A Search for missing pieces of the puzzle; the development of asthma and atopy Reijmerink, Naomi Elizabeth

Transcriptie

1 University of Groningen A Search for missing pieces of the puzzle; the development of asthma and atopy Reijmerink, Naomi Elizabeth IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below. Document Version Publisher's PDF, also known as Version of record Publication date: 2009 Link to publication in University of Groningen/UMCG research database Citation for published version (APA): Reijmerink, N. E. (2009). A Search for missing pieces of the puzzle; the development of asthma and atopy. Groningen: s.n. Copyright Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons). Take-down policy If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim. Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum. Download date:

2 Nederlandse samenvatting

3 Inleiding De prevalentie van astma en atopie is aan het eind van de vorige eeuw fors gestegen, met name in westerse landen. Momenteel blijft de prevalentie stabiel, maar op dit moment zijn astma en atopie nog steeds de meest voorkomende chronische ziekten onder kinderen in Nederland. Bij kinderen komen astma en atopie vaak samen voor. Door de forse toename in de afgelopen decennia en de grote druk die deze ziekte op de kinderen, hun ouders en de maatschappij legt is het van groot belang de achtergrond en ontwikkeling van astma en atopie beter te begrijpen. Dit kan mogelijk leiden tot betere preventie, behandeling en mogelijk genezing. Uit onderzoek is gebleken dat astma en atopie een complexe pathogenese hebben. Dit houdt in dat zowel omgevingsfactoren als verschillende genen ten grondslag liggen aan de ontwikkeling van astma en atopie. De speurtocht naar de genen die bijdragen aan astma en atopie is aan het eind van de vorige eeuw begonnen. Definitie Atopie is een verzamelnaam voor IgE gemedieerde ziekten zoals eczeem, hooikoorts, conjunctivitis en astma. Individuen die atopisch zijn produceren IgE antilichamen tegen veel voorkomende, niet-pathogene lichaamsvreemde eiwitten. Atopie kan men testen door middel van het bepalen van totaal en specifiek IgE in het bloed en doormiddel van huidpriktesten. De definitie van astma is minder eenduidig. In de afgelopen decennia zijn verschillende definities van astma voorgesteld. Een momenteel veel gebruikte definitie is in 1995 gepubliceerd door het National Heart, Lung and Blood Institute uit de Verenigde Staten. De vertaalde definitie luidt als volgt: Astma is een chronische ontstekingsreactie van de luchtwegen, waarin vele cellen en cellulaire elementen een rol spelen, met name mestcellen, eosinofiele granulocyten, T-cellen, macrofagen, neutrofiele granulocyten en epitheelcellen. Bij individuen die hier gevoelig voor zijn zorgt deze ontstekingsreactie voor terugkerende episoden van piepen, benauwdheid, kortademigheid en hoesten, vooral s nachts en in de vroege ochtend. Deze episoden zijn meestal geassocieerd met een variabele luchtwegobstructie die vaak reversibel is, spontaan of met medicatie. Het ontstekingsproces veroorzaakt ook een toegenomen bronchiale reactiviteit op verschillende stimuli. In de jaren na het vaststellen van deze definitie hebben we geleerd dat de verandering van de structuur van de luchtwegen in astma ook een grote rol speelt. Zo zijn er veranderingen te zien als hypertrofie van het gladde spierweefsel rond de luchtwegen, depositie van subepitheliaal collageen en verandering van fibroblasten in myofibroblasten. Dit proces wordt remodellering genoemd. Aanvankelijk ging men er van uit dat deze veranderingen veroorzaakt worden door het chronische ontstekingsproces dat aanwezig is bij astma. Uit onderzoek blijkt echter dat deze remodellering ook al aanwezig kan zijn bij kinderen en dus mogelijk ook een rol speelt bij het ontstaan van astma. Een nieuwe definitie hierover is echter nog niet geformuleerd. 180

4 Nederlandse samenvatting Hygiëne hypothese Eén van de mogelijke oorzaken van de snelle toename van astma en atopie aan het eind van de vorige eeuw is de veranderde leefomgeving, met name een meer hygiënische leefomgeving. De afname in microbiële expositie zou ervoor kunnen zorgen dat er een verstoord evenwicht ontstaat tussen Th-1 en Th-2 lymfocyten. Microbiële infecties en blootstelling spelen een belangrijke rol in de rijping van de Th-1 type afweerrespons. Hierbij wordt de Th-2 type afweerrespons, welke mogelijk het allergische fenotype produceert, onderdrukt. De Hygiëne hypothese gaat er vanuit dat door verminderde microbiële blootstelling een toename in astma en atopie kan ontstaan. Dit wordt onderbouwd door studies die onder andere aantonen dat opgroeien in een rijke microbiële omgeving, zoals op een boerderij, beschermt tegen de ontwikkeling van astma en atopie. Toll like receptoren (TLRs) en hieraan gerelateerde eiwitten, spelen een belangrijke rol in de aangeboren afweer. Toll like receptoren herkennen microben en als reactie hierop wordt een cascade geactiveerd die o.a. zorgt voor rijping van T helper cellen en activatie van het afweersysteem. In dit proefschrift zijn verschillende TLRs en hieraan gerelateerde eiwitten (zoals CD14 en IL1RL1) bestudeerd. Genetica De genen van de mens liggen opgeslagen in het DNA, in de kern en in de mitochondria van de cel. Humaan DNA bevat 23 chromosoom paren met 1 paar geslachtschromosomen (X en Y). De chromosomen zijn opgebouwd uit 2 strengen en deze strengen weer uit nucleotiden. Nucleotiden zijn opgebouwd uit een suiker-fosfaat molekuul en een base. De 2 strengen worden met elkaar verbonden door 4 verschillende basen (Adenine, Cytosine, Thymine en Guanine; Ook wel als A,C,G en T vermeld). A bindt altijd met T, en C altijd met G (ook wel een basepaar genoemd,zie ook figuur 1 in de introductie). Binnen een gen vormen 3 van deze baseparen samen een aminozuur. Aminozuren zijn de bouwstenen van alle eiwitten, noodzakelijk voor structuur, signalering en functioneren van ons lichaam. Veel voorkomende variaties (>1% in de bevolking) in het DNA worden polymorfismen genoemd. Polymorfismen gelokaliseerd in genen kunnen van invloed zijn op de expressie of functie van de eiwitten waarvoor deze genen coderen. In dit proefschrift zijn verschillende Single nucleotide polymorfismen (SNPs) onderzocht: dit zijn polymorfismen waarbij een enkele basepaar (of nucleotide) verandert, (bijvoorbeeld van een C naar een G, met andere woorden van dit polymorfisme zijn 2 allelen aanwezig een C allel en een G allel). Een SNP wordt tegenwoordig vaak met een rs-nummer aangegeven zodat duidelijk is voor andere onderzoeksgroepen over welke SNP gesproken wordt. Genen, omgeving en complex genetische ziekten Astma en atopie zijn complex genetische aandoeningen, dat wil zeggen dat meerdere genen en omgevingsfactoren een rol spelen bij de ontwikkeling van astma en atopie. Het genetisch onderzoek is de afgelopen jaren zeer succesvol geweest. Er zijn meer dan honderd genen vastgesteld die een rol kunnen spelen bij (sub) fenotypen van astma en atopie. Fenotypen zijn bijvoorbeeld hyperreactiviteit, longfunctie en speci- 181

5 fiek IgE. Verschillende benaderingen zijn gebruikt om deze genen vast te stellen. In dit proefschrift hebben we gebruik gemaakt van de kandidaat-gen methode, d.w.z. het onderzoeken van genen met een biologische functie welke een rol kunnen spelen bij de ontwikkeling van astma en atopie (bv omdat ze belangrijk zijn in de aangeboren afweer (TLRs, CD14, IL1RL1). Naast de kandidaat gen methode is het ook mogelijk om middels andere technieken het genoom te onderzoeken: Linkage analyse (het vaststellen welke gebieden binnen families overerven). Genome wide screens (het screenen van het gehele genoom op gebieden waar polymorfismen voorkomen met verschillende frequenties tussen patiënten en controles en positional cloning (het onderzoeken van polymorfismen op een steeds smaller gebied, totdat men genaderd is tot een of meer genen die polymorfismen bevatten die in verschillende frequentie voorkomen tussen patiënten en controles). Het voordeel, maar tevens ook een uitdaging van deze methoden is dat men hierdoor vaak genen ontdekt waarvan de functie (nog) niet duidelijk is. Een voorbeeld hiervan is ADAM33, een gen dat waarschijnlijk belangrijk is voor luchtwegremodellering. In dit proefschrift wordt de rol van ADAM33 bij o.a. het optreden van astma en het ontwikkelen van een slechtere longfunctie onderzocht. Naast genen zijn ook omgevingsfactoren van belang bij de ontwikkeling van astma en atopie. Uit onderzoek blijkt dat de omgevingsfactoren die een rol spelen bij de ontwikkeling van astma en atopie vaak al aanwezig zijn tijdens de zwangerschap. Zo zijn roken door de moeder van invloed op de longontwikkeling van het kind en verhoogt dit het risico op astma. Daarnaast zou hoge microbiële expositie kunnen beschermen tegen met name de ontwikkeling van atopie. Het wordt steeds duidelijker dat astma en atopie veroorzaakt worden door een complexe interactie tussen genen en omgevingsfactoren. De eerste studies die deze interacties aantonen zijn reeds verschenen. Voor onderzoek naar deze complexe interacties zijn zeer grote (geboorte) cohorten nodig. Samenwerking tussen verschillende onderzoeksgroepen is daarom cruciaal. In dit proefschrift worden verschillende gengen en gen-omgevingsinteracties beschreven die bestudeerd konden worden in de Allergenic studie, een samenwerking tussen de 3 Nederlandse geboortecohorten PI- AMA, PREVASC en KOALA. Doel van het onderzoek in dit proefschrift Het doel van het in dit proefschrift beschreven onderzoek is het vaststellen welke genen, welke omgevingsfactoren, en welke interacties tussen genen onderling en tussen genen en omgevingsfactoren een rol spelen bij de ontwikkeling van astma en atopie. Deze verschillende factoren hebben we onderzocht in diverse populaties; o.a. in astma families, astma trios en in de Allergenic studie; een samenstelling van de 3 geboortecohorten PIAMA, PREVASC en KOALA. 182

6 Nederlandse samenvatting Hoofdstuk 1 geeft een overzicht van de huidige kennis over gen-gen interactie, genomgeving interactie, de invloed van in utero blootstelling en de rol van geslacht bij de ontwikkeling van longziekten bij kinderen. Kandidaat gen onderzoek In hoofdstuk 2 tot en met 4 hebben wij kandidaatgenen onderzocht waarvan het aannemelijk is dat zij een rol spelen bij de ontwikkeling van astma en atopie, omdat de eiwitten die deze genen produceren al bekend zijn voor astma en atopie. In hoofdstuk 2 hebben wij een polymorfisme in de promoter regio (dit is de begin regio van het gen, de functie van deze regio is onder andere aangeven hoe vaak een gen wordt afgeschreven) van het CD14 gen onderzocht. CD14 is de receptor voor o.a. Lipopolysaccharide (LPS), een component van de wand van een gram negatieve bacterie. Binding van LPS zorgt voor activatie van het immuunsysteem met onder andere rijping van Th-1 cellen. Als er Th-1 rijping plaatsvindt dan zou dat kunnen beschermen tegen ontwikkeling van atopie, wat met name wordt veroorzaakt door een Th-2 uitrijping. Uit eerder onderzoek bleek dat het rs (CD14/-159) C allel geassocieerd was met een verhoogd risico op atopie. Wij onderzochten dit polymorfisme bij patiënten met astma en hun partners van de familie astma studie en vonden dat dragers van het CC genotype met een positieve huidpriktest (wijzend op atopie) een hoger totaal IgE en hoger aantal positieve huidpriktesten hadden dan dragers van het CT of TT genotype. Hierbij repliceerden we de gevonden resultaten van Baldini en collega s. Hierna zijn deze resultaten nog veelvuldig gerepliceerd door andere onderzoeksgroepen. In hoofdstuk 3 onderzochten wij polymorfismen in de genen IL1RL1, IL18R1 en IL18RAP. IL1RL1 is de IL-33 receptor en speelt een belangrijke rol in de Toll receptor pathway en Th-2 modulatie. Soms is er in het genoom sprake van Linkage Disequilibrium (LD) Dit betekend dat verschillende polymorfismen samen overerven binnen de onderzochte populatie. Dit wil zeggen dat de informatie die verkregen wordt door één polymorfisme in een gebied met sterk LD gelijk is aan het andere polymorfisme dat tegelijkertijd overerft. In het door ons onderzochte gebied vonden wij sterke LD. Daarom hebben wij polymorfismen in zowel IL1RL1 als de ernaast gelegen genen IL18R1 en IL18RAP onderzocht. IL18R1 en IL18RAP vormen samen de IL-18 receptor. Deze receptor speelt ook een belangrijke rol in Th-1 en Th-2 stimulatie. Wij hebben 21 polymorfismen onderzocht bij de astma families, astma trios en trios met hooikoorts. Verschillende polymorfismen in alle drie de genen waren geassocieerd met atopische en astmatische fenotypen, zowel in de astma families als in de astma trios. Het LD was zo sterk in dit gebied van het chromosoom dat uiteindelijk in deze studie niet te onderscheiden viel welke van de drie onderzochte genen voor de associaties zorgde. Hoofdstuk 4 is de eerste studie van Allergenic. Allergenic is een samenstelling van 3 geboortecohorten PIAMA, PREVASC en KOALA. Het doel van deze samenstelling is het vergroten van de aantallen waardoor complexe gen-gen en gen-omgevingsinteracties kunnen worden onderzocht. In de eerste studie wilden wij onderzoeken of deze 3 cohorten gecombineerd konden worden voor onze genetische analyses. Wij onderzochten twee kandidaat genen CD14 en IL13. Verschillende studies hebben reeds aangetoond dat beide genen een rol spelen bij 183

7 de ontwikkeling van atopie en dat gen-omgevingsinteracties aanwezig zijn tussen polymorfismen in CD14 en (huis)dierexpositie. Wij repliceerden deze data en toonde aan dat inderdaad de drie studies gecombineerd kunnen worden voor onderzoek. Gen-gen interacties Zoals al eerder gemeld worden astma en atopie veroorzaakt door complexe gen-gen en gen-omgevingsinteracties. Na het vaststellen van de rol van CD14 en IL1RL1 bij de ontwikkeling van astma en atopie, waren wij vervolgens geïnteresseerd in de Toll like receptor-4 (TLR-4) route. Deze cascade van eiwitten (met o.a. CD14 en IL1RL1) speelt een belangrijke rol in de aangeboren afweer en van verschillende eiwitten binnen deze route is aangetoond dat zij belangrijk zijn bij astma en atopie ontwikkeling. Het is daarom mogelijk dat ook complexe gen-gen interacties binnen deze route een rol spelen bij de ontwikkeling van astma en atopie. In hoofdstuk 5 werden 169 polymorfismen in 29 genen van de TLR-4 route geanalyseerd in de Allergenic studie. Door middel van de nieuwe statische analyse MDR konden de polymorfismen en complexe gen-gen interacties worden onderzocht. Er werden significante interacties vastgesteld zonder dat vooraf één van de genen op zichzelf significante associatie vertoonde. Verschillende nieuwe interacties werden vastgesteld en tevens kwamen enkele niet eerder beschreven genen naar voren die mogelijk een rol spelen bij astma en atopie ontwikkeling (zoals MAP3K7IP1 en BPI) Interessant was tevens de bevinding dat polymorfismen die niet geassocieerd waren met de bestudeerde fenotypen (zoals totaal en specifiek IgE) in interactie met andere polymorfismen wel een rol lijken te spelen. Gen-omgevings interacties In hoofdstuk 6 bestudeerden wij gen-omgevingsinteracties binnen de Allergenic studie. Polymofismen in verschillende toll receptoren en enkele gerelateerde genen zoals CD14 en MD2 werden onderzocht in combinatie met hoge microbiële expositie, zoals dat gereflecteerd wordt door de aanwezigheid van huisdieren in huis, het hebben van broertjes en zusjes en het verblijven op een kinderdagverblijf. Opnieuw werd MDR gebruikt voor de analyse. De aanwezigheid van meer dan één broertje of zusje bleek een risicofactor voor de ontwikkeling van een hoog totaal IgE. Dit effect bleek in alle drie cohorten onafhankelijk van elkaar te bestaan. Daarnaast stelden we vast dat een polymorfisme in het gen TLR6 dit risico nog meer versterkt. Ook bleken complexe interacties te bestaan tussen het aanwezig zijn op een kinderdagverblijf, het hebben van meerdere broertjes of zusjes en een polymorfisme in LBP. Uiteraard dienen vervolgstudies onze resultaten te repliceren. Hoofdstuk 7 beschrijft een studie naar ADAM33. Dit gen wordt geclassificeerd als het eerste ontdekte astmagen. Door middel van linkage analyse werd dit gen in 2003 ontdekt. Tot op heden is nog niet precies vastgesteld wat de functie van ADAM33 is. Mogelijk dat het een rol speelt bij veranderingen in de structuur van de luchtwegen. Studies van onze eigen onderzoeksgroep hebben reeds aangetoond dat polymorfismen in ADAM33 niet alleen geassocieerd waren met astma, maar tevens met een versnelde achteruitgang van longfunctie bij astmapatiënten en ook in de 184

8 Nederlandse samenvatting algemene bevolking. Tevens bleek uit een andere studie dat polymorfismen in ADAM33 ook een rol speelden bij de groei van de longfunctie op de kinderleeftijd. Dit wilde dus zeggen dat ADAM33 mogelijk naast een astmagen ook een longfunctiegen zou kunnen zijn. Wij onderzochten 6 polymorfismen in het PIAMA geboortecohort. Verschillende astmafenotypen en de longfunctie werden op de leeftijd van 4 en 8 jaar geanalyseerd. Daarnaast wilden wij onderzoeken of gen-omgevingsinteracties aanwezig waren tussen polymorfismen in ADAM33 en rookexpositie tijdens en na de zwangerschap aangezien beide een rol lijken te spelen bij de ontwikkeling van astma en longfunctie. Naast replicatie van de associatie van polymorfismen in ADAM33 met astma, ontdekten wij dat interacties tussen rookexpositie tijdens de zwangerschap en polymorfismen in ADAM33 een rol kunnen spelen bij de ontwikkeling van longfunctie en hyperreactiviteit, de gevoeligheid van de luchtwegen voor niet-allergische prikkels. Functionele genetica In hoofdstuk 8 beschrijven wij een studie naar de functionele effecten van het promoter polymorfisme rs (CD14/-159). We onderzochten of dit polymorfisme van invloed is op (membraan gebonden) CD14 expressie en IL10 en IL12 cytokineproductie na stimulatie van PBMC s door LPS. We vonden inderdaad een effect op CD14 expressie en IL10 productie, echter dit effect bleek met name veroorzaakt door de aanwezigheid van atopie. Wij concludeerden dan ook dat atopische status een belangrijke confounder is in deze studie. Conclusies De in dit proefschrift beschreven studies laten zien dat verschillende genen, omgevingsfactoren en complexe gen-gen en gen-omgevingsfactoren een rol spelen bij de ontwikkeling van astma en atopie. Onderzoek zoals beschreven in dit proefschrift zal helpen de immense astma en atopie puzzel op te lossen. Het vaststellen van de verschillende genetische- en omgevingsfactoren zal ervoor zorgen dat risicogroepen kunnen worden opgespoord en dat bijpassende levensstijl adviezen en therapeutische behandelingen aan deze groepen kunnen worden gegeven. 185

9