Bachelorproef aangeboden tot het verkrijgen van het diploma bachelor Biomedische laboratoriumtechnologie (MLT)

Transcriptie

1 Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest Bachelorproef aangeboden tot het verkrijgen van het diploma bachelor Biomedische laboratoriumtechnologie (MLT) Wilke Vandensande Apr. Luitenant-kolonel Heuninckx Labo Hematologie Militair Hospitaal Koningin Astrid (MHKA) Neder-Over-Heembeek Departement Gezondheidszorg Academiejaar Bachelor Biomedische Laboratoriumtechnologie Erasmushogeschool Brussel Departement Gezondheidszorg en Landschapsarchitectuur Laarbeeklaan 121 B-1090 Jette t +32 (0) gl@ehb.be

2

3 Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest Bachelorproef aangeboden tot het verkrijgen van het diploma bachelor Biomedische laboratoriumtechnologie (MLT) Wilke Vandensande Apr. Luitenant-kolonel Heuninckx Labo Hematologie Militair Hospitaal Koningin Astrid (MHKA) Neder-Over-Heembeek Departement Gezondheidszorg Academiejaar Bachelor Biomedische Laboratoriumtechnologie Erasmushogeschool Brussel Departement Gezondheidszorg en Landschapsarchitectuur Laarbeeklaan 121 B-1090 Jette t +32 (0) gl@ehb.be

4 VOORWOORD Ik zou graag mijn dankwoord willen uiten aan geneesheer Kolonel Neirinckx, directeur van het Militair Hospitaal Koningin Astrid voor de mogelijkheid en de toestemming om in het bioklinisch laboratorium een eindwerkstage te mogen uitvoeren. Mijn promotor Klinisch Bioloog Apr. Luitenant-kolonel Heuninckx zou ik willen bedanken voor de mogelijkheid om een eindwerkstage te mogen uitvoeren in het bioklinisch laboratorium onder zijn begeleiding en steun, maar ook omwille van het vertrouwen in mij. Vervolgens wil ik Klinisch Biologe Apr. Van Haute bedanken voor de begeleiding, maar ook voor de kennis en expertise die ze met mij wou delen. Tevens wil ik ook Christa Van de Ven bedanken voor de goede opvang, de technische uitleg en de begeleiding bij het uitvoeren van dit eindwerk, maar ook alle laboranten van het laboratorium voor het goed ontvangst, uitleg, aangename sfeer en het vertrouwen om mij gedurende deze periode zelfstandig te laten werken. Graag had ik ook mijn dankwoord geuit aan Marjan Van Esbroeck en Anne-Marie Feyens van het Instituut voor Tropische Geneeskunde (ITG) te Antwerpen voor het uitwisselen van malariapositieve monsters, de hulp en informatie gedurende deze stage. Ik apprecieer ook de hulp van Anne Demulder van het UVC Brugmann om bereid te zijn malariapositieve monsters uit te wisselen. Ook mijn dank aan An Vermoesen en Lobke Tremmerie van de firma ANALIS voor de opleiding, hulp en informatie van het toestel UniCel DxH800. Mijn dankwoord gaat ook uit naar Apr. Dorien Van den Bossche voor het contact met het ITG en de hulp gedurende deze periode. Mevrouw Brisaert, Mevrouw Crabbe en Mevrouw Roelandt zou ik tevens ook willen bedanken voor hun tussentijdse opvolging en hulp tijdens dit eindwerk I P a g i n a

5 ORGANIGRAM Klinisch laboratorium Militair Hospitaal Koninging Astrid (MHKA) (Klinisch Bioloog Apotheker Luitenant-kolonel Heuninckx) Quality Manager Klinisch Bioloog (Apotheker Luitenant-kolonel Heuninckx) Adjunct Klinisch Biologen (Apotheker Luitenant-kolonel (res) Van Haute Apotheker Kapitein (res) Hing) Pre- en postanalytische diensten Analytische diensten Labo Hematologie Labo Biochemie Labo Bacteriologie Labo Serologie Labo Toxicologie Labo Urine Wachtpersoneel II P a g i n a

6 INHOUDSTAFEL VOORWOORD... I ORGANIGRAM... II INHOUDSTAFEL... III FIGURENLIJST... VI TABELLENIJST... IX LIJST AFKORTINGEN... XI SAMENVATTING... XII ABSTRACT... XIII I. INLEIDING... 1 II. PROBLEEMSTELLING... 2 III. PROEFOPSTELLING... 3 IV. THEORIE ACHTERGROND MALARIA MALARIA IN BELGIË PARASIET ASEKSUELE CYCLUS IN DE MENS SEKSUELE CYCLUS IN DE ANOPHELES MUG IMMUNITEIT THERAPIE PROFYLAXIE BEHANDELING RESISTENTIE RECIDIVITEIT SYMPTOMEN KLINISCHE VERSCHIJNSELEN HEMATOLOGIE BIOCHEMIE DIAGNOSE MICROSCOPIE IMMUNOCHROMATOGRAFIE (SNELTEST) HRP PLDH SEROLOGIE MOLECULAIRE TECHNIEKEN HEMATOLOGISCHE ANALYSERS LITERATUUR V. EXPERIMENTEN BECKMAN COULTER UNICEL DXH MATERIAAL EN METHODEN APPARATUUR MONSTER III P a g i n a

7 MEETPRINCIPES COMPLETE CLOOD COUNT (COULTER PRINCIPE) HEMOGLOBINE (SPECTROFOTOMETRISCH PRINCIPE) DIFFERENTIATIE (VCS PRINCIPE) VOLUME CONDUCTIVITEIT LICHTVERSTROOIING MTM NRBC (VCS METHODE) REAGENTIA DXH DILUENT DXH CELL LYSE DXH DIFF PACK DXH CLEANER RAPPORTERING CBC EN DIFFERENTIATIE FLAGS SUPPLEMENTAIRE DATA HISTOGRAM D-DATAPLOTS D-DATAPLOTS SURFACE-PLOTS CODES SUSPECT/SYSTEM/DEFINITIVE MESSAGES PROEFOPSTELLING METHODE MONSTERAFNAME CONTROLES ANALYSE OP UNICEL DXH STATISTIEK RESULTATEN PARAMETERS PER GROEP MALARIA NEGATIEVE CONTROLEGROEP (NORMAAL) MALARIA POSITIEVE CONTROLEGROEP (MALARIA) GROEP GEHOSPITALISEERDE PATIËNTEN MET EEN INFECTIE GROEP TERUGKERENDE MILITAIREN VAN BUITENLANDSE MISSIE MALARIA DISCRIMINANT FACTOR STANDAARDDEVIATIE VAN HET CELVOLUME LYMFOCYTEN STANDAARDDEVIATIE VAN HET CELVOLUME MONOCYTEN BLOEDPLAATJES HISTOGRAM DATAPLOTS PD NRBC IV P a g i n a

8 SENSITIVITEIT / SPECIFICITEIT / CUTT-OFF WAARDE DISCUSSIE SNELTEST (SD P.F./PAN) MATERIAAL EN METHODEN APPARATUUR MONSTER MEETPRINCIPE PROCEDURE RESULTATEN MALARIA POSITIEVE CONTROLEGROEP MALARIA NEGATIEVE CONTROLEGROEP GROEP GEHOSPITALISEERDE PATIËNTEN MET EEN INFECTIE GROEP MILITAIREN TERUGKEREND VAN BUITENLANDSE MISSIE CONCLUSIE MICROSCOPIE MATERIAAL EN METHODEN APPARATUUR REAGENTIA PRINCIPE BLOEDUITSTRIJKJE DIKDRUPPEL MAY GRÜNWALD GIEMSA GIEMSA PROCEDURE BLOEDUITSTRIJKJE MET MAY GRÜNWALD GIEMSA KLEURING DIKDRUPPEL MICROSCOPIE RESULTATEN CONCLUSIE VI. CONCLUSIE VII. DISCUSSIE VIII. REFERENTIES IX. APPENDIX X. BIJLAGE V P a g i n a

9 FIGURENLIJST Figuur 1: Proefopstelling studie... 3 Figuur 2: Plasmodium species verdeling van 210 malariagevallen in België in 2005 (Instituut voor Tropische Geneeskunde & Belgische Vereniging van LaboratoriumTechnologen, 2007)... 4 Figuur 3: VCS-data (V: volume, C: conductiviteit, S: scattering) met het gemiddelde (Mean) en de standaarddeviatie (SD) van de populatie witte bloedcellen (NE: neutrofielen, LY: lymfocyten, MO: monocyten en EO: eosinofielen) na telling en differentiatie op de UniCel DxH 800. Links de VCS-data van een persoon in goede gezondheid. Rechts de VCS-data van een persoon met een malaria-infectie die een duidelijk hoger gemiddeld volume en een grotere standaarddeviatie van de monocyten en lymfocyten weergeeft. (Briggs et al., 2006) Figuur 4: Histogram van de witte bloedcellen met op de x-as de grootte of volume (fl) en op de y-as de celfrequentie. Links een histogram van een persoon in goede gezondheid en rechts van een persoon met een malaria-infectie met een extra piek voor de drempelwaarde van 35 fl. (Briggs et al., 2006) Figuur 5: 2D-dataplot van de bloedcepopulaties met op de x-as de lichtverstrooiing en op de y-as het volume. Links een persoon in goede gezondheid met een goede scheiding in de celpopulaties en een geconcentreerde lymfocyten en monocyten populatie. Rechts een persoon met een malaria-infectie met geen goede scheiding tussen de celpopulaties en een heterogene minder geconcentreerde lymfocyten en monocyten populatie. (Briggs et al., 2006) Figuur 6: ROC-analyse voor de malariafactor. Een cut-off waarde of grenswaarde van 3,7 vertoont een sensitiveit van 98% en een specificiteit van 94%. Een lagere cut-off waarde resulteert in een lagere specificiteit, een hogere factor in een lagere sensitiviteit. (Briggs et al., 2006) Figuur 7: NRBC 2D-plot (y-as RLALS, x-as AL2) van een patiënt met een P.vivax infectie. Malariasignalen zijn groen, NRBC-signalen rood en de WBC signalen blauw. (Lee at al, 2012) Figuur 9: NRBC 2D-plots van een patiënt met P.vivax-infectie. Links de dataplot op dag 0 van de behandeling, in het midden de dataplot na 2 dagen behandeling en rechts de dataplot na 12 dagen behandeling. Naarmate de parasitemie afneemt, neemt ook het aantal malariasignalen af. (Lee at al, 2012) Figuur 8: Differentiatie 2D-plot (y-as volume, x-as RLS) van een patiënt met een P.vivax infectie. Malariasignalen zijn rood (inclusief rode bloedcellen, neutrofielen zijn roze, de blauwe signalen zijn lymfocyten, de groene signalen zijn monocyten, de gele signalen zijn eosinofielen en de witte signalen zijn basofielen. (Lee at al, 2012) Figuur 10: De 2D-dataplots en WBC-histogrammen van een normaal bloedmonster (links) en een bloedmonster met een malaria-infectie (rechts). De dataplot van malaria toont een extra populatie aan onder de populatie lymfocyten en een extra populatie (piek voor 35 fl grenswaarde) voor de lymfocyten op het histogram. (Simon-Lopez, 2013) Figuur 11: ROC-analyse van de malariafactor toont een cutt-off waarde van 5,06 met een sensitiviteit van 69,9% en een specificiteit van 82,5%. (Simon-Lopez, 2013) Figuur 12: Herhaalbaarheid. Het gemiddelde SD V volume (Vsd) van de monocyten en lymfocyten van 10 monsters na elke run. Voor de lymfocyten is de gemiddelde variatiecoëfficiënt 4,4% en voor de monocyten 5,5%.(Simon-Lopez, 2013) Figuur 13: De invloed van de leeftijd van het monster op de SD V volume (Vsd) van de monocyten en lymfocyten. Het gemiddelde SD V volume (Vsd) van de monocyten en lymfocyten van 10 monsters gedurende een tijdspanne van 77u. Het monster is stabiel voor deze parameter gedurende 11 uur na de bloedafname. (Simon-Lopez, 2013) Figuur 14: Coulter-methode in de Beckman Coulter DxH voor de celtelling van bloedcellen in een bloedmonster (Beckman Coulter Ireland, 2013) Figuur 15: Meting van het volume in de MTM (Beckman Coulter Ireland, 2013) Figuur 16: Meting van de conductiviteit in de MTM (Beckman Coulter Ireland, 2013) Figuur 17: Lichtverstrooiing meting in de MTM, simultaan met de meting van volume en conductiviteit (Beckman Coulter Ireland, 2013) Figuur 18: Meting van het volume door gelijkstroom (DC) impedantie in de MTM (Beckman Coulter Ireland, 2013) Figuur 19: Meting van de intracellulaire inhoud van de cel door radiofrequentie (RF) impedantie in de MTM.. 24 Figuur 20: Multitransducermodule (MTM) in de UniCel DxH 800 die gebruikt wordt voor de meting van volume, conductiviteit en lichverstrooiing of scattering (VCS technologie). De onderdelen van deze module worden uitgelegd in tabel 7 en 8. (Beckman Coulter Ireland, 2013) Figuur 21: Patient Results scherm die de rapportering van de resultaten (grijze kaders) weergeeft van een bloedmonster na een complete blood count (CBC) en een differentiatie VI P a g i n a

10 Figuur 22: Supplementaire data van de differentiatie (DIFF) geeft voor elke meting (volume, conductiviteit en lichtverstrooiing) een gemiddelde waarde (M) en een standaarddeviatie of spreiding (SD) weergegeven Figuur 23: Histogram van de witte bloedcellen (WBC) met op de x-as het celvolume (fl) en op de y-as de celfrequentie Figuur 24: Histogram van de rode bloedcellen (RBC) met op de x-as het celvolume (fl) en op de y-as de celfrequentie Figuur 25: Histogram van de bloedplaatjes (PLT) met op de x-as het celvolume (fl) en op de y-as de celfrequentie Figuur 26: Histogram van de witte bloedcellen (WBC) met op de x-as het celvolume (fl) en op de y-as de celfrequentie en de situering van de populaties witte bloedcellen op de x-as. (Beckman Coulter Ireland, 2013) Figuur 27: Celpopultaties lymfocyten (blauw), monocyten (groen), neutrofielen (paars), eosinofielen (oranje), basofielen (wit) en non-witte bloedcellen (rood) weergegeven op de 2D-dataplots na differentiatie. Links de 5PD1-dataplot met op de x-as de rotated light scattering (RLS) en op de y-as het volume (V). Rechts de 5PD2 dataplot met op de x-as het de ondoorzichtigheid (OP) en op de y-as het volume (V) Figuur 28: Celpopulaties nucleated red blood cells (rood), witte bloedcellen (blauw), en andere populaties (groen) weergegeven op de 2D-dataplot na differentiatie. Links de NRBC1-dataplot met op de x-as het doorgelaten licht (AL2) en op de y-as de rotated light angle scatter (RLALS). Rechts de NRBC2-dataplot met op de x-as het volume (RUMALS) en op de y-as het doorgelaten licht (ALS2) Figuur 29: 3D-dataplot met de assen volume, lichtverstrooiing en het doorgelaten licht geeft de elpopultaties lymfocyten (blauw), monocyten (groen), neutrofielen (paars), eosinofielen (oranje), basofielen (wit) en nonwitte bloedcellen (rood) weer Figuur 30: Surface-plot van de 5PD1-plot met op de x-as de rotated light scattering (RLS) en op de y-as het volume (V). Lymfocyten (blauw), monocyten (groen), neutrofielen (paars), eosinofielen (oranje), basofielen (wit) en non-witte bloedcellen (rood) Figuur 31: Surface-plot van de NRBC1-plot met op de x-as het doorgelaten licht (AL2) en op de y-as de rotated light angle scatter (RLALS). Nucleated red blood cells (rood), witte bloedcellen (blauw), en andere populaties (groen) Figuur 32: Boxplot voor de evaluatie van de malaria discriminant factor met n= het aantal monsters Figuur 33: Boxplot voor de evaluatie van de spreiding van het volume van de lymfocyten (SD V lymfocyten) met n= het aantal monsters Figuur 34: Boxplot voor de evaluatie van de spreiding van het volume van de lymfocyten (SD V lymfocyten) met n= het aantal monsters Figuur 35: Boxplot voor de evaluatie van de spreiding van de bloedplaatjes met n= het aantal monsters Figuur 36: WBC-histogrammen van de malaria positieve monsters. Histogrammen A, B, D en E vertonen geen mooie afgescheiden piek op de 35 fl genswaarde. Het begin van een extra piek of populatie is zichtbaar ter hoogte van de 35 fl grenswaarde Figuur 37: WBC-histogrammen van de monsters met een vals positieve malaria discriminant factor (>4,5). Histogrammen A t.e.m.h zijn monsters afkomstig uit de groep patiënten met een infectie en histogrammen I t.e.m. K zijn monsters afkomstig uit de groep terugkerende militairen van buitenlandse missie. Deze histogrammen vertonen geen extra piek voor de 35 fl grenswaarde Figuur 38: Differentiatie 5PD1-dataplot van een normaal monster (parameters binnen referentiewaarden en persoon in goede gezondheid) Figuur 39: Differentiatie 5PD1-dataplots van malaria positieve monsters Figuur 40: Differentiatie 5PD1-dataplots van de monsters met een vals positieve malaria discriminant factor (>4,5). Dataplots A t.e.m. H zijn monsters afkomstig uit de groep patiënten met een infectie en dataplots I t.e.m. K zijn monsters afkomstig uit de groep terugkerende militairen van buitenlandse missie Figuur 41: NRBC1 data-plot van een normaal monster (parameters binnen referentiewaarden) Figuur 42: NRBC-dataplots van malaria positieve monsters Figuur 43: NRBC-dataplots van de monsters met een vals positieve malaria discriminant factor (>4,5). Dataplots A t.e.m. H zijn monsters afkomstig uit de groep patiënten met een infectie en dataplots I t.e.m. K zijn monsters afkomstig uit de groep terugkerende militairen van buitenlandse missie Figuur 44: ROC-analyse van de malaria disciminant factor geeft een ideale cut-off waarde van 5,0 op basis van de data in deze studie Figuur 45: Immunochromatografisch principe voor de malariadetectie van de SD SD BIOLINE Malaria Ag P.f/Pan sneltest (World Health Organization, 1999) Figuur 46: Werkwijze voor de sneltest SD BIOLINE Malaria Ag P.f/Pan (Alere, 2013) VII P a g i n a

11 Figuur 47: Een P.ovale trofozoiët in een bloeduitstrijkje gekleurd met May-Grünwald Giemsa op een vergroting 100x10 onder de lichtmicroscoop Figuur 48: Een P.ovale geparasiteerde rode bloedcel met meerdere trofozoïeten (polyparasitisme, zeldzaam) in een bloeduitstrijkje gekleurd met May-Grünwald Giemsa op een vergroting 100x10 onder de lichtmicroscoop. 61 Figuur 49: Een P.ovale schizont die op uitbarsten staat in een bloeduitstrijkje gekleurd met May-Grünwald Giemsa op een vergroting 100x10 onder de lichtmicroscoop Figuur 50: Een P.falciparum trofozoiët in een bloeduitstrijkje gekleurd met May-Grünwald Giemsa op een vergroting 100x10 onder de lichtmicroscoop Figuur 51: Een P.falciparum trofozoiët (oudere vorm) in een bloeduitstrijkje gekleurd met May-Grünwald Giemsa op een vergroting 100x10 onder de lichtmicroscoop Figuur 52: Een P.falciparum trofozoiët (oudere vorm) in een bloeduitstrijkje gekleurd met May-Grünwald Giemsa op een vergroting 100x10 onder de lichtmicroscoop Figuur 53: Negatieve SD Bioline P.f/Pan sneltest bij een vermoeden van malaria-infectie (later geconfirmeerd als P.ovale infectie) op de dag van diagnose Figuur 54: Negatieve SD Bioline P.f/Pan sneltest bij een vermoeden van malaria-infectie (later geconfirmeerd als P.ovale infectie) vier dagen na de dag van diagnose en na behandeling met chloroquine Figuur 55: WBC (witte bloedcel) histogram vertoont een abnormale verdeling en een extra populatie op de 35 fl volume grenswaarde (hoge celfrequentie) Figuur 56: WBC (witte bloedcel) histogram vertoont een goede verdeling en geen extra populatie op de 35 fl volume grenswaarde Figuur 57: NRBC dataplot van een militair met een P.ovale infectie vertoont een groene extra populatie links onderaan. Nucleated red blood cells (NRBC) zijn rood en de witte bloedcellen blauw Figuur 58: NRBC dataplot van de militair met een P.ovale infectie na 4 dagen behandeling met chloroquine. De groene extra populatie is verdwenen. Nucleated red blood cells (NRBC) zijn rood en de witte bloedcellen blauw Figuur 59: NRBC surface plot van een militair met een P.ovale infectie vertoont een groene extra populatie links onderaan. Nucleated red blood cells (NRBC) zijn rood en de witte bloedcellen blauw Figuur 60: NRBC dataplot van de militair met een P.ovale infectie na 4 dagen behandeling met chloroquine. De groene extra populatie is verdwenen. Nucleated red blood cells (NRBC) zijn rood en de witte bloedcellen blauw Figuur 61: Grafiek invloed tijd en temperatuur op de malaria discriminant factor Figuur 62: Grafiek invloed tijd en temperatuur op de SD V monocyten Figuur 63: Grafiek invloed tijd en temperatuur op de SD V lymfocyten Figuur 64: De dataplots die de monsters vertoonden na bewaring op koelkasttemperatuur (4 C)(links naar rechts: na afname, na 24u, na 48u en na 72u na afname) Figuur 65: De dataplots die de monsters vertoonden na bewaring op kamertemperatuur (links naar rechts: na afname, na 24u, na 48u en na 72u na afname) Figuur 66: De NRBC-dataplots die de monsters vertoonden na bewaring op koelkasttemperatuur (4 C)(links naar rechts: na afname, na 24u, na 48u en na 72u na afname) Figuur 67 : De NRBC-dataplots die de monsters vertoonden na bewaring op kamertemperatuur (links naar rechts: na afname, na 24u, na 48u en na 72u na afname) Figuur 68: De WBC histogrammen die de monsters vertoonden na bewaring op koelkasttemperatuur (4 C)(links naar rechts: na afname, na 24u, na 48u en na 72u na afname) Figuur 69: De WBC histogrammen die de monsters vertoonden na bewaring op kamertemperatuur (links naar rechts: na afname, na 24u, na 48u en na 72u na afname) Figuur 70: Correlatie malaria discriminant factor met de standaarddeviatie van de lymfocyten Figuur 71: Correlatie malaria discriminant factor met de standaarddeviatie van de monocyten Figuur 72: Correlatie SD V lymfocyten met SD V monocyten Figuur 73: Correlatie bloedplaatjes met de malaria discriminant factor Figuur 74: Stadia van de P.falciparum parasiet. 1: Normale rode bloedcel; 2-18: Trofozoïeten (2-10 ringstadia); 19-26: Schizonten; 27-28: Vrouwelijke gametocyten (macrogametocyten); Mannelijke gametocyten (microgametocyten) Figuur 75: Stadia van de P.ovale parasiet. 1: Normale rode bloedcel; 2-5: Jonge trofozoïeten (ringstadia); 6-15: Trofozoïeten; 16-13: Schizonten; 24: Vrouwelijke gametocyt ; 25: Mannelijke gametocyt VIII P a g i n a

12 TABELLENIJST Tabel 1: Parameters op de UniCel DxH 800 die gebruikt werden in deze studie Tabel 2: Malariaprofylaxe ( 2010)... 8 Tabel 3: Behandeling malaria aanval ( 2010)... 8 Tabel 4: Significante verschillen tussen de malaria positieve en malaria negatieve groep na een Wilcoxon rank test. (Simon-Lopez, 2013) Tabel 5: Beschrijving, eenheid en meetprincipe per parameter bij analyse op de UniCel DxH 800 (Beckman Coulter Ireland, 2013) Tabel 6: Baden voor het mengen van reagens met monster in de UniCel DxH 800 (Beckman Coulter Ireland, 2013) Tabel 7: Kanalen in de MTM module (UniCel DxH 800) die het volume en de conductiviteit meten. (Beckman Coulter Ireland, 2013) Tabel 8: Kanalen in de MTM module (UniCel DxH 800) die de lichtverstrooiing meten. (Beckman Coulter Ireland, 2013) Tabel 9: Flags bij de rapportering van de resultaten (UniCel DxH 800) (Beckman Coulter Ireland, 2013) Tabel 10: Codes op de UniCel DxH800 (Beckman Coulter Ireland, 2013) Tabel 11: Parameters op de Beckman Coulter DxH80 die in deze studie worden geëvalueerd Tabel 12: Het aantal monsters met een malariafactor hoger dan 4,5 en lager dan 4,5 per groep na analyse op de UniCel DxH Tabel 13: Evaluatie van de parameters van een complete blood count (CBC) en een differentiatie na analyse op de UniCel DxH 800 voor de malaria negatieve controlegroep Tabel 14: Evaluatie van de parameters van een complete blood count (CBC) en een differentiatie na analyse op de UniCel DxH 800 voor de malaria positieve controlegroep Tabel 15: Evaluatie van de parameters van een complete blood count (CBC) en een differentiatie na analyse op de UniCel DxH 800 voor de groep gehospitaliseerde patiënten met een infectie Tabel 16: Evaluatie van de parameters van een complete blood count (CBC) en een differentiatie na analyse op de UniCel DxH 800 voor de groep terugkerende militairen van buitenlandse missie Tabel 17: Significante verschillen tussen de groepen bij de vergelijking van de malaria discriminant factor Tabel 18: Significante verschillen tussen de groepen bij de vergelijking van de spreiding van het volume voor de lymfocyten (SD V lymfocyten) Tabel 19: Significante verschillen tussen de groepen bij de vergelijking van de spreiding van het volume voor de monocyten (SD V monocyten) Tabel 20: Significante verschillen tussen de groepen bij de vergelijking van de bloedplaatjes Tabel 21: Sensitiviteit/specificiteit malaria discriminant factor berekend op de resultaten van de monsters uit de vier groepen (positieve controlegroep, negatieve controlegroep, groep terugkerende militairen van buitenlandse missie en de groep patiënten met een infectie) Tabel 22: Significante verschillen malaria discriminant factor (Malaria D factor) Tabel 23: Interpretatie van de sneltest SD BIOLINE Malaria Ag P.f/Pan (Alere, 2013) Tabel 24: Resultaten van de sneltest SD BIOLINE Malaria Ag P.f/Pan bij de malaria positieve controlegroep.. 52 Tabel 25: Resultaten, foto s en interpretatie van de sneltest SD BIOLINE Malaria Ag P.f/Pan bij de malaria positieve controlegroep Tabel 26: Resultaten van de sneltest SD SD BIOLINE Malaria Ag P.f/Pan bij de groep gehospitaliseerde patiënten met een infectie (niet-malaria) Tabel 27: Resultaten van de sneltest SD SD BIOLINE Malaria Ag P.f/Pan bij de groep militairen terugkerend van buitenlandse missie Tabel 28: Som van de resultaten SD BIOLINE Malaria Ag P.f/Pan bij de malaria positieve controlegroep, de groep gehospitaliseerde patiënten met een infectie (niet-malaria) en de groep militairen terugkerend van buitenlandse missie Tabel 29: Resultaten, specificiteit en sensitiviteit van de sneltest SD BIOLINE Malaria Ag P.f/Pan bij de malaria positieve controlegroep, de groep gehospitaliseerde patiënten met een infectie (niet-malaria) en de groep militairen terugkerend van buitenlandse missie Tabel 30: Resultaten van de microscopie (dikdruppel en bloeduitstrijkje) IX P a g i n a

13 Tabel 31: Het aantal geparasiteerde rode bloedcellen per µl (AP/µl), de Plasmodium species en de verschillende stadia dat werd vastgesteld bij elk monster in de malaria positieve controlegroep Tabel 32: Vergelijking van de sneltest SD Biolone Malaria p.f./pan met de malaria discriminant factor op de UniCel DxH 800 en de gouden standaard microscopie Tabel 33: Beschrijvende statistiek van de malaria discriminant factor voor de vier groepen Tabel 34: T-test voor de vergelijking van de malaria discriminant factor tussen de groepen. Significant verschil op een 0.01 betrouwbaarheidsniveau (*) en significant verschil op 0.05 betrouwbaarheidsniveau (**) Tabel 35: Beschrijvende statistiek van de spreiding van het volume voor de lymfocyten (SD V lymfocyten) voor de vier groepen Tabel 36: T-test voor de vergelijking van de spreiding van het volume voor de lymfocyten (SD V lymfocyten)tussen de groepen. Significant verschil op een 0.01 betrouwbaarheidsniveau (*) en significant verschil op 0.05 betrouwbaarheidsniveau (**) Tabel 37: Beschrijvende statistiek van de spreiding van het volume voor de monocyten (SD V monocyten) voor de vier groepen Tabel 38: T-test voor de vergelijking van de van het volume voor de monocyten (SD V monocyten) tussen de groepen. Significant verschil op een 0.01 betrouwbaarheidsniveau (*) en significant verschil op 0.05 betrouwbaarheidsniveau (**) Tabel 39: Beschrijvende statistiek van de spreiding van de bloedplaatjes voor de vier groepen Tabel 40: T-test voor de vergelijking van de van de bloedplaatjes tussen de groepen. Significant verschil op een 0.01 betrouwbaarheidsniveau (*) en significant verschil op 0.05 betrouwbaarheidsniveau (**) Tabel 41: De invloed van kamertemperatuur en tijd op de malariafactor (SD V monocyten en SD V lymfocyten) Tabel 42: De invloed van koelkasttemperatuur (4 C) en tijd op de malariafactor (SD V monocyten en SD V lymfocyten) Tabel 43: Kenmerken P.falciparum (ITG) Tabel 44: Kenmerken P.ovale (ITG) X P a g i n a

14 LIJST AFKORTINGEN Afkorting Beschrijving Afkorting Beschrijving # Absoluut aantal MCHC Mean corpuscular hemoglobin concentration µl microliter MCV Mean corpuscular volume 2D 2 dimensionaal Mean Gemiddelde 3SD 3 keer de standaarddeviatie MHKA Militair Hospitaal Koningin Astrid 5PD 5 scatterkanalen MLT Medische laboratoriumtechnologie AL2 Axial light loss MO Monocyten AP Aantal parasieten MPV Mean platelet volume Apr. Apotheker MTM Multitransducermodule AUC Area under the curve n Aantal BA Basofielen NE Neutrofielen CBC Complete blood count NRBC Genucleërde rode bloedcellen CRP C-reactief proteïne p p-waarde d.w.z. dit wil zeggen P. Plasmodium DC Gelijkstroom P.f. Plasmodium falciparum DIFF Differentiatie PCR Polymerase chain reaction EDTA Ethyleendiaminetetra-azijnzuur pldh parasiet- Lactaat dehydrogenase ELISA enzyme-linked immunosorbent assay PLT Platelet EO Eosinofielen RBC Rode bloedcellen fl Femtoliter RDT Rapid Diagnostic Test HCT Hematocriet RDW Red cell distribution width HGB Hemoglobine RDW-SD Red cell distribution width- standaarddeviatie HIV HIV- infectie RF Radiofrequentie HRP Histidine-rich-proteïne RLALS Rotated low angle light scatter ID Identificatie RLS Rotate light scatter ITG Instituut voor Tropische Geneeskunde SAM Sample aspiration module LDH Lactaat dehydrogenase SD V Standaarddeviatie van het volume LMALS Lower M axial light scatter SMS Slidemaker stainer LY Lymfocyten t.o.v. ten opzichte van m.b.v. met behulp van UMALS Upper M axial light scatter MALS LMALS +UMALS V Volume MCH Mean corpuscular hemoglobin VCS Volume Conductiviteit Scattering Vsd Standaarddeviatie van het volume WBC Witte bloedcellen XI P a g i n a

15 SAMENVATTING Malaria is een tropische ziekte die uitgezonden militairen in risicogebieden kan treffen. Er is noodzaak naar een snelle diagnose wanneer er een vermoeden is van een malariainfectie om de juiste behandeling toe te passen. Een gecalculeerde malaria discriminant factor ((standaarddeviatie volume lymfocyten * standaarddeviatie volume monocyten)/100) op een automatische hematologische celteller (UniCel DxH 800) zou een additionele test kunnen zijn om de aanwezigheid van een malaria-infectie aan te tonen. De malaria dicriminant factor op de automatische celteller werd vergeleken met de malaria antigen P.f./pan sneltest en de lichtmicroscopie als referentiemethode. Deze studie heeft als doel vast te stellen of de factor kan worden toegepast in de routine van het Militair Hospitaal Koningin Astrid. In deze studie werd gebruik gemaakt van een negatieve controlegroep (296 monsters negatief voor malaria afkomstig van 296 gezonde personen) en een positieve controlegroep (6 monsters van 6 patiënten die gediagnosticeerd werden met malaria). Daarnaast werd gebruik gemaakt van 2 andere groepen; 178 monsters afkomstig van 52 gehospitaliseerde patiënten met een infectie en 136 monsters afkomstig van 136 personen die terugkeerden van buitenlandse missie. Er is een groot significant verschil tussen malaria negatieve monsters en malaria positieve monster wanneer de malaria discriminant factor, SD V monocyten, SD V lymfocyten en de bloedplaatjes werden vergeleken (**p<0.01). Echter kunnen andere infecties ook een verhoogde malaria discriminant factor vertonen door de aanwezigheid van grotere monocyten en lymfocyten als reactie op de infectie. De waarden van de malaria discriminant factor, de SD V monocyten en de SD V lymfocyten bij enkele monsters met een valspositieve indicatie voor malaria kunnen de resultaten van deze waarden bij de monsters met een echt positieve malaria discriminant factor overlappen. De overlapping is vooral op te merken bij de SD V monocyten en in mindere mate bij de SD V monocyten. In deze studie is een cut-off waarde van 5,0 beter geschikt voor malaria indicatie dan de gebruikte 4,5 cut-off waarde, omdat het aantal monsters met een valspositieve indicatie voor malaria werd gereduceerd met ongeveer 48% en de specificiteit steeg zonder een daling van de sensitiviteit. Het witte bloedcellen- (WBC) histogram en de nucleated red blood cells (NRBC) dataplots kunnen geraadpleegd worden wanneer een hoge malaria dicriminant factor wordt aangegeven om eventuele malariasignalen op te merken. Echter is de NRBC dataplot enkel nuttig om een indicatie te geven van een eventuele P.ovale-infectie. De sneltest kan een tweede indicatie geven voor een malaria-infectie wanneer een hoge malariafactor wordt aangegeven, maar de microscopie blijft de gouden standaard omwille van de hoogste sensitiviteit en specificiteit in de routine laboratoria XII P a g i n a

16 ABSTRACT Malaria is a tropical disease that can affect military people on mission in high-risk areas. There is need for a rapid diagnosis when there is a suspicion of malaria infection to apply the appropriate treatment. A malaria calculated discriminant factor ((standard deviation volume lymphocytes * standard deviation volume monocytes)/100) to an automatic hematology cell counter (UniCel DxH 800) may be an additional test in order to detect the presence of a malaria infection, but the specificity of this parameter is uncertain. The factor in the automatic cell counter was compared with the malaria antigen P.f./pan sneltest test (RDT) and light microscopy as the reference method. This study aims to determine whether the factor can be used in the routine of the Military Hospital Royal Astrid. In this study, a negative control group consisted 296 samples negative for malaria from 296 healthy individuals and a positive control group consisted 6 samples from 6 patients who were diagnosed with malaria. In addition two groups were examined in the same way as the positive and the nagative control group; the first group consisted 178 samples from 52 hospitalized patients with an infection and the second group consisted 136 samples form military people who were returning from a mission abroad. There is a significant difference between the malaria negative samples and malaria positive samples when the malaria discriminant factor, SD V monocytes, SD V lymphocytes, and platelets were compared (** p < 0.01). However, other infections may also have an increased malaria discriminant factor due to the effects of the presence of larger monocytes and lymphocytes in response to the infection. The values of the malaria discriminant factor, SD V monocytes and SD V lymphocytes in some samples with a "false positive" indication for malaria had an overlap with these values in the samples with a real positive indication for malaria. This overlap is particularly noticeable in the SD V monocytes and to a lesser extent in the SD V monocytes. In this study, a cut-off value of 5,0 for malaria indicaton was better than the 4.5 cut-off value wich was used in this study, because the number of samples with a false positive indication for malaria was reduced by approximately 48 % and specificity was increased without a decrease in sensitivity. The white blood cell (WBC) histogram and the nucleated red blood cells (NRBC) data plot can be evaluated when a high malaria discriminant factor is been detected to notice malaria signals. However, the NRBC dataplot is only useful to give an indication of a possible P.ovale infection. The rapid diagnostic test can provide a second indication of a malaria infection when a high malaria discriminant factor is been detected but the microscopy remains the gold standard of its high sensitivity and specificity in routine laboratories XIII P a g i n a

17 I. INLEIDING Het Militair Hospitaal Koningin Astrid is een hospitaal dat de medische bijstand voorziet van de Belgische militairen. Een aantal van deze militairen wordt onderzocht alvorens ze op missie vertrekken en bij terugkeer van missie. De overige monsters zijn afkomstig van militairen die een medische keuring ondergaan. Deze monsters kunnen zowel afkomstig zijn van kandidaten als van huidig militair personeel. Daarnaast beschikt het hospitaal over een brandwondencentrum en een hospitalisatieafdeling voor patiënten met een infectie. Deze patiënten zijn gehospitaliseerd of komen op geregelde basis langs voor hun nodige verzorging. Het labo Hematologie onderzoekt interne bloedmonsters en externe bloedmonsters. De interne bloedmonsters zijn afkomstig van militair personeel, patiënten die een onderzoek ondergaan of van gehospitaliseerde patiënten. Externe monsters zijn afkomstig van militair personeel op de verschillende legerbasissen in België. Onlangs werd een nieuw hematologische automatische celteller (UniCel DxH 800) aangekocht om de celtelling en de differentiatie van bloedmonsters te kunnen bepalen. Dit toestel biedt de mogelijkheid om een malaria discriminant factor te laten bepalen op de monsters die door het toestel onderzocht worden voor een differentiatie en een celtelling. Dit is een gecalculeerde factor die afhankelijk is van de spreiding van het volume van de monocyten en de spreiding van het volume van de lymfocyten in een bloedmonster. Hoe groter de spreiding (SD: standaarddeviatie) van het volume tussen de monocyten en de spreiding van het volume tussen de lymfocyten, hoe groter de waarde van de factor. Een hoge factor zou wijzen op een vermoeden van een malariainfectie. Deze bachelorproef begint met een korte samenvatting van de uitgevoerde studie. Vervolgens wordt de algemene achtergrond van malaria geschetst gevolgd door een literatuurstudie van de Beckman Coulter UniCel DxH800. In het experimenteel gedeelte wordt het materiaal, de procedure, de resultaten en de discussie voor elke experiment in deze studie weergegeven, gevolgd door de vergelijking met de bevindingen in de literatuur. In de conlusie wordt de studie besproken aan de hand van de doelstellingen. 1 P a g i n a

18 II. PROBLEEMSTELLING Deze factor is interessant voor het Militair Hospitaal Koningin Astrid omdat dit de mogelijkheid biedt om een malariaroutinescreening uit te voeren op bloedstalen afkomstig van militair personeel die terugkeerden van malariarisicogebieden. Er moet echter nagegaan worden of de gehospitaliseerde patiënten met een infectie ook een verhoogde malaria discriminantfactor hebben. Wanneer dit het geval is, zullen een groot aantal monsters een valspositieve indicatie voor malaria vertonen. Bovendien moet worden nagegaan of de cut-off waarde van 4,5 voldoende sensitiviteit en specificiteit biedt om malaria te detecteren. Deze studie heeft als doel deze factor te bestuderen aan de hand van een groep negatieve malaria monsters afkomstig van gezonde personen, een groep stalen afkomstig van gehospitaliseerde patiënten met een infectie, een groep stalen afkomstig van militairen die terugkeerden van buitenlandse missie en een groep stalen van malaria positieve patiënten om vast te stellen of deze factor gebruikt kan worden in het Hospitaal. 2 P a g i n a

19 III. PROEFOPSTELLING Gedurende 12 dagen werden EDTA-volbloed stalen van de malaria negatieve controlegroep, de groep patiënten met een infectie en de groep terugkerende militairen van buitenlandse missie geanalyseerd op de Malaria discriminant factor >4,5 SD Bioline Malaria p.f./pan sneltest Microscopie Bloeduitstrijkje Dikdruppel UniCel DxH 800. Van elk staal binnen de groep werden de resultaten van enkele parameters bijgehouden (tabel 1). Wanneer een malaria factor hoger dan 4,5 door het toestel werd berekend, werd een Malaria antigen P.f./pan sneltest uitgevoerd om een eventuele malaria-infectie te kunnen bevestigen. Figuur 1: Proefopstelling studie Tabel 1: Parameters op de UniCel DxH 800 die gebruikt werden in deze studie. Complete blood count (CBC) Differentiatie Additionele gegevens Rode bloedcellen count Neutrofielen SD V lymfocyten Bloedplaatjes count Lymfocyten SD V monocyten Witte bloedcellen count Monocyten Malaria discriminant factor Eosinofielen Basofielen Van deze bloedmonsters werd ook een geautomatiseerd of manueel bloeduitstrijkje gemaakt en gekleurd met May-Grünwald Giemsa door de Beckman Coulter SMS. Een dikdruppel preparaat werd bereid en gekleurd met Giemsa. Beide werden onder de lichtmicroscoop bekeken om na te gaan of er effectief sprake was van malaria. Indien er Plasmodium-parasieten op te merken waren in het bloeduitstrijkje of in de dikdruppel, werd een telling uitgevoerd om het aantal parasieten of het aantal geïnfecteerde RBC per µl volbloed te bepalen. Vanaf er één parasiet in het bloeduitstrijkje of dikdruppel aanwezig is, werd het monster als positief voor malaria bevonden, maar wel ter confirmatie opgestuurd naar het Instituut voor Tropische Geneeskunde. Stalen met een malariafactor hoger of gelijk 4,5 met een negatieve sneltest, een negatieve dikdruppel en een negatief bloeduitstrijkje werden als vals positief aangenomen. Stalen met een malariafactor lager dan 4,5 met een negatieve sneltest, een negatieve dikdruppel en een negatief bloeduitstrijkje werden als negatief aangenomen. Vervolgens werd aangetoond of er een significant verschil is tussen de 4 groepen op vlak van de malaria discriminant factor, de SD V lymfocyten, de SD V monocyten en de bloedplaatjes door deze resultaten statistisch te verwerken in een boxplot en de significante verschillen aan te tonen met een t-test. Een ROC-analyse werd uitgevoerd om de ideale cut-off waarde in deze studie te bepalen. 3 P a g i n a

20 IV. THEORIE 1. ACHTERGROND 1.1. MALARIA Malaria is een parasitaire infectieziekte die overgedragen wordt door de Anopheles mug die de vector is voor de protozoa van het geslacht Plasmodium. Er zijn een 146 tal verschillende soorten Plasmodium die verschillende gastheren kunnen infecteren, bijvoorbeeld mensen, apen, vogels, knaagdieren, enzovoort. Er zijn vier Plasmodium species die de mens infecteren en malaria kunnen veroorzaken. P.falciparum kan potentiëel dodelijk zijn omdat het zich kan ophopen in de bloedvaten van de hersenen. (Instituut voor Tropische Geneeskunde & Belgische Vereniging van LaboratoriumTechnologen, 2007) (Guillaume, 2009) 1.2. MALARIA IN BELGIË Malaria treedt in België vooral op bij patiënten die verbleven hebben in een malaria risicogebied en daar een malariainfectie hebben opgelopen, hiervoor gebruikt men de term importmalaria. Vroeger kwam malaria wereldwijd voor, maar de infectieziekte werd in Europa uitgeroeid waardoor de infectiehaarden verdwenen. Tot 2000 steegde de importmalaria door de groei van migratie, missies en reizen naar tropische streken. Na 2000 was er een daling door het nemen van van nieuwe profylaxe. Malariagevallen gediagnosticeerd in België (2005) (n=210) P.malariae P.ovale P.vivax P.falciparum Figuur 2: Plasmodium species verdeling van 210 malariagevallen in België in 2005 (Instituut voor Tropische Geneeskunde & Belgische Vereniging van LaboratoriumTechnologen, 2007) Malaria kan buiten de risicogebieden ook optreden in de omgeving van luchthavens, men spreekt in deze gevallen over airportmalaria. De geïnfecteerde Anopheles mug kan bijvoorbeeld meereizen in de bagageruimte van een vliegtuig of in containers vanuit de malaria risicogebieden. Wanneer de mug de reis overleeft kan deze nog in staat zijn om een mens te infecteren. (Paugam & Yera, 2005) (Instituut voor Tropische Geneeskunde & Belgische Vereniging van LaboratoriumTechnologen, 2007) 4 P a g i n a

21 In Europa werden 64 gevallen van airportmalaria vastgesteld tussen 1969 en In de zomer van 1995 werden zelfs 6 malariagevallen gedetecteerd in de luchthaven van Brussel bij personen die nooit in het buitenland geweest waren, waarvan zelfs één met dodelijke afloop. Drie van deze patiënten waren personeel van de luchthaven en de overige 3 patiënten waren bezoekers van de luchthaven. (Instituut voor Tropische Geneeskunde & Belgische Vereniging van LaboratoriumTechnologen, 2007) Malaria kan ook overgedragen worden via transplantatatie van organen (hart, nieren, lever), via bloedtransfusie of per ongeluk door het personeel in de laboratoria en zorginstellingen. (Instituut voor Tropische Geneeskunde & Belgische Vereniging van LaboratoriumTechnologen, 2007) 1.1. PARASIET Er zijn vier Plasmodium species die de mens infecteren en malaria kunnen veroorzaken; P.falciparum, P.vivax, P.ovale en P.malariae. Meer info en afbeeldingen over deze parasieten in Bijlage 1: Plasmodium Falciparum en bijlage 2: Plasmodium Ovale De cyclus bevat een seksuele cyclus (sporogenie) met vermenigvuldiging in bepaalde Anopheles soorten en een aseksuele cyclus (schizogenie) met vermenigvuldiging in de gewervelde gastheer. De levenscyclus is voor de vier species van Plasmodium gelijkaardig met slechts enkele verschillen. (Instituut voor Tropische Geneeskunde & Belgische Vereniging van LaboratoriumTechnologen, 2007) (Guillaume, 2009) ASEKSUELE CYCLUS IN DE MENS De besmette Anopheles mug steekt de mens en zuigt bloed op. Tijdens het steken worden de sporozoïeten geïnjecteerd in de bloedstroom van de mens met een beetje speeksel van de mug dat een anticoagulans bevat. De sporozoïeten in de bloedstroom migreren naar de lever waar ze de levercellen (hepatocyten) binnen dringen waarin de parasiet zich aseksueel zal vermenigvuldigen (schizogenie in de lever, pre-erytrocytaire fase) tot een schizont ontstaat. Deze schizont leidt uiteindelijk tot duizenden merozoïten. De fase in de lever is de incubatieperiode van de parasiet en verloopt asymptomatisch. Uiteindelijk barst de levercel die de schizont bevat open waardoor al de merozoïeten vrijkomen in de bloedbaan. Elke merozoït infecteert een rode bloedcel. Wanneer de parasiet in de rode bloedcel zit, spreekt men van een trofozoïet. In de rode bloedcel zal de parasiet zich opnieuw vermenigvuldigen tot een schizont (schizogenie in de rode bloedcel, erytrocytaire fase). Deze schizont voedt zich met het hemoglobine in de rode bloedcel wat leidt tot het metabolisatieproduct hemozoïne. Dit hemozoïne bestaat voornamelijk uit ijzercomponenten en toont zich onder de vorm van een pigment. Op het einde van de vermenigvuldiging barst ook hier de schizont open en komen de merozoïeten vrij die opnieuw nieuwe rode bloedcellen kunnen infecteren, wat gepaard gaat met symptomen (koortsige aanvallen). 5 P a g i n a

22 Sommige leverschizonten kunnen blijven voortbestaan in de levercellen tot jaren na de infectie, namelijk hypnozoïeten. Hypnozoïeten worden alleen teruggevonden bij P.ovale en P.vivax. Hypnozoïeten kunnen de oorzaak zijn van een nieuwe malaria aanval tot zelfs jaren nadat de persoon teruggekeerd is uit de streek waar hij besmet raakte. Na de verschillende cycli in de rode bloedcellen zullen sommige parasieten zich differentiëren in seksuele vormen, namelijk gametocyten. Wanneer een Anopheles mug deze persoon terug steekt zal de mug deze gametocyten opnemen. Deze mug is de vector waarin de seksuele cyclus van de parasiet plaats vindt. Gametocyten geven geen symptomen bij de geïnfecteerde personen. Deze kunnen zelfs tot meerdere dagen of weken na de behandeling teruggevonden worden in het perifere bloed omdat deze niet gevoelig zijn aan de behandeling. Door de opeenvolging van de erytrocytaire cycli zal de parasitemie zich steeds verhogen. (Instituut voor Tropische Geneeskunde & Belgische Vereniging van LaboratoriumTechnologen, 2007) (Guillaume, 2009) (World Health Organization, 1999) SEKSUELE CYCLUS IN DE ANOPHELES MUG Er zijn 60 soorten Anopheles muggen die een belangrijke vector zijn voor malaria. Aangezien enkel de vrouwelijke muggen een bloedmaaltijd nemen, komen ook enkel deze muggen in aanmerking voor de overdracht van malaria. Wanneer de vrouwelijke Anopheles mug een bloedmaaltijd neemt bij een mens met malaria, zuigt deze zowel de aseksuele vormen op als de gametocyten. Enkel de gametocyten overleven de vertering in de mug en kunnen zich verder ontwikkelen. Mannelijke gameten delen zich in gameten die de vrouwelijke gameten kunnen bevruchten wat tot het voortbrengen van zygoten leidt. Deze zygoten vormen zich om tot mobiele oökineten. Oökineten migreren door de maagwand van de mug en nestelen zich in de buitenwand van de maag. Deze genestelde oökineten worden oöcysten genoemd. Een oöcyst kan duizenden sporozoïten produceren en loslaten rond de maag van de mug. De losgelaten sporozoïten migreren naar de speekselklieren van de mug. De ontwikkeling in de mug is afhankelijk van het Plasmodium species, maar ook van de buitentemperatuur. Hoe lager de buitentemperatuur, hoe trager de cyclus en zelfs bij een temperatuur onder de 18 C is de ontwikkeling zo traag dat de levensduur van de mug overschreden wordt. (Instituut voor Tropische Geneeskunde & Belgische Vereniging van LaboratoriumTechnologen, 2007) (Guillaume, 2009) (Simon-Lopez, 2013) 1.2. IMMUNITEIT Malaria komt in bepaalde streken vaak voor, deze streken worden endemische streken genoemd. Omdat de lokale bevolking in deze streken frequent geïnfecteerd werd hebben sommige personen na enkele jaren een natuurlijke immunisatie verwoven voor de parasiet. Echter komt deze immuniteit langzaam op gang en verschijnt dit pas 2 tot 5 6 P a g i n a

23 jaar na blootstelling. Door deze verworven immuniteit kunnen deze personen de parasiet asymptomatisch dragen. Dit betekent echter niet dat deze personen een totale bescherming hebben voor malaria, ze kunnen nog steeds geïnfecteerd worden maar vertonen echter geen symptomen. Deze immuniteit is labiel en verdwijnt tussen de 12 en 24 maanden in afwezigheid van herinfectie. Het biedt dus zeker geen garantie tot een totale en levenslage immuniteit. In deze streken worden vooral jonge kinderen en zwangere vrouwen getroffen door malaria. Jonge kinderen hebben nog geen voldoende immuniteit opgebouwd en. Bij zwangere vrouwen is de immuniteit verzwakt en kan de parasiet zich manifesteren in de placenta. (Instituut voor Tropische Geneeskunde & Belgische Vereniging van LaboratoriumTechnologen, 2007) (Paugam & Yera, 2005) (Lee et al, 2012) (World Health Organization, 1999) (World Health, Organization, 2012) Niet-endemische gebieden zijn gebieden waar malaria helemaal niet frequent voorkomt. Bijgevolg is deze bevolking ook niet geïmmuniseerd. Personen uit deze bevolking hebben een grotere kans op malaria omdat ze geen verwoven immuniteit hebben. (Instituut voor Tropische Geneeskunde & Belgische Vereniging van LaboratoriumTechnologen, 2007) (World Healt Organiztion, 2012) 1.3. THERAPIE PROFYLAXIE De muggen in de risicogebieden zijn vooral s avonds en s nachts actief, door beschermende kledij te dragen en te slapen onder een muskietennet kan een beet van een Anopheles mug al vermeden worden Malaria-infectie bij reizigers in de risicogebieden wordt voorkomen door het innemen van malariaprofylaxe (chemoprofylaxe) middelen. Profylaxe middelen voorkomen geen besmetting maar wel een uitbraak van een malaria aanval, maar kunnen wel de aanval uitstellen. Afhankelijk van het gebied, het seizoen, de verblijfsduur en eerder ingenomen profylaxe wordt voor een bepaalde profylaxe gekozen. ( 2010) (World Health Organization, 2012) Er wordt volop onderzoek verricht naar de ontwikkeling van een vaccin tegen malaria door het opsporen en onderzoeken van de verschillende antigenen. Maar tot nu toe is er nog steeds geen efficiënt vaccin werkzwaam. Het doel van vaccinatie is om in het lichaam antistoffen te vormen die specifiek binden aan de antigenen van de parasiet. (Strien, 2002) 7 P a g i n a

24 Tabel 2: Malariaprofylaxe ( 2010) Actieve stof Chloroquine Atovaquon + proguanil Mefloquine Doxycycline Beschrijving P.vivax, P.ovale en P.malariae, P.falciparum is vaak resistent Voor reizigers: één week voor vertrek innemen tot weken na terugkomst ( 3 tabletten per week) P.vivax, P.ovale en P.malariae en P.falciparum Voor reizigers: één dag voor vertrek innemen tot 1 week na terugkomst (1 tablet/dag) P.vivax, P.ovale, P.malariae en P.falciparum Voor reizigers: twee weken voor vertek innemen tot 4 weken na terugkomst (1 tablet/week) P.vivax, P.ovale, P.malariae en P.falciparum Voor reizigers: één dag voor vertek innemen tot 4 weken na terugkomst (1 tablet/dag) BEHANDELING Om een acute malaria-aanval te behandelen komen verschillende actieve stoffen in aanmerking. Tabel 3: Behandeling malaria aanval ( 2010) Actieve stof(fen) Atovaquon + Proguanil Artemether + Lumefantrine Beschrijving 4 tabletten éénmaal per dag 24 tabletten (6x 4 tabletten) in een periode van 60 uur Kinine + Doxycyxline Artemsinine combinaties Chloroquine Minimum 3 dagen inname van kininesulfaat (500mg) om de 8 uur en op dag 3 of 2 wordt doxycycline gestart (200mg) en de dag erna wordt de dosis gehalveerd (100mg) gedurende de komende 6 dagen. Artesunaat (dag 1 200mg, dag mg) altijd in combinatie met doxycycline of mefloquine. 25 mg per kg lichaamsgewicht op drie dagen (enkel bij verlaten van een gebied waar P.falciparum of choroquine resistentie zeer laag is of onbestaand) RESISTENTIE Bij de Plasmodium-parasiet kunnen ook toevallige mutaties van het parasitaire genoom optreden. Wanneer deze mutaties optreden wanneer antimalariatherapie wordt toegepast, zullen parasieten zonder mutatie vernietigd worden, maar parasieten met een mutatie kunnen de parasiet resistent maken tegen de behandeling waardoor deze de therapie overleven. Zo zullen deze resistente parasieten zich verder vermenigvuldigen waardoor de reeds toegepaste therapie niet meer effectief zal zijn. Op deze manier is er voor vele antimalariamedicatie langzaam een resistentie ontstaan. Vandaar is het belangrijk om steeds op zoek te gaan naar nieuwe therapieën. De keuze voor een 8 P a g i n a

25 therapie waar twee actieve stoffen gecombineerd worden, vermindert de kans op resistentie. (Instituut voor Tropische Geneeskunde & Belgische Vereniging van LaboratoriumTechnologen, 2007) (World Health Organization, 1999) 1.5. RECIDIVITEIT Naast resistentie kan ook recidiviteit optreden. Wanneer een therapie niet de interhepatische parasieten (hypnozoïeten) bij P.vivax, P.ovale en P.malariae infecties treft, kunnen deze ook lang in de lever verblijven en de oorzaak zijn van een herval. (Instituut voor Tropische Geneeskunde & Belgische Vereniging van LaboratoriumTechnologen, 2007) 1.6. SYMPTOMEN De symptomen van een malaria-infectie zijn moeilijk te definiëren en heel aspecifiek. Een hoge parasitemie gaat niet steeds gepaard met sterkere symptomen. De meest voorkomende symptomen zijn koorts, rillingen, gewrichtspijn, soms overgeven en diarree. Deze symptomen lijken erg op een griep waardoor malaria soms hiermee verward. (Instituut voor Tropische Geneeskunde & Belgische Vereniging van LaboratoriumTechnologen, 2007) (Castrynck, 2013) (World Health Organization, 2003) 1.7. KLINISCHE VERSCHIJNSELEN HEMATOLOGIE In sommige gevallen van een malaria-infectie wordt een verlaagd aantal bloedplaatjes of trombocyten teruggevonden (trombopenie). Zowel leukopenie als leukocytose kunnen optreden bij een infectie met de Plasmodium parasiet. Bij een malaria-infectie kunnen ook grote lymfocyten en monocyten waargenomen worden omdat deze cellen de infectie willen bestrijden door fagocytose. (Instituut voor Tropische Geneeskunde & Belgische Vereniging van LaboratoriumTechnologen, 2007) (Paugam & Yera, 2005) (World Health Organization, 2003) BIOCHEMIE Bij malaria kan ook het C-reactief proteïne (CRP) verhoogd zijn omwille van de infectie. Ook kan het gehalte billirubine verhoogd zijn door de lyse van de levercellen. Een verhoogd gehalte lacaat dehydrogenase (LDH) en hypoglycemie worden ook soms teruggevonden bij een malaria-infectie. (Paugam & Yera, 2005) (Nicolas et al., 1998) 9 P a g i n a

26 1.8. DIAGNOSE De diagnose van malaria kan vastgesteld worden door microscopie (onderzoek bloeduitstrijkje en dikdruppelpreparaat), immunochromatografische sneltesten, serologie, moleculaire technieken (PCR) en automatische celtellers MICROSCOPIE Microscopisch onderzoek kan uitgevoerd worden op een bloeduitstrijkje of een dikdruppelpreparaat. Als monster wordt volbloed gebruikt dat wordt afgenomen via een vingerprik of via een veneuze punctie. Het bloeduitstrijkje wordt gekleurd met May- Grünwald Giemsa en het dikdruppelpreparaat met Giemsa. Het bloeduitstrijkje wordt vooral gebruikt om de Plasmodium species te differentiëren. (Instituut voor Tropische Geneeskunde & Belgische Vereniging van LaboratoriumTechnologen, 2007) (Paugam & Yera, 2005) (World Health Organization 1999) (World Health Organization 2009) (Guillaume, 2009) (De Jonge et al., 1999) IMMUNOCHROMATOGRAFIE (SNELTEST) Commerciële malariasneltesten zijn gebaseerd op het immunochromatografisch principe. Deze testen detecteren de parasitaire antigenen in een bloedhemolysaat. Deze testen bevatten monoklonale antilichamen gericht tegen één of meerdere Plasmodium antigenen. (Paugam & Yera, 2005) (Instituut voor Tropische Geneeskunde & Belgische Vereniging van LaboratoriumTechnologen, 2007) HRP-2 HRP-2 is een wateroplosbaar proteïne, namelijk een glycoproteïne dat geproduceerd wordt door de aseksuele vormen en de jonge gametocyten van P.falciparum. Dit proteïne wordt in grote hoeveelheid teruggevonden op de oppervlakte van de geparasiteerde rode bloedcellen omdat het uitgescheiden wordt doorheen de celwand van de geïnfecteerde rode bloedcel. Momenteel wordt steeds HRP-2 gedetecteerd samen met een panmalaria antigen, dit is een antigen dat geproduceerd wordt door alle vier species van Plasmodium. (Paugam & Yera, 2005) (Instituut voor Tropische Geneeskunde & Belgische Vereniging van LaboratoriumTechnologen, 2007) (Hopkins et al., 2007) (Hänscheid, 199) PLDH Het panmalaria antigen pldh, parasietspecifiek lactaat dehydrogenase is een enzyme dat betrokken is bij de glycolyse en wordt geproduceerd door de aseksuele vormen en de gametocyten van de levende parasieten en in mindere mate door de sexuele vormen. (Paugam & Yera, 2005) (Instituut voor Tropische Geneeskunde & Belgische Vereniging van LaboratoriumTechnologen, 2007) (Hopkins et al., 2007) (Hänscheid, 199) 10 P a g i n a

27 SEROLOGIE De antilichamen in het bloed kunnen ook aangetoond worden en een hulp zijn bij de diagnose. Maar deze zijn pas aantoonbaar minstens één week na het begin van de symptomen. Onderzoek voor deze fase zou tot vals negatieve vastellingen leiden en bovendien kunnen reeds genezen patiënten tot enkele maanden vals positief reageren. Deze opsporing kan wel van belang zijn om aan te tonen of een persoon in het verleden een malaria-infectie heeft doorgemaakt. Deze antilichamen geven geen bescherming tegen en volgende besmetting. De meest gebruikte technieken zijn de indirecte immunofluorescentie en de ELISA-test. Deze methode gebruikt de antigenen voor de detectie van antilichamen tegen Plasmodium. De parasitemie die nog te laag is om in een dikdruppel zichtbaar te zijn, is de subpatente parasitemie. Deze parasitemie kan echter wel al gedetecteerd worden door de serologische technieken. (Paugam & Yera, 2005) (Instituut voor Tropische Geneeskunde & Belgische Vereniging van LaboratoriumTechnologen, 2007) Deze techniek wordt toegepast voor de screening van bloeddonoren en voor de bevestiging van een vroegere vermoedde malaria-aanval. (Instituut voor Tropische Geneeskunde & Belgische Vereniging van LaboratoriumTechnologen, 2007) MOLECULAIRE TECHNIEKEN Deze technieken worden toegepast in de referentielaboratoria voor malaria. Deze techniek heeft de grootste gevoeligheid en de grootste specificiteit en wordt niet toegepast in de routine omdat dit een tijdrovende en dure techniek is. De techniek is het beste voor de identificatie van twijfelachtige species en ook voor de vaststelling van een menginfectie. De test wordt toegepast als confirmatie van de microscopie. De subpatente parasitemie kan echter wel al gedetecteerd worden met de PCR-techniek. (Instituut voor Tropische Geneeskunde & Belgische Vereniging van LaboratoriumTechnologen, 2007) (Paugam & Yera, 2005) (Hänscheid, 199) HEMATOLOGISCHE ANALYSERS Hematologische analysers kunnen ook bijdragen in de detectie van malaria. De Abott Cell-Dyn 3000 en 4000 kunnen het hemozoïne in de monocyten en neutrofielen detecteren door depolarisatie van licht. De Abott Cell-Dyn 4000 kan ook het aanwezige DNA van de parasiet in de geïnfecteerde rode bloedcellen detecteren door de fluorescentiekleuring die normaal wordt gebruikt voor de telling van reticulocyten. De UniCel DxH 800 meet de standaarddeviatie van het volume van de lymfocyten en monocyten en berekent hieruit een discriminant factor voor de indicatie van malaria. Dit laatste toestel wordt gedetailleerd besproken in het experiment 1. Beckman Coulter UniCel DxH 800. (Instituut voor Tropische Geneeskunde & Belgische Vereniging van LaboratoriumTechnologen, 2007) (Campuzona-Zulunga, 2010) (Briggs et al., 2006) 11 P a g i n a

28 2. LITERATUUR Het menselijk lichaam reageert op een malaria-infectie door een stijging van het aantal monocyten en de activering van monocyten wat resulteert in grotere monocyten. Mononuclaire fagocyterende cellen zullen bij een malaria-infectie trachten de geïnfecteerde rode bloedcellen te fagocyteren. Hemozoïne is een bruin pigment dat geproduceerd wordt wanneer de parasieten het hemoglobine in de rode bloedcellen verteren. Hemozoïne wordt gefagocyteerd door neutrofielen en monocyten. Het is ook bewezen dat de lymfocyten een belangrijke rol spelen in de afweerreactie op malaria. Door de activatie van de lymfocyten zijn deze cellen ook groter dan de gewone lymfocyten. (Pierce & Miller, 2009) (Chua et al., 2013) (Fourcade et al., 2004) (Briggs et al., 2006) (Lee at al, 2012) (Simon-Lopez, 2013) Studies hebben aangetoond dat de spreiding (standaarddeviatie: SD) van het volume (grootte) van de populatie monocyten en de populatie lymfocyten significant verschillend is bij een malaria-infectie t.o.v. normaal. Beckman Coulter UniCel DxH 800 is een automatische hematologische celteller die deze grootte of volume van de cellen in deze populaties meet en een standaarddeviatie op deze populatie berekent met behulp van de VCS technologie. De VCS technologie laat toe om het volume, conductiviteit en de scattering van een cel simultaan te meten. Meer informatie over deze technologie wordt vermeld in Meetprincipe. Het volume van een cel wordt volgens het impedantie principe gemeten. Uit de standaarddeviatie van het volume van de monocyten (SD V monocyten) en de standaarddeviatie van het volume van de lymfocyten (SD V lymfocyten) wordt een malaria discriminant factor berekend. Wanneer deze factor hoger is dan een bepaalde cut-off waarde, wijst dit op een indicatie van een malaria-infectie. (Fourcade et al., 2004) (Briggs et al., 2006) (Lee at al, 2012) (Simon-Lopez, 2013) Figuur 3: VCS-data (V: volume, C: conductiviteit, S: scattering) met het gemiddelde (Mean) en de standaarddeviatie (SD) van de populatie witte bloedcellen (NE: neutrofielen, LY: lymfocyten, MO: monocyten en EO: eosinofielen) na telling en differentiatie op de UniCel DxH 800. Links de VCS-data van een persoon in goede gezondheid. Rechts de VCS-data van een persoon met een malaria-infectie die een duidelijk hoger gemiddeld volume en een grotere standaarddeviatie van de monocyten en lymfocyten weergeeft. (Briggs et al., 2006) Een witte bloedcelhistogram (WBC histogram) onderscheidt na analyse de witte bloedcellen van de gekernde rode bloedcellen (erytroblasten) en puin (apoptotische cellen, celmembranen, infectieuze organismen, ) op basis van hun grootte uitgedrukt in fl. Vanaf de drempelwaarde van 35 fl worden cellen als witte bloedcellen geïdentificeerd. 12 P a g i n a

29 Een WBC histogram geeft een grootteverdeling weer van de witte bloedcellen. Een WBC histogram van een monster met een malaria-infectie vertoont een kleine extra piek voor de drempel van 35 fl die afwezig is bij personen in goede gezondheid. (Briggs et al., 2006) (Simon-Lopez, 2013) Figuur 4: Histogram van de witte bloedcellen met op de x-as de grootte of volume (fl) en op de y-as de celfrequentie. Links een histogram van een persoon in goede gezondheid en rechts van een persoon met een malaria-infectie met een extra piek voor de drempelwaarde van 35 fl. (Briggs et al., 2006) Voor de differentiatie van de verschillende celpopulataties wordt een 2D-dataplot weergegeven die het volume (y-as) uitzet t.o.v. geroteerde lichtverstrooiing (x-as). Door de aanwezigheid van geactiveerde monocyten en geactiveerde monocyten in monsters met Plasmodium parasieten, is de populatie monocyten en lymfocyten op de dataplot minder geconcentreerd dan bij monsters van gezonde personen. Door de heterogeniteit in volume (grootte) van cellen binnen de populatie, liggen de dots ook meer verspreid en minder geconcentreerd. (Briggs et al., 2006) (Simon-Lopez, 2013) Figuur 5: 2D-dataplot van de bloedcepopulaties met op de x-as de lichtverstrooiing en op de y-as het volume. Links een persoon in goede gezondheid met een goede scheiding in de celpopulaties en een geconcentreerde lymfocyten en monocyten populatie. Rechts een persoon met een malaria-infectie met geen goede scheiding tussen de celpopulaties en een heterogene minder geconcentreerde lymfocyten en monocyten populatie. (Briggs et al., 2006) Studie Briggs et al. Een studie in Zuid-Afrika en Londen onderzocht een groep monsters afkomstig van gezonde personen met bloedwaarden binnen de referentiewaarden (n=1079), een groep monsters waar een malaria onderzoek door de dokters is aangevraagd (n=275) en een groep monsters afkomstig van personen met een HIV-infectie (n=51). Deze groepen werden geanalyseerd met de VCS technologie en werden vergeleken met de microscopie 13 P a g i n a

30 en immunologische diagnostische technieken. De monsters bestonden uit perifeer bloed in K 3 EDTA tubes. Uit de groep waarop een malaria onderzoek werd aangevraagd bleken 147 monsters echt positief voor een malaria-infectie, de overige stalen waren afkomstig van personen met koorts, virale of besmettelijke ziektes. De monsters werden geanalyseerd op de Beckman Coulter analyser en microscopisch onderzocht ter referentie. De resultaten van de SD volume van de lymfocyten en monocyten, het gemiddelde volume van monocyten, de malaria discriminant factor, het aantal bloedplaatjes en het aantal eosinofielen werden met behulp van de Mann-Whitney U test onderzocht om statistische verschillen vast te stellen tussen de malaria positieve monsters verdacht op malaria-infectie, malaria negatieve monsters verdacht op malariainfectie, HIV positieve monsters en de monsters uit de controlegroep (gezond). De HIV positieve groep, de malaria negatieve groep en de malaria positieve groep hadden significant hogere waarden dan de controlegroep bij de variabelen malaria discriminant factor, SD V monocyten, SD V lymfocyten en gemiddeld volume van de monocyten (p<0.0001). De malaria negatieve monsters en de HIV positieve monsters waren ook significant verschillend van de malaria positieve monsters bij deze variabelen (p<0.0001). De malaria positieve monsters en de malaria negatieve monsters hadden een lager aantal bloedplaatjes dan de controlegroep (p<0.05). De malaria positieve monsters hadden een significant lager aantal bloedplaatjes dan de malaria negatieve groep (p<0.001). De malaria positieve monsters hadden ook een lager aantal bloedplaatjes dan HIV positieve monsters (p<0.001). (Briggs et al., 2006) Een ROC-analyse werd ook uitgevoerd op de malariafactor om een grenswaarde of cutt-off value in te stellen voor de detectie van malaria. De ROC-curve toonde aan dat de grenswaarde van 3,7 voor de malaria factor een sensitiviteit had van 98% en een specificiteit van 94%. Een lagere cut-off waarde resulteert in een lagere specificiteit (hoger aantal vals waarden), een hogere factor in een lagere sensitiviteit (hoger aantal vals negatieve waarden). De UAC (area under the curve) bedraagde 0,983. (Briggs et al., 2006) In deze studie werd echter geen relatie gevonden tussen het percentage parasitemie en de waarde van de malariafactor. Een hoge parasitemie gaat dus niet gepaard met een hoge malariafactor. Het type Plasmodium species beïnvloedde ook niet de malariafactor. (Briggs et al., 2006) Figuur 6: ROC-analyse voor de malariafactor. Een cut-off waarde of grenswaarde van 3,7 vertoont een sensitiveit van 98% en een specificiteit van 94%. Een lagere cut-off waarde resulteert in een lagere specificiteit, een hogere factor in een lagere sensitiviteit. (Briggs et al., 2006) 14 P a g i n a

31 De valspositieve monsters waren vooral afkomstig van personen met andere infecties. Een virale infectie zoals bijvoorbeeld HIV kan de SD V lymfocyten verhogen wat kan resulteren in vals positieve waarden van de malariafactor. Deze studie moet herhaald worden op monsters afkomstig van kinderen omdat kinderen verschillend van volwassenen reageren op infecties wat kan resulteren in verschillende veranderingen in de VCS-data. (Briggs et al., 2006) Studie H.K. Lee et al. De volledige bloedbeeld- (CBC) telling werd uitgevoerd op de UniCel DxH 800 tussen juli 2009 en april 2011 in Seoul in St. Mary's Hospital, Korea. Deze analyse werd uitgevoerd op een groep personen met P.vivax infectie (84 tot AP/μL en gemiddeld 6532 AP/μL) (AP= aantal parasieten), een malaria negatieve groep (inclusief personen met sepsis, hematologische aandoeningen en gezonde personen) en een groep monsters met leukopenie (<2000 WBC/µl). Microscopie was de referentiemethode om malaria te diagnosticeren en werd uitgevoerd door experts. De patiënten met een malaria-infectie werden behandeld met hydroxychloroquine en primaquine. Enkele patiënten werden ook opgevolgd. De dataplots van de genucleëerde rode bloedcellen (NRBC) werden gescreend. (Lee at al, 2012) De monsters positief voor P.vivax vertoonde karakteristieke, geaggregeerde ronde signalen die laag gelegen waren op de RLALS-as (y-as, lichtverstrooiing) en op de AL2-as (x-as, doorgelaten licht). De malariasignalen waren groen, de NRBC-signalen rood en de WBC-signalen blauw op de 2D-plot. Op de differentiatie-dataplots waar het volume werd uitgezet t.o.v. de geroteerde lichtverstrooiing (x-as, RLS) lagen de malariasignalen horizontaal gelegen op de bodem onder de witte bloedcelpopulaties en waren rood. Deze rode plots waren echter inclusief de rode bloedcellen die ook rode signalen geven. (Lee at al, 2012) Figuur 7: NRBC 2D-plot (y-as RLALS, x-as AL2) van een patiënt met een P.vivax infectie. Malariasignalen zijn groen, NRBC-signalen rood en de WBC signalen blauw. (Lee at al, 2012) 15 P a g i n a

32 Figuur 8: Differentiatie 2D-plot (y-as volume, x-as RLS) van een patiënt met een P.vivax infectie. Malariasignalen zijn rood (inclusief rode bloedcellen, neutrofielen zijn roze, de blauwe signalen zijn lymfocyten, de groene signalen zijn monocyten, de gele signalen zijn eosinofielen en de witte signalen zijn basofielen. (Lee at al, 2012) De NRBC 2D-plots van patiënten met P.vivax infectie werden verzameld in het begin van de behandeling en gedurende enkele dagen na de behandeling. Naarmate de behandeling vorderde, daalde het aantal malariasignalen op de dataplots. Vier tot twaalf dagen na de behandeling verdwenen de parasieten uit het bloed en waren geen malariasignalen zichtbaar op de plots. De grootte van de malariasignalen was ruw gecorreleerd met de parasitemie. (Lee at al, 2012) Figuur 9: NRBC 2D-plots van een patiënt met P.vivax-infectie. Links de dataplot op dag 0 van de behandeling, in het midden de dataplot na 2 dagen behandeling en rechts de dataplot na 12 dagen behandeling. Naarmate de parasitemie afneemt, neemt ook het aantal malariasignalen af. (Lee at al, 2012) Alle monsters uit de malaria (P.vivax) positieve groep vertoonden de karakteristieke malariasignalen op de NRBC-dataplots en waren makkelijk te identificeren, de sensitiviteit was 100%. Slechts één monster vertoonde licht gelijkaardige signalen maar deze signalen konden makkelijk onderscheden worden van die van de P.vivax monsters, de specificiteit werd hierdoor 100%. Men is echter onzeker welke cellen verantwoordelijk zijn voor deze malariasignalen. Men beweert dat de gametocyten verantwoordelijk zijn voor deze signalen. De gametocyten zijn groter dan andere stadia en werden in alle monsters van de malaria positieve groep teruggevonden. De rode bloedcellen worden 16 P a g i n a

33 gelyseerd om de differentiatie uit te voeren waardoor shizonten tijdens de lyse zullen barsten in kleine merozoiëten en bovendien zijn de trofozoëten veel te klein. Hierdoor zijn enkel de gametocyten potentiëel verantwoordelijk voor deze signalen op de plots van de UniCel DxH 800. (Lee at al, 2012) Studie R. Simon-Lopez Ook deze studie toonde aan dat in malaria positieve monsters de SD V lymfocyten verhoogd is door de aanwezigheid van grote lymfocyten, namelijk reactieve en geactiveerde lymfocyten en dat de SD V monocyten verhoogd is door de aanwezigheid van geactiveerde monocyten, macrofagen en pigment-dragende monocyten. Er werden in deze studie klinische bloedmonsters onderzocht, namelijk monsters waarvan de arts een onverklaarde koorts vaststelde of monsters van personen afkomstig uit malaria endemische gebieden of van personen die gereisd hebben in deze gebieden (n=89). Er waren 32 monsters positief voor P.falciparum (n=28) en P.vivax (n=4) en 57 monsters negatief op basis van microscopisch onderzoek van het bloeduitstrijkje. Het aantal geïnfecteerde rode bloedcellen werd geteld en er werd een range van 0,1% tot 4,65% geïnfecteerde rode bloedcellen bij de positieve monsters waargenomen. De monsters waren afkomstig van zowel kinderen als volwassenen (8 maand tot 72 jaar). Alle monsters werden geanalyseerd op de hematologische analyser Coulter GEN*S TM van Beckman Coulter. De dataplots bij malaria positieve monsters gaven een grotere heterogeniteit in de populatie lymfocyten en monoyten en een extra populatie onder de populatie lymfocyten weer. In het WBC histogram was een extra populatie aanwezig aan de linkerzijde van de lymfocyten wat zichtbaar is als een extra piek voor de grenswaarde van 35 fl. (Simon-Lopez, 2013) Figuur 10: De 2D-dataplots en WBC-histogrammen van een normaal bloedmonster (links) en een bloedmonster met een malaria-infectie (rechts). De dataplot van malaria toont een extra populatie aan onder de populatie lymfocyten en een extra populatie (piek voor 35 fl grenswaarde) voor de lymfocyten op het histogram. (Simon-Lopez, 2013) 17 P a g i n a

34 De onderzochte parameters werden onderworpen aan een statistische analyse m.b.v. de Wilcoxon rank test. De parameters die verantwoordelijk waren voor een significant verschil tussen de positieve en de negatieve malariagroep werden onderworpen aan een ROC-analyse om een cut-off waarde te bepalen voor de detectie van malaria. Deze studie toonde aan dat er een significant verschil verschil was tussen de twee groepen wanneer het gemiddeld volume van de neutrofielen, de SD V lymfocyten, het gemiddeld volume van de monocyten en de SD V monocyten. De ROC analyse van de malaria factor toonde aan dat een cut-off waarde van 5,06 een sensitiviteit gaf van 96,9% en een specificiteit van 82,5%. Een sensitiviteit van 100% gaf echter een specificiteit van 77,2%. Tabel 4: Significante verschillen tussen de malaria positieve en malaria negatieve groep na een Wilcoxon rank test. (Simon-Lopez, 2013) Positieve Negatieve Significantie Gemiddeld V neutrofielen Gemiddeld V monocyten SD V monocyten SD V lymfocyten 151,8 ± 11,9 145,7 ± 12,4 p = ,6 ± 12,1 170,4 ± 11,9 p = ,7 ± 3,6 20,1 ± 4,1 p = ,6 ± 4,2 20,3 ± 4,4 p = Figuur 11: ROC-analyse van de malariafactor toont een cutt-off waarde van 5,06 met een sensitiviteit van 69,9% en een specificiteit van 82,5%. (Simon-Lopez, 2013) Omdat de SD V volumes van de monocyten en de lymfocyten significant verschillend zijn tussen de malaria positieve bloedmonsters en de malaria negatieve bloedmonsters, werden op deze paramers additionele testen uitgevoerd. (Simon-Lopez, 2013) De herhaalbaarheid, de stabiliteit en de invloed van de leeftijd van de monsters op de parameters werden onderzocht. Enkele monsters werden meerdere malen op de analyser geplaatst en de variatiecoëfficiënt van de twee parameters werden berekend voor elk monster. De gemiddelde variatiecoëfficiënt van de monsters werd berekend om de herhaalbaarheid uit te drukken, dit bedroeg voor de SD V lymfocyten 4,4% en voor de SD V monocyten 5,5%. De invloed van de leeftijd van het monster werd geevalueerd door 15 monsters op geregelde tijdstippen op hetzelfde toestel te analyseren (5, 8, 11, 17, 29, 53 en 77 uur na de bloedafname). De gemiddelden van het volume en de SD V van de monocyten en lymfocyten werden berekend. Deze test toonde aan dat de SD V lymfocyten en SD V monocyten stabiel blijven gedurende een tijdsperiode van 11u, nadien is er een stijging. (Simon-Lopez, 2013) 18 P a g i n a

35 De stabiliteit werd onderzocht door regelmatig een groep monsters van 10 testpersonen op de Coulter Gen*S TM te analyseren en ook op een ander toestel met hetzelfde VCS detectiesysteem (LH750) gedurende een maand. Het gemiddelde van de volumes en de SD V van de monocyten en lymfocyten werd berekend voor elke groep. Gedurende een maand werd een range van 18,6-20,6 waargenomen voor de SD V lymfocyten en een range van 15,3-16,9 voor de SD V monocyten met een variatiecoëfficiënt gelijk aan 4% voor beide parameters. (Simon-Lopez, 2013) Figuur 12: Herhaalbaarheid. Het gemiddelde SD V volume (Vsd) van de monocyten en lymfocyten van 10 monsters na elke run. Voor de lymfocyten is de gemiddelde variatiecoëfficiënt 4,4% en voor de monocyten 5,5%.(Simon-Lopez, 2013) Figuur 13: De invloed van de leeftijd van het monster op de SD V volume (Vsd) van de monocyten en lymfocyten. Het gemiddelde SD V volume (Vsd) van de monocyten en lymfocyten van 10 monsters gedurende een tijdspanne van 77u. Het monster is stabiel voor deze parameter gedurende 11 uur na de bloedafname. (Simon- Lopez, 2013) Conclusie Microscopie blijft de gouden standaard voor de malariadiagnose. De PCR-techniek is bewezen gevoeliger om de 4 species te identificeren maar is vooral duur en niet praktisch in de routinelabo s. De malariafactor mag niet dienen als vervanging van de microscopie maar dient om het laboratoriumpersoneel te waarschuwen om aandachtig te zijn voor malaria in bepaalde monsters en bloeduitstrijkjes. 19 P a g i n a

36 V. EXPERIMENTEN 1. BECKMAN COULTER UniCel DxH MATERIAAL EN METHODEN APPARATUUR De automatische celteller UniCel DxH 800 van Beckman Coulter werd gebruikt om de celtelling en de differentiatie van de bloedmonsters uit te voeren MONSTER Als monster werd gebruik gemaakt van een volbloed K 3 EDTA-tube. Een minimumvolume van 200µl monster is vereist. Het monster mag maximaal 48u na afname op het toestel geanalyseerd worden (zie Appendix 7) (Beckman Coulter Ireland, 2013) MEETPRINCIPES Beckman Coulter heeft een patent op de Coulter methode. Deze methode wordt toegepast om de de Complete Blood Count op een monster uit te voeren. De VCS technologie wordt gebruikt voor de differentiatie van de witte bloedcellen. Deze technologie steunt op 3 meetprincipes; volume, conductiviteit en laserlichtverstrooiing (scattering). Tabel 5 geeft per parameter de beschrijving, de eenheid en het meetprincipe weer. (Beckman Coulter Ireland, 2013) Tabel 5: Beschrijving, eenheid en meetprincipe per parameter bij analyse op de UniCel DxH 800 (Beckman Coulter Ireland, 2013) Parameter Meetprincipe Eenheid WBC White Blood Cell Count Coulter principe 10³ cells/μl RBC Red Blood Cell Count Coulter principe 10 6 cells/μl HGB Hemoglobine Spectrofotometrie g/dl MCV Mean Corpuscular Volume Afgeleid uit RBC histogram fl Gemiddeld volume van de rode bloedcellen PLT Platelet Count Coulter principe 10³ cells/μl MPV Mean Platelet Volume Gemiddeld volume van de bloedplaatjes Afgeleid uit PLT histogram Fl NE Neutrofielen percentage [NE /(NE+LY+MO+EO+BA events)] x 100 VCSn technologie % LY Lymfocyten percentage [LY /(NE+LY+MO+EO+BA events)] x 100 VCSn technologie % MO Monocyten percentage [MO /(NE+LY+MO+EO+BA events)] x 100 VCSn technologie % 20 P a g i n a

37 EO BA NRBC HCT MCH MCHC RDW RDW- SD NE# LY# MO# EO# BA # NRBC # Eosinofielen percentage [EO /(NE+LY+MO+EO+BA events)] x 100 Basofielen percentage [BA /(NE+LY+MO+EO+BA events)] x 100 Nucleated Red Blood Cell percentage Erytroblasten Hematocriet The relative volume of packed erythrocytes to whole blood Mean Corpuscular Hemoglobin Gemiddelde hoeveelheid hemoglobine in de RBC Mean Corpuscular Hemoglobin Concentration Gemiddelde concentratie hemoglobine in de RBC Red Cell Distribution Width De grootteverdeling spreiding van de RBC (Variatiecoefficiënt) Red Cell Distribution Width SD De grootteverdeling spreiding van de RBC (Standaarddeviatie) Neutrofielen (absoluut aantal) Lymfocyten (absoluut aantal) Monocyten (absoluut aantal) Eosinofielen (absoluut aantal) Basofielen (absoluut aantal) Nucleated red blood cells (absoluut aantal) VCSn technologie % VCSn technologie % VCSn technologie /100 WBC Berekening Hct (%) = (RBC X MCV)/10 % Berekening MCH (pg) = (Hgb/RBC) x 10 Pg Berekening MCHC (g/dl) = (Hgb/Hct) x 100 g/dl Afgeleid uit RBC histogram % Afgeleid uit RBC histogram fl Berekening NE# (10³/μL) = (NE/100) x WBC 10³ cells/μl Berekening LY# (10³/μL) = (LY/100) x WBC 10³ cells/μl Berekening MO# (10³/μL) =(MO/100) x WBC 10³ cells/μl Berekening EO# (10³/μL) = (EO/100) x WBC 10³ cells/μl Berekening BA# (10³/μL) = (BA/100) x WBC 10³ cells/μl Berekening 10³ cells/μl NRBC (10³/μL) = (NRBC/100) x WBC COMPLETE CLOOD COUNT (COULTER PRINCIPE) De complete blood count (CBC) bevat de telling van de witte bloedcellen, de rode bloedcellen en de bloedplaatjes. De naald aspireert 165 µl monster uit de tube en een pomp zorgt ervoor dat het monster naar het WBC- en het RBC-bad getransporteerd wordt. Hierin wordt diulent onderaan het bad via aan opening onder een spiraalstroom in het bad aangevoerd. In het WBC-bad wordt WBC-diluent en lyse toegevoegd, aan het 21 P a g i n a

38 RBC-bad enkel RBC-diluent. Door deze spiraalstroom worden luchtbellen voorkomen en ontstaat een goed mengsel. (Beckman Coulter Ireland, 2013) Tabel 6: Baden voor het mengen van reagens met monster in de UniCel DxH 800 (Beckman Coulter Ireland, 2013) WBC bad RBC bad Monster 28 µl 1,6 µl DxH Diluent 6 ml 10 ml DxH Cell Lyse 1,08 ml / Finale dilutie 1:251 1:6250 De suspensie (reagens en de cellen) wordt doorheen een meetopening geleid. Alle cellen passeren één voor één door de meetopening. Achter de opening stroomt een extra hoeveelheid diluent in één richting (sweep flow) die de cel meeneemt in de stroom waardoor voorkomen wordt dat de cellen opnieuw door de opening passeren (recirculatie) en worden geteld als bloedplaatjes. (Beckman Coulter Ireland, 2013) De coulter methode telt en meet de cellen door het meten en detecteren van veranderingen in elektrische weerstand wanneer een partikel in een conductieve diluent passeert doorheen een smalle opening. Aan beide kanten van de opening bevindt zich een elektrode, deze elektroden zorgen voor een bepaalde spanning in de opening. Wanneer een cel of partikel doorheen deze opening passeert, zal dit een hogere weerstand genereren. Dit resulteert in een meetbare elektrische puls. De grootte van de elektrische puls is proportioneel aan het celvolume en de het aantal pulsen is een waarde voor de celtelling. (Beckman Coulter Ireland, 2013) Figuur 14: Coulter-methode in de Beckman Coulter DxH voor de celtelling van bloedcellen in een bloedmonster (Beckman Coulter Ireland, 2013) Om foute waarden te voorkomen (bijvoorbeeld als gevolg van een geblokkeerde opening), wordt voor elke staalverdunning drie metingen in 3 verschillende meetopeningen geanalyseerd. Het gemiddelde van deze metingen wordt weergegeven als het resultaat. Er moeten minstens twee metingen zijn die binnen elkaars bereik liggen om een resultaat te kunnen rapporteren. Een meting die volledig afwijkt van de twee andere metingen wordt automatisch geëxcludeerd. Wanneer er voor een parameter geen twee metingen binnen elkaars bereik liggen, geeft het systeem geen waarde voor 22 P a g i n a

39 deze parameter en voor de parameters die hiervan afhankelijk zijn (bijvoorbeeld de berekende parameters). Een resultaat is dus minstens het gemiddelde van twee metingen. Wanneer na de celtelling te weinig elektrische pulsen werden waargenomen, zal het toestel automatisch de telling verlengen. (Beckman Coulter Ireland, 2013) HEMOGLOBINE (SPECTROFOTOMETRISCH PRINCIPE) Vanuit de verdunning voor de WBC-telling wordt het hemoglobine in een aparte meetkamer (cuvet) bepaald. Het lysereagens lyseert de rode bloedcellen waardoor het hemoglobine vrij komt en met het reagens een gekleurd complex vormt (hemochromogeen) dat gemeten kan worden. De absorptie van het gekleurd complex is recht evenredig met het hemoglobinegehalte van het monster. Hemoglobine wordt fotometrisch gemeten bij een golflengte van 525 nm. Een optische lichtbundel schijnt door de cuvet en een fotodetector meet de absorptie van de lichtbundel. Hoe meer licht geabsorbeerd wordt, hoe meer gekleurd complex aanwezig in de verdunning en hoe hoger het hemoglobinegehalte. Bij elke analyse wordt eerst een blancometing uitgevoerd op diluent waarmee het monstersignaal wordt vergeleken. (Beckman Coulter Ireland, 2013) DIFFERENTIATIE (VCS PRINCIPE) Deze technologie steunt op 3 meetprincipes; volume, conductiviteit en laserlichtverstrooiing (scattering). Beckman Coulter ontwierp een module waarin deze 3 metingen simultaan uitgevoerd kunnen worden, namelijk de multitransducermodule (MTM). De differentiatie, de NRBC en de reticulocyten worden bepaald in de VCS-module van het toestel. Deze module zorgt voor de dilutie van het monster in de mengkamers. De module en reagentia staan onder gecontroleerde temperatuur zodat de lyse steeds een correcte werking heeft. Het lyse reagens wordt eerst toegevoegd en zal de rode bloedcellen lyseren. Nadien wordt de stabilisator toegevoegd die de activiteit van het lyse reagens stopt door neutralisatie waardoor de vorm van de witte bloedcellen behouden wordt. Monster en reagentia worden gemengd door een gereguleerde gerichte luchtstroom van 4 psi. Vervolgens worden de mengsels via een valve tot in de multitransducing module (MTM) gebracht. Deze MTM laat één cel tegelijk passeren doorheen de flowcel door hydrodynamische focussering. Wanneer een cel door de flowcel passeert worden tegelijkertijd verschillende metingen uitgevoerd. Een diodelaser zal de cellen belichten. In deze flowcel wordt het volume, de conductiviteit en de lichtverstrooiing (onder 5 bepaalde hoeken) gemeten. Er worden steeds 8192 cellen geanalyseerd. Bij stalen met veel interferenties, bijvoorbeeld door de aanwezigheid van lyse-resistente rode bloedcellen, worden de 8192 evenementen uitgebreid tot evenementen. Zo bekomt men steeds, zelfs in aanwezigheid van interferenties, een accurate formule. (Beckman Coulter Ireland, 2013) 23 P a g i n a

40 Figuur 15: Meting van het volume in de MTM (Beckman Coulter Ireland, 2013) VOLUME Figuur 16: Meting van de conductiviteit in de MTM (Beckman Coulter Ireland, 2013) Figuur 17: Lichtverstrooiing meting in de MTM, simultaan met de meting van volume en conductiviteit (Beckman Coulter Ireland, 2013) Het volume wordt in de MTM gemeten door gebruik te maken van gelijkstroom (DC) impedantie. De DC impedantie is een maat voor het celvolume van de cel. Wanneer de cel doorheen de flowcel in het geleidend medium van de MTM passeert zal er een verandering zijn in elektrische weerstand. Aan beide kanten van de flowcel opening bevinden zich elektrodes die een spanning genereren in de flowcel. De passage van een cel zal een hogere weerstand geven wat resulteert in een meetbare elektrische puls en de grootte van de puls is proportioneel aan het celvolume. (Beckman Coulter Ireland, 2013) (Simon-Lopez, 2013) Figuur 18: Meting van het volume door gelijkstroom (DC) impedantie in de MTM (Beckman Coulter Ireland, 2013) CONDUCTIVITEIT Conductiviteit is de eigenschap die een component heeft om elektrische stroom te geleiden. De conductiviteit in de MTM wordt gemeten door gebruik te maken van radiofrequentie (RF) impedantie. De RF-impedantie is een maat voor de intracellulaire inhoud. Celwanden kunnen een geleidende functie hebben voor hoogfrequente stroom. De stroom kan doorheen de celwand en detecteert het verschil in de isolerende eigenschappen van de celcomponenten. De stroom karakteriseert de nucleaire, chemische en Figuur 19: Meting van de intracellulaire inhoud van de cel door radiofrequentie (RF) impedantie in de MTM. granulaire bestanddelen van de cel. (Beckman Coulter Ireland, 2013) 24 P a g i n a

41 LICHTVERSTROOIING Een laser zal de cel in de flowcel belichten waardoor de cel een deel van de lichtbundel zal absorberen en een deel zal verstrooiien. Sensoren zijn onder bepaalde hoeken geplaatst die dit licht kunnen detecteren. Een sensor die in dezelfde richting als de laser gesitueerd is, meet het licht dat door de cel gaat. Zo kan waargenomen worden hoeveel licht verstrooid wordt. (Beckman Coulter Ireland, 2013) MTM Figuur 20: Multitransducermodule (MTM) in de UniCel DxH 800 die gebruikt wordt voor de meting van volume, conductiviteit en lichverstrooiing of scattering (VCS technologie). De onderdelen van deze module worden uitgelegd in tabel 7 en 8. (Beckman Coulter Ireland, 2013) Tabel 7: Kanalen in de MTM module (UniCel DxH 800) die het volume en de conductiviteit meten. (Beckman Coulter Ireland, 2013) Kanaal Electrode 1 Lower electrode (RF en DC) 2 Higher electrode(rf en DC) 25 P a g i n a

42 Tabel 8: Kanalen in de MTM module (UniCel DxH 800) die de lichtverstrooiing meten. (Beckman Coulter Ireland, 2013) Kanaal Sensor Hoek Meting 3 AL2 0 Axial Light Loss Schaduw/absorptie 4 LALS 5-1 Low Angle Light Scatter Grootte en structuur van de cel 5 LMALS Granulariteit 6 UMALS MALS LMALS + UMALS NRBC (VCS METHODE) De metingen van de Rotaded angle light scatter (RLALS) versus het licht dat door de cel wordt doorgelaten (AL2) in de flowcel in de MTM bieden het beste onderscheid tussen NRBC en WBC en de beste detectie van reuzeplaatjes en plaatjesaggregaten. (Beckman Coulter Ireland, 2013) REAGENTIA DXH DILUENT Deze isotonische bufferoplossing verdunt de monsters, spoelt de modules tussen de verschillende analyses en zorgt voor een sheat vloeistofstroom wanneer de monsteroplossing door de flowcel passeert. Het wordt gebruikt voor de telling van de WBC, RBC, bloedplaatjes en NRBC. (Beckman Coulter Ireland, 2013) (Simon-Lopez, 2013) DXH CELL LYSE Dit is een reagens die de rode bloedcellen lyseert om de witte bloedcellen te kunnen tellen en om het hemoglobine gehalte te kunnen meten. Het zet het hemoglobine om in een hemochromogeen dat fotometrisch gemeten kan worden. (Beckman Coulter Ireland, 2013) (Simon-Lopez, 2013) DXH DIFF PACK Dit pack bevat een erytrocytaire lysereagens die de rode bloedcellen lyseert en een stabilisatiereagens die ervoor zorgt dat de witte bloedcellen hun vorm behouden wordt. Deze twee reagentia verdunnen samen het monster dat nadien door de flowcel zal passeren. (Beckman Coulter Ireland, 2013) DXH CLEANER Deze oplossing reinigt het toestel door de residuele componenten te degraderen zodat ze kunnen worden weggespoeld met de DxH Diluent. (Beckman Coulter Ireland, 2013) 26 P a g i n a

43 RAPPORTERING De rapportering ven de resultaten na de analyse van een bloedmonster kan gebeuren op verschillende manieren. Deze resultaten en rapporteringen kunnen geraadpleegd worden op de software van het toestel (UniCel DxH 800) CBC EN DIFFERENTIATIE Na een complete blood count en differentiatie van een bloedmonster op de UniCel DxH 800 worden de parameters met hun eenheden gerapporteerd in het Patient Results scherm. Figuur 21: Patient Results scherm die de rapportering van de resultaten (grijze kaders) weergeeft van een bloedmonster na een complete blood count (CBC) en een differentiatie FLAGS Naast het resultaat van een parameter kunnen flags weergegeven worden. Deze flags maken diegene die de resultaten interpreteert alert op enkele overschreden limieten of problemen. Indien de waarde van de parameter buiten de referentiewaarden valt wordt 27 P a g i n a

44 deze aangeduid rechts van het resultaat met een flag (H: high of L: low). (Beckman Coulter Ireland, 2013) Tabel 9: Flags bij de rapportering van de resultaten (UniCel DxH 800) (Beckman Coulter Ireland, 2013) Flag Beschrijving + Resultaat boven de meetrange - Resultaat onder de meetrange R Review van een resultaat vereist. Verschijnt ook bij een System message C L Lage kritische limiet overschreden C H Hoge kritische limiet overschreden a L Lage actie limiet overschreden a H Hoge actie limiet overschreden H Hoge referentierange overschreden L Lage referentierange overschreden P Partiele of gedeeltelijke opzuiging gedetecteerd gedurende de monsteranalyse N Non-bloedmonster gedetecteerd SUPPLEMENTAIRE DATA Door in het Patient results scherm onderaan het tabblad Additional data te selecteren, verschijnt een pop-up venster waarin supplementaire data van de analyse geraadpleegd kunnen worden. In het tabblad DIFF wordt voor elke meting (volume, conductiviteit en lichtverstrooiing) een gemiddelde waarde (M) en een standaarddeviatie of spreiding (SD) weergegeven. Door de veranderingen in deze waarden kunnen abnormale popultaties of heterogeniteiten van populaties opgespoord worden. De malariafactor is een automatische regel die berekend wordt op basis van de waarde van de spreiding van het volume van de lymfocyten (LY SD op het V kanaal) en die van de monocyten (MO SD op het V kanaal). (Beckman Coulter Ireland, 2013) Figuur 22: Supplementaire data van de differentiatie (DIFF) geeft voor elke meting (volume, conductiviteit en lichtverstrooiing) een gemiddelde waarde (M) en een standaarddeviatie of spreiding (SD) weergegeven. 28 P a g i n a

45 HISTOGRAM In het Patient results scherm worden ook 3 histogrammen weergegeven. De x-as van het histogram geeft de relatieve celfrequentie weer t.o.v. de grootte van de cel (fl). Voor de witte bloedcellen, de rode bloedcellen en de bloedplaatjes wordt een histogram uitgezet en weergegeven in dit scherm. (Beckman Coulter Ireland, 2013) Figuur 23: Histogram van de witte bloedcellen (WBC) met op de x-as het celvolume (fl) en op de y-as de celfrequentie. Figuur 24: Histogram van de rode bloedcellen (RBC) met op de x-as het celvolume (fl) en op de y-as de celfrequentie. Figuur 25: Histogram van de bloedplaatjes (PLT) met op de x- as het celvolume (fl) en op de y- as de celfrequentie. Figuur 26: Histogram van de witte bloedcellen (WBC) met op de x- as het celvolume (fl) en op de y-as de celfrequentie en de situering van de populaties witte bloedcellen op de x-as. (Beckman Coulter Ireland, 2013) D-DATAPLOTS Er worden 2 dataplots weergegeven om de celpopulaties na differentiatie weer te geven. 5PD1/5PD2 Een eerste dataplot 5PD1 zet volume (y-as) uit t.o.v. geroteerde lichtverstrooiing of rotated light scattering (RLS, x-as). De tweede dataplot 5PD2 zet volume uit (y-as) t.o.v. de ondoorzichtigheid (OP, x-as). (Beckman Coulter Ireland, 2013) 29 P a g i n a

46 Figuur 27: Celpopultaties lymfocyten (blauw), monocyten (groen), neutrofielen (paars), eosinofielen (oranje), basofielen (wit) en nonwitte bloedcellen (rood) weergegeven op de 2D-dataplots na differentiatie. Links de 5PD1-dataplot met op de x-as de rotated light scattering (RLS) en op de y-as het volume (V). Rechts de 5PD2 dataplot met op de x-as het de ondoorzichtigheid (OP) en op de y-as NRBC1/NRBC2 Voor de NRBC worden ook 2 dataplots weergegeven. Deze dataplot geeft twee populaties weer, de WBC en de NRBC. De eerste dataplot NRBC1 ze het licht dat doorgelaten wordt door de cel (AL2, x-as) uit t.o.v. van de rotaded angle light scatter (RLALS, y-as). De tweede dataplot NRBC2 geeft het volume (RUMALS, y-as) weer t.o.v. van het licht dat door de cel wordt doorgelaten (AL2, x-as). (Beckman Coulter Ireland, 2013) Figuur 28: Celpopulaties nucleated red blood cells (rood), witte bloedcellen (blauw), en andere populaties (groen) weergegeven op de 2D-dataplot na differentiatie. Links de NRBC1-dataplot met op de x-as het doorgelaten licht (AL2) en op de y-as de rotated light angle scatter (RLALS). Rechts de NRBC2-dataplot met op de x-as het volume (RUMALS) en op de y-as het doorgelaten licht (ALS2). 30 P a g i n a

47 D-DATAPLOTS Deze dataplot plaats 3 assen ten opzichte van elkaar waardoor een 3D structuur in de vorm van een kubus gecreërd wordt. Deze dataplots geven de populaties weer op basis van densiteit volume, lichtverstrooiing (RLS) en het doorgelaten licht (OP) waardoor een 3D-structuur onstaat. (Beckman Coulter Ireland, 2013) Figuur 29: 3D-dataplot met de assen volume, lichtverstrooiing en het doorgelaten licht geeft de elpopultaties lymfocyten (blauw), monocyten (groen), neutrofielen (paars), eosinofielen (oranje), basofielen (wit) en non-witte bloedcellen (rood) weer SURFACE-PLOTS Deze hebben dezelfde assen zoals de 2D plots maar bevatten nog de densiteit op een z- as. Deze z-as wordt weergegeven als een piekhoogte. Hoe meer cellen van een bepaalde populatie aanwezig, hoe hoger de piek op de oppervlakte. (Beckman Coulter Ireland, 2013) Figuur 30: Surface-plot van de 5PD1-plot met op de x-as de rotated light scattering (RLS) en op de y-as het volume (V). Lymfocyten (blauw), monocyten (groen), neutrofielen (paars), eosinofielen (oranje), basofielen (wit) en non-witte bloedcellen (rood) Figuur 31: Surface-plot van de NRBC1-plot met op de x-as het doorgelaten licht (AL2) en op de y-as de rotated light angle scatter (RLALS). Nucleated red blood cells (rood), witte bloedcellen (blauw), en andere populaties (groen) 31 P a g i n a

48 CODES Wanneer het toestel geen resultaten kan genereren door bijvoorbeeld problemen tijdens de analyse, wordt een code weergegeven in plaats van het resultaat. (Beckman Coulter Ireland, 2013) Tabel 10: Codes op de UniCel DxH800 (Beckman Coulter Ireland, 2013) Code Beschrijving ===== De analyse werd stopgezet door het systeem ::::: In de flow cel is een klonter gedetecteerd.. De berekende parameter kan niet worden berekend omdat een van de primaire parameters buiten de meetrange ligt. Of verschijnt wanneer de klep van het toestel werd geopend tijdens de analyse Resultaat overschrijdt de operatierange????? Resultaat ligt buiten de range van waarden die op het scherm kunnen worden weergegeven ##### Resultaat werd verworpen SUSPECT/SYSTEM/DEFINITIVE MESSAGES De suspect, system en definitive berichten worden weergegeven in het vak Susp/Sys/Def net onder de patiëntgegevens aan de bovenkant van het scherm. Suspect berichten zijn rood; System berichten zijn groen, en definitive berichten zijn blauw. Berichten zijn alfabetisch gerangschikt in hun soort. (Beckman Coulter Ireland, 2013) PROEFOPSTELLING Gedurende 12 dagen werden 296 EDTA-volbloed monster van de malaria negatieve controlegroep, 178 monsters van de groep patiënten met een infectie, 136 monsters van de groep terugkerende militairen van buitenlandse missie en 6 monsters van de malaria positieve controlegroep geanalyseerd op de UniCel DxH 800. Van elk staal in deze groepen werden de resultaten van enkele parameters geëvalueerd (tabel 8). Tabel 11: Parameters op de Beckman Coulter DxH80 die in deze studie worden geëvalueerd. Complete blood count (CBC) Differentiatie Additionele gegevens Rode bloedcellen count Neutrofielen SD V lymfocyten Bloedplaatjes count Lymfocyten SD V monocyten Witte bloedcellen count Monocyten Malaria discriminant factor Eosinofielen Basofielen 32 P a g i n a

49 METHODE MONSTERAFNAME Volbloed werd veneus afgenomen in paarse K 3 EDTA tubes. Deze tubes werden in het trieercentrum gelabeld a.d.h.v. de aangevraagd analyses. Het was uitermate belangrijk dat in deze monsters geen bloedstolsels aanwezig waren omdat dit resulteert in vals lage waarden van de bloedplaatjes. De bloedmonsters in deze studie waren maximaal 48 dagen oud CONTROLES Elke ochtend werden 2 controlereeksen met het toestel geanalyseerd alvorens er werd gestart met de routinetubes. De Coulter 6C Cell controlereeks geeft de mogelijkheid om na te gaan of het toestel nog een correcte werking heeft voor alle gemeten en gecalculeerde parameters (CBC, differentiatie en NRBC parameters). De Coulter Retic-X Cell controlereeks wordt toegepast om de reticulocyten parameters te controleren. Elke controlereeks bevat 3 controletubes; een monster met hoge, normale en lage waarden voor de parameters. Wanneer deze controles geen afwijkende waarden vertoonden (niet boven 3SD) konden de resultaten binnen de tijdspanne van twee opeenvolgende controles vrijgegeven worden, d.w.z. deze monsters waren correct geanalyseerd. (Beckman Coulter Ireland, 2013) ANALYSE OP UNICEL DXH 800 De routine EDTA-tubes werden na triage met hun dop in de casettes (rekjes) geplaatst die compatibel zijn met de DxH 800 en de SMS en met de tubes. Dit rek heeft een capaciteit voor 5 tubes. Elke plaats in de cassette heeft een eigen ID-barcode, de tubes werden zodanig geplaatst dat de 2D-barcode leesbaar is langs de opening van de cassette. De cassette werd vervolgens op het toestel geplaatst. De transportband detecteerde het rekje en plaatste via een transportband het rekje tot voor de barcodereader. De laser scande de barcodes van de tubes en van de plaatsen op het rek. Op deze manier kon het toestel weten welke tube zich waar bevindt. Het rekje werd doorgeschoven naar een mengonderdeel, waar het hele rekje 11 keer gekanteld werd waardoor alle tubes samen gemengd werden. Vervolgens daalde de naald en detecteerde automatisch de hoogte van de tube om op deze manier te weten hoe diep de naald moet aspireren. Vervolgens werd een volume van 165µl bloed geaspireerd en via tubings en valven naar de analysekamers van het toestel geleid. Tussen de aspiratie van 2 tubes werd het rekje nogmaals 4 maal 33 P a g i n a

50 gekanteld. Na analyse van alle tubes in het rekje, werd het rekje doorgeschoven naar de output bufferruimte. De aspiratienaald (SAM : Sample aspiration module) transporteerde het monster naar een valve waar het monster werd gesegmenteerd voor een CBC analyser (Complete blood count). Wanneer ook een differentiatie, een NRBC analyse of een reticulocyten analyse werd aangevraagd, werd via dezelfde naald ook monster verdeeld over verschillende dilutie of mengkamers STATISTIEK De onderzochte parameters en de factor van de vier groepen werden grafisch weergegeven als een boxplot die de verdeling van de data voorstelde. Vervolgens werd ook met behulp van een t-test de parameter tussen alle groepen vergeleken om significante verschillen waar te kunnen nemen. Er werd gebruik gemaakt van een t-test op het gemiddelde van 2 reeksen ongepaarde metingen (twee verschillende groepen) met ongelijke varianties. De outliers werden opgespoord door gebruik te maken van de Grubb s outlier test RESULTATEN Tabel 12: Het aantal monsters met een malariafactor hoger dan 4,5 en lager dan 4,5 per groep na analyse op de UniCel DxH 800. Malaria discriminant factor Malaria discriminant factor < 4,5 > 4,5 NORMAAL (296 monsters) Malaria negatieve 296 monsters 0 monsters controlegroep MALARIA (6 monsters) Malaria positieve controlegroep 0 monsters 6 monsters INFECTIE (178 monsters) Groep patiënten met een 150 monsters 27 monsters infectie TRAVEL (136 monsters) Groep militairen terugkerend van buitenlandse missie 133 monsters 3 monsters 34 P a g i n a

51 PARAMETERS PER GROEP MALARIA NEGATIEVE CONTROLEGROEP (NORMAAL) Tabel 13: Evaluatie van de parameters van een complete blood count (CBC) en een differentiatie na analyse op de UniCel DxH 800 voor de malaria negatieve controlegroep. Complete blood count Standaarddeviatie (SD) Minimum waarde Maximum waarde Gemiddelde (CBC) / differentiatie Rode bloedcellen 3, /mm³ 6, /mm³ 5, /mm³ 0, /mm³ Bloedplaatjes /mm³ /mm³ 227, /mm³ 45, /mm³ Witte bloedcellen 3, /mm³ 14, /mm³ 6, /mm³ 2, /mm³ Neutrofielen 32 % 81% 56,77 % 8,97 % Lymfocyten 12,3 % 57 % 30,94 % 7,96 % Monocyten 2 % 19 % 8,95 % 2,11 % Eosinofielen 0 % 9,4 % 2,66 % 1,78 % Basofielen 0 % 2,1 % 0,69 % 0,36 % SD V lymfocyten 11,27 20,46 13,90 1,21 SD V monocyten 13,62 23,55 16,86 1,58 Malaria discriminant factor 1,6720 4,4235 2,3498 0, MALARIA POSITIEVE CONTROLEGROEP (MALARIA) Tabel 14: Evaluatie van de parameters van een complete blood count (CBC) en een differentiatie na analyse op de UniCel DxH 800 voor de malaria positieve controlegroep. Complete blood count Standaarddeviatie Minimum waarde Maximum waarde Gemiddelde (CBC) / differentiatie (SD) Rode bloedcellen 3, /mm³ 6, /mm³ 4, /mm³ 0, /mm³ Bloedplaatjes /mm³ /mm³ 106, /mm³ 43, /mm³ Witte bloedcellen 3, /mm³ 13, /mm³ 6, /mm³ 3, /mm³ Neutrofielen 16,9 % 87 % 63,6 % 24,23 % Lymfocyten 9,4 % 61,5 % 23,55 % 19,80 % Monocyten 2,3 % 20,5 % 11,25 % 7,46 % Eosinofielen 0,4 % 1,6 % 0,93% 0,45 % Basofielen 0,1 % 1 % 0,67 % 0,36 % SD V lymfocyten 19,29 42,94 29,51 9,32 SD V monocyten 12,8 33,97 26,13 7,82 Malaria discriminant factor 5,2835 9,0469 7,2485 1, P a g i n a

52 GROEP GEHOSPITALISEERDE PATIËNTEN MET EEN INFECTIE (INFECTIE) Tabel 15: Evaluatie van de parameters van een complete blood count (CBC) en een differentiatie na analyse op de UniCel DxH 800 voor de groep gehospitaliseerde patiënten met een infectie. Complete blood count Standaarddeviatie Minimum waarde Maximum waarde Gemiddelde (CBC) (SD) Rode bloedcellen 2, /mm³ 5, /mm³ 3, /mm³ 0, /mm³ Bloedplaatjes /mm³ /mm³ 363, /mm³ 187, /mm³ Witte bloedcellen 4, /mm³ 33, /mm³ 11, /mm³ 5, /mm³ Neutrofielen 24,90 % 94,00 % 67,4551 % 13,63 % Lymfocyten 24,0 % 68,70 % 20,9557 % 12,18 % Monocyten 1,00 % 16,40 % 8,5749 % 3,11 % Eosinofielen 0,00 % 8,00 % 2,1204 % 1,73 % Basofielen 0,00 % 1,80 % 0,391% 0,36 % SD V lymfocyten 12,1 29,54 17,1766 2,92 SD V monocyten 14,33 29,2 20,3218 2,81 Malaria discriminant factor 2,0180 7,0364 3,5251 0, GROEP TERUGKERENDE MILITAIREN VAN BUITENLANDSE MISSIE (TRAVEL) Tabel 16: Evaluatie van de parameters van een complete blood count (CBC) en een differentiatie na analyse op de UniCel DxH 800 voor de groep terugkerende militairen van buitenlandse missie. Complete blood Minimum Maximum Standaarddevia Gemiddelde count (CBC) waarde waarde tie (SD) Rode bloedcellen 3, /mm³ 5, /mm³ 4, /mm³ 0, /mm³ Bloedplaatjes /mm³ /mm³ 221, /mm³ 42, /mm³ Witte bloedcellen 3, /mm³ 15, /mm³ 6, /mm³ 2, /mm³ Neutrofielen 37,60 % 83,80 % 57,17 % 9,40 % Lymfocyten 10,00 % 53,00 % 31,58 % 8,41% Monocyten 3,00 % 14,50 % 8,22 % 2,09 % Eosinofielen 0,00 % 12,00 % 2,37 % 1,86 % Basofielen 0,00 % 1,40 % 0,66 % 0,30 % SD V lymfocyten 11,8 21,90 14,0404 1,43 SD V monocyten 14,17 29,11 17,0016 1,94 Malaria discriminant factor 1,8948 5,8307 2,4024 0, P a g i n a

53 Malariafactor (SD volume lymfocyten x SD volume monocyten) / 100) Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest MALARIA DISCRIMINANT FACTOR Studie malaria discriminant factor (Beckman Coulter DxH800) 10,0000 9,5000 9,0000 8,5000 8,0000 7,5000 7,0000 6,5000 6,0000 5,5000 5,0000 4,5000 4,0000 3,5000 3,0000 2,5000 2,0000 1,5000 1,0000 4,4235** 4,3367** 3,8980* Monsters van personen in goede gezondheid (n=296) 7,0364* Monsters van 52 personen met een infectie (n=178) 5,8307** 5,1859** 4,6494** Monsters van personen terugkerend van missie (n=136) Monsters van personen met een malaria infectie (n=6) Groep Figuur 32: Boxplot voor de evaluatie van de malaria discriminant factor met n= het aantal monsters. Tabel 17: Significante verschillen tussen de groepen bij de vergelijking van de malaria discriminant factor Significant verschil NORMAAL & NORMAAL NORMAAL & INFECTIE & INFECTIE & TRAVEL & INFECTIE & TRAVEL MALARIA TRAVEL MALARIA MALARIA **p < 0.01 p > 0.05 **p < 0.01 **p < 0.01 **p < 0.01 **p < P a g i n a

54 SD V Lymfocyten Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest STANDAARDDEVIATIE VAN HET CELVOLUME LYMFOCYTEN (SD V LYMFOCYTEN) Studie SD V Lymfocyten (Beckman Coulter DxH800) 46, , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,4600** 20,0400** 19,0000** Monsters van personen in goede gezondheid (n=296) 29,5400** 28,5800** Monsters van personen met een infectie (n=179) 21,9000** 20,0300** 19,4700* Monsters van personen terugkerend van missie (n=136) Monsters van personen met een malaria infectie (n=6) (n=5) Groep Figuur 33: Boxplot voor de evaluatie van de spreiding van het volume van de lymfocyten (SD V lymfocyten) met n= het aantal monsters. Tabel 18: Significante verschillen tussen de groepen bij de vergelijking van de spreiding van het volume voor de lymfocyten (SD V lymfocyten). NORMAAL & NORMAAL NORMAAL & INFECTIE & INFECTIE & TRAVEL & INFECTIE & TRAVEL MALARIA TRAVEL MALARIA MALARIA Significant verschil **p < 0.01 p> 0.05 **p < 0.01 **p < 0.01 *p < 0.05 **p < P a g i n a

55 SD V Monocyten Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest STANDAARDDEVIATIE VAN HET CELVOLUME MONOCYTEN (SD V MONOCYTEN) 36, , ,0000 Studie SD V monocyten (Beckman Coulter DxH800) 30, , ,1100** 26, , , , , , , , , ,5500** 23,1200* Monsters van personen in goede gezondheid (n=296) Monsters van personen met een infectie (n=179) 23,6800* 23,8800* Monsters van personen terugkerend van missie (n=136) Groep Monsters van personen met een malaria infectie (n=5) (n=6) Figuur 34: Boxplot voor de evaluatie van de spreiding van het volume van de lymfocyten (SD V lymfocyten) met n= het aantal monsters. Tabel 19: Significante verschillen tussen de groepen bij de vergelijking van de spreiding van het volume voor de monocyten (SD V monocyten). NORMAAL & NORMAAL NORMAAL & INFECTIE & INFECTIE & TRAVEL & INFECTIE & TRAVEL MALARIA TRAVEL MALARIA MALARIA Significant verschil **p < 0.01 p > 0.05 *p < 0.05 **p < 0.01 p > 0.05 *p < P a g i n a

56 Bloedplaatjes (.10³/mm³) Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest BLOEDPLAATJES Studie Bloedplaatjes (Beckman Coulter DxH800) Monsters van personen in goede gezondheid (n=295) Monsters van 52 personen met een infectie (n=178) Monsters van personen Monsters van personen terugkerend van missie met een malaria (n=136) infectie (n=6) Groep Figuur 35: Boxplot voor de evaluatie van de spreiding van de bloedplaatjes met n= het aantal monsters. Tabel 20: Significante verschillen tussen de groepen bij de vergelijking van de bloedplaatjes. Significant verschil NORMAAL & NORMAAL NORMAAL & INFECTIE & INFECTIE TRAVEL & INFECTIE & TRAVEL MALARIA TRAVEL & MALARIA MALARIA **p< 0.01 p > 0.05 **p < 0.01 **p < 0.01 *p < 0.05 **p < P a g i n a

57 HISTOGRAM Vier van de zes malaria positieve monsters vertoonden vermoedelijk een extra celpopulatie kleiner dan de lymfocyten. Het histogram op dit toestel toonde de piek voor de 35 fl grenswaarde niet, maar een hoge celfrequentie op de 35 fl grens en geen goede afgescheiden piek voor deze grens wees op de aanwezigheid van de extra piek of celpopulatie kleiner dan 35 fl. De celfrequentie bij de malaria positieve monsters op deze grenswaarde is veel hoger dan die bij normale (niet malaria) monsters. Alle histogrammen van de monsters met een vals positieve malariafactor (hoger dan >4,5) vertoonden een lagere celfrequentie op de 35 fl grenswaarde, waardoor geconcludeerd werd dat er geen extra celpopulatie of piek aanwezig was voor de 35 fl grenswaarde. Figuur 36: WBC-histogrammen van de malaria positieve monsters. Histogrammen A, B, D en E vertonen geen mooie afgescheiden piek op de 35 fl genswaarde. Het begin van een extra piek of populatie is zichtbaar ter hoogte van de 35 fl grenswaarde. Figuur 37: WBC-histogrammen van de monsters met een vals positieve malaria discriminant factor (>4,5). Histogrammen A t.e.m.h zijn monsters afkomstig uit de groep patiënten met een infectie en histogrammen I t.e.m. K zijn monsters afkomstig uit de groep terugkerende militairen van buitenlandse missie. Deze histogrammen vertonen geen extra piek voor de 35 fl grenswaarde 41 P a g i n a

58 DATAPLOTS PD1 De 5PD1-dataplots van de malaria positieve monsters en de monsters met een vals positieve malaria factor werden geëvalueerd. Deze dataplot onderscheidt de populaties lymfocyten (blauw), monocyten (groen), neutrofielen (paars), eosinofielen (oranje), basofielen (wit) van elkaar. Op de dataplots van de malaria positieve monsters was een meer verspreidde populatie monocyten en lymfocyten aanwezig op de dataplots en was er geen optimale scheiding tussen de populaties t.o.v. een normaal monster (figuur 38 met parameters binnen de referentiewaarden en een goede scheiding tussen de populaties). Links onderaan lagen bij alle malaria positieve monsters een opmerkelijk grotere rode populatie t.o.v. van een normaal monster. Deze rode populatie bevat het puin dat niet als een witte bloedcel werd gedefiniëerd. Volgens de literatuur zijn deze rode dots de malariasignalen. Echter toonden enkele monsters (figuur 40: monsters A, G, I, J en K ) met een vals positieve malaria discriminant factor (>4,5) ook een rode populatie en een meer verspreidde populatie monocyten en lymfocyten op de 5DP1 dataplot. Bij deze monsters was de populatie met rode dots minder dens dan bij de malaria positieve monsters. Figuur 38: Differentiatie 5PD1-dataplot van een normaal monster (parameters binnen referentiewaarden en persoon in goede gezondheid). 42 P a g i n a

59 Figuur 39: Differentiatie 5PD1-dataplots van malaria positieve monsters. Figuur 40: Differentiatie 5PD1-dataplots van de monsters met een vals positieve malaria discriminant factor (>4,5). Dataplots A t.e.m. H zijn monsters afkomstig uit de groep patiënten met een infectie en dataplots I t.e.m. K zijn monsters afkomstig uit de groep terugkerende militairen van buitenlandse missie. 43 P a g i n a

60 NRBC1 De NRBC1 dataplots van de malaria positieve monsters en de monsters met een vals positieve malaria factor (>4,5) werden geëvalueerd. Deze dataplot onderscheidt de populatie witte bloedcellen (blauw) van de gekernde rode bloedcellen of erytroblasten (NRBC, rood) en de non-witte bloedcellen (groen). Op de dataplots van twee monsters met een P.ovale infectie (figuur 46, monsters A en F) was linksonder op de dataplots een duidelijke groene populatie zichtbaar t.o.v. een normaal monster (figuur 41 met parameters binnen de referentiewaarden). Volgens de literatuur zouden deze groene dots de malariasignalen voorstellen. De groene dots linksboven op de dataplot waren mogelijk bloedplaatjesaggregaten. De overige malaria positieve monsters met een P.falciparum infectie (figuur 42, monsters B, C, D en E) vertonen echter geen groene populatie links onderaan de dataplot. De monsters met een vals positieve malaria discriminant factor (>4,5) (figuur 43) vertoonden geen groene populatie links onderaan de dataplot. Figuur 41: NRBC1 data-plot van een normaal monster (parameters binnen referentiewaarden). 44 P a g i n a

61 Figuur 42: NRBC-dataplots van malaria positieve monsters. Figuur 43: NRBC-dataplots van de monsters met een vals positieve malaria discriminant factor (>4,5). Dataplots A t.e.m. H zijn monsters afkomstig uit de groep patiënten met een infectie en dataplots I t.e.m. K zijn monsters afkomstig uit de groep terugkerende militairen van buitenlandse missie. 45 P a g i n a

62 Sensitiviteit (%) Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest SENSITIVITEIT / SPECIFICITEIT / CUTT-OFF WAARDE Van de negatieve controlegroep en de groep patiënten met een infectie (andere infectie dan malaria) is gekend dat deze groep negatief is voor een malaria-infectie, en bij de positieve controlegroep dat ze positief is voor een malaria-infectie. Wanneer de cut-off waarde voor malaria werd ingesteld op 4,5 is een sensitiviteit van 100% en een specificiteit van 94,30% waar te nemen. Op basis van deze data zou de cut-off waarde voor de malariafactor verhoogd kunnen worden naar 5,0 wat het aantal vals positieve monsters in deze studie met ongeveer 48% reduceert zonder het aantal vals negatieve te induceren, dit resulteert in een sensitiviteit van 100% en een specificiteit van 97,26%. Tabel 21: Sensitiviteit/specificiteit malaria discriminant factor berekend op de resultaten van de monsters uit de vier groepen (positieve controlegroep, negatieve controlegroep, groep terugkerende militairen van buitenlandse missie en de groep patiënten met een infectie). Plasmodium in bloed Geen Plasmodium in het bloed (Microscopie postief) (Microscopie negatief) Malariafactor > 4, (TP: True Positive) (FP: False Positive)(11 patiënten) Malariafactor < 4, (FN : False Negative) (TN: True Negative) Totaal Sensitiviteit ( in deze studie) 100 % Specificiteit (in deze studie) 94,30 % ,0 5,5 6,5 9,0 ROC analyse Malariafactor Beckman Coulter UniCell DxH800 5,0 4, Specificiteit(%) 4,0 Figuur 44: ROC-analyse van de malaria disciminant factor geeft een ideale cut-off waarde van 5,0 op basis van de data in deze studie. 46 P a g i n a

63 1.3. DISCUSSIE Er is een significant verschil waar te nemen in de standaarddeviatie (SD of spreiding) van het volume van de lymfocyten (p<0.01) en in de standaarddeviatie (SD of spreiding) van het volume van de monocyten (p<0.05) tussen de malaria negatieve en de malaria positieve controlegroep. Er is een significant verschil waar te nemen in de standaarddeviatie (SD of spreiding) van het volume van de lymfocyten (p<0.05), maar geen significant verschil in de standaarddeviatie (SD of spreiding) van het volume van de monocyten (p>0.05) tussen de malaria negatieve en de malaria positieve controlegroep. De spreiding van het celvolume van de monocyten bij de malaria positieve monsters en de monsters met een andere infectie dan malaria zijn beide verhoogd en overlappen elkaar. De malaria discriminant factor is berekend op basis van de standaarddeviatie van het volume van lymfocyten en van de monocyten ((SD V lymfocyten*sd V monocyten)/100). Deze factor is significant verschillend (p<0.01) tussen de vergelijkingen van deze drie groepen (malaria positieve controlegroep, malaria negatieve controlegroep en de groep patiënten met een infectie). Wanneer de cut-off waarde van de malariafactor op 4,5 werd ingesteld, worden in de groep patiënten met een infectie 27 vals positieve monsters vastgesteld door gebruik te maken van microscopie als referentiemethode (zie later). Er een overlapping waar te nemen van de laagste waarden van de malaria positieve controlegroep met de hoogste waarden van de onderzoeksgroep gehospitaliseerde patiënten met een infectie. De malariafactor is onderhevig aan de veranderingen in de celpopulaties van andere infecties wat resulteert in vals positieve malaria indicaties. Tabel 22: Significante verschillen malaria discriminant factor (Malaria D factor). NORMAAL & NORMAAL & NORMAAL & INFECTIE & INFECTIE & TRAVEL INFECTIE TRAVEL MALARIA TRAVEL MALARIA MALARIA Malaria D factor p < 0.01 p > 0.05 p < 0.01 p < 0.01 p < 0.01 p < 0.01 SD V lymfocyten p < 0.01 p > 0.05 p < 0.01 p < 0.01 p < 0.05 p < 0.01 SD V monocyten p < 0.01 p > 0.05 p < 0.05 p < 0.01 p > 0.05 p < 0.05 Bloedplaatjes p < 0.01 p > 0.05 p < 0.01 p < 0.01 p < 0.01 p < 0.01 & Op basis van deze data zou de cut-off waarde voor de malariafactor verhoogd kunnen worden naar 5,0 wat het aantal vals positieve monsters met ongeveer 48% reduceert zonder het aantal vals negatieve te induceren, dit resulteert in een sensitiviteit van 100% en een specificiteit van 97,25%. De omvang van de monsters in de malaria positieve controlegroep is echter klein (6 monsters) waardoor de studie best herhaald wordt met een groter aantal monsters om deze conclusie te bekrachtigen 47 P a g i n a

64 Het aantal bloedplaatjes kan een indicatie zijn voor een malaria-infectie, maar er kunnen even goed monsters afkomstig van malaria geïnfecteerde patiënten een normaal aantal bloedplaatjes bevatten. Het enkel focussen op deze parameter zou het aantal valsnegatieve monsters verhogen. Deze parameter is niet specifiek genoeg om een malaria-infectie vast te stellen. De extra celpopulatie voor de 35 fl grenswaarde die zichtbaar was als een hogere celfrequentie op de 35 fl grens t.o.v. van een normaal staal kan een indicatie zijn voor een malaria-infectie. Deze extra celpopulatie was bij de patiënten met een andere infectie dan malaria en een malaria dicriminant factor > 4,5 afwezig, wat het onderscheid kan maken tussen deze twee groepen. Maar het is ook bekend dat bloedplaatjesaggregaten deze extra piek ook kunnen genereren. De rode populatie links onderaan de differentiatie 2D-dataplots van de lichtverstrooiiing (5PD1) was zowel bij de malaria positieve monsters als bij sommige monsters met een andere infectie dan malaria en een malaria discriminant factor > 4,5 aanwezig. Hierdoor is deze dataplot het niet ideaal om een indicatie voor malaria aan te geven. De groene populatie links onderaan, de malariasignalen op de NRBC 2D-dataplots waren enkel aanwezig bij de positieve malaria monsters met een P.ovale infectie. Deze signalen waren bij de patiënten met een andere infectie dan malaria en een malaria dicriminant factor > 4,5 afwezig Deze dataplot kan een bevestiging zijn van een P.ovale-infectie maar niet voor alle Plasmodium species. 48 P a g i n a

65 2. SNELTEST (SD p.f./pan) 2.1. MATERIAAL EN METHODEN APPARATUUR Er wordt gebruik gemaakt van de SD BIOLINE Malaria Ag P.f/Pan sneltest-kit. Deze kit bevat capillairen, een bufferoplossing en sneltestcassettes MONSTER Als monster kan zowel vers veneus bloed als veneus bloed in een EDTA-, citraat- of heparinetube gebruikt worden. Stalen ouder dan 3 dagen kunnen resulteren in een aspecifieke reactie. Wanneer de stalen bewaard worden in de koelkast, moeten ze binnen de 3 dagen gebruikt worden voor de sneltest. (Alere, 2013) MEETPRINCIPE Deze sneltest maakt de detectie van het antigen HRP-2 specifiek voor Plasmodium falciparum en het antigen pldh pan specifiek voor Plasmodium species in een humaan bloedmonster mogelijk. Pan specifiek betekent dat de vier species van Plasmodium gedetecteerd kunnen worden. (Alere, 2013) De sneltestcassette bevat een membraanstrip met 3 regio s. Op de P.f.-regio werden monoklonale muisantilichamen geïmmobiliseerd die specifiek zijn voor HRP-2 (P.falciparum). Dit antigen is een glycoproteïne dat massaal wordt geproduceerd door te trofozoïeten en de jonge gametocyten van het species P.falciparum. Het antigen kan tot 28 dagen na het verdwijnen van de parasieten in het bloed aanwezig blijven. Op de pan regio werden muis monoklonale antilichamen geïmmobiliseerd die specifiek zijn voor LDH van de vier Plasmodium species. Dit antigen is een lactaat dehydrogenase dat geproduceerd wordt door de aseksuele vormen van alle Plasmodium species. Op de controleregio werden geit-anti-muis monoklonale antilichamen gebonden die binden met de vije niet-gebonden muisantilichamen. In deze regio moet steeds een zichtbare lijn verschijnen om te concluderen dat de migratie van de componenten correct gebeurde en om de sneltest als geldig aan te nemen. (Alere, 2013) (World Health Organization, 1999) Daarnaast zijn er ook niet gebonden muisantilichamen (HRP-2 en pldh) aanwezig op het membraan en deze zijn met colloïd goud geconjugeerd en kunnen een reactie aangaan met de malaria antigenen in het bloedstaal. Volgens het chromatografisch principe zullen deze migreren over het membraan tot de verschillende regio s. Op de regio s zal het antigen-antilichaam complex specifiek voor het geïmmobiliseerde antilichaam op het membraan binden en een zichtbare lijn induceren. De colloïd goud geconjugeerde vrije 49 P a g i n a

66 antilichamen op het membraan migreren verder tot de controlelijn waar ze binden met de geïmmobiliseerde antilichamen en ook een zichtbare lijn induceren. (Alere, 2013) (World Health Organization, 1999) Tijdens het aanbrengen van het monster wordt ook een buffer toegevoegd. Deze buffer bevat runderalbumine die dient als blokkeerstof om aspecifieke bindingen te voorkomen, maar bevat ook Triton X-100 die de rode bloedcellen lyseert. (Alere, 2013) (World Health Organization, 1999) Figuur 45: Immunochromatografisch principe voor de malariadetectie van de SD SD BIOLINE Malaria Ag P.f/Pan sneltest (World Health Organization, 1999) Echter is er een kans op valsnegatieve RDT s door het prozone-effect. Het prozone-effect of het hoge-dosis Hook effect treedt op wanneer er een overmaat te detecteren antilichamen of antigenen aanwezig zijn in het te onderzoeken monster. Een studie van het Instituut Tropische Geneeskunde te Antwerpen en de faculteit Health, medicine and Life Sciences van de Universiteit te Maastricht toonde aan dat het prozone-effect een oorzaak is van valsnegatieve P.falciparum bij RDT s die HRP-2 antigenen detecteren. Terwijl het pldh, en pan specifiek-ldh geen prozone-effect vertoonden. Hyperparasitemie van P.falciparum kan resulteren in valsnegatieve resultaten bij een HRP-2 sneltest. (World Health Organization, 1999) (Gillet et al., 2009) SD Bioline beweert dat deze sneltest een sensitiviteit heeft van 99,7% bij P.falciparum monsters, 95,5% bij non-p.falciparum monsters en een specificiteit van 99,5%. (Alere, 2013) 50 P a g i n a

67 PROCEDURE Elk bloedmonster met een malaria discriminant factor hoger dan 4,5 na analyse op de UniCel DxH 800 en elk bloedmonster uit de malaria positieve controlegroep, werd aangebracht op een sneltestcasette en geinterpreteerd. Na analyse op de UniCel DxH 800 werd bij 28 bloedmonsters van de 178 bloedmonsters uit de groep gehospitaliseerde patiënten met een infectie, een malaria discriminant factor hoger dan 4,5 waargenomen. Dit waren 28 bloedmonsters afkomstig van 8 gehospitaliseerde patiënten op de infectie-afdeling. Wegens de hoge kostprijs van de sneltest werd geopteerd om slechts één positief bloedmonster per patiënt te onderzoeken. De 6 bloedmonsters uit de malaria positieve controlegroep, die ook een malaria discriminant factor hadden hoger dan 4,5 na analyse op de UniCel DxH 800 werden onderzocht met de sneltest. Tenslotte werden de 3 bloedmonsters met een malaria discriminant factor hoger dan 4,5 uit de groep militairen terugkerend van buitenlandse missie ook onderzocht met de sneltest. Er werd een volume van 5 µl bloed op de cassette aangebracht in de sample opening en 5 druppels buffer in de bufferopening. Na 15 minuten werd de testregio van de sneltestcassette geïnterpreteerd. Figuur 46: Werkwijze voor de sneltest SD BIOLINE Malaria Ag P.f/Pan (Alere, 2013) Tabel 23: Interpretatie van de sneltest SD BIOLINE Malaria Ag P.f/Pan (Alere, 2013) Sneltestcassette Interpretatie Positief: Plasmodium falciparum-infectie Positief: Plasmodium falciparum-infectie positief of menginfectie van Plasmodium falciparum met een andere Plasmodium species Positief: Andere Plasmodium species (niet P.falciparum) infectie Negatief Ongeldig: Controlelijn is niet zichtbaar Ongeldig: Controlelijn is niet zichtbaar 51 P a g i n a

68 2.2. RESULTATEN MALARIA POSITIEVE CONTROLEGROEP Vijf onderzochte bloedmonsters met een discriminant factor hoger dan 4,5 gaven een postivieve sneltest. Slechts één bloedmonster van een patiënt gediagnosticeerd met malaria (P.ovale) gaf een negatieve sneltest, dit is dus een vals-negatief resultaat van de sneltest. Vier van de 6 bloedmonsters gaven na de interpretatie van de sneltest een positief resultaat voor een Plasmodium falciparum-infectie of een menginfectie van Plasmodium falciparum met de andere Plasmodium species. Eén van de 6 bloedmonsters gaf na de interpretatie van de sneltest het resultaat van een infectie met Plasmodium ovale, Plasmodium vivax of Plasmodium malariae. Echter werd ook na de sneltest vastgesteld dat één bloedmonster een negatief resultaat gaf voor Plasmodium, terwijl dit monster afkomstig is van een patiënt gediagnosticeerd met malaria. Tabel 24: Resultaten van de sneltest SD BIOLINE Malaria Ag P.f/Pan bij de malaria positieve controlegroep. Aantal patiënten met een malaria discriminant factor hoger dan 4,5 na analyse op UniCel DxH 800 (6 monsters) Aantal personen met een Aantal personen met een positieve malaria sneltest negatieve malaria sneltest 5 1 Tabel 25: Resultaten, foto s en interpretatie van de sneltest SD BIOLINE Malaria Ag P.f/Pan bij de malaria positieve controlegroep. Confirmatie Bloedmonster Regio s Interpretatie ITG Gekleurd bandje: - Controleregio Negatief = Vals-negatief P.ovale Gekleurd bandje: - Controleregio - Pan regio - P.f. regio Gekleurd bandje: - Controleregio - Pan regio - P.f. regio Gekleurd bandje: - Controleregio - Pan regio - P.f. regio Positief: P.falciparum-infectie positief of menginfectie van P. falciparum met een andere Plasmodium species Positief: P.falciparum-infectie positief of menginfectie van P. falciparum met een andere Plasmodium species Positief: P. falciparum-infectie positief of menginfectie van P. falciparum met een andere Plasmodium species P.falciparum P.falciparum P.falciparum 52 P a g i n a

69 Gekleurd bandje: - Controleregio - Pan regio - P.f. regio Gekleurd bandje: - Controleregio - Pan regio Positief: P.falciparum-infectie positief of menginfectie van P.falciparum met een andere Plasmodium species Positief: Plasmodium species infectie positief P.falciparum P.ovale MALARIA NEGATIEVE CONTROLEGROEP Er werden geen bloedmonsters uit deze groep onderzocht omdat geen enkel monster een malaria discriminant factor hoger dan 4,5 had na analyse op de Beckman Coulter DxH GROEP GEHOSPITALISEERDE PATIËNTEN MET EEN INFECTIE (NIET-MALARIA) De 8 onderzochte bloedmonsters van de 8 patiënten waarvan de 27 bloedmonsters met een discriminant factor hoger dan 4,5 afkomstig waren gaven een negatieve sneltest. Tabel 26: Resultaten van de sneltest SD SD BIOLINE Malaria Ag P.f/Pan bij de groep gehospitaliseerde patiënten met een infectie (niet-malaria). Aantal patiënten met een malaria discriminant factor hoger dan 4,5 na analyse op UniCel DxH 800 (8 patiënten) Aantal patiënten met een Aantal patiënten met een positieve malaria sneltest negatieve malaria sneltest GROEP MILITAIREN TERUGKEREND VAN BUITENLANDSE MISSIE Uit de groep militairen terugkerend van buitenlandse missie bleken na de sneltest de 3 bloedmonsters met een malaria discriminant factor hoger dan 4,5 een negatieve sneltest te vertonen. Tabel 27: Resultaten van de sneltest SD SD BIOLINE Malaria Ag P.f/Pan bij de groep militairen terugkerend van buitenlandse missie. Aantal personen met een positieve malaria sneltest Aantal personen met een negatieve malaria sneltest Aantal personen met een malaria discriminant factor hoger dan 4,5 na analyse op UniCel DxH 800 (3 monsters) P a g i n a

70 2.3. CONCLUSIE Er werd de som gemaakt van de bloedmonsters uit de 3 onderzoeksgroepen die een malaria discriminant factor hoger dan 4,5 gaven, namelijk 36 bloedmonsters. Van de 36 bloedmonsters bleken uit de sneltest slechts 5 bloedmonsters een echt positieve sneltest te vertonen voor een Plasmodium-infectie (true positive) op basis van de sneltest, de malaria discriminant factor, de microscopie en de malaria diagnose van het ITG. Op basis van de sneltest en de malaria discriminant factor én de gekende malariadiagnose bleek echter één bloedmonster een vals negatieve sneltest te vertonen (false negative). De overige 30 bloedmonsters bleken op basis van de microscopie vermoedelijk een echte negatieve sneltest te vertonen voor een Plasmodium-infectie (true negative). Tabel 28: Som van de resultaten SD BIOLINE Malaria Ag P.f/Pan bij de malaria positieve controlegroep, de groep gehospitaliseerde patiënten met een infectie (niet-malaria) en de groep militairen terugkerend van buitenlandse missie. Positieve sneltest Negatieve sneltest 5 bloedmonsters 1 bloedmonster Diagnose van malaria bekend (True positive) (False negative) (confirmatie ITG) 0 bloedmonsters 11 bloedmonsters Diagnose van malaria onbekend (False positive) (True negative) (confirmatie ITG) Tabel 29: Resultaten, specificiteit en sensitiviteit van de sneltest SD BIOLINE Malaria Ag P.f/Pan bij de malaria positieve controlegroep, de groep gehospitaliseerde patiënten met een infectie (niet-malaria) en de groep militairen terugkerend van buitenlandse missie. Plasmodium in bloed (Microscopie positief) Geen Plasmodium in het bloed (Microscopie negatief) Sneltest positief 5 0 Sneltest negatief 1 11 Totaal 6 11 Sensitiviteit 83,3% Specificiteit 100% Op basis van deze studie heeft de sneltest SD Bioline Malaria Antigen P.f./Pan een sensitiviteit van 83,3% en een specificiteit van 100%. De firma beweert dat de sneltest een sensitiviteit heeft van 99,7% bij P.falciparum-monsters, 95,5% bij non-p.falciparum monsters en een specificiteit van 99,5%. Op basis van de resultaten in deze studie is de sensitiviteit van de sneltest 16,7% lager en de specificiteit 0,5% hoger dan wat men beweert. Door enkel een sneltest uit te voeren op de bloedmonsters met een factor hoger dan 4,5 kan onvoldoende bevestiging gegeven worden voor een malaria-infectie. Dit is te concluderen uit één bloedmonster uit de malaria positieve controlegroep (P.ovale) die een malaria factor hoger dan 4,5 had, maar een negatieve sneltest. 54 P a g i n a

71 3. MICROSCOPIE De microscopie blijft de gouden standaard op vlak van malaria diagnose. De dikdruppel en het bloeduitstrijkje worden altijd onderzocht om eerdere screeningstesten te confirmeren. Voor de groep patiënten met een infectie en de groep militairen terugkomend van buitenlandse missie werd een bloeduitstrijkje en dikdruppel onderzocht wanneer de malaria discriminant factor hoger of gelijk was aan 4,5. Voor de malaria positieve controlegroep werd voor elk monster een bloeduitstrijkje en een dikdruppel onderzocht MATERIAAL EN METHODEN APPARATUUR Voor de groep patiënten met een infectie en de groep militairen terugkomend van buitenlandse missie werd steeds een automatisch bloeduitstijkje gemaakt en gekleurd door de Beckman Coulter SMS. Wegens het beperkt monstervolume van de monsters uit de malaria positieve controlegroep werden deze bloeduitstrijkjes manueel bereid maar gekleurd met de Beckman Coulter SMS. De dikdruppel werd voor alle groepen manueel bereid en gekleurd REAGENTIA Methanol 96% May Grünwald Giemsa Hemato-buffer ph 6,8 Malaria-buffer ph 7, PRINCIPE BLOEDUITSTRIJKJE Veneus afgenomen volbloed in een tube met anticoagulans K 3 EDTA of een druppel volbloed afgenomen via een vingerprik werd uitgestreken op een objectglaasje tot een dun laagje bloed werd bekomen. Een bloeduitstrijkje bestaat uit een dik gedeelte in het begin van de vlam en een dun gedeelte in het uitlopend einde van de vlam. Hierdoor is het bloed minder geconcentreerd in het einde van de vlam waardoor een monolayer van rode bloedcellen na kleuring microscopisch kan waargenomen worden. Het bloeduitstrijkje werd gefixeerd om de rode bloedcellen intact te houden en vervolgens gekleurd met May-Grünwald Giemsa. Aangezien het bloed minder geconcentreerd is, is 55 P a g i n a

72 de gevoeligheid van een bloeduitstrijkje lager dan die van het geconcentreerde dikdruppel preparaat. Hierdoor wordt het bloeduitstrijkje voornamelijk gebruikt om de Plasmodium species te identificeren in de rode bloedcellen. De rode bloedcellen in het uitstrijkje zijn intact wat de identificatie makkelijker maakt. (Instituut voor Tropische Geneeskunde & Belgische Vereniging van LaboratoriumTechnologen, 2007) (Paugam & Yera, 2005) (World Health Organization 1999) (World Health Organization 2009) (Guillaume, 2009) (De Jonge et al., 1999) ( 2006) ( 2011) DIKDRUPPEL Een druppel volbloed veneus afgenomen in een tube met anticoagulans K 3 EDTA of een druppel volbloed afgenomen via een vingerprik werd aangebracht op een objectglaasje. Deze druppel bloed werd gedefibrineerd door met een scherp voorwerp in de druppel bloed te draaien. Dit gebeurde onmiddellijk en lang genoeg om een goed dikdruppelpreparaat te bekomen. Het preparaat werd niet gefixeerd zodat de rode bloedcellen lyseerden. Doordat de druppel bloed op een kleine oppervlakte geconcentreerd werd, heeft dit preparaat een grotere sensitiviteit voor de Plasmodium opsporing dan het bloeduitstrijkje. De detectielimiet is sterk afhankelijk van de microscopist die het preparaat onderzoekt. (Instituut voor Tropische Geneeskunde & Belgische Vereniging van LaboratoriumTechnologen, 2007) (Paugam & Yera, 2005) (World Health Organization 1999) (World Health Organization 2009) (Guillaume, 2009) (De Jonge et al., 1999) ( 2006) MAY GRÜNWALD GIEMSA De May-Günwald Giemsa kleuring werd toegepast om de componenten van hematologische uitstrijkjes te kleuren. De zure kleurstof eosine en de basische kleurstof methyleenblauw in de May-Grünwald kleurstof hebben een affiniteit voor de basische respectievelijke zure celcomponenten. Eosine bindt aan de positief geladen groepen in hemoglobine of positief geladen korrels (alkalische derivaten) van de eosinofiele granulocyten waardoor ze roze kleuren. Methyleenblauw kleurt het RNA en DNA doordat het bindt aan de negatief geladen fosfaatgroepen, maar het kleurt ook de negatief geladen korrels (heparine) in het cytoplasma van de basofiele granulocyten en het primitieve cytoplasma waardoor deze blauw tot paars kleuren. De May-Grunwald oplossing bevat ook methanol die de bloedcellen zal fixeren. Giemsa bevat naast eosine, methyleenblauw en methanol ook het oxidatie product van methyleenblauw, namelijk methyleenazuur. Methyleenazuur bevat polychrome (veelkleurige) kleureigenschappen waardoor het de details van de kernen van de witte bloedcellen en de granulatie van de bloedplaatjes beter en duidelijker zal kleuren. Vandaar dat Giemsa toegevoegd wordt aan de May-Grünwald kleuring om een nog optimalere kleuring te bekomen en een beter onderscheid te kunnen maken tussen de morfologie van de verschillende bloedcellen. (Guillaume, 2009) ( (at.vwr-cmd.com) 56 P a g i n a

73 GIEMSA Zoals reeds vermeld bevat Giemsa eosine, methyleenblauw, methanol en methyleenazuur. Methyleenazuur bevat polychrome (veelkleurige) kleureigenschappen waardoor het de details van de kernen van de witte bloedcellen en de granulatie van de bloedplaatjes beter en duidelijker zal kleuren. (Guillaume, 2009) PROCEDURE BLOEDUITSTRIJKJE MET MAY GRÜNWALD GIEMSA KLEURING Er werd 5 µl volbloed (van K 3 EDTA tube of van een vingerprik afgenomen) en aangebracht op een objectglaasje. Onmiddellijk na het aanbrengen van het bloed werd een tweede objectglaasje met de smalle rand in een hoek van 45 geplaatst vlak voor de druppel bloed. Door het objectglaasje naar achter te trekken tot tegen de druppel, vult de contactoppervlakte tussen de twee objectglaasjes zich voor 2/3 met het bloed. Vervolgens werd met een vloeiende en snelle beweging het objectglaasje naar voren getrokken te om het bloed uit te strijken. ( 2006) (Deluol, 2004) Het bloeduitstrijkje werd gedroogd aan de lucht maar bloeduitstrijkjes die bereid werden met volbloed uit K 3 EDTA tubes moesten extra lang drogen omdat de adhesie aan de objectglaasjes moeilijker verloopt. Het uitstrijkje werd manueel aangeboden aan de Beckman Coulter SMS en doorliep een automatisch kleurproces doordat het objectglaasje verschillende baden doorliep (methanol 96%, May-Grünwald ½ verdund met hematobuffer ph 6,8, Giemsa ½ verdund met hematobuffer ph 6,8). (Beckman Coulter Ireland, 2013) DIKDRUPPEL Er werd 5 µl volbloed (van K 2 EDTA tube of van een vingerprik afgenomen) en aangebracht op een objectglaasje. Onmiddellijk na het aanbrengen van het bloed werd met de niet-afgeronde hoek van een tweede objectglaasje de druppel plaatselijk uitgesmeerd door continu met de hoek van het glaasje in de druppel te draaien gedurende 2 minuten. ( 2006) (Deluol, 2004) (Van Haute, 2013) Het objectglaasje werd 10 minuten gedroogd in een droogoven bij een temperatuur van 80 C. (Van Haute 2013) De Giemsa kleuring werd steeds vers bereid door aan 40 ml malaria buffer (ph 7,2) 50 druppels Giemsa kleurstof toe te voegen en te homogeniseren (Van Haute, 2013). Deze malaria buffer werd bereid door een buffertablet (Kaliumdiwaterstoffosfaat 0,7 g (KH 2 PO 4 ), Dinatriumwaterstoffosfaat 1,04 g (Na 2 HPO 4 )) op te lossen in 1 L water en de 57 P a g i n a

74 ph te controleren met een ph meter (Guillaume, 2009). De ph van deze buffer is zeer belangrijk omdat anders de kleuring van de granulatie niet correct verloopt, wat resulteert in valse microscopische beelden. (Guillaume, 2009) Het gedroogde objectglaasje werd met de bloedoppervlakte naar onderen gericht op een deksel met een holte naar boven gericht geplaatst. Vervolgens werd de kleurstof voorzichtig in het deksel gegoten tot de kleurstof contact heeft met de volledige oppervlakte van het objectglaasje. Het objectglaasje werd gedurende 35 minuten op deze manier gekleurd. Deze methode werd voorgesteld op een congres in Amsterdam en nu toegepast in de routine van het Militair Hospitaal. Deze methode heeft het voordeel dat mogelijke vervuiling van de kleurstof niet op het objectglaasje terechtkomt maar naar de bodem van het deksel zakt. Vervolgens werd het objectglaasje voorzichtig afgespoeld met water. De dikdruppel werd nogmaals 10 minuten bij 80 C gedroogd en nadien microscopisch afgelezen. (Van Haute, 2013) MICROSCOPIE Om de Plasmodium-parasieten microscopisch op te sporen in het bloed werd de dikdruppelpreparaat onder een vergroting van 50x10 globaal gescreend en nadien op een vergroting van 100x10 met immersieolie grondig gescreend. Deze screening diende ongeveer 15 minuten te duren. (Van Haute, 2013) Indien een preparaat vermoedelijk negatief leek te zijn, werd nog 30 minuten verder gezocht alvorens negatief geantwoord werd. In gevallen waar men malaria vermoedde (omwille van de symptomen en verblijf patiënt) kon een tweede microscopist ingeschakeld worden voor een tweede opinie of bij een zeer sterk vermoeden kon op een later tijdstip een tweede bloedstaal van de verdachte patiënt onderzocht worden. (Van Haute, 2013) Wanneer een preparaat positief is voor Plasmodium parasieten, werd nagegaan hoe groot de densiteit was van de parasitemie. Wanneer het aantal parasieten in het preparaat veel te groot was om nauwkeurig te tellen, werd geteld op het bloeduitstrijkje. Wanneer het aantal parasieten niet te hoog was, kon de parasitemie bepaald worden op het dikdruppel preparaat. DIKDRUPPEL In het dikdruppelpreparaat werd op een 100x10 vergroting het aantal parasieten geteld per 200 witte bloedcellen. Wannneer men minder dan 10 parasieten telde per 200 witte bloedcellen werd de telling verdergezet tot 500 witte bloedcellen. Wanneer er gametocyten of schizonten werden waargenomen, werden deze niet meegeteld maar wel 58 P a g i n a

75 vermeld als commentaar bij de telling. Wanneer het aantal parasieten per 200 witte bloedcellen en het totaal aantal witte bloedcellen per µl in het bloed (door CBC analyse op de Beckman Coulter DxH) gekend was kon het aantal parasieten per µl berekend worden. (Van Haute, 2013) (World Health Organization, 2003) Bijvoorbeeld: 250 parasieten waargenomen bij het tellen van 200 witte bloedcellen en de concentratie witte bloedcellen in het staal is 4,5.10³/mm³ (4,5.10³/µl) dan is de parasitemie 5625 AP/µl. Wanneer een dikdruppel positief was voor de Plasmodium parasieten, werd een ongekleurd dikdruppelpreparaat van dit monster opgestuurd naar het Instituut voor Tropische Geneeskunde (ITG) te Antwerpen voor de confirmatie van de parasitemie. Het ITG is het nationaal referentiecentrum voor malaria. BLOEDUITSTRIJKJE In het uitstrijkje werd het aantal geparasiteerde rode bloedcellen op 5000 rode bloedcellen geteld. De beste methode hiervoor is het aantal rode bloedcellen in één veld te tellen en hier het aantal geparasiteerde rode bloedcellen te tellen, vervolgens werd er overgegaan tot een naastgelegen veld met dezelfde densiteit rode bloedcellen tot een totaal van 5000 rode bloedcellen werd geteld. Deze telling kon het best herhaald worden tot verschillende velden geteld werden en hiervan werd het gemiddelde genomen. Gametocyten en schizonten werden niet meegeteld maar wel vermeld als commentaar. Wanneer het aantal geparasiteerde rode bloedcellenparasieten per 5000 rode bloedcellen en het totaal aantal rode bloedcellen per µl in het bloed ook (door CBC analyse op de Beckman Coulter UniCel DxH 800) gekend was, kon het aantal parasieten per µl berekend worden. (Van Haute, 2013) (World Health Organization, 2003) Bijvoorbeeld: Op 5000 rode bloedcellen (10 velden) werden 10 geparasiteerde rode bloedcellen getelt en de concentratie rode bloedcellen in het staal is 4, /mm³ (4, /µl) dan is de parasitemie 9000 AP/µl of 0,2%. In het bloeduitstrijkje werd ook de Plasmodium species geïdentificeerd, omdat de trofozoïeten en schizonten van de verschillende species bepaalde specifieke veranderingen van de rode bloedcellen induceren. Gametocyten zijn het meest specifiek per species, de aanwezigheid van gametocyten vergemakkelijkt de identificatie. In het bloeduitstrijkje kon ook een eventuele menginfectie waargenomen worden. Wanneer een bloeduitstrijkje positief was voor een Plasmodium-infectie, werd een ongekleurd maar wel gefixeerd bloeduitstrijkje van dit monster opgestuurd naar het 59 P a g i n a

76 Instituut voor Tropische Geneeskunde te Antwerpen voor de confirmatie van de parasitemie en de identificatie. In het ITG werd de PCR-techniek toegepast om met zekerheid een menginfectie of een species te bevestigen. De correcte species identificatie is belangrijk voor de behandeling en in geval van resistentie RESULTATEN In alle monsters uit de malaria positieve controlegroep werd na microscopisch onderzoek (dikdruppel en bloeduitstrijkje) Plasmodium-parasieten, namelijk trofozoiëten waargenomen. Twee van de zes monsters werden vastgesteld als een P.ovale infectie, en de overige vier als P.falciparum. Alle monsters met een malaria discriminant factor hoger dan 4,5 uit de groep gehospitaliseerde patiënten met een infectie hadden geen parasieten zichtbaar in hun bloed. De drie monsters met een malaria discriminant factor hoger dan 4,5 uit de groep terugkerende militairen van buitenlandse missie hadden geen Plasmodium parasieten zichtbaar in het bloed bij microscopisch onderzoek, waarvan één monster afkomstig was van een patiënt die drie dagen eerder gediagnosticeerd was met malaria (P.ovale) en in die 3 dagen een behandeling onderging. Tabel 30: Resultaten van de microscopie (dikdruppel en bloeduitstrijkje). Geen parasieten in bloed Microscopie negatief Parasieten in bloed Microscopie positief Malaria factor < 4,5 / / Malaria factor > 4,5 30 (11 patiënten) 6 Sneltest - 30 (11 patiënten) 1 Sneltest Tabel 31: Het aantal geparasiteerde rode bloedcellen per µl (AP/µl), de Plasmodium species en de verschillende stadia dat werd vastgesteld bij elk monster in de malaria positieve controlegroep. Monster AP/µl Plasmodium species Stadia P.ovale Trofozoïeten, schizonten en gametocyten P.falciparum Trofozoïeten P.falciparum Trofozoïeten P.falciparum Trofozoïeten P.falciparum Trofozoïeten 6 Parasitemie niet gekend P.ovale Trofozoïeten 60 P a g i n a

77 Figuur 47: Een P.ovale trofozoiët in een bloeduitstrijkje gekleurd met May-Grünwald Giemsa op een vergroting 100x10 onder de lichtmicroscoop Figuur 48: Een P.ovale geparasiteerde rode bloedcel met meerdere trofozoïeten (polyparasitisme, zeldzaam) in een bloeduitstrijkje gekleurd met May-Grünwald Giemsa op een vergroting 100x10 onder de lichtmicroscoop Figuur 49: Een P.ovale schizont die op uitbarsten staat in een bloeduitstrijkje gekleurd met May-Grünwald Giemsa op een vergroting 100x10 onder de lichtmicroscoop Figuur 50: Een P.falciparum trofozoiët in een bloeduitstrijkje gekleurd met May-Grünwald Giemsa op een vergroting 100x10 onder de lichtmicroscoop Figuur 51: Een P.falciparum trofozoiët (oudere vorm) in een bloeduitstrijkje gekleurd met May-Grünwald Giemsa op een vergroting 100x10 onder de lichtmicroscoop Figuur 52: Een P.falciparum trofozoiët (oudere vorm) in een bloeduitstrijkje gekleurd met May-Grünwald Giemsa op een vergroting 100x10 onder de lichtmicroscoop 3.3. CONCLUSIE Alle 6 monsters uit de malaria positieve controlegroep werden malaria positief bevonden op basis van microscopisch onderzoek. Er werden dus geen valsnegatieve monsters vastgesteld. Bovendien werden dankzij de microscopie de overige 30 monsters afkomstig van 11 patiënten met een malaria factor hoger dan 4,5 negatief bevonden. Microscopie blijft de gouden standaard voor de malaria diagnose in routine laboratoria. 61 P a g i n a

78 VI. CONCLUSIE De malaria discriminant factor kan een hulp zijn in de screening van malaria. Wanneer een monster op de UniCel DxH 800 een celtelling en differentiatie (CBC+DIFF) ondergaat wordt automatisch deze malaria factor berekend. Deze methode is snel en vereist geen extra expertise of extra hoeveelheid monster. Er is een groot significant verschil tussen malaria negatieve monsters en malaria positieve monster. Echter kunnen andere infecties ook een verhoogde malaria discriminant factor vertonen door de aanwezigheid van grotere monocyten en lymfocyten als reactie op de infectie. De waarden van de malaria discriminant factor, de SD V monocyten en de SD V lymfocyten bij monsters met een vals positieve malaria discriminant factor kunnen de resultaten van deze waarden bij de monsters met een echt positieve malaria discriminant factor overlappen. De spreiding van het celvolume van de lymfocyten toonde meer significante verschillen aan tussen de groepen dan de spreiding van het celvolume van de monocyten. In deze studie is de een cut-off waarde van 5,0 voor malaria indicatie ideaal. Het aantal monsters met een vals positieve indicatie voor malaria werd gereduceerd met ongeveer 48% en de specificiteit steeg zonder een daling van de sensitiviteit. Het witte bloedcelhistogram (WBC-histogram) kan geraadpleegd worden wanneer door het toestel een hoge malaria discriminant factor wordt aangegeven. Echter vertonen niet alle malaria positieve monsters een hogere celfrequentie op de 35 fl grens t.o.v. een normaal monster. Een WBC-histogram met een hogere celfrequentie op de 35 fl grens kan echter wel het vermoeden van malaria bij een hoge malaria discriminant factor bevestigen. De differentiatie 2D-dataplots van de lichtverstrooiing (5PD1) vertoonden een extra populatie of malariasignalen bij de zes monsters van de malaria positieve controlegroep. Echter waren deze niet karakteristiek aanwezig en verscheen deze populatie ook bij enkele monsters van de gehospitaliseerde patiënten met een infectie (niet-malaria). De interpretatie van de dataplots is niet specifiek genoeg om bij een hoge malaria discriminant factor het vermoeden van een malaria-infectie te bevestigen. De NRBC-dataplots vertoonden enkel een groene populatie links onderaan bij de monsters met een P.ovale infectie. De interpretatie van deze dataplots voor het bevestigen van een vermoeden van malaria-infectie bij een hoge malaria discriminant factor is niet specifiek en sensitief genoeg aangezien 4/6 van de monsters deze populatie niet vertoondde. De sneltest van de gekende malaria positieve monsters was bij 5 van de 6 monsters positief met de juiste interpretatie van Plasmodium species. De sneltest was negatief bij 62 P a g i n a

79 alle monsters met een malaria discriminant factor hoger dan 4,5 maar een negatief microscopisch onderzoek. De microscopie kon de malaria-infectie bij alle gekende malaria positieve monsters bevestigen. De monsters met een malaria discriminant factor hoger dan 4,5 uit de overige 3 groepen waren negatief voor microscopisch onderzoek. Tabel 32: Vergelijking van de sneltest SD Biolone Malaria p.f./pan met de malaria discriminant factor op de UniCel DxH 800 en de gouden standaard microscopie. Diagnose malaria bekend Diagnose malaria onbekend maar negatief bij microscopie Malaria factor < 4,5 0 / (580) Malaria factor > 4, (11 patiënten) Sensitiviteit: 100% Specificiteit: 94,30% Sneltest Sneltest Sensitiviteit: 83,33 % Specificiteit: 100% Microscopie Microscopie Sensitiveit: 100 % Maximale specificiteit: 100% Deze studie toont aan dat de automatische detectie van malaria met behulp van de malaria discriminant factor op de UniCel DxH 800 interessant kan zijn voor een eerste screening van malaria wanneer er geen vermoeden is van een malaria-infectie. Een hogere malaria discriminant factor kan de laborant of onderzoeker alert maken op een potentiële malaria-infectie. Een sneltest kan additioneel uitgevoerd worden om een tweede screening uit te voeren, maar het microscopisch onderzoek dient steeds uitgevoerd te worden voor de confirmatie van de potentiële malaria-infectie. Wanneer men een monster positief voor malaria heeft ontdekt of een monster heeft waarvan men een malaria-infectie sterk vermoedt, moet het monster opgestuurd worden naar het Instituut voor Tropische Geneeskunde (ITG) te Antwerpen voor de confirmatie met de moleculaire technieken zoals PCR die de grootste gevoeligheid hebben voor de malaria detectie. Deze screening kan bijdragen tot de detectie of indicatie van malaria-infecties wanneer de symptomen afwezig zijn en de dokter geen vermoeden heeft van malaria. Hierdoor zou het aantal niet ontdekte malaria-infecties kunnen dalen. 63 P a g i n a

80 VII. DISCUSSIE In deze studie was de omvang van de malaria positieve monsters erg klein. Gedurende de periode februari-april waren er slechts 6 monsters van patiënten met een malariainfectie beschikbaar voor de studie. Bovendien waren enkel de species P.falciparum en P.ovale vertegenwoordigd en niet P.vivax en P.malariae. De studie zou herhaald moeten worden met een groter aantal malaria positieve monsters om een betere conclusie te vormen over de geautomatiseerde detectie van malaria. Ook zouden alle species vertegenwoordigd moeten zijn om te evalueren of de detectie mogelijk is voor alle Plasmodium species. De groep monsters van militairen die terugkeerden van buitenlandse missie hoefde niet in deze studie toegevoegd te worden. Maar deze groep werd toch onderzocht om een eventuele onvermoedde malaria-infectie te kunnen detecteren. 64 P a g i n a

81 VIII. REFERENTIES Alere. (2013). SD Bioline Malaria Antigen P.f/Pan test procedure. Beckman Coulter Ireland, Inc. (2013a). Unicel DxH800 Coulter Cellular Analysis System and UniCel DxH 600 Coulter Cellular Analysis System: Instructions for Use. USA. Beckman Coulter Ireland, Inc. (2013b). UniCel DxH Slidemaker Stainer, Coulter Cellular Analysis System Slidemaler Stand-Alone for Hematology Specimen Processing: Instructions for Use. USA. Briggs, C., Da Costa, A., Freeman, L., Aucamp, I., Ngubeni, B. & Machin S.J. (2006). Development of an Automated Malaria Discriminant Factor Using VCS Technology. Journal of clinical pathology, 126, nr.5, pp Geraadpleegd op 18 januari 2014 via Campuzano-Zuluanga, G. Grobusch, M.P. & Hänscheid, T. (2010). Automated haematology analysis to diagnose malaria. Malaria Journal, 9, nr.346. Geraadpleegd op 19 januari 2014 via Castrynck, H., Meensel, Van B. & Lontie, M. (2013). Diagnose van malaria. Labo-mailing, nr.209. Geraadpleegd op 19 januari 2014 via Chua, C.L. Brown, G. Hamilton, J.A. Rogerson, S. & Boeuf, P. (2013). Monocytes and macrophages in malaria: protection or pathology?. Trends in parasitology, 29, pp Geraadpleegd op 15 februari 2014 via Coatney, G.R., Collins, W.E., Warren, M. & Contacos, P.G. (1971). The Primate Malarias. U.S. Department of Health, Education and Welfare. Betesha. De Jonge, N., Polderman, A.M. & Verhave, J.P. (1999). Diagnose van malaria. Nederlands tijdschrift Klinische Chemie en Laboratoriumgeneeskunde, nr.24, pp Geraadpleegd op 19 januari 2014 via Deluol, A.M. (2004). Colour Atlas of parasitology vol.4: Blood and tissue parasites. Saint- Maur: Éditions Varia. 65 P a g i n a

82 Donati, D., Mok, B., Chêne, A., XU, H., Thangarajh, M., Glas, R., Chen, Q., Wahlgren, M. & Bejarano, M.T. (2006). Increased B Cell Survival and Preferential Activation of the Memory Compartment by a Malaria Polyclonal B Cell Activator. International Journal of Immunology, 177, nr.5, pp Geraadpleegd op 8 februari 2014 via Everdingen, van J.J.E., Glerum, J.H. & Wiersma T. (2001). Praktische huisartsgeneeskunde: Diagnose en therapie. Houten: Bohn Stafleu van Loghum. Fourcade, C., Casbas, M.J., Belaouni, H., Duran Gonzalez, J.J., Sassier, P., Jiminze Garcia, P.J. & Esteban Pepio, M.A. (2004). Automated detection of malaria by mean of the haematology analyser Coulter GEN.S. International Journal of Laboratory Hematology, 26, pp Geraadpleegd op 8 februari 2014 via Gillet, P., Mori, M., Esbroeck, Van E., Ende, Van den J. & Jacobs, J. (2009). Assessment of the prozone effect in malaria rapid diagnostic tests. Malaria Journal, 8, nr.271. Geraadpleegd op 10 mei 2014 via Guillaume, V. (2009, april). Parasitologie sanguin. (1 e druk). Brussel: De Boeck. Hänscheid, T. (1999). Diagnosis of malaria: a review of alternatives to conventional microscopy. Clinical & Laboratory Haematology,21, 4, pp Geraadpleegd op 2 februari 2014 via Hedley, B.D., Keeney, M., Chin-YEE, I. & Brown, W. (2010). Initial performance evaluation of the UniCel DxH 800 Coulter cellular analysis system. International Journal of laboratory hematology, 33, pp Geraadpleegd op 1 februari 2014 via Hoffman, R., Benz, E.J., Shattil, S.J., Furie, B. & Cohen, H.J. (1991). Hematology: Basic principles and practice. (1 e druk). New York: Churchill Livingstone. Hopkins, H., Kambale, W., Kamya, M.R., Staedke, S.G., Dorsey, G. & Rosenthal, P.J. (2007). The comparison of HRP2- and pldh-based rapid diagnostic tests for malaria with longitudinal follow-up in Kampala, Uganda. The Amarican Society of Tropical Medicine and Hygiene, 76, nr.6, pp Geraadpleegd op 18 januari 2014 via 66 P a g i n a

83 Instituut voor Tropische Geneeskunde & Belgische Vereniging van LaboratoriumTechnologen. (2007, juni). Laboratoriumdiagnose van malaria en andere bloedparasieten, voortgezette beroepsopleiding in de parasitologie. Lee, H.K., KIM, S.I., CHAE, H., Kim, M., LIM, J., OH, E.J., KIM, Y., PARK, Y.J., LEE, W., & HAN, K. (2012). Sensitive detection and accurate monitoring of Plasmodium vivax parasites on routine complete blood count using automatic blood cell analyzer (DxH800 TM ). International Journal of Laboratory Hematology, 34, pp Nicolas, X., Hugard, L., Desemerie, F., Nicolas, F. & Floch, J.J. (1998). Paludisme: Apport diagnostique des modifications biologiques chez l expatrié. Feuillets de biologie, xxix, nr.223, pp Paugam, A. & Yera, H. (2005). Diagnostic biologique du paludisme. Biologiste et practicien, 2, nr.142, pp Pierce, S.K. & Miller, L.H. (2009). World Malaria Day 2009: What malaria knows about the immune system that immunologists still don t. International Journal of Immunology, 182, nr.9, pp Geraadpleegd op 8 februari 2014 via Simon-Lopez, R. (2013). U.S Patent No. 7,256,048B2. Fullerton, Beckman Coulter, Inc. Strien, van W. (2002). Malariakaarten helpen bij speurtocht naar vaccin. Cicero, nr. 16, pp Geraadpleegd op 2 februari 2014 via / pdf Tangpukdee, N., Duangdee, C., Wilairatana, P. & Krudsood, S. (2009). Malaria diagnosis: A Brief Review. Korean Journal of Parasitology, 47, nr.2, pp Geraadpleegd op 1 februari 2014 via Van Haute (2013). Procedure: Frottis de sanguin et DDR. [SOP]. Labo Hematologie, Militair Hospitaal Koninging Astrid. Warhurst, D.C. & Williams, J.E. (1996). Laboratory diagnosis of malaria. Journal of clinical pathology, 49, nr.7, pp Geraadpleegd op 18 januari via 67 P a g i n a

84 World Health Organization Geneva. (1999, oktober). New Perspectives: Malaria Diagnosis, Report of a joint WHO/Usaid informal consultation. (WHO/MAL/ ). Geraadpleegd op 18 januari 2014 via World Health Organization Geneva. (2003). Manual of basic techniques for a health laboratory.(2 de editie). Geraadpleegd op via 15 maart 2014 via World Health Organization Geneva. (2009, oktober). Parasitological confirmation of malaria diagnosis: Report of a WHO technical consultation Geneva. (NLM classification: WC 765). Geraadpleegd op 1 februari 2014 via World Health Organization. (2012). International travel and health. Hoofdstuk 7. Geraadpleegd op 2 februari 2014 via Websites: May Grünwald s stain for microscopy. Geraadpleegd op 2 februari 2014 via Product Information May-Grünwald Giemsa. Geraadpleegd op 2 februari 2014 via Laboratory diagnosis of malaria: Preparation of blood smears (2011). Geraadpleegd op 18 januari 2014 via Malariabehandeling in geval van nood (2010). Geraadpleegd op 26 april 2014 via Standard Operating Procedure voor het maken van grotere hoeveelheden malariapreparaten (2006). Geraadpleegd op 20 januari 2014 via Clinical manifestations of malaria (2013). Geraadpleegd op 18 januari 2014 via 68 P a g i n a

85 IX. APPENDIX Appendix 1: Schema malaria discriminant factor in de onderzochte groepen...69 Appendix 2: Beschrijvende statistiek en t-test analyse (malaria discriminant factor)...70 Appendix 3 : Beschrijvende statistiek en t-test analyse (SD V lymfocyten)...72 Appendix 4 : Beschrijvende statistiek en t-test analyse (SD V monocyten)...74 Appendix 5 : Beschrijvende statistiek en t-test analyse (bloedplaatjes)...76 Appendix 6: Case study P.ovale infectie...78 Appendix 7: Invloed temperatuur en leeftijd van het bloedmonster op de malaria discriminant factor, de dataplots en het WBC histogram Appendix 8: Correlatie...86 Appendix 1: Schema malaria discriminant factor in de onderzochte groepen 296 monsters Gezonde personen (296) Geen bezoek aan risicogebied, geen symptomen 0 monsters met een malaria discriminant factor > 4,5 178 monsters STUDIE Gehospitaliseerde patiënten met een infectie (52) Geen bezoek aan risicogebieden, geen symptomen 27 monsters (8 patiënten) met een malaria discriminant factor > 4,5 27 monsters vals positief (geen malaria) op basis van de lichtmicroscopie en/of sneltest 6 monsters Personen met malaria diagnose (6) 6 monsters met een malaria discriminant factor > 4,5 6 monsters echt positief (malaria infectie) op basis van de lichtmicroscopie en/of sneltest 2 monsters 132 monsters Militairen terugkerend van buitenlandse missie (132) 3 monsters met een malaria discriminant factor > 4,5 vals positief (geen malaria) op basis van de lichtmicroscopie en/of sneltest 1 monster afkomstig van een patiënt met malaria na 4 dagen behandeling 69 P a g i n a

86 Appendix 2: Beschrijvende statistiek en t-test analyse (malaria discriminant factor) Tabel 33: Beschrijvende statistiek van de malaria discriminant factor voor de vier groepen. NORMAAL INFECTIE TRAVEL MALARIA Gemiddelde 2,3306 3,5052 2,3388 7,2485 Standaardfout 0,0182 0,0692 0,0260 0,7167 Mediaan 2,2797 3,4026 2,2930 7,4641 Modus 2,1168 3,0400 #N/B #N/B Standaarddeviatie 0,3122 0,9234 0,2995 1,7554 Steekproefvariantie 0,0975 0,8527 0,0897 3,0816 Kurtosis 0,9666 0,5270 4,8427-2,9458 Scheefheid 0,9676 0,7612 1,5639-0,1075 Bereik 1,7442 5,0184 1,9151 3,7633 Minimum 1,6720 2,0180 1,8948 5,2835 Maximum 3,4162 7,0364 3,8099 9,0469 Som 682, , , ,4910 Aantal (zonder outliers) CI (95%) 0,0359 0,1366 0,0514 1,8422 CI (99%) 0,0473 0,1802 0,0679 2,8897 Tabel 34: T-test voor de vergelijking van de malaria discriminant factor tussen de groepen. Significant verschil op een 0.01 betrouwbaarheidsniveau (*) en significant verschil op 0.05 betrouwbaarheidsniveau (**). NORMAAL & INFECTIE NORMAAL & TRAVEL NORMAAL & MALARIA (eenzijdig) T- statistische gegevens -16,4099-0,2569-6,8600 P (T<=t) 5, , , Kritiek gebied van T-toets 95% 1,9718 1,9690 2,0150 Kritiek gebied van T-toets 98,75% (Bonferroni correctie van 95%) 2,5203 2,5149 3,1634 Kritiek gebied van T-toets 99% 2,6004 2,5945 3,3649 Kritiek gebied van T-toets 99,75% 3,0617 3,0525 (Bonferroni correctie van 99%) 4,7733 Conclusie T > Kritische T Significant verschil** (µ1 µ2) p(5, ) < α T < Kritische T Geen significant verschil (µ1=µ2) p(0,797471) > α T > Kritische T Significant verschil** (µ2>µ1) p(0,000503) < α 70 P a g i n a

87 INFECTIE & INFECTIE & TRAVEL & MALARIA MALARIA TRAVEL (eenzijdig) (eenzijdig) T- statistische gegevens 15,7783-5,1991-6,8464 P (T<=t) 3, , , Kritiek gebied van T-toets 95% 1,9706 2,0150 2,0150 Kritiek gebied van T-toets 98,75% (Bonferroni correctie van 95%) 2,5180 3,1634 3,1634 Kritiek gebied van T-toets 99% 2,5980 3,3649 3,3649 Kritiek gebied van T-toets 99,75% (Bonferroni correctie van 99%) 3,0579 4,7733 4,7733 Conclusie T > Kritische T T > Kritische T T > Kritische T Significant Significant Significant verschil** verschil** verschil** (µ2>µ1) (µ1 µ2) (µ2>µ1) p(0,000508) < α p(3, ) < α p(0,001735) < α 71 P a g i n a

88 Appendix 3 : Beschrijvende statistiek en t-test analyse (SD V lymfocyten) Tabel 35: Beschrijvende statistiek van de spreiding van het volume voor de lymfocyten (SD V lymfocyten) voor de vier groepen. NORMAAL INFECTIE TRAVEL MALARIA Gemiddelde 13,84 17,04 13,94 29,49 Standaardfout 0,061 0,20 0,10 3,79 Mediaan 13,75 16,82 13,80 25,77 Modus 13,57 16,63 13,43 #N/B Standaarddeviatie 1,05 2,64 1,15 9,29 Steekproefvariantie 1,10 6,98 1,32 86,36 Kurtosis -0,10-0,58 3,81-1,28 Scheefheid 0,46 0,40 1,27 0,74 Bereik 5,81 11,49 7,67 23,65 Minimum 11,27 12,16 11,8 19,29 Maximum 17,08 23,65 19,47 42,94 Som 4054, , ,57 176,91 Aantal CI (95%) 0,1205 0,3930 0,1963 9,7523 CI (99%) 0,1588 0,5186 0, ,2971 Tabel 36: T-test voor de vergelijking van de spreiding van het volume voor de lymfocyten (SD V lymfocyten)tussen de groepen. Significant verschil op een 0.01 betrouwbaarheidsniveau (*) en significant verschil op 0.05 betrouwbaarheidsniveau (**). NORMAAL & INFECTIE NORMAAL & TRAVEL NORMAAL & MALARIA (eenzijdig) T- statistische gegevens -15,3716-0,8391-4,1235 P (T<=t) 3, , , Kritiek gebied van T-toets 95% 1,9714 1,9700 2,0150 Kritiek gebied van T-toets 98,75% (Bonferroni correctie van 95%) 2,2577 2,2557 3,1634 Kritiek gebied van T-toets 99% 2,5996 2,5966 3,3649 Kritiek gebied van T-toets 99,75% (Bonferroni correctie van 99%) Conclusie T > Kritische T Significant verschil** (µ1 µ2) p(3, ) < α 2,8371 2,8334 T < Kritische T Geen significant verschil (µ1=µ2) p(0,402275) > α 4,7733 T > Kritische T Significant verschil** (µ2>µ1) p(0,004571) < α 72 P a g i n a

89 INFECTIE & TRAVEL INFECTIE & MALARIA (eenzijdig) TRAVEL & MALARIA (eenzijdig) T- statistische gegevens 13,9540-3,2754-4,0968 P (T<=t) 3, , , Kritiek gebied van T-toets 95% 1,9694 2,0150 2,0150 Kritiek gebied van T-toets 98,75% (Bonferroni correctie van 95%) 2,5158 3,1634 3,1634 Kritiek gebied van T-toets 99% 2,5955 3,3649 3,3649 Kritiek gebied van T-toets 99,75% (Bonferroni correctie van 99%) Conclusie 3,0540 T > Kritische T Significant verschil** (µ1 µ2) p(3, ) < α T > Kritische T Significant verschil* (µ2>µ1) p(0,011033) < ,7733 4,7733 T > Kritische T Significant verschil** (µ2>µ1) p(0,004692) < α 73 P a g i n a

90 Appendix 4 : Beschrijvende statistiek en t-test analyse (SD V monocyten) Tabel 37: Beschrijvende statistiek van de spreiding van het volume voor de monocyten (SD V monocyten) voor de vier groepen. NORMAAL INFECTIE TRAVEL MALARIA Gemiddelde 16,83 20,22 16,91 26,13 Standaardfout 0,09 0,20 0,14 3,19 Mediaan 16,57 20,06 16,63 26,65 Modus 16,00 19,00 16 #N/B Standaarddeviatie 1,53 2,66 1,63 7,82 Steekproefvariantie 2,35 7,10 2,67 61,13 Kurtosis 1,75-0,52 4,23 0,97 Scheefheid 1,10 0,16 1,62-0,94 Bereik 9,50 12,67 9,71 21,17 Minimum 13,62 14,33 14,17 12,8 Maximum 23, ,88 33,97 Som 4965, , ,11 156,78 Aantal CI (95%) 0,1756 0,3964 0,2783 8,2052 CI (99%) 0,2313 0,5231 0, ,8704 Tabel 38: T-test voor de vergelijking van de van het volume voor de monocyten (SD V monocyten) tussen de groepen. Significant verschil op een 0.01 betrouwbaarheidsniveau (*) en significant verschil op 0.05 betrouwbaarheidsniveau (**). NORMAAL & INFECTIE NORMAAL & TRAVEL NORMAAL & MALARIA (eenzijdig) T- statistische gegevens -15,4265-0,4714-2,9114 P (T<=t) 5, ,6378 0,0167 Kritiek gebied van T-toets 95% 1,9697 1,9697 2,0150 Kritiek gebied van T-toets 98,75% (Bonferroni correctie van 95%) 2,5163 2,5163 3,1634 Kritiek gebied van T-toets 99% 2,5960 2,5960 3,3649 Kritiek gebied van T-toets 99,75% (Bonferroni correctie van 99%) Conclusie T > Kritische T Significant verschil** (µ1 µ2) p(5, ) < α 3,0549 3,0549 T < Kritische T Geen significant verschil (µ1=µ2) p(0,637759) > α 4,7733 T > Kritische T Significant verschil* (µ2>µ1) p(0,016673) < P a g i n a

91 INFECTIE & TRAVEL INFECTIE & MALARIA (eenzijdig) TRAVEL & MALARIA (eenzijdig) T- statistische gegevens 13,5053-1,8467-2,88511 P (T<=t) 1, ,0620 0,0172 Kritiek gebied van T-toets 95% 1,9680 2,0150 2,0150 Kritiek gebied van T-toets 98,75% (Bonferroni correctie van 95%) 2,5131 3,1634 3,1634 Kritiek gebied van T-toets 99% 2,5925 3,3649 3,3649 Kritiek gebied van T-toets 99,75% (Bonferroni correctie van 99%) Conclusie 3,0494 T > Kritische T Significant verschil** (µ1 µ2) p(1, ) < α T > Kritische T Geen significant verschil (µ2>µ1) p(0,062041) > ,7733 4,7733 T > Kritische T Significant verschil* (µ2>µ1) p(0,034382) < P a g i n a

92 Appendix 5 : Beschrijvende statistiek en t-test analyse (bloedplaatjes) Tabel 39: Beschrijvende statistiek van de spreiding van de bloedplaatjes voor de vier groepen. NORMAAL INFECTIE TRAVEL MALARIA Gemiddelde Standaardfout 2,64 14,03 3,68 17,82 Mediaan Modus #N/B Standaarddeviatie 45,39 187,18 42,87 43,64 Steekproefvariantie 2060, , , ,57 Kurtosis 0,09 1,76 0,44-0,77 Scheefheid 0,47 1,21 0,003-0,38 Bereik Minimum Maximum Som Aantal CI (95%) 5, ,6864 7, ,7988 CI (99%) 6, ,5310 9, ,8387 Tabel 40: T-test voor de vergelijking van de van de bloedplaatjes tussen de groepen. Significant verschil op een 0.01 betrouwbaarheidsniveau (*) en significant verschil op 0.05 betrouwbaarheidsniveau (**). NORMAAL & INFECTIE NORMAAL & TRAVEL NORMAAL & MALARIA (eenzijdig) T- statistische gegevens -9,5076 1,4213 6,6975 P (T<=t) 8, , , Kritiek gebied van T-toets 95% 1,9725 1,9686 2,0150 Kritiek gebied van T-toets 98,75% (Bonferroni correctie van 95%) 2,5217 2,5141 3,1634 Kritiek gebied van T-toets 99% 2,6020 2,5937 3,3649 Kritiek gebied van T-toets 99,75% (Bonferroni correctie van 99%) Conclusie T > Kritische T Significant verschil** (µ1 µ2) p(8, ) < α 3,0642 3,0512 4,7733 T < Kritische T Geen significant verschil (µ1=µ2) p(0,156368) > α T > Kritische T Significant verschil** (µ2>µ1) p(0,000561) < α 76 P a g i n a

93 INFECTIE & TRAVEL INFECTIE & MALARIA (eenzijdig) TRAVEL & MALARIA (eenzijdig) T- statistische gegevens 9, ,3049 6,2773 P (T<=t) 8, , , Kritiek gebied van T-toets 95% 1,9718 1,7709 2,0150 Kritiek gebied van T-toets 98,75% (Bonferroni correctie van 95%) 2,5204 2,5326 3,1634 Kritiek gebied van T-toets 99% 2,6005 2,6503 3,3649 Kritiek gebied van T-toets 99,75% (Bonferroni correctie van 99%) Conclusie T > Kritische T Significant verschil** (µ1 µ2) p(8, ) < α 3,0619 3,3725 4,7733 T > Kritische T Significant verschil* (µ2>µ1) p(2, ) < 0.05 T > Kritische T Significant verschil** (µ2>µ1) p(0,000753) < α 77 P a g i n a

94 Appendix 6: Case study P.ovale infectie In het Militair Hospitaal Koningin Astrid melde een man zich aan op de spoedafdeling. De man had sinds twee weken last van koorts, een lopende neus en hoofdpijn. Hij constulteerde de huisarts die hem antibiotica voorschreef. Zijn toestand verslechterde en hij consulteerde de spoedgevallen afdeling van het Militair Hospitaal. De man was militair en verbleef in 2011 gedurende 2 maanden in Kindu (buitenlandse zending) en verliet Kindu in december Hij nam toen mefloquine als profylaxe tot twee weken na het verlaten van Kindu. Sinds de zendig is hij niet ziek geweest of vertoonde hij geen symptomen van malaria. Er was geen enkel vermoeden van malaria en de dokter vroeg ook geen malaria onderzoek aan. Er werd veneus bloed afgenomen in een K 3 EDTA-tube en geanalyseerd op de UniCel DxH 800. Er werd een leukopenie van 3,8 10³/mm³ vastgesteld (referentiewaarde 4,30-10,60 10³/mm³) met 87% neutrofielen, 9,4% lymfocyten en 2,3% monocyten, maar ook een trombopenie van ³/mm³ (referentiewaarde ³/mm³). Tijdens de analyse van het bloed in een heparine tube werd een CRP van ongeveer 49 mg/l (referentiewaarde 0,0-5,0 mg/l) waargenomen. Het toestel gaf na de celtelling en differentiatie en malaria discriminant factor van 8,7360 aan. Na raadpleging van de supplementaire data werd een spreiding van het celvolume van de monocyten van 33,60 waargenomen en een spreiding van het celvolume van de lymfocyten van 26,00. Ook het witte boedcellen histogram (WBC) vertoonde de extra populatie (hoge celfrequentie) op de 35 fl grenswaarde. De NRBC dataplot vertoonde ook de groene populatie links onderaan, wat mogelijk malariasignalen kunnen zijn. Omwille van het laag aantal plaatjes, de leukopenie, de verhoogde CRP, het WBC histogram, de NRBC dataplot en de hoge malaria discriminant factor werd een sneltest uitgevoerd. De sneltest gaf echter een negatief resultaat. Figuur 53: Negatieve SD Bioline P.f/Pan sneltest bij een vermoeden van malaria-infectie (later geconfirmeerd als P.ovale infectie) op de dag van diagnose Figuur 54: Negatieve SD Bioline P.f/Pan sneltest bij een vermoeden van malaria-infectie (later geconfirmeerd als P.ovale infectie) vier dagen na de dag van diagnose en na behandeling met chloroquine. 78 P a g i n a

95 Vervolgens werd een dikdruppel en een bloeduitstrijkje bereid en microscopisch onderzocht. Bij het bekijken van het eerste veld van het bloeduitstrijkje werd meteen al een geparasiteerde rode bloedcel teruggevonden. Het bloeduitstrijkje bevatte trofozoïten en schizonten. Sommige rode bloedcellen hadden polyparasitisme. Omwille van de aanwezigheid van schizonten en de vorm van de trofozoiëten werd P.ovale infectie vermoed. Er werden 0,1% geïnfecteerde rode bloedcellen aangetroffen in het bloeduitstrijkje. In de dikdruppel werden ook parasieten aangetroffen en werd een parasitemie van 3951 parasieten/µl geteld (209 parasieten per 201 witte bloedcellen en een celtelling van 3800 witte bloedcellen per µl op de UniCel DxH 800). Er werd onmiddellijk een behandeling gestart van 100 mg chloroquine (6 tabletten per dag op de eerste dag van de behandeling en de daaropvolgende 3 dagen 3 tabletten per dag). Het monster werd opgestuurd naar het Instituut voor Tropische Geneeskunde (ITG) te Antwerpen voor confirmatie. Ook hier bevond men de dikdruppel en het bloeduistrijkje positief en werd de infectie van P.ovale geconfirmeerd. Ook hier was de test op het pldh antigen en het HRP-2 negatief. Er werd een parasitemie van 4192 aseksuele parasieten (AP)/µl vastgesteld. Na vier dagen behandeling met Chloroquine kwam de man opnieuw op controle en werden opnieuw dezelfde analyses en testen uitgevoerd. De man had geen leukopenie meer (6,5 10³/mm³) met 54,2% neutrofielen, 35,1% lymfocyten en 8,6% monocyten. Ook was de trombopenie verdwenen (229 10³/mm³). De malaria discriminant factor was gedaald tot 5,8307 maar nog steeds hoger dan de cut-off waarde van 4,5. Na raadpleging van de supplementaire data werd een spreiding van het celvolume van de monocyten van 29,11 waargenomen en een spreiding van het celvolume van de lymfocyten van 20,03. Het witte boedcellen histogram (WBC) vertoonde niet meer de extra populatie (hoge celfrequentie) op de 35 fl grenswaarde. De groene populatie linksonderaan op de NRBC dataplot was ook verdwenen. Figuur 55: WBC (witte bloedcel) histogram vertoont een abnormale verdeling en een extra populatie op de 35 fl volume grenswaarde (hoge celfrequentie). Figuur 56: WBC (witte bloedcel) histogram vertoont een goede verdeling en geen extra populatie op de 35 fl volume grenswaarde. 79 P a g i n a