Causes and consequences of cholestasis Sturm, Ekkehard

Transcriptie

1 Causes and consequences of cholestasis Sturm, Ekkehard IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below. Document Version Publisher's PDF, also known as Version of record Publication date: 2003 Link to publication in University of Groningen/UMCG research database Citation for published version (APA): Sturm, E. (2003). Causes and consequences of cholestasis: nonparenchymal cells and nuclear receptors as regulators of hepatic gene expression in cholestatic liver disease Groningen: s.n. Copyright Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons). Take-down policy If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim. Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum. Download date:

2 Samenvatting 143

3 Galvorming is een belangrijke functie van de lever, welke verstoord is bij cholestase. De secretie van gal is afhankelijk van de structurele en functionele integriteit van transportsystemen in levercellen (hepatocyten) en galgangcellen (cholangiocyten). De gepolariseerde hepatocyt heeft zeer gespecialiseerde transportsystemen op de basolaterale (sinusoïdale) en de canaliculaire (apicale) membraan. Vectorieel transport van galzouten uit het bloedcompartiment naar de gal is van groot belang voor zowel galvorming als ook voor het in stand houden van de enterohepatische circulatie van galzouten. Twee gespecialiseerde transporteiwitten reguleren de galzoutopname en - secretie in de hepatocyt: Ntcp op de basolaterale membraan is verantwoordelijk voor opname en BSEP op de apicale membraan is de belangrijkste transporter voor uitscheiding van galzouten in de gal. Gestoord galzouttransport kan ontstaan ten gevolge van infecties en sepsis of blootstelling aan geneesmiddelen, maar ook bij auto-immuun, metabole of genetische aandoeningen. Het onderzoek beschreven in dit proefschrift beoogt de componenten te karakteriseren die verantwoordelijk zijn voor het ontstaan van cholestase tijdens sepsis en voor adaptatie in de levercel als reactie op accumulatie van galcomponenten zoals optreedt tijdens cholestase. Hoofdstuk 1 verschaft een overzicht van de nu bekende transportsystemen in de hepatocyt en van de belangrijkste mechanismes van adaptatie aan verstoorde galvorming via nucleaire receptoren en signaaltransductie routes. Gedetailleerde informatie wordt gegeven over de achtergrond en de oorzaken van genetische vormen van cholestase, inclusief een beknopt overzicht van diagnostische en therapeutische benaderingen. Progressieve familiaire intrahepatische cholestase (PFIC) en benigne recidiverende intrahepatische cholestase (BRIC) vormen een groep van vier verschillende ziekten, waarbij elk van deze vier toegeschreven kan worden aan mutaties in een specifiek transporteiwit. Genmutaties van transporteiwitten kunnen ook een rol spelen bij polygenetische aandoeningen, zoals intrahepatische cholestase van zwangerschap en bij de vorming van galstenen. Hoofdstuk 2 beoogt de cellulaire componenten te identificeren die betrokken zijn bij het optreden van cholestase ten gevolge van endotoxinemie. Endotoxinemie is het aanwezig zijn in het bloed van endotoxinen en is een belangrijke component in de pathofysiologie van een sepsis ten gevolge van zogenaamd gram-negatieve bacteriën. Uitgaande van de veronderstelling dat geactiveerde macrofagen in de lever een rol spelen in de cascade tussen de blootstelling aan endotoxinen (LPS) en het ontstaan van cholestase, is een in vitro model ontwikkeld waarin een macrofaag cellijn werd blootgesteld aan LPS. Geïsoleerd medium van deze cellen bleek grote hoeveelheden van de zogenaamde proinflammatoire cytokinen te bevatten, zoals TNFa, IL-1ß and Il-6. Als de hepatocyt cellijn WIF-B werd blootgesteld aan dit geconditioneerde medium werd de galzoutopname sterk geremd, in vergelijking met 144

4 na blootstelling aan de LPS, waarna het eveneens weer snel afnam tot een ondetecteerbaar niveau. De stimulering van PAF-AH activiteit in de gal als reaktie op blootstelling aan LPS zou kunnen bijdragen aan het voorkomen van beschadiging van galwegen en darm ten gevolge van ontsteking. De hogere activiteit van PAF-AH en LCAT in plasma zou kunnen dienen om overmatig PAF en geoxideerde fosfolipiden in de circulatie te elimineren. De homeostase van galzouten in de lever wordt gereguleerd via negatieve terugkoppeling op expressie van genen betrokken bij de opname en synthese van galzouten. Galzouten blijken zelf goed te kunnen binden aan de nucleaire receptor FXR, hetgeen hen in staat stelt om de expressie van het snelheidsbepalende enzym van de galzoutsynthese, cholesterol 7a-hydroxylase (CYP7A1), te onderdrukken via inductie van de remmende nucleaire receptor SHP. De studie beschreven in hoofdstuk 5 beoogde te bepalen of SHP ook een terugkoppeling verzorgt in regulatie van Ntcp, het belangrijke galzout opname eiwit. In vers geïsoleerde rattenhepatocyten leidde incubatie met galzouten tot een verminderde retinoid-gemedieerde activering van Ntcp genexpressie en functie, hetgeen tegelijkertijd optrad met een toename van SHP expressie. Aansluitend werden transfectie experimenten verricht in HepG2 en COS cellen, welke een FXR-afhankelijke onderdrukking van het RXR:RAR respons element in de Ntcp promotor aantoonden. Co-transfectie van Shp remde ook de retinoidgemedieerde activering van de Ntcp promotor op een directe manier. Galzout stimulering van de transcriptie van Shp zou dus kunnen leiden tot een remming van Ntcp gen expressie. Dit mechanisme stelt de hepatocyt in staat om de galzoutsynthese en -opname gecoördineerd te reguleren, waarbij celschade als gevolg van het accumuleren van galzouten in cholestatische omstandigheden zou kunnen worden voorkomen. Het nucleaire receptorsysteem stelt de hepatocyt in staat om op een gecoördineerde manier de transcriptie te reguleren van genen die een rol spelen in het metabolisme van zowel galzouten als van lipiden. Patienten die lijden aan PFIC type 2 tonen karakteristieke veranderingen in het lipidenmetabolisme, onder andere tot uiting komend in lage plasma concentraties van apolipoproteïne A-I (apo A-I). Hoofdstuk 6 behandelt de hypothese dat de galzoutsensor FXR een belangrijke transcriptionele regulator van apo A-I zou kunnen zijn. In transgene muizen die het humane apo A-I gen tot expressie brengen leidde behandeling met de FXR-agonist taurocholaat tot sterke daling van de serumconcentratie van het humane apo A-I en van het (humaan) apo A-I mrna niveau in de lever. In vitro onderzoek met vers geïsoleerde humane hepatocyten en met HepG2 cellen die werden blootgesteld aan galzouten toonde een dosisafhankelijke onderdrukking van de apo A-I genexpressie aan. Galzout-geactiveerd FXR verminderde de humane apo A-I promotor activiteit via een negatief FXR 146

5 Samenvatting blootstelling aan controle medium en aan LPS alleen. In de laatste situatie, dus zonder een interventie met macrofaag activering, was galzoutopname in WIF-B cellen niet verminderd. Steady state-mrna gehaltes van Ntcp waren onderdrukt na blootstelling aan geconditioneerd medium, tot een niveau vergelijkbaar met dat na blootstelling aan cytokines. De resultaten tonen derhalve aan dat macrofagen die cytokines uitscheiden een essentiële rol zouden kunnen spelen in LPS-geïnduceerde cholestase door een remming van de galzout opname door de lever. Hoofdstuk 3 beschrijft studies in een ratmodel waarin Kupffer cellen (lever macrofagen) waren geinactiveerd. Ratten waren namelijk behandeld met liposomaal clodronaat, hetgeen een effectieve verwijdering van de Kupffer cel populatie in de lever tot gevolg had. In dit model werd de rol van deze niet-parenchymale levercellen in LPS-geïnduceerde verstoring van Ntcp expressie in vivo onderzocht. Na blootstelling aan LPS bleek de expressie van TNF-a en IL-1ß genen in levers zonder Kupffer cellen significant lager te zijn dan in controle levers. Gen- en eiwitexpressie van Ntcp was gepreserveerd in levers zonder Kupffer cellen. Il-1ß kan leiden tot c-jun/jnk gerelateerde fosforylering van het RXR gedeelte van de RXR:RAR nucleaire receptor heterodimer. Deze nucleaire receptor heterodimer is een belangrijke transactivator van de Ntcp promotor, hetgeen echter wordt geremd door fosforylering. Fosforylering van RXR:RAR kan daarom leiden tot onderdrukking van activatie van het Ntcp gen. In dieren waarin de Kupffer cel populatie in lever was uitgeschakeld bleek de IL-1ß expressie slechts in geringe mate verhoogd te zijn na LPS blootstelling, hetgeen was geassocieerd met preservatie van de RXR:RAR heterodimeer binding (gelshift analyse) en van Ntcp transcriptie. Deze observatie ondersteunt de centrale rol van Kupffer cellen in LPS-geïnduceerde cholestase en suggereert dat Kupffer cellen een potentiëel aangrijpingspunt zouden kunnen zijn voor farmacologische behandeling van sepsisgeïnduceerde cholestase. Ontstekingsmediatoren (b.v. cytokines en platelet-activating factor, PAF)) en ontstekingsmodulatoren (zoals PAF-acetylhydrolase, PAF-AH) en lecithine-cholesterol acyltransferase (LCAT)) zijn componenten die onder fysiologische omstandigheden (ook) in de gal worden uitgescheiden. Ontstekingsmodulatoren kunnen belangrijk zijn voor het neutraliseren van ontstekingsgemedieerde schade aan galwegen en aan het darmweefsel. In hoofdstuk 4 is het gedrag van PAF-AH en LCAT als onderdeel van de hepatobiliare ontstekingsrespons gekarakteriseerd. Een endotoxemische aanslag op de lever in de vorm van LPS leidde tot een snelle en specifieke uitscheiding in de gal van PAF-AH activiteit, met karakteristieken die overeenkomen met het type enzym dat normaal gesproken in plasma aangetroffen wordt. Later in de tijd werd ook een toename in plasma PAF-AH aangetroffen, terwijl de LCAT activiteit in plasma reeds vroeg na LPS toediening steeg. Ook de activiteit van LCAT in de gal steeg zeer snel 145

6 Samenvatting responselement. FXR bleek transcriptionele inhibitie uit te oefenen in de vorm van een monomeer zonder betrokkenheid van SHP transactivatie. Deze observaties kunnen belangrijke implicaties hebben voor het ontwikkelen van FXR antagonisten als potentiële antiatherogene (HDL-verhogende) geneesmiddelen. PFIC patienten lijden aan extreme jeuk (pruritus). De oorzaak van dit fenomeen is niet bekend. Hoofdstuk 8 beschrijft de toepassing van een extracorporele albumine dialyse techniek (MARS) in een patiënt met BRIC. De patiënt ervoer een duidelijke vermindering van de jeuk en een langdurige verlaging van de plasma galzoutconcentraties. Tegelijkertijd met de MARS behandeling en de vermindering van de ernst van cholestase normaliseerd de apo A-I concentratie in plasma, terwijl deze tijdens de cholestatische periode duidelijk verlaagd was geweest. Het is suggestief dat dit fenomeen het gevolg is van een verlaging van de intracellulaire concentraties van endogene FXR liganden, en dus van de FXR-gemedieerde onderdrukking van apo A-I expressie. In conclusie, het complex van processen dat aanleiding geeft tot het ontstaan van verschillende vormen van cholestase blijkt ook beïnvloed te worden door andere cellen dan de hepatocyten zelf, namelijk door Kupffer cellen die mediatoren uitscheiden, en omvat een grote variatie van nucleaire receptoren, liganden en eiwitten in de signaaltransductie route. Geselecteerde componenten van deze cascade zouden geschikt kunnen zijn als farmacologisch aanknopingspunt om metabole en cholestatische ziekten in de toekomst beter te kunnen behandelen. 147

7 148