Niet meer na een DNA-analyse!

Transcriptie

1 o! Niet meer na een DNA-analyse! Eveline Schaeffer Kandinsky College Nijmegen Iris Bakker Kandinsky College Nijmegen Roos Vincken en Inge Verheul Kandinsky College Nijmegen Hienke Sminia Netherlands Bioinformatics Centre & Leve DNA!

2 Inhoud van de workshop Lezing: (25 min) Van genomics naar metagenomics De techniek achter metagenomics Aan de slag met publieke metagenomen (25 min) Leerlingproject: Waalwater PWS (30 min) Wrap-up (10 min)

3 Genomics? Verbetering DNA-technieken + Toename rekenkracht van computers = DNA-onderzoek aan populaties en het hele genoom ipv. individuele organismen en specifieke stukjes DNA

4 Genomics is Holistisch: onderzoek naar het hele genoom in relatie tot het organisme en de omgeving High throughput: grote hoeveelheden data worden in relatief kort tijdsbestek gegenereerd Onderzoek vanuit data: in tegenstelling tot traditioneel onderzoek waarbij wordt uitgegaan van een hypothese

5 Genomics Metagenomics versus Genoom van een organisme of populatie Genoom van een omgeving

6 Domein Voorbeeld 1: Sargasso Zee Lente 2004: J. Craig Venter gebruikt zeewater om microbiële genomen van het zeewater te bestuderen. 1,2 miljoen genen gevonden Waarvan 70,000 compleet nieuwe genen Van, naar verwachting, zo n 1800 soorten Inclusief 148 nieuwe bacteriële fylogenetische groepen Rijk Afdeling / Stam Klasse Orde Familie Tak Geslacht Sectie Reeks Soort Ondersoort Varieteit Vorm

7 2: Onderzoek aan Mammoeten: Paleo-omgevingen Herconstrueren is nuttig om: Begrijpen van de dynamiek van ecosysteemveranderingen Het herconstrueren van ecosystemen voor de industralisatie Belangrijk voor publieke en politieke keuzes in conservatiebiologie

8 Wat heeft Naturalis/NBIC gedaan Onderzoek aan uitwerpselen en maaginhoud van gevonden mammoeten 3 vindplaatsen Yukagir : Maag en darmen Lyuba : Jong, maar eten uitwerpselen ouderen > in maag Cape Blossom: Uitwerpselen

9

10 Resultaten Plantenfamilies geindentificeerd, sommigen tot op genus Yukagir: 8 Cape Blossom: 12 Lyuba: 7 Gevonden planten ondersteunen hypothese van mammoet steppe omgeving Extra: mammoeten lijken coprofagen te zijn

11 Hoe krijg je data? Extraheren DNA Kopiëren 16S rrna met PCR

12 16S rrna Subunit van het bacteriële ribosoom Rood: hoog variabele regio s 1540 nucleotides Wordt veel gebruik in evolutionair onderzoek Groen: hoog geconserveerde regio s Geconserveerde regio s: Makkelijk om primers op te ontwerpen Hypervariabele regio s: Soortonderscheidend

13 Hoe krijg je data? Extraheren DNA Kopiëren 16S rrna met PCR Lezen DNA met Sequencer

14 Sequencen Sanger sequencing Tot ±2005 Gebruikt bij HUGO 3 miljard dollar en 13 jaar om het menselijk genoom te lezen.

15 Sequencen

16 Sequencen 2012 Maximaal afleesbare lengte: 200bp Betrouwbaarheid: 98% Duur run : 2 uur Aantal bp per run: ±1 miljard Kosten: $1 per miljoen basen Techniek: Chip leest vrijkomen elektrische lading bij binding base

17 Hoe krijg je data? Extraheren DNA Kopiëren 16S rrna met PCR Lezen DNA met Sequencer

18 Hoe krijg je data? >T0UG1:4:281 TGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGCCGTGTCTCAGTCCAGT GTGCTGATCATCGTCCCGAAATTTGGTTAAACCCCCAAAGG GCCTAACCAGCTATGATCACGCTGTAAGCTACTGCCTCACA ACTGCTATCAGACGCGAGCCTCCTGGCGGATTCCTCTTGC TCCAGACTGCGTACGGGTATTAGCAGCCGTTCCACTGTGTC CCTACCACGACAGTCTCGCGTTATACGTCCGCCATGCAAC C >T0UG1:5:36 TGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTATCTCAGTCCCA AATGTGGACCGGTCACCCCTCTAGCAAGGCCCGGATACCT AACCCCGGTACGCTAAAAAGCCCATTTGGATTAAAAGCCCA ACTACCCCAACCAAACAAACGCCTGAAATAAACGGACCGTC CGAAAGATCCAATTC >T0UG1:5:208 TGCTGCCTCCCGTAGGAGTCGGACCGTGTCTCAGTTCCAG TGTGCTGATCATTCTCCTCGACAGCTATGATCATCCGCTTG GTAAGCTACTTTGGCCTTCCACCAACTTAGCTAATCAGATC CGCAGGTAGCCCACCTCGGGTCGGTTTCCTCGTTTGCCTA CCTCGACATCAGTTAGG >T0UG1:11:250 TGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTCGTCCTACAGTC CCAAGTTGTGGCCTCGTAACGTCACTCGCCTCCGCAACCT AGCTAAACTGACACGCTCGAACGCCTACTTGGCCGATCCA CCTACTTAGCCTAACTCAGACGCGGATCTCCTGGCGTTC reads

19 Soorten-analyse Denk aan: Welke bacteriën zorgen voor de smaak van kaas? Wat is de biodiversiteit van een onbewoond eiland? Komt in deze rivier een schadelijke bacterie voor?

20 PCR-stap bepaalt uitkomst Extraheren DNA Kopiëren 16S rrna met PCR Lezen RNA met Sequencer

21 PCR-stap bepaalt uitkomst Kopiëren 16S rrna met PCR Kopiëren al het DNA met PCR of Voordeel: relatief goedkoop Nadeel: alleen soortenanalyse Voordeel: functie-analyse mogelijk Nadeel: relatief duur

22 Functie-analyse Denk aan: Voorkomen van functies in een zoet water biotoop versus zout water biotoop Zijn bepaalde functies afwezig in een vervuild milieu? Zijn er genen waarvan we niet wisten dat bacteriën die ook hadden?

23 Zelf data bekijken Start Firefox op Ga naar: Log in: hienke password: levedna2013 Klik op de wereldbol rechtsbovenin (duurt lang!)

24

25 Leerlingenproject: Waalwater

26 Leerlingproject: Waalwater iets met bioinformatica een proefje doen Deze projecten waren niet haalbaar

27 Leerlingenproject: Waalwater vervuiling van de rivier (riool overstroming, vee, industrie) Onderzoek naar de aanwezigheid van bepaalde bacterien die met vervuiling te maken hebben. Leerlingen hebben op 3 momenten monsters genomen in de waal op 3 verschillende plaatsen

28 In het Waalwater kijken 049 monster monster monster monster monster monster monster monster monster 232 Dag, locatie, monsternummer Er zijn twee monsters per locatie per dag genomen Data: Dag 1 28 juni 2012 Dag 2 5 september 2012 (Dag 3 22 oktober 2012)

29 Metagenomen vergelijken Klik op de wereldbol rechtsbovenin. Klik dan op het getal achter Available for analysis Selecteer één van de Waalwatersamples door op de code (bijv. 060_greater200) te klikken Klik op Analyze (bovenaan de pagina)

30 Metagenomen vergelijken Klik op het plusje achter Metagenomes. Selecteer de gewenste metagenomen (049 t/m 060 muv 052) door ze met de pijltjes-knop in het rechtervlak te zetten.

31 Metagenomen vergelijken Klik op het plusje achter Annotation sources. Selecteer Greengenes en klik op ok. (Greengenes is een 16s rrna-databank) Selecteer en klik dan op generate. (vergeet niet de values op raw te zetten!) Het genereren van de grafieken kan even duren

32 Zoek eens naar 1. Kies een bacterie uit 2. Wat doet deze bacterie? 3. Komt de bacterie voor in het Waalwater? 4. Hoe kan dit in het sample zitten en/of wat is het gevolg voor het Waalwater? Citrobacter freundii Staphylococcus epidermidis Deinococcus radiodurans Legionella pneumophila Prochlorococcus marinus (Synechococcus elongatus )

33 Wrap-up Metagenomics: onderzoek naar het genoom van een omgeving Online analyse: publieke metagenomen en analyse staan online en zijn voor iedereen (dus ook voor leerlingen) toegankelijk Lesmateriaal: laat je adres achter om het te ontvangen

34 Publieke metagenomen Klik bijvoorbeeld op het bovenste public metagenoom: CA_05_4.6 Dit metagenoom valt binnen een groter project The oral metagenome in health and disease Het is een Spaans onderzoek. Bij Project Information vind je: Onderzoek naar bacteriële genomen in de mond (en de functies van aangetroffen bacteriële genen). Vergelijking metagenoom van mensen mét en zonder cariës (tandbederf)

35 Publieke metagenomen Klik helemaal onderaan de pagina op [show] bij Metadata Klik vervolgens op last onderaan de tabel. Hier vind je: De data afkomstig van een 42-jarige man die 24 uur geleden zijn tanden heeft gepoetst Hij heeft last van tandbederf Humane DNA-sequenties zijn niet meegenomen in de analyse Bij Functional Category Hits Distribution staan taartdiagrammen die inzicht geven in de verschillende gen-functies Bij Taxonomic Hits Distribution staan taartdiagrammen die inzicht geven in de voorkomende soorten

36 Publieke metagenomen Bron: wikipedia Hoeveel procent van het monster is Streptococcus? 4,2% Nederlands Domein Rijk Afdeling / Stam Klasse Orde Familie Tak Geslacht Sectie Reeks Soort Ondersoort Varieteit Vorm Engels Domain Kingdom Division - Phylum Class Order Family Tribe Genus Section Series Species Subspecies Variety Form

37 Publieke metagenomen Hoeveel hiervan is Streptococcus mutans? Scroll naar boven en klik op analyze 1 Klik vervolgens op barchart En dan op generate. Zet de values op raw (ipv normalized) om percentages te krijgen. 2 3

38 Publieke metagenomen Klik steeds op de juiste taxonomische onderverdeling: Bron: wikipedia Hoeveel hiervan is Streptococcus mutans? 3,05% van Streptococcus van 4,2% van het totaal Dus: 0,1281% van het totale monster Hoeveel soorten zijn er in totaal bij deze 42-jarige man in de mond aangetroffen? 1655 soorten

39 Publieke metagenomen Bij een gezond persoon ziet de pagina er zo uit: Metagenome NameNOCA_01P Welk aandeel heeft Streptococcus mutans hier? 1,20% van 20,1% van het totaal Dus: 0,2412% van het totale monster

40 Publieke metagenomen Cariës versus gezond gebit Aanwezigheid S. mutans 0,1281% 0,2412% Aanwezigheid S. mutans

41 Publieke metagenomen The oral metagenome in health and disease Pedro Belda-Ferre, Luis David Alcaraz, Raúl Cabrera-Rubio, Héctor Romero, Aurea Simón-Soro, Miguel Pignatelli, and Alex Mira ISME J January; 6(1): Published online 2011 June 30. doi: /ismej PubMed These data show that cavities are not dominated by Streptococcus mutans (the species originally identified as the ethiological agent of dental caries) but are in fact a complex community formed by tens of bacterial species, in agreement with the view that caries is a polymicrobial disease. Pilot-onderzoek (kleinschalig), dus populatieonderzoek is nodig om bovenstaande trend te bewijzen. Geeft wel inzicht in het zoeken naar medicijn: Op zoek naar bacteriën die veelvuldig voorkomen bij mensen zonder cariës, en weinig bij mensen met cariës.