekend volgens Nei (1972; 1978). Dendrogrammen werden gemaakt volgens de Nei unbiased minimum distance methode. De dendrogrammen geven een visueel inzicht in de verwantschap tussen de verschillende populaties en tussen de verschillende isolaten (Hall, 2001). Virulentie test Op grond van polymorfisme (AFLP) werd een keuze gemaakt voor een sub set van isolaten t.b.v. de virulentiebepalingen. Hierbij werd gekozen voor isolaten die op AFLP-niveau van elkaar verschilden. Isolaten met een identiek AFLP-patroon werden verondersteld een sterke verwantschap te bezitten. Aangenomen werd dat die verwantschap er ook was voor het virulentiespectrum. Er werd gebruik gemaakt van de R-genenset die ook door het SCRI (Schotland) wordt gebruikt (Black s differential set; Black et al., 1953; Malcomson & Black, 1966). De R-genenset bestaat uit 12 verschillende genotypen R0, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10 en R11. De R-genenset werd in de kas opgekweekt. Bladmateriaal van planten van 6 tot 8 weken oud werd gebruikt in de virulentietoetsen. Virulentietoetsen werden uitgevoerd als een herhaald experiment. In totaal werden 67 P. infestans isolaten getoetst, 34 isolaten verzameld in 2004 en 33 in Ieder isolaat werd op twee blaadjes van de desbetreffende R-gen-plant getest in een detached leaf assay. Daartoe werden de blaadjes op een laagje wateragar in een Petrischaal gelegd. Blaadjes werden geïnoculeerd door een sporangiën suspensie ( sporangia/ml ) over het blad te vernevelen. Na inoculatie werden de blaadjes geïncubeerd in een klimaatkamer bij 15 C en 16 uur licht, zoals beschreven door Flier en anderen (2003a). Eén week na inoculatie werd de aantasting beoordeeld. Onder de lichtmicroscoop werd vastgesteld of er sporulatie door P. infestans optrad. Compatibiliteit tussen isolaat en genotype werd verondersteld als tenminste 5% van het blad aangetast werd en sporulatie door het pathogeen kon worden waargenomen. In 2004 is een beperkte set van isolaten getoetst op R8, vanwege gebrekkige groei van het plantmateriaal. Aantasting op R8 is daarnaast vaak moeilijk te scoren en duplo s willen nog wel eens verschillen in compatibiliteit. Aangenomen werd dat als één van de beide toetsen een positief resultaat opleverde er sprake was van compatibiliteit. Statistische analyse Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van Genstat versie 9. De random verdeling van virulentiefactoren over paringstypen werd getoetst met de genstat procedure BNTEST. Verschillen in tijdstippen van eerste infectie van de verschillende genotypen werd getoets met de REML procedure van Genstat.

16 10

17 11 3. Resultaten In 2004 werden 112 P. infestans isolaten verzameld en in 2005 waren dat er 141. De meeste isolaten werden verzameld op de locatie Vredepeel. De isolaten werden toegevoegd aan de isolaten collectie van Plant Research International. AFLP-analyse De verzamelde P. infestans isolaten werden genetisch gekarakteriseerd op basis van het paringstype en 78 loci. Bijlagen I t/m V geven de AFLP-patronen van de P. infestans isolaten in de verschillende jaren en op de verschillende locaties. In bijlage I is duidelijk te zien dat AFLP-patronen van de isolaten uit Vredepeel verschillen vertonen. AFLPpatronen van isolaten uit Valthermond komen met elkaar overeen, hetgeen aangeeft dat de populatie in dit proefveld klonaal was. Bijlage II laat zien dat P. infestans isolaten verzameld in Lelystad 2004 een identiek AFLP-patroon hebben. In Vredepeel 2005 (bijlage IV) en Lelystad 2005 (bijlage IV & V) waren de meeste P. infestans isolaten identiek op AFLP-niveau. Een enkel isolaat per locatie week af van het dominante type. In Valthermond (Bijlage V) was een grote mate van variatie tussen de isolaten te vinden. In Tabel 2 is de mate van polymorfie binnen de 6 bemonsterde P. infestans populaties weergegeven in termen van heterozygotie en het aantal polymorfe loci. Voor maximaal 23 van de 79 loci (inclusief paringstype) werd polymorfie in de populatie gevonden. Dat wil zeggen dat de waargenomen verschillen tussen isolaten maximaal gebaseerd is op 30% van de waargenomen loci. Voor minimaal de overige 70% loci waren de isolaten uit een lokale populatie identiek. Populatie 1 en 3 lieten geen variatie zien in AFLP-patronen en paringstype. De meeste genetische variatie werd gevonden in populatie 6. Voor de getoetste P. infestans isolaten uit 2004 en 2005 over de 3 locaties was er in totaal voor 33 loci polymorfie. In 2005 was de mate van heterozygotie en het aantal polymorfe loci groter dan in In 2005 werd over een langere periode verzameld dan in Tabel 2. Analyse genetische diversiteit binnen de 6 P. infestans populaties gemonsterd in 2004 & Jaar Locatie Periode waarover de isolaten verzameld zijn Populatie Aantal isolaten Gemiddelde mate van heterozygotie # polymorfe loci % polymorfe loci 2004 Lelystad 9-20 juli Vredepeel 1-26 juli Valthermond juli Lelystad juli Vredepeel 15 juli-18 aug Valthermond 14 juli-26 aug Alle 1,2, Alle 4,5, Tabel 3 geeft de matrix voor paarsgewijze verschillen in genetische diversiteit van de P. infestans populaties, zoals bemonsterd in 2004 en Hieruit kan worden afgeleid in hoeverre P. infestans isolaten uit de 6 verschillende populaties genetisch op elkaar lijken of juist van elkaar verschillen. In 2004 waren de P. infestans proefveldpopulaties in Vredepeel en Valthermond op AFLP-niveau niet van elkaar te onderscheiden. In 2005 was de P. infestans proefveldpopulatie in Lelystad vergelijkbaar met die van Vredepeel. De P. infestans populatie verzameld in Valthermond 2004 vertoonde enige verwantschap met de populatie in Lelystad en Vredepeel in 2005.

18 12 Tabel 3. Analyse van paarsgewijze verschillen voor de genetische diversiteit tussen populaties gemonsterd in 2004 & P-waarde voor onderscheidbaarheid is gebaseerd op de exacte test voor populatie differentiatie van Raymond & Rousset (1995). jaar Locatie Populatie Lelystad Vredepeel Valthermond Lelystad Vredepeel Valthermond 2004 Lelystad Vredepeel a Valthermond Lelystad Vredepeel Valthermond a Populaties zijn significant verschillend als de P-waarde kleiner is dan P=0.05. De genetische afstand tussen de 6 P. infestans proefveld-populaties is weergegeven in Figuur 2. Populaties 4 (Lelystad, 2005) en 5 (Vredepeel, 2005) zijn nauwelijks van elkaar te onderscheiden op AFLP-niveau. De P. infestans populatie zoals bemonsterd in Valthermond in 2005 is wel onderscheidbaar van de populaties 4 & 5. In 2004 waren populatie 2 & 3 niet onderscheidbaar en week de P. infestans populatie in Lelystad af. Genetische afstand Lelystad 2004 Vredepeel 2005 Valthermond 2005 Vredepeel 2004 Valthermond 2004 Lelystad 2004 Figuur 2. Dendrogram van de P. infestans populaties, voor jaren en locaties. Figuren 3a en 3b geven dendrogrammen voor de verschillende P. infestans isolaten afkomstig van de verschillende genotypen en locaties per jaar. De isolaten clusteren grotendeels per locaties bij elkaar. Figuren 3c en 3d geven de dendrogrammen van de P. infestans populaties voor respectievelijk de genotypen met nieuwe resistentiegenen en de R-gen differential set.

19 Figuur 3a. Dendrogram van P. infestans isolaten verzameld in 2004, naar Nei & Li (1979). De verwantschap tussen isolaten wordt uitgedrukt in genetische afstand. Groepen die bij elkaar clusteren worden als genetisch verwant beschouwt. De getallen geven het percentage waarmee een bepaalde AFLP-groep wordt ondersteund.

20 14 Figuur 3b. Dendrogram van P. infestans isolaten verzameld in 2005, naar Nei & Li (1979). Voor een verdere verklaring zie Figuur 3a.

21 15 Figuur 3c. Dendrogram van P. infestans isolaten volgens Nei & Li (1979), verzameld in 2004 en 2005 op genotypen beschikbaar gesteld door de veredelingsbedrijven. Voor een beschrijving per jaar zie Figuren 3a en 3b. Voor een verdere verklaring zie Figuur 3a.

22 16 Figuur 3d. Dendrogram van P. infestans isolaten volgens Nei & Li (1979), verzameld in 2004 en 2005 op de R-gen differential set. Voor een beschrijving per jaar zie Figuren 3a en 3b. Voor een verdere verklaring zie Figuur 3a.

23 17 Paringstype Tabel 4 geeft een overzicht van het aantal isolaten behorend tot één van de beide paringstypen die in de P. infestans proefveldpopulatie voorkwamen op de drie locaties. In 2004 domineerde een van de beide paringstypen op de verschillende locaties. In 2005 was de P. infestans populatie heterogener. Zelffertiele isolaten werden niet aangetroffen in de geteste isolaten. Tabel 4. Aantal isolaten met paringstype A1 of A2 uitgesplitst over jaren en locaties. Tevens staat vermeld het percentage isolaten met paringstype A2. De frequentie van paringstype A1 is complementair aan die van A2. Jaar Paringstype Lelystad Vredepeel Valthermond Lelystad Vredepeel Valthermond A A % A Niet alle genotypen werden elk jaar op elke locatie geïnfecteerd door P. infestans (Tabel 5). Echter, geen van de genotypen bleef op alle locaties en in beide jaren vrij van aantasting door P. infestans. Dit betekent dat er voor elk resistentiegen virulentie in de P. infestans populatie, tenminste op één van de drie locatie in tenminste één van de twee jaren, aanwezig was.

24 18 Tabel 5. De genotypes op de drie locaties die geïnfecteerd zijn met P.infestans met de bijbehorende paringstypes. Genotype Vredepeel Lelystad Valthermond Biogold A2 A2 A1 A2 A2 * HZPC-02 A2 * * * A2 * HZPC-04 A2 A2 * * A2 * HZPC-05 A2 A2 A1 A2 A2 A1 & A2 KA A2 A2 * * A2 * CMK-MCD1 A2 A2 * A2 A2 A1 AM A2 A2 A1 A2 A2 A1 & A2 R 0 A2 A2 A1 A2 * A1 R 1 A2 A2 A1 A2 A2 A1 R 2 A2 A2 A1 A2 A2 A2 R 3 A2 A2 A1 A2 A2 A1 R 4 A2 A2 A1 A2 A2 A1 R 5 A2 A2 * A2 A2 A2 R 6 A2 A2 A1 A2 A2 A1 & A2 R 7 A2 A2 A1 A2 A2 A1 R 8 A2 A1 * * * A1 R 9 A2 A1 A1 * * * R 10 A2 A2 A1 A1 A2 A1 R 11 A1 & A2 A2 A1 A2 A2 A1 Spirit - A2 - A2 - A1 VR A2 - A2 - A2 Axona - A2 - A2 - A2 Mira - A2 - * - * KA A2 - A2 - A2 KA A2 - A2 - A2 - Genotype op die locatie in 2004 niet aangeplant in de proef * geen P.infestans infectie waargenomen Op elk van de locaties en in beide jaren werden de isolaten gedomineerd door een van de twee paringstypes. Alleen in Valthermond 2005 kwamen beide paringstypes in ongeveer even grote aantallen voor. De meeste virulentie-factoren kwamen even vaak voor in isolaten van beide paringstypen (Tabel 6). Virulentie voor R5 en R6 werd significant vaker gevonden bij isolaten met paringstype A2 dan met paringstype A1.

25 19 Tabel 6. Aantal P. infestans isolaten en het percentage dat een bijbehorende virulentiefactor in het isolaat aanwezig was, uitgesplitst naar paringstype. Paringstype Aantal isolaten Frequentie (%) waarmee virulentiefactoren in de P. infestans populatie aanwezig waren R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 R8 R9 R10 R11 A A Significantie - a < a - geen significant verschil Virulentie Het virulentie patroon van de isolaten werd getoetst met een detached leaf test op R-gen differentials (Tabel 7). De meeste isolaten waren complex, met gemiddeld 8 tot 10 virulenties per isolaat (Tabellen 7 en 8). Tabel 7. Virulentie spectrum van P. infestans isolaten verzameld in Lelystad, Valthermond en Vredepeel in 2004 en Locatie Verzameldatum Isolaat Genotypen AFLP-groep Nei & Li (1979) Virulentie (race) Valthermond NL AM I 1,2,3,4,5,6,7,* a,10,11 Lelystad NL AM VII 1,2,3,4,6,7,8,9,10,11 Vredepeel NL AM I 1,2,3,4,5,6,7,10,11 Lelystad NL AM I 1,2,3,4,5,6,7,10,11 Valthermond NL AM XII 1,2,3,4,7,10,11, Vredepeel NL Axona 05-I 1,2,3,4,(5) b,6,7,(8),10,11 Valthermond NL Axona 05-I 1,2,3,4,5,6,7,10,11 Valthermond NL Biogold 04-I 1,2,3,4,5,6,7,10,11 Vredepeel NL Biogold 04-I 1,2,3,4,5,6,7,8,10,11 Lelystad NL Biogold 04-VII 1,2,3,4,6,7,8,10,11 Vredepeel NL Biogold 05-I 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 Valthermond NL Biogold 05-X 1,2,3,4,5,6,7,10,11 Valthermond NL CMK MCD1 04-I 1,2,3,4,5,6,7,10,11 Vredepeel NL CMK MCD1 04-I 1,2,3,4,5,6,7,8,10,11 Vredepeel NL CMK-MCD1 05-I 1,2,3,4,5,6,7,10,11 Valthermond NL CMK-MCD1 05-IX 1,2,3,4,(6),7,10,11 Lelystad NL CMK-MCD1 05-I 1,2,3,4,5,6,7,10,11 Valthermond NL HZPC I 1,2,3,4,5,6,7,8,10,11 Vredepeel NL HZPC I 1,2,3,4,5,6,7,8,10,11 Valthermond NL HZPC I 1,2,3,4,6,7,8,11 Vredepeel NL HZPC I 1,2,3,4,5,6,7,8,10,11 Lelystad NL HZPC VII 1,2,3,4,6,7,8,(9),10,11 Vredepeel NL HZPC-05? c 1,2,3,4,5,6,7,8,10,11 Valthermond NL HZPC I 1,2,3,4,5,6,7,9,10,11 Vredepeel NL HZPC I 1,2,3,4,5,6,7,(8),(9),10,11 Lelystad NL HZPC I 1,2,3,4,5,6,7,(8),9,10,11

26 20 Locatie Verzameldatum Isolaat Genotypen AFLP-groep Nei & Li (1979) Virulentie (race) Valthermond NL HZPC XIV 1,2,3,4,5,6,7,10,11 Valthermond NL KA I 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 Vredepeel NL KA I 1,2,3,4,5,6,7,(9),10,11 Vredepeel NL KA I 1,2,3,4,5,6,7,9,10,11 Vredepeel NL KA I 1,2,3,4,5,6,7,10,11 Valthermond NL KA X 1,2,3,4,6,7,10,11 Vredepeel NL KA I 1,2,3,4,5,6,7,10,11 Vredepeel NL Mira 05-I 1,2,3,4,5,6,7,10,11 Vredepeel NL Spirit 05-I 1,2,3,4,5,6,7,(8),9,10,11 Lelystad NL Spirit 05-V 1,2,3,4,7,10,11 Valthermond NL Spirit 05-VIII 1,2,3,4,7,10,11 Vredepeel NL VR I 1,2,3,4,5,6,7,(8),9,10,11 Valthermond NL VR X 1,2,3,4,5,6,7,10,11 Vredepeel NL R0 04-V 1,3,4,7,(11) b Vredepeel NL R0 05-I 1,2,3,4,5,6,7,(8),10,11 Vredepeel NL R1 04-V 1,2,3,4,7 Lelystad NL R1 04-VII 1,2,3,4,6,7,* a,10,11 Valthermond NL R1 04-I 1,2,3,4,5,6,7,10,11 Valthermond NL R1 05-XI 1,2,3,4,7,10,11 Vredepeel NL R2 04-III (1),(2),(3),(4),(5),6,(7),8,(10),11 Lelystad NL R2 04-VII 1,2,3,4,6,7,8,10,11 Vredepeel NL R3? c 1,2,3,4,5,6,7,8,10,11 Valthermond NL R3 04-I 1,(2),3,4,6,7,11 Valthermond NL R3 05-IX 1,2,3,4,6,7,10,11 Lelystad NL R4 04-VII 1,2,3,4,6,7,8,10,11 Vredepeel NL R4 05-I 1,2,3,4,5,6,7,10,11 Valthermond NL R4 05-XIII 1,2,3,4,7,10,11 Vredepeel NL R5 04-VI 1,2,3,4,5,6,7,8,10,11 Vredepeel NL R6 04-VI 1,2,3,4,5,6,7,8,10,11 Lelystad NL R6 04-VII 1,2,3,4,6,7,(8),10,11 Vredepeel NL R7? 1,2,3,4,5,6,7,8,10,11 Vredepeel NL R8 04-VI 1,2,3,4,5,6,7,8,10,11 Valthermond NL R8 05-III 1,2,3,4,7,8,10,11 Vredepeel NL R8 05-VI 1,2,3,4,(5),6,7,8,9,10,11 Lelystad NL R9 04-VII 1,2,3,4,6,7,8,9,10,11 Vredepeel NL R9 05-VI 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 Vredepeel NL R10 04-VI 1,2,3,4,5,6,7,*,9,10,11 Lelystad NL R10 04-VII 1,2,3,4,6,7,10,11 Vredepeel NL R11 04-I 1,2,3,4,5,6,7,10,11 Vredepeel NL R11 04-II 1,(2),3,4,7,10,11 Vredepeel NL R11 05-I 1,2,3,4,5,6,7,8,10,11 Valthermond NL R11 05-IX 1,2,3,4,7,10,11 a b c * R8 uitgevallen in test, ( ) percentage bladaantasting 5%, wel sporulatie waargenomen, AFLP-fingerprinting van het isolaat is niet gelukt.

27 21 Tabel 8. Gemiddeld aantal virulentiefactoren voor R1 t/m R11 per isolaat per jaar waargenomen op de verschillende locaties. Het maximum aantal virulentiefactoren is 11. Locatie Vredepeel Lelystad Valthermond Isolaten die middels AFLP-fingerprinting vergelijkbare patronen vertoonden en daardoor na populatie genetische analyse in één en dezelfde groep werden ingedeeld hadden niet altijd hetzelfde virulentiepatroon. Isolaten uit groep 05-I bezaten gemeenschappelijke virulentie voor R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R10 en R11. Individuele isolaten uit deze groep hadden ook virulentie voor R8 en R9. Isolaten uit groep 05-IX verschilden met betrekking tot virulentie voor R6. Voor groep 05-X met betrekking tot virulentie voor R5. In groep 04-VII varieerde de compatibiliteit van de isolaten voor R8. In cluster 04-I, 04-VI en 04-VII varieerde de compatibiliteit van de isolaten voor R9. Figuur 4 geeft de frequentie waarmee virulentie voor een R-gen in de Nederlandse P. infestans AFLP-groepen uitgesplitst naar 2004 en 2005 aanwezig was. Virulentie voor R1, R2, R3, R4 en R7 komt in elke AFLP-groep voor. Virulentie voor R8, R9 en in mindere mate R6 en R5 komen minder vaak voor in de P. infestans AFLP-groepen. Figuur 5 geeft de frequentie verdeling voor virulentie gebaseerd op individuele isolaten weer. Omdat binnen populaties en AFLP-groepen meerdere isolaten dezelfde genetische achtergrond hebben wordt de frequentieverdeling voor virulentie wat scheef getrokken. In grote lijnen komt de frequentieverdeling voor virulentiefactoren op AFLP-groepsniveau overeen met die op isolaatniveau. Vangveldjes 2004 & 2005; AFLP-groepsniveau 100 Frequentie van virulentiegenen voor Rx (%) R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 R8 R9 R10 R11 Resistentiegenen Figuur 4. Frequentie van virulentiegenen in P. infestans populaties in 2004 en 2005 op AFLP-groepsniveau.

28 22 Vangveldjes 2004 & 2005; isolaatniveau Frequentie van virulentiegenen voor Rx (%) R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 R8 R9 R10 R11 Resistentiegenen Figuur 5. Frequentie van virulentiegenen in P. infestans populaties in 2004 en 2005 op isolaatniveau. In 2004 werden de isolaten verzameld tussen 1 en 26 juli. In 2005 was dat tussen 14 juli en 26 augustus. Tabel 9 geeft een overzicht van het moment waarop de eerste isolaten verzameld zijn op de verschillende genotypen gemiddeld over beide jaren. Op de meeste genotypen werden binnen één week van elkaar P. infestans lesies aangetroffen waarvan het pathogeen geïsoleerd kan worden. Op Axona, R9, HZPC-04 en R8 werden de eerste symptomen drie weken later aangetroffen dan op R0, dat de start van de epidemie markeert.

29 23 Tabel 9. Moment van bemonstering van de eerste 2 isolaten per genotype, gemiddeld over 2004 en Genotype Datum R 0 10-jul a..... R 1 11-jul a..... R 7 12-jul a..... R 3 13-jul a b.... KA jul a b c... R 2 16-jul a b c... R 4 16-jul a b c... spirit 17-jul a b c... VR jul a b c... R 6 17-jul a b c... R jul a b c... R jul a b c... Mira 18-jul a b c d.. R 5 18-jul. b c d.. AM jul. b c d.. Biogold 18-jul. b c d.. CMK MCD-1 18-jul. b c d.. KA jul. b c d.. KA jul.. c d.. HZPC jul.. c d.. VR jul.. c d e. HZPC jul... d e f Axona 31-jul.... e f R 9 3-aug.... e f HZPC-04 3-aug..... f R 8 5-aug..... f Genotypen aangeduid met verschillende letters verschillen significant van elkaar in het tijdstip van de eerste zichtbare infectie. Op de meeste genotypen beschikbaar gesteld door veredelingsbedrijven bleef de aantasting door P. infestans beperkt tot enkele lesies. In z n algemeenheid bleef de aantasting op de genotpypen meer beperkt naarmate de eerste aangetaste bladeren later verschenen.

30 24

31 25 4. Discussie en conclusies Genetische variatie In beide jaren blijken op de meeste locaties isolaten met paringstype A1 en A2 naast elkaar voor te komen. Hoewel meestal één van de beide paringstypen domineert is meiotische recombinatie in de meeste gevallen een mogelijkheid. Op basis van de AFLP-patronen en paringstype kan geconcludeerd worden dat de P. infestans proefveld-populaties in Valthermond (2004) en Lelystad (2004) van elkaar verschilden maar dat de afzonderlijke populaties op beide locaties geen genetische variatie vertoonden. De afzonderlijke populaties op deze beide locaties waren klonaal. Mogelijk zijn ze ontstaan door infectie vanuit een enkele klonale bron in de omgeving. Van daaruit heeft de epidemie zich verspreidt over de verschillende genotypen. Bovendien werden de eerste infecties op de aangetaste genotypen binnen anderhalve week van elkaar gevonden, wat er op duidt dat er een relatief sterke bron met een qua virulentie zeer complexe achtergrond aanwezig is geweest op deze beide locaties in Proefveld-populaties in Lelystad (2005) en Vredepeel (2005) vertoonden weinig genetische variaties. Grotere verschillen tussen de isolaten werden gevonden binnen de populaties van Vredepeel (2004) en Valthermond (2005). Infectie van de genotypen is in deze gevallen uit meerdere bronnen ontstaan. De periode waarover de isolaten verzameld werden, ongeveer een maand, was in deze gevallen ook langer. Isolaten bemonsterd per locatie verschilden soms niet of meestal weinig van elkaar op AFLP-niveau en qua paringstype. Dit geeft tevens aan dat er per locatie over het algemeen één dominant isolaat aanwezig was, soms vergezeld van meerdere verwante isolaten. Deze dominante isolaten waren qua virulentiespectrum complex, waardoor zij de meeste genotypen in de vangveldjes kon aantasten. De vraag is in hoeverre de subpopulaties van de drie locaties representatief zijn voor de gehele Nederlandse P. infestans populatie. De populaties bemonsterd in 2004 verschilden sterk van die in Binnen een jaar waren er in elk jaar twee subpopulaties (locaties) die sterk op elkaar leken op AFLP-niveau. Het AFLP-bandenpatroon (paringstype + 78 bandjes) is een beperkte set. Voor veel van de bandjes is geen genetische variatie gevonden in de onderzochte P. infestans populatie. Dit wil overigens niet zeggen dat isolaten met hetzelfde bandenpatroon genetisch volledig identiek zijn. Dit zou b.v. kunnen blijken uit het feit dat sommige isolaten met een identiek AFLP-patroon toch een verschillend virulentiespectrum hebben. In groep 05-I is er variatie voor virulentie voor R8 en R9. Een deel van de verklaring voor dit fenomeen is echter ook te vinden in het feit dat toetsen van virulentie op deze beide R-gen differentials vaak praktisch moeilijk is. Ook voor andere clusters bestaat er enige variatie in het virulentiespectrum, maar dit betreft steeds variatie voor 1 virulentiegen. Virulentie Van de klonen ter beschikking gesteld door de kweekbedrijven is niet altijd de genetische achtergrond bekend waarop resistentie tegen P. infestans gebaseerd is. Alle genotypen konden door P. infestans op tenminste één van de drie locaties in tenminste één jaar worden aangetast. Dit geeft aan dat in de Nederlandse P. infestans populatie virulentie aanwezig is voor alle getoetste resistenties. De meeste isolaten werden verzameld in juli waardoor verlies van resistentie door veroudering van de plant slechts een beperkte rol gespeeld kan hebben. Het moment van eerste aantasting verschilde echter wel voor de getoetste genotypen (Tabel 9). Hoewel de mate van aantasting niet kwantitatief is vastgesteld bleef de aantasting op sommige genotypen beperkt tot één of enkele lesies. Op die genotypen die al vroeg werden geïnfecteerd nam de aantasting meestal snel toe en gingen de planten volledig ten onder. Op genotypen die later werden geïnfecteerd bleef de aantasting meestal beperkt in omvang. Dit geeft aan dat er voor genoytpen in de laatste categorie wel virulentie aanwezig was, maar dat de epidemie sterk vertraagd werd. Onduidelijk is of virulentie voor deze vorm van resistentie gepaard ging met een verlaagde fitness van het

32 26 betreffende isolaat. Het kan ook zijn dat er in de genotypen een hoog niveau van rest-resistentie tegen P. infestans aanwezig is. De door de veredelingsbedrijven beschikbaar gestelde genotypen zijn slechts een deel van het materiaal dat gebruikt wordt bij de resistentieverdeling tegen P. infestans. Het verdient aanbeveling ook andere genotypen met mogelijk resistentie tegen P. infestans in het onderzoek op te nemen. Dit dient zich niet te beperken tot de cultuuraardappel, maar ook wilde verwanten die als resistentiebron kunnen dienen zouden meegenomen moeten worden. Uit het onderzoek blijkt dat isolaten met een identiek AFLP-patroon toch een verschillend virulentiespectrum kunnen hebben. Dit geeft aan dat bij toetsing op virulentie het nuttig is om ook schijnbaar identieke isolaten te toetsen op het virulentiespectrum. Virulentietoetsen zijn echter erg arbeidsintensief. Voor het behalen van goede resultaten is toetsing in het voorjaar een belangrijke voorwaarde. Dit heeft echter tot gevolg dat het virulentiespectrum van de isolaten niet tijdens het seizoen bekend wordt. Om vroegtijdig inzicht te krijgen in het virulentiespectrum blijft het vooralsnog nodig isolaten te verzamelen op vangplanten, met de te toetsen genetische achtergrond. Genotypen met een bepaalde genetische achtergrond fungeren als een natuurlijk filter en worden alleen door P. infestans geïnfecteerd als de combinatie compatibel is. De verzamelde isolaten kunnen vervolgens ter bevestiging van het virulentiepatroon getoetst worden op genotypen met verschillende resistentiegenen. De aandacht zou zich hierbij moeten richten op genotypen met nieuwe resistentiegenen. R-gen toetsing Toetsing in het laboratorium op de R-genen set laat zien dat de meeste P. infestans isolaten complex zijn, ondanks het feit dat ze geïsoleerd zijn van genotypen met één resistentiegen of een beperkt aantal resistentiegenen. Een aantal isolaten beschikt over virulentie voor alle 11 klassieke resistentiegenen. Virulentie voor R1, R2, R3, R4, R7, R10 en R11 komt vrijwel in elk isolaat voor, hetgeen het hoge basisniveau voor complexiteit van de NL P. infestans isolaten illustreert. Virulentie voor R5 en R6 leek gecorreleerd aan het paringstype. Virulentie voor R5 en R6 kwam overigens wel bij isolaten van beide paringstypen voor. Mogelijk dat de schijnbare koppeling aan paringstypen meer te maken had met de dominantie van een bepaald paringstype per locatie per jaar en het al of niet aanwezig zijn van virulentiefactoren voor R5 en R6 in die betreffende populatie. Om uitsluitsel te krijgen over dit fenomeen is bemonstering van meerdere populaties (plaats) in verschillende jaren (tijd) nodig. De isolaten zijn niet getest op genotypen met een andere genetische achtergrond voor resistentie dan R1 t/m R11. Het is onduidelijk of virulentie voor deze andere resistentiegenen veelvuldig in de populatie voorkomen. Uit de veldwaarneming kwam wel naar voren dat die virulentie voor een groot aantal nieuwe resistentiegenen er wel is. Hieruit blijkt dat P. infestans beschikt over een grote genetische variatie met betrekking tot virulentie voor resistentie uit wilde verwanten. Bij veredeling op resistentie zal hier rekening mee moeten worden gehouden. Exploitatie resistentiegenen Het is raadzaam om potentieel in te kruisen resistentiegenen (bijvoorbeeld in wilde verwanten) te toetsen tegen de Nederlandse P. infestans populatie, zodat op basis van het virulentiespectrum de meest belovende resistentiegenen benut kunnen worden. Het is daarom nodig om genotypen met een nieuwe resistentie-achtergrond tegen P. infestans op te nemen in het onderzoek. Herhaald toetsen in de tijd is nodig om de ontwikkeling van virulenties in de P. infestans populatie te kunnen volgen. Hiermee kan erosie van resistentiegenen in een vroegtijdig stadium worden herkend. Het mag verwacht worden dat introductie van genen waarvoor al virulentie in de P. infestans populatie aanwezig is geen duurzame bescherming zal bieden (Pilet et al., 2005; Montarry et al., 2006). Grootschalige introductie van zo n ras zal er toe leiden dat de selectiedruk op de P. infestans populatie groot wordt, wat kan leiden tot een snelle

33 27 adaptatie op populatieniveau aan het nieuw geïntroduceerde resistentiegen (Toxopeus, 1964). De vraag is of introductie van meerdere resistentiegenen tegen P. infestans in de cultuuraardappel een vertragend effect heeft op de adaptatie van P. infestans. Waarschijnlijk mag dat alleen verwacht worden als virulentie voor deze genen gepaard gaat met verlies aan fitness van het pathogeen. Conclusies Voor alle getoetste genotypen was op een of meerdere locaties en jaren virulentie in de P. infestans populatie aanwezig. De mate van genetische variatie in de P. infestans proefveldpopulatie verschilt per locatie en per jaar. De populatie Lelystad 2004 en Valthermond 2004 waren op AFLP-niveau klonaal. Een jaar later was de populatie in Valthermond zeer heterogeen. In beide jaren en op de meeste locaties komen beide paringstypen (A1 & A2) naast elkaar voor in de populatie en vormen daarmee een basis voor genetische recombinatie. Hoewel isolaten genetisch identiek kunnen zijn op AFLP-niveau komen verschillen in virulentiespectrum voor. Proeftechnische complicaties m.b.t. de betrouwbaarheid waarmee enkele R-gen differentials bepaald kunnen worden spelen hier mofgelijk een rol. Om inzicht te krijgen in het virulentiespectrum blijft toetsing op genotypen met verschillende genetische achtergrond noodzakelijk. Uitbreiding van het onderzoek met genotypen met nieuwe resistentiegenen, inclusief wilde verwanten is raadzaam. P. infestans isolaten hebben meestal 8 tot 10 virulentiefactoren en zijn daarmee complex als het gaat om het virulentiespectrum. Virulentie voor R1, R2, R3, R4, R7, R10 & R11 komt in bijna alle isolaten voor. Meestal is er daarnaast ook nog virulentie voor andere R-genen. Virulenties blijven in de populatie, ondanks dat ze niet noodzakelijk zijn voor infectie van bepaalde genotypen. Dit wijst erop dat virulentie in dit geval niet gepaard gaat met verlies aan fitness van het pathogeen. Indien virulentie voor resistentiegenen in de P. infestans populatie aanwezig is mag verwacht worden dat na introductie van het resistentiegen in een genotype aanwezige virulentie snel door de populatie verspreidt zal worden. Bij de introductie van resistentiegenen in aardappelrassen zal nadrukkelijk rekening gehouden moeten worden met aanwezigheid van virulentie in de P. infestans populatie, om snelle erosie van de resistentie te voorkomen. Resistentiegenen waarvoor nog geen virulentie in de Nederlandse P. infestans populatie gevonden is kunnen mogelijk bijdragen aan duurzame beheersing van de aardappelziekte. Monitoring van P. infestans populatie op compatibiliteit met wilde verwanten is nodig om vroegtijdig inzicht te krijgen in het virulentiespectrum aanwezig in de populatie. Hierop moet een verantwoorde inzet van deze nieuwe resistentiegenen in een integrale beheersingsstrategie worden gebaseerd.

34 28

35 29 5. Literatuur Abu-El Samen, F.M., G.A. Secor & A.C. Gudmestad, Genetic variation among asexual progeny of Phytophthora infestans detected with RAPD and AFLP markers. Plant Pathology 52: Black, W., C. Mastenbroek, W.R. Mills & L.C. Petersen, A proposal for an international noemnclature of races of Phytophthora infestans and of genes controlling immunity in Solanum demissum derivates. Euphytica 2: Caten, C.E., Intra-racial variation in Phytophthora infestans and adaptation to field resistance for potato late blight. Annals of Applied Biology 77: Drenth, A., I.C.Q. Tas & F. Govers, DNA fingerprinting uncovers a new sexually reproducing population of Phytophthora infestans in the Netherlands. European Journal of Phytopathology 101: Flier, W.G., G.B.M. van den Bosch & L.J. Turkensteen, 2003a. Stability of partial resistance in potato cultivars exposed to aggressive strains of Phyophthora infestans. Plant pathology 52: Flier, W.G., G.B.M. van den Bosch & L.J. Turkensteen, 2003b. Epidemiological importance of Solanum sisymbriifolium, S. nigrum and S. dulcamara as alternative hosts for Phytophthora infestans Plant pathology 52: Forbes, G.A., M.G. Chacón, H.G. Kirk, M.A. Huarte, M. van Damme, S. Distel, G.R. Mackay, H.E. Stewart, R. Lowe, J.M. Duncan, H.S. Mayton, W.E. Fry, D. Andrivon, D. Ellissèche, R. Pellé, H.W. Platt, G. MacKenzie, T.R. Tarn, L.T. Colon, D.J. Budding, H. Lozoya-Saldaña, A. Hernandez-Vilchis & S. Capezio, Stability of resistance to Phytophthora infestans in potato: an international evaluation. Plant Pathology 54: Hall, B.G., Phylogenetic trees made easy. A how-to manual for molecular biologists. Sinauer Associates Inc. Sunderland MA, USA 179 p. Inglis, D.A., D.A. Johnson, D.E. Legard, W.E. Fry & P.B. Hamm, Relative resistances of potato clones in response to new and old populations of P. infestans. Plant Disease 80: James, R.V. & W.E. Fry, Potential for Phytophthora infestans populations to adapt to potato cultivars with rate-reducing resistance. Phytopathology 73: Malcolmson, J.F. & W. Black, New R-genes in Solanum demissum Lindl. and their complementary races of Phytophthora infestans (Mont.) de Bary. Euphytica 15: Montarry, J., R. Corbiere, S. Lesueur, I. Glais & D. Andrivon, Does selection by resistant hosts trigger local adaptation in plant-pathogen systems? Journal of Evolutionary Biology 19: Nei, M., Estimation of average heterozygosity and genetic distance from a small number of individuals. Genetics 89(3): Nei, M., Genetic distances between populations. American naturalist 106: Nei, M. & W.H. Li, Mathematical model for studying genetic variationb ion terms of restriction endonucleases. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 76: Pilet, F., R. Pellé, D. Ellissèche & D. Andrivon, Efficacy of the R2 resistance gene as a component for the durable management of potato late blight in France. Plant pathology 54: