Oxygenatie en spiervermoeidheid in de voorarmspieren bij patiënten met mitochondriale myopathie tijdens een handknijptest

Transcriptie

1 Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen Opleiding Lichamelijke Opvoeding en Bewegingswetenschappen Academiejaar Oxygenatie en spiervermoeidheid in de voorarmspieren bij patiënten met mitochondriale myopathie tijdens een handknijptest Masterproef voorgelegd ter behalen van de graad Master in de Lichamelijke Opvoeding en Bewegingswetenschappen Door: Achten Emma en Dumortier Jasmien Promotor: Prof. Dr. Bourgois Jan Co-promotor: Dr. Boone Jan Begeleider: Drs. Celie Bert

2 II

3 Voorwoord Reeds tijdens de scriptieseminaries in derde bachelor stond de keuze voor dit thesisonderwerp voor ons als een paal boven water. Beiden zijn we sinds het aanvatten van onze opleiding sterk geboeid door de combinatie exacte wetenschappen en het menselijk lichaam. Een thesistitel binnen het onderzoeksdomein inspanningsfysiologie, gecombineerd met een patiëntenpopulatie, leek ons dan ook een leerrijke en intrigerende uitdaging. Deze scriptie was een werk van lange adem, en af en toe wat hyperventilatie, maar gelukkig stonden we hierbij nooit alleen. Bij deze willen we van de gelegenheid gebruik maken om de mensen die ons in welke vorm dan ook steunden eventjes in de bloemetjes te zetten. In eerste instantie willen we graag onze promotor Prof. Dr. Jan Bourgois bedanken voor de constructieve feedback en verhelderende inzichten. Hij was bovendien degene die ons tijdens zijn hoorcolleges met de microbe inspanningsfysiologie besmette. Na het schrijven van deze thesis kunnen we enkel constateren dat dit vreemde beestje ons nog meer in zijn ban heeft. Ook bedanken we onze co-promotor Dr. Jan Boone voor het geven van feedback en het delen van zijn kennis over near-infrared spectroscopy. We willen ook onze dank uiten aan Dr. Van Coster en Dr. De Bleecker, die hun steun verleenden aan dit onderzoek door patiënten te rekruteren. Deze laatsten danken we dan ook van harte voor hun bereidwillige medewerking. Alle hulp en steun die we van onze begeleider Bert Celie kregen, valt niet in woorden te omvatten. Dag en nacht stond hij voor ons paraat om ons uit de nood te helpen en ons te corrigeren indien nodig. Hij prikkelde (letterlijk) en pijnigde onze hersenen, waardoor we een eigen kritische blik op wetenschappelijke bevindingen leerden te ontwikkelen. Zijn relaxte manier van werken voorkwam stress en grijze haren, en hij was zelfs diegene die ons behoedde voor een burn-out. Bovendien slaagde hij er in goede en kwade dagen telkens opnieuw in een brede glimlach op ons gezicht te toveren, wat ervoor zorgde dat elke ontmoeting een vrolijk onderonsje werd. Zeker willen we ook onze ouders bedanken voor de jarenlange steun tijdens onze studie en de vrijheid die ze ons tijdens onze studententijd gaven om onze eigen persoonlijkheid te ontdekken. III

4 We vergeten zeker niet de tientallen proefpersonen te bedanken die we contacteerden om als match te fungeren voor patiënten, ook Anneke Volkaert voor het analyseren van de lactaatwaarden en het olijke duo Tine Bex en Laura Blancquaert voor de aangename testmomenten die al dan niet plaatsvonden. Aangezien belangrijke mensen altijd laatst komen, willen we ten slotte ook onze collega s LO-studenten bedanken. Vooreerst konden wij in grote getale op hen beroep doen om de betrouwbaarheid van het onderzoek te verifiëren. Keer op keer waren dit hoogst aangename testmomenten waarbij de lachspieren frequent getraind werden. Bovendien beleefden we doorheen onze HILO-carrière talloze wonderlijke momenten samen waar we nu reeds met weemoed aan terugdenken. Kortom, onze studententijd samen was een fantastische periode waar we enkel positieve herinneringen aan overhouden. IV

5 Abstract Doelstellingen: De term mitochondriale myopathie omvat een heterogeen spectrum van genetische aandoeningen aan het elektronen transport systeem (ETS) in het spierweefsel. Het aerobe energiesysteem is bijgevolg in zijn functie beperkt, waardoor inspanningsintolerantie één van de voornaamste symptomen van de ziekte is. Deze studie richt zich op het ontwikkelen van een inspanningstest met handdynamometer, waarbij near infrared spectroscopy (NIRS) gehanteerd werd om verschillen in deoxy[hb+mb]-concentraties tussen patiënten en controles te detecteren. Onderzoeksmethode: Het studieprotocol bestond uit een handknijptest tot uitputting, waarbij de opeenvolgende belastingsintensiteiten gebaseerd werden op de maximale vrijwillige contractiekracht (MVC). Tijdens de test werden de deoxy[hb+mb]-concentraties in de musculus flexor carpi radialis en flexor carpi ulnaris a.d.h.v. NIRS gedetermineerd. Door vooraf een arteriële occlusie amplitude te bewerkstelligen, konden de deoxy[hb+mb]- waarden relatief t.o.v. deze 100%-waarde bekeken worden. Deze relatieve waarden maakten het vergelijken van de concentraties ondanks grote inter-individuele verschillen mogelijk. Vooraleer de mitochondriale myopathie patiënten aan het protocol te onderwerpen, werd de betrouwbaarheid van het testprotocol geverifieerd. Hierbij voerden 20 proefpersonen de inspanningtest tweemaal uit binnen een periode van één week. Vervolgens werden 11 patiënten met mitochondriale myopathie getest en hun deoxy[hb+mb]-concentraties vergeleken met deze van de gematchte controlegroep. Resultaten: Bij de test-retest werd voor de maximale procentuele deoxy[hb+mb]-waarden een betrouwbaarheid van geconstateerd. Naarmate de belastingsintensiteit steeg, nam de betrouwbaar tussen test en retest toe. Bij de vergelijkende studie vertoonden de patiënten significant lagere maximale procentuele deoxy[hb+mb]-waarden (p < 0.001) vergeleken met de controles; respectievelijk ± 9.12 % en ± %. De submaximale belastingstrappen waren significanter verschillend tussen de patiënten en de controles naarmate de intensiteit toenam. Conclusie: Patiënten met mitochondriale myopathie vertonen zowel bij de verschillende submaximale belastingsintensiteiten, als bij de maximale procentuele deoxy[hb+mb]- waarden, kleinere concentratieverschillen vergeleken met de controlegroep. Gezien deze bevindingen, kan het testprotocol aangewend worden als screeningstest en mogelijks als evaluatiemethode om de effectiviteit van behandelingsstrategieën te onderzoeken. V

6 Inhoudstafel Voorwoord... III Abstract... V Inhoudstafel... VI 1. Literatuurstudie Situering Energievoorziening Mitochondriale myopathie Definiëring en onderliggende mechanismen Mitochondriaal DNA Nucleair DNA Expressie van de myopathie Subtypes Ziekten veroorzaakt door mutaties in het mitochondriale DNA Ziekten veroorzaakt door mutaties in het nucleaire DNA Diagnose en screening Biopt MRS Prenatale screening Behandelingen Voedingsstrategieën Trainingsstrategieën: kracht- en uithoudingstraining Perifere oxygenatie Fysiologische respons van mitochondriale myopathie patiënten op diverse inspanningstests Inspanningsintolerantie Inspanningstests Probleemstelling en hypothesen VI

7 2. Methoden en technieken Betrouwbaarheid Populatie Studiedesign Vergelijkende studie Populatie Studiedesign Materiaal Analyse Data-analyse Statistische analyse Resultaten Test-retest betrouwbaarheid Maximale handknijpkracht Arteriële occlusie amplitude Submaximale en maximale procentuele deoxy[hb+mb]-waarden Invloed van de subcutane vetlaag op het deoxy[hb+mb]-signaal Vergelijkende studie Antropometrie proefpersonen Maximale handknijpkracht Arteriële occlusie amplitude Submaximale en maximale procentuele deoxy[hb+mb] Aantal doorlopen belastingstrappen Lactaatmetingen Discussie Test retest betrouwbaarheid Vergelijkende studie Testprotocol Lactaat Arteriële occlusie amplitude Conclusie VII

8 5. Referentielijst Bijlagen Informatiebrief Informed consent VIII

9 LITERATUURSTUDIE 1. Literatuurstudie 1.1. Situering Om het menselijk lichaam optimaal te laten functioneren is een feilloze samenwerking nodig tussen talloze structuren en moleculen. Gezien de gedetailleerde en complexe aard van het menselijk lichaam, kennen defecten aan dergelijke mechanismen verschillende etiologieën. Afhankelijk van de locatie, de ernst en de aard van de dysfunctie, kunnen verschillende fenotypes tot uiting komen. Uiteenlopende metabole wegen zorgen voor de energievoorziening die noodzakelijk is voor het functioneren van het lichaam. Binnen de aerobe energielevering spelen mitochondriën een sleutelrol, waardoor defecten aan deze structuren een fundamentele impact kunnen hebben op de werking van dergelijke systemen. Patiënten met mitochondriale aandoeningen kunnen op tal van manieren in hun functioneren beperkt worden, aangezien mitochondriën alom vertegenwoordigd zijn in het menselijk lichaam. Pathologieën die zich manifesteren in de mitochondriën van de skeletspieren worden gebundeld onder de overkoepelende term mitochondriale myopathie. Binnen deze klasse van aandoeningen wordt de prevalentie geschat op 1/8000 (Tarnopolsky en Raha, 2005). De diagnose bestaat vooralsnog uit een biopsie, die door zijn invasieve aard een minder praktische, en bovendien pijnlijke procedure is. Dergelijke nadelen bieden een beweegreden om een screeningsmethode te ontwikkelen om zo het gebruik van biopten te beperken. Near Infrared Spectroscopy (NIRS) wordt als screeningsapparatuur voorgesteld, aangezien hierbij op een niet-invasieve manier de perifere oxygenatie - die aangetast is bij patiënten met mitochondriale myopathie - kan bestudeerd worden,. In deze studie wordt de bruikbaarheid onderzocht om tijdens een handknijptest NIRS als screeningsinstrument te implementeren bij mitochondriale myopathie patiënten. Een handknijptest wordt voorgesteld als alternatief voor een fietstest, aangezien deze laatste voor patiënten zowel op cardiovasculair als musculoskeletaal niveau heel belastend is. 1

10 LITERATUURSTUDIE 1.2. Energievoorziening In ons lichaam zorgt een complexe reeks van metabole wegen voor de afbraak van voeding tot bruikbare substraten. Aan de hand van een keten van reacties wordt via deze substraten uiteindelijk adenosine trifosfaat (ATP) verkregen, die als brandstof aangewend wordt. De energielevering voor het lichaam kan zowel aeroob als anaeroob gebeuren. De anaerobe energiesystemen hebben een kleine capaciteit maar een groot vermogen, waardoor deze manier van energielevering vooral aangesproken wordt tijdens korte, intensieve inspanningen. Er wordt een opsplitsing gemaakt tussen het fosfageen- en het glycolytisch systeem. ATP, dat in de skeletspier als onmiddellijke energiebron fungeert, heeft een beperkte capaciteit ( mmol/kg), waardoor deze slechts een tweetal seconden energie kan leveren (Wells, 2009). Om de ATP-concentratie alsnog constant te houden, zorgt het fosfageensysteem via de fosforylatie van creatinefosfaat (CrP) voor een snelle resynthese van ATP. Na een zestal seconden is de voorraad CrP uitgeput, waardoor de temporele energiebuffering van ATP wegvalt. Na uiterlijk 15 seconden is de ATP-concentratie volledig gedepleteerd (Wells, 2009). Bij intensieve inspanningen die langer dan 15 seconden maar korter dan 3 minuten duren, wordt vooral beroep gedaan op de anaerobe glycolyse. Hierbij wordt glycogeen in het cytosol omgezet tot pyruvaat en vervolgens tot melkzuur, wat grotendeels quasi onmiddellijk dissocieert in H + en lactaat. Bicarbonaat buffert de opstapeling van H +, waardoor een initiële metabole acidose voorkomen wordt. Lactaat wordt reeds in de actieve spieren gemetaboliseerd en het overige deel wordt door carboxylaat-transporters uit de spieren naar de bloedbaan gebracht. Van daaruit wordt het lactaat naar de inactieve spiermassa, de lever, de nieren, het hart en de hersenen gebracht, waar het dissocieert en als intermediair metaboliet andere functies vervult. Tijdens intensieve inspanningen kan echter niet al het lactaat onmiddellijk afgebroken of getransporteerd worden, wat leidt tot een accumulatie van dit metaboliet. Bij een bepaalde intensiteit zal de maximale lactaat steady state (maxlass) bereikt worden, wat betekent dat de lactaatproductie bij die bepaalde belastingsintensiteit nog net in evenwicht is met de maximale lactaateliminatie. Elke hogere belastingsintensiteit zal derhalve leiden tot een continue toename van lactaat en H + in de bloedbaan. In tegenstelling tot de anaerobe energielevering, verbruiken de aerobe energiesystemen wel O 2. Afhankelijk van de duur en de intensiteit van de inspanning en de beschikbaarheid van de substraten, wordt gebruik gemaakt van verschillende energiebronnen. Tijdens inspanningen 2

11 LITERATUURSTUDIE van middellange duur (3 tot 30 min) worden koolhydraten als dominante energiebron aangewend. Hierbij wordt glucose via de glycolyse omgezet in pyruvaat, die onder aerobe omstandigheden gedehydrolyseerd wordt tot acetyl co-enzyme A (CoA). Ook de β-oxidatie, die voornamelijk tijdens inspanningen van lange duur aan matige intensiteit benut wordt, zorgt via de omzetting van vetzuren voor de productie van acetylcoa. Dit metaboliet wordt in de Krebscyclus gebracht, waar verschillende metabole wegen verantwoordelijk zijn voor de omzetting tot ATP, waterstofionen (H + ) en de elektronencarriers nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) en flavine adenine dinucleotide (FADH 2 ). Deze elektronencarriers zorgen vervolgens via de oxidatieve fosforylering (OXPHOS) in het elektronentransportsysteem (ETS) voor de voornaamste productie van ATP. De elektronen van NADH en FADH 2 worden via verschillende complexen in het dubbel fosfolipiden membraan van de mitochondria getransfereerd wat uiteindelijk leidt tot de omzetting van O 2 tot H 2 O. De energie die verkregen wordt door de transfer van de elektronen (witte pijlen, figuur 1) door het ETS, wordt gebruikt om de protonen (blauwe pijlen, figuur 1) van de matrix in de intermembranaire ruimte te pompen. Hierdoor ontstaat een elektrochemische protonengradiënt ( P) over het binnenste membraan van het mitochondrion. Deze gradiënt zorgt voor de synthese van ATP wanneer de protonen (H + ) van de intermembranaire ruimte terugstromen naar de matrix door het enzyme ATP-synthase (Johanssen en Ravussin, 2009). In de mitochondria kunnen er echter elektronen lekken uit het ETS met de vorming van vrije radicalen als gevolg. Deze vormen reactive oxygen species (ROS) en veroorzaken - bij overdreven productie - schade aan vetten, proteïnen en DNA (oxidatieve stress), wat kan bijdragen tot onder andere apoptose, leeftijdsgerelateerde en degeneratieve ziektes en maligne groei van kankers (Wilmore et al., 2008). Figuur 1 - Werking van het elektronentransportsysteem (ETS) (Johanssen en Ravussin, 2009). 3

12 LITERATUURSTUDIE Aangezien bij patiënten met mitochondriale myopathie het ETS op diverse manieren aangetast is, kunnen zij slechts in beperkte mate beroep doen op de aerobe energielevering. Het fosfageen- en glycolytisch systeem worden bijgevolg sneller aangesproken om alsnog de energievraag bij te houden. Dergelijke anaerobe inspanningen kunnen slechts een beperkte tijd volgehouden worden, waardoor inspanningsintolerantie een veelvoorkomend symptoom is bij mitochondriale myopathie patiënten. 4

13 LITERATUURSTUDIE 1.3. Mitochondriale myopathie Definiëring en onderliggende mechanismen Mitochondriale aandoeningen worden geclassificeerd als ziekten die defecten vertonen in de mitochondriën. Deze stoornissen kunnen zich in uiteenlopende weefsels manifesteren, wat leidt tot een grote verscheidenheid aan symptomen zoals spierkrampen, inspanningsgeïnduceerde spierpijnen (Van Goethem, 2009), kleinere gestalte, gehoorverlies, hoofdpijn, oftalmoparese (beperking van opwaartse blik), ptosis (neerhangen van bovenste oogleden), diabetes mellitus, hypertrofe cardiomyopathie, myoglobinuria (myoglobine in de urine als resultaat van spierafbraak) en als gevolg hiervan renale tubulaire acidose. Neurologische symptomen zoals axonale neuropathie (paresthesieën, ataxie) (Van Goethem, 2009), epileptische aanvallen en beroerte-achtige episodes kunnen tevens voorkomen (McFarland et al., 2002). Aangezien het hart, de hersenen en de spieren de grootste vraag hebben naar aerobe energielevering, komen defecten in deze weefsels het meest voor (Tarnopolsky en Raha, 2005; DiMauro en Schon, 2001). Naast deze organen kunnen ook de pancreas, het beenmerg, de nieren, de lever, het gehoor, het gezichtsvermogen en de galblaas aangetast zijn (McFarland et al., 2002). Binnen de mitochondriale ziekten worden aandoeningen aan het spierweefsel als mitochondriale myopathieën gedefinieerd. Mitochondriale myopathie is een verzamelnaam van ziekten gekarakteriseerd door een of meerdere genetische defecten aan de mitochondriën, die de oxidatieve fosforylatie (OXPHOS) beperken (Grassi et al., 2009). Het belangrijkste symptoom van mitochondriale myopathieën is een verminderde inspanningstolerantie gepaard gaande met een tragere recuperatie (Van Beekvelt et al., 1999). Hoewel inspanningsintolerantie het voornaamste symptoom is van mitochondriale myopathieën, wordt dit soms over het hoofd gezien door de aanwezigheid van prominentere aandoeningen aan het centraal zenuwcentrum (Jeppesen et al., 2003). Figuur 2 - Cel met nucleus met ndna en mitochondrion met mtdna. Genetische mutaties liggen aan de basis van deze myopathieën en kunnen zich zowel in het nucleaire DNA (ndna) als in het mitochondriale DNA (mtdna) manifesteren (figuur 2). Mutaties in het DNA kunnen erfelijk zijn of 5

14 LITERATUURSTUDIE zich spontaan ontwikkelen zoals deleties, puntmutaties en depleties (bij mtdna) (DiMauro en Schon, 2001). Een deletie is een mutatie in DNA waarbij een stuk van een chromosoom is verwijderd, waardoor er minimum 1 nucleotide ontbreekt. Bij een puntmutatie wordt een nucleotide uitgewisseld voor een ander, zonder wijziging in het aantal nucleotiden. Bij de reductie van de hoeveelheid mtdna, is er sprake van mtdna depletie (Tuan et al., 2002). Genetische overerfbare mutaties worden gedefinieerd als mutaties die verworven zijn door overerving van gemuteerd DNA via de moeder of via de vader Mitochondriaal DNA Elk mitochondrion bevat 2 tot 10 kopieën van mtdna en per cel kunnen er duizenden mitochondriën voorkomen (figuur 3). Zowel zaadcellen (in de staart) als eicellen bevatten mitochondriën en derhalve mtdna. Echter, wanneer een zaadcel een eicel bevrucht, gaan de mitochondriën van de zaadcel verloren. Bijgevolg kan mitochondriaal DNA enkel via de moeder overgeërfd worden (maternale erfelijkheid). Dit betekent dat mutaties in het mtdna door de moeder doorgegeven worden aan al haar kinderen, maar dat slechts de meisjes de ziekte zullen overdragen (DiMauro et Davidzon, 2005). MtDNA puntmutaties en single deleties (ontbreken van 1 base van een nucleotide) worden echter niet overgedragen door de moeder, maar ontwikkelen zich sporadisch (DiMauro et al., 2001, 2005; Shoffner, 2000). Figuur 3 - Mitochondrion met mtdna. In een gezonde cel zijn alle mtdna moleculen identiek; dit patroon heet homoplasmie. Een aangetaste cel bevat echter 2 soorten mtdna, zijnde gezond en gemuteerd (heteroplasmie). Bij niet-schadelijke ( neutrale ) mutaties van mtdna kan echter al het mtdna gemuteerd zijn, wat ook homoplasmie wordt genoemd (Taivassalo et al., 2006; DiMauro en Schon, 6

15 LITERATUURSTUDIE 2001). Cellen waarvan al het mtdna schadelijk gemuteerd is, en dus tevens als homoplastisch kan bestempeld worden, zijn vaak niet leefbaar. DiMauro en Davidzon (2005) beschreven echter gevallen waarin de mutatie homoplastisch bleek en de patiënten toch konden overleven. Tijdens de mitose of kerndeling worden, naast het genetisch materiaal in de nucleus, ook de mitochondriën en bijgevolg het mtdna willekeurig over de dochtercellen verdeeld, waardoor de verhouding van wild-type (gezond) en gemuteerd mtdna voortdurend verandert. Deze verhouding bepaalt de drempelwaarde voor het manifesteren van mitochondriale ziektes in weefsels en stelt bijgevolg het moment voor waarop gezond mtdna niet langer kan compenseren voor het gemuteerd mtdna (McFarland et al., 2002). Deze drempelwaarde wijzigt naargelang het weefsel en de mutatie; hoe groter de afhankelijkheid van het oxidatieve metabolisme, des te lager de drempelwaarde (DiMauro en Schon, 2001; McFarland et al., 2002). De continue wijziging in ratio van gezond op gemuteerd mtdna biedt tevens een verklaring voor de verandering van fenotype bij patiënten met mitochondriale myopathie. De mitotische deling kan echter geen verklaring geven voor veranderingen in de drempelwaarde van niet-delende cellen zoals skeletspieren en neuronen (DiMauro en Schon, 2001). Als alternatieve verklaring wordt hiervoor een passieve replicatie van mtdna voorgesteld (Chinnery en Samuels, 1999). Dit is het willekeurig repliceren van bepaalde mtdna molecules, waarbij arbitrair meer wild-type of meer gemuteerde moleculen kunnen vermenigvuldigd worden. Hierdoor is het mogelijk dat binnen een cel de verhouding van wild-type en gemuteerd mtdna, en daarmee samenhangend de drempelwaarde, wijzigt (Birky, 1994; Chinnery en Samuels, 1999) Nucleair DNA Nucleair DNA (ndna) wordt doorgegeven volgens de erfelijkheidswetten van Mendel. Terwijl bij mtdna de erfelijkheid van een ziekte bepaald wordt door 3 factoren (maternale overdracht, heteroplasmie en de mitotische deling), is dit niet het geval bij ndna. Dit repliceert slechts één keer tijdens de celdeling in tegenstelling tot mtdna, dat continu gerecycleerd wordt (Bogenhagen en Clayton, 1977; Birky, 1994). Volgens de geneticaleer van Mendel is de mutatiecel ofwel heterozygoot ofwel homozygoot; dit laatste betekent dat er enkel mutante of enkel normale allelen voor een bepaald gen aanwezig zijn. Binnen de genen kunnen er autosomaal recessieve en autosomaal dominante allelen teruggevonden worden. Wanneer de mutatie dominant is, komt dit altijd tot uiting bij het nageslacht. Als de mutatie 7

16 LITERATUURSTUDIE echter recessief is, komt de ziekte enkel tot uiting bij een kruising met een gen dat tevens de mutatie heeft op een recessief of dominant allel (Shoffner, 2000). Zowel mtdna als ndna zijn noodzakelijk voor het correct functioneren van de oxidatieve fosforylatie. Het mtdna bevat 37 genen, waarvan 2 ribosomale RNAs (rrna) coderen, 22 transfer RNAs (trna) en 13 coderen polypeptides die deel uitmaken van het elektronenetransportsysteem (ETS). Het ndna codeert de polypeptides die samen met de reeds vermelde polypeptides, complexen I, III, IV en V vormen (Shoffner, 2000). Complex II wordt volledig gecodeerd door het ndna. Aangezien zowel het ndna als het mtdna bepalend zijn voor de oxidatieve fosforylatie (OXPHOS), kunnen defecten zowel via de moeder als via de wetten van de genetica van Mendel worden overgedragen (Shoffner, 2000) Expressie van de myopathie Zoals eerder vermeld, veroorzaken mutaties in het DNA defecten in het ETS. Hierdoor wordt het aerobe energiesysteem in zijn functie beperkt, wat een lagere ATP-productie en een toename van ROS (Reactive Oxygen Species) generatie bewerkstelligt. Bovendien wordt er vervroegd overgegaan op de anaerobe energiesystemen bij het leveren van intensieve inspanningen (Mahoney et al., 2002). Afhankelijk van de ernst van de defecten gebeurt dit vroeger of later. Bendahan et al. (1992) en McFarland et al. (2002) constateerden significant hogere lactaatconcentraties bij patiënten dan bij gezonde personen, zowel in rust als tijdens inspanning. Patiënten met dezelfde mtdna mutatie kunnen verschillende symptomen vertonen aangezien de weefsels in verschillende gradaties, of helemaal niet, kunnen aangetast zijn. Omgekeerd kunnen verschillende mutaties tevens dezelfde pathologieën veroorzaken (Tarnopolsky, 2006). De verklaring hiervoor is te vinden bij het principe van de mitotische deling en het drempeleffect Subtypes Mitochondriale myopathieën kunnen veroorzaakt worden door ofwel mutaties in het mtdna ofwel in het ndna. Afhankelijk van de locatie van de mutatie, kunnen de ziekten in klassen opgedeeld worden. Mutaties in het ndna komen veel minder vaak voor dan mtdna mutaties (DiMauro en Schon, 2001). 8

17 LITERATUURSTUDIE Ziekten veroorzaakt door mutaties in het mitochondriale DNA Ziekten veroorzaakt door mutaties in het mitochondriale DNA worden in 3 klassen opgedeeld: ziekten die veroorzaakt zijn door (1) herverdelingen van het mtdna waarbij genen worden verwijderd of vermenigvuldigd, (2) puntmutaties in trna of rrna genen waardoor er defecten ontstaan in de mitochondriale proteïne synthese en door (3) mutaties die een aminozuur veranderen waardoor een kritische functie van de OXPHOS wordt aangetast (Shoffner, 2000). Deze classificatie is echter niet absoluut. Andere auteurs zoals DiMauro en Schon (2001) delen mtdna ziekten op in 2 klassen: ziekten die veroorzaakt zijn door (1) mutaties in genen die de mitochondriale proteïne synthese in zijn geheel beschadigen, waaronder single deleties en puntmutaties in rrna of trna en (2) mutaties in specifieke proteïnecoderende genen. Myoclonic Epilepsy met Ragged-Red Fibers (MERRF) en Mitochondrial Encephalomyopathy, Lactic Acidosis, and Stroke-Like Episodes (MELAS) zijn 2 mitochondriale ziekten waarbij een puntmutatie in het trna aan de basis ligt (Tuan et al., 2002). Bij MERRF zijn de voornaamste symptomen myoclonische gegeneraliseerde toevallen, cerebellaire ataxie, myopathie, dementie, gehoorverlies, neuropathie en optische atrofie (Tuan et al., 2002). MELAS manifesteert zich normaliter in de kindertijd of voor de leeftijd van 40 jaar. Het is een progressieve ziekte waarbij de voornaamste symptomen beroerte-achtige episodes, focale of gegeneraliseerde toevallen, migraine, braken en dementie zijn (Parikh, 2010). In beide aandoeningen is er sprake van spieraantasting. Er bestaan echter vele mitochondriale ziekten waarbij de mechanismen in de skeletspieren intact blijken te zijn. Deze ziekten worden niet vermeld omdat ze geen relevantie hebben voor deze studie Ziekten veroorzaakt door mutaties in het nucleaire DNA Deze categorie van defecten kan verder onderverdeeld worden in 3 klassen: (1) mutaties van genen die enzymen of translocases coderen, (2) defecten aan mitochondriale proteïne importatie en (3) defecten aan de intergenome dialoog (tussen ndna en mtdna). De ziekte van Leigh (zie verder) is een voorbeeld van een aandoening waarbij zowel mutaties aan het ndna als aan het mtdna aan de basis kunnen liggen. 9

18 LITERATUURSTUDIE Mutaties van het DNA-polymerase gamma (POLG)-gen veroorzaken een defect in het polymerase gamma-eiwit waardoor er afwijkingen en een daling van de synthese van het mitochondriale DNA ontstaan (Cohen en Naviaux, 2010). De functie van het polymerase gamma-eiwit (pol-γ) speelt zich immers af in de replicatie en het herstel van mtdna (G. Van Goethem, 2009). De meeste mutaties zijn recessief (bv. Alpers-Huttenlocher syndroom), maar sommigen zijn dominant, zoals degene die adpeo (autosomal dominant Progressive External Ophtalmoplegia) veroorzaakt (Cohen en Naviaux, 2010). Hiernaast zijn er nog vele mitochondriale ziekten die Tabel 1- Mitochondriale syndromen bij POLG-mutaties (Van Goethem, 2009). geïnduceerd worden door POLG-mutaties. Mutaties in het POLG1-gen dat ndna codeert, zijn meestal de oorzaak van Alpers syndroom. Ook genen die betrokken zijn in de mtdna replicatie kunnen aan de basis liggen van deze ziekte, die zich meestal op jonge leeftijd ontwikkelt en waarbij het ETS aangetast is (Naviaux, 1999). De belangrijkste symptomen zijn refractaire epilepsie, psychomotorische regressie en hepatopathie (Van Goethem, 2009). De ziekte van Leigh en Friedreich s Ataxia zijn 2 aandoeningen die gemeenschappelijk hebben dat de patiënten ataxie vertonen (Shoffner, 2000; Grassi et al., 2007). De belangrijkste oorzaken van de ziekte van Leigh zijn defecten aan complexen I, IV en V, waardoor de respiratorische keten in zijn functie beperkt wordt. Deze patiënten vertonen vaak hypotonie, spierspasmen en abnormaliteiten aan de hersenstam (Shoffner, 2000; Tuan et al., 2002). Friedreich s Ataxia is een progressieve neurodegeneratieve ziekte die systemische manifestaties heeft zoals verminderde of afwezige reflexen en diabetes (Grassi et al., 2007; Shoffner, 2000). Bovendien vertonen deze patiënten vaak spierzwakte. Ook bij patiënten die mutaties vertonen in het ndna, is het spectrum van mitochondriale myopathieën enorm. Daar velen van deze ziekten geen spieraantastingen vertonen, worden ze niet verder besproken Diagnose en screening Vermoeidheid is een belangrijk symptoom van mitochondriale myopathie. Doordat vermoeidheid in veel ziektebeelden optreedt, is diagnosticeren aan de hand van dit symptoom 10

19 LITERATUURSTUDIE geen sinecure. Initiële onderzoeken voor mitochondriale myopathie houden bloedanalyses (niveau van lactaat, glucose en geglyceerd hemoglobine vaststellen), schildklier- en leverfunctietests, creatine kinase analyses, lumbale puncties en elektrocardiografieën in (McFarland et al., 2002). Omdat mtdna-mutaties niet via bloedanalyses vast te stellen zijn (met de uitzondering van Pearson s ziekte), werden alternatieve tests ontwikkeld om de diagnose alsnog objectief te kunnen stellen. Hieronder volgt de uitleg van de voornaamste methoden Biopt Bij een spierbiopt worden op basis van histochemie, elektronenmicroscopie en DNAextractiemethoden analyses van het weefsel gemaakt (Tarnopolsky en Raha, 2005). De meeste labo s controleren de werking van complex I+III, II+III, cytochroom c oxidase (IV) (COX) en citraat synthase om mitochondriale myopathieën te detecteren. Een spierbiopt is de meest betrouwbare procedure om de ziekte te diagnosticeren, zelfs wanneer andere tests negatief zijn (Finsterer et al., 1998; Tatke, 2007). Bij histochemisch onderzoek worden vezels gekleurd volgens Gomoris trichroom methode om aangetast weefsel te kunnen onderscheiden van gezond. De aangetaste vezels vertonen een proliferatie van mitochondriën en onregelmatige purperen plekken onder het sarcolemma en tussen de myofibrillen waardoor ze ragged-red fibers (RRF) worden genoemd (Tuan et al., 2002). Ook worden de vezels geanalyseerd op de succinaatdehydrogenase- en op COXreacties (figuur 4). Bij vele OXPHOS-aandoeningen zijn er echter geen aantastingen merkbaar op de spierbiopten (Shoffner, 2000; McFarland et al., 2002). Bijkomend nadeel van een bioptafname is dat het een invasieve methode bedraagt, waarbij er slechts een miniem stuk weefsel kan geanalyseerd worden (Siciliano et al., 2007). Bovendien moet er rekening mee gehouden worden dat elke ziekte andere zichtbare kenmerken vertoont in het spierweefsel. Figuur 4 - Histochemie; (A) Ragged Red Fiber gekleurd volgens Gomoris trichroom methode. (B) Cytochroom c oxidase gekleurd met mozaïekvormige donkere (type I) en lichte (type IIa en IIb) en een COX-vezel in het midden. (C) Succinaatdehydrogenase positief bloedvat bij een MELAS-patiënt (Bourgeois en Tarnopolsky, 2004). 11

20 LITERATUURSTUDIE Bij elektronenmicroscopisch onderzoek zijn mitochondriale dysfuncties voornamelijk te herkennen aan de inclusie van paracrystalline (figuur 5); dit zijn intramitochondriale accumulaties van kristalvormig dimerisch mitochondriaal creatine kinase (Tarnopolsky et al., 2004). Deze kristallisatie wordt gestimuleerd door de verhoogde vrijzetting van vrije radicalen bij patiënten met mitochondriale myopathie. Met behulp van elektronenmicroscopie kan de toename in grootte en aantal, en de vorm van de mitochondria gedetecteerd worden (Siciliano et al., 2007; Van Goethem, 2009). Zowel bij de elektronenmicroscopie als bij de histochemie zijn defecten minder duidelijk zichtbaar bij kinderen als bij volwassenen (Tarnopolsky en Raha, 2005). Figuur 5 - Intramitochondriale paracrystalline-inclusie bij mitochondriale myopathie patiënten (Cohen et al. 1998) MRS Magnetische resonantie spectroscopie (MRS) - ook wel nucleaire magnetische resonantie (NMR) spectroscopie genoemd - wordt gebruikt bij de diagnose van mitochondriale myopathieën waarbij er vermoedelijke storingen zijn in het centraal zenuwstelsel (Tarnopolsky en Raha, 2005). De scan op zich geeft geen definitieve diagnose, maar moet hiervoor gecorreleerd worden met klinische, histologische en moleculaire data (da Rocha et al., 2007). Proton MRS ( 1 H-MRS) meet de lactaatconcentraties in de cerebrospinale vloeistof (CSV) en de corticale witte massa, die beide verhoogd zijn bij mitochondriale myopathie patiënten (Pavlakis et al., 1998; Tarnopolsky en Raha, 2005; Argov et al., 2000). Fosforagene MRS ( 31 P-MRS) wordt gebruikt om een daling van de corticale CrP-concentratie en een stijging in P i vast te stellen, maar vooral om vertragingen van het CrP-herstel aan te geven (Siciliano et al., 2007; Tarnopolsky en Raha, 2005). Behalve een diagnostische functie, kan 31 P-MRS ook waardevol zijn om therapeutische effecten aan te tonen van onder andere creatine en coënzyme Q 10 (Kornblum et al., 2005; Tarnopolsky en Raha, 2005). 12

21 LITERATUURSTUDIE Prenatale screening Bij de familiale anamnese van mitochondriale myopathieën kan prenatale screening van cruciaal belang zijn. Negatieve prenatale screeningstests geven echter geen uitsluitsel, aangezien door de mitotische delingen de mutatieload zowel tijdens als na de zwangerschap kan veranderen. Bij MILS (Maternally Inherited Leigh Syndrome) blijken er echter geen veranderingen in mutatieload te zijn, waardoor deze screening nuttig kan zijn in families met prevalentie van deze ziekte (DiMauro en Schon, 2001) Behandelingen Mitochondriale myopathieën zijn erfelijke, ongeneeslijke ziektes. De laatste jaren werden er echter strategieën ontwikkeld om de levenskwaliteit van de patiënten te verbeteren. Dergelijke strategieën richten zich op (1) de verbetering van de aerobe energie transductie door de ETS (cofactoren en training), (2) de reductie van de productie van vrije radicalen (antioxidanten), (3) het omzeilen van metabole defecten (cofactoren en ketogeendieet) of (4) het voorzien van alternatieve energiebronnen (creatine) (Devries en Tarnopolsky, 2009). Hieronder volgt een opdeling in voedings- en trainingsstrategieën Voedingsstrategieën Coënzyme Q 10 (CoQ 10 ) speelt een sleutelrol bij de elektronenflow tussen complexen I en II naar complex III van het ETS (Mahoney et al., 2002). Naast deze belangrijke oxidatieve functie, treedt Q 10 eveneens op als antioxidant ter eliminatie van ROS (Tomasetti et al., 1999). Sacconi et al. (2010) vonden bij 36% van de mitochondriale myopathie patiënten een tekort aan coënzyme Q 10, wat een beweegreden biedt voor onderzoek naar de effecten van inname hiervan. Supplementatie van CoQ 10 leidde tot verminderde lactaat- en pyruvaatconcentraties, zowel tijdens rust (Goda et al., 1987), als tijdens inspanning (Abe et al., 1999). Ook de lage VO 2max en ventilatiedrempel, die leiden tot vroegtijdige uitputting in mitochondriale myopathie patiënten, bleken verhoogd na behandeling met CoQ 10 (Bendahan et al., 1992). Mitochondriale myopathie patiënten vertonen een verhoogd gebruik van de creatine fosfaatflux (zie hoger) waardoor er in rust en na inspanningen een daling is van de voorraden creatinefosfaat (Mahoney et al., 2002). De supplementatie van creatine monofosfaat is gebaseerd op de theorieën dat een verhoogde intramusculaire CrP concentratie (1) kan zorgen voor een versnelde aanvulling van ATP na inspanningen door een verbetering van het CrPsysteem (Rodriguez et al., 2007), (2) de rol van energiebuffer kan vervullen bij het begin van 13

22 LITERATUURSTUDIE inspanningen en zo de afhankelijkheid van OXPHOS kan doen afnemen (Mahoney et al., 2002), (3) H + -accumulatie kan bufferen en (4) maximale activatie van de glycolyse en glycogenolyse kan bewerkstelligen. Uit onderzoek van Tarnopolsky et al. (1997) bleek dat behandeling met creatine resulteerde in een stijging van de prestatie bij anaerobe inspanningen van hoge intensiteit en bij aerobe inspanningen. Bovendien werd ook een hogere power output vastgesteld die evenredig was met de stijging in intramusculaire CrPconcentratie. Aan de andere kant werden geen noemenswaardige schadelijke neveneffecten ondervonden door de supplementatie van creatine-monohydraat. Andere studies vonden tevens een verbetering van de inspanningstolerantie en het activiteitsniveau in het dagelijkse leven (Mahoney et al., 2002). Bij gezonde individuen treedt er 2 tot 3 maanden na continue creatine-supplementatie een plafondeffect op; er is geen verdere stijging van creatine in de spier, soms is er zelfs sprake van een daling (Vandeberghe et al., 1997; Hespel et al., 2001; Volek et al., 1999). Derave et al. (2003) onderzochten het effect van langdurige (> 2 maanden) creatine-inname bij drie klassen van ziekten. Mitochondriale myopathie behoorde tot een klasse die slechts gedeeltelijk kon genezen worden door langdurige creatine-inname. Er is echter nog onvoldoende onderzoek gevoerd om te besluiten dat supplementatie op lange termijn therapeutische voordelen heeft. Figuur 6 - Plasma lactaatconcentratie in 3 groepen mitochondriale myopathiepatiënten (MELAS, CPEO/KSS en andere ziekten) (Rodriguez et al., 2007). Creatine (monohydraat), coënzyme Q 10 en α-liponzuur functioneren alle drie als antioxidant in het menselijk lichaam (Sestili et al., 2006; Tomasetti et al., 1999; Migliore et al., 2004). Rodriguez et al. (2007) stelden vast dat de combinatie van deze supplementen leidt tot een significante daling van de lactaatconcentraties in rust (figuur 6). Oxidatieve stress kan sporadische mtdna mutaties voorafgaan en zo verder de oxidatieve fosforylatie beschadigen, wat tot de accumulatie van ROS leidt. Antioxidanten kunnen deze vicieuze keten met positieve feedback onderbreken (Mahoney et al., 2002; figuur 7). Ze houden tevens de vorming van paracrystalline tegen (Tarnopolsky et al., 2004). Bij deze combinatietherapie moet echter genoteerd worden dat de effecten afhankelijk zijn van de soort mitochondriale myopathie. 14

23 LITERATUURSTUDIE PPAR s (Peroxisome Proliferator-Activated Receptors) maken deel uit van de nucleaire receptoren die verantwoordelijk zijn voor de regulatie van genexpressieprogramma s van metabole wegen. PGC-1α (Peroxisome Proliferator-Activated Receptors-γ Coactivator-1α) moduleert de mitochondriale biogenese en coactiveert PPAR-γ. Deze activatie verbetert de mogelijkheid van cellen om hun mitochondriale werking te behouden (Wang et al., 2002). Onderzoek wees uit dat de toediening van agonisten van PPAR leidde tot een vertraagde ontwikkeling van de myopathie en een verhoogde levensduur (Wenz et al., 2008). Figuur 7 - De vicieuze cirkel van mtdna mutaties en Reactive Oxygen Species (ROS) (Mahoney et al. 2002). Quercetine is een natuurlijk voorkomend flavinoïde (Fiorani et al., 2009) dat PGC-1α concentraties doet stijgen in de hersenen en in spieren met trage spiervezels (Davis et al., 2009). Hierdoor wordt de mitochondriale biogenese sterker geactiveerd en neemt de oxidatieve fosforylatie toe (Puigserver en Spiegelman, 2003). Dit veroorzaakt een stijging van de piekopname van zuurstof en uitstel van vermoeidheid tijdens langdurige inspanningen (Calvo et al., 2008). Behalve zijn werking via PGC-1α, beïnvloedt quercetine ook de inspanningstolerantie in vitro als adenosine A1 receptor antagonist (Davis et al., 2009). Quercetine induceert tevens een stijging in de cytochroom c concentratie, mtdna en inspanningscapaciteit (Davis et al., 2009). Aangezien inspanningsintolerantie een van de belangrijkste symptomen is van mitochondriale myopathie, kan quercetine bijgevolg een aanzienlijke bijdrage leveren tot de levenskwaliteit van de patiënten. Dit flavinoïde heeft bovendien voordelige effecten als antioxidant en anti-inflammatoir middel (Davis et al., 2009) Trainingsstrategieën: kracht- en uithoudingstraining Naast de bovenvermelde voedingsstrategieën, kunnen zowel kracht- als uithoudingstrainingen ter preventie van deconditionering geïmplementeerd worden in de behandeling van patiënten met mitochondriale myopathie. Fysieke inactiviteit leidt immers tot een toename van mutant mtdna t.o.v. gezond mtdna (Taivassalo en Haller, 2004). Aerobe training blijkt bovendien een positief effect te hebben op de levenskwaliteit en inspanningstolerantie bij patiënten (Hassani et al., 2010). 15

24 LITERATUURSTUDIE Onderzoeken naar de effecten van krachttraining zijn gebaseerd op het principe van genshifting. Bij overload door krachttraining worden de spiervezels beschadigd waarop satellietcellen geactiveerd worden om deze te herstellen. Aangezien er in de satellietcellen bij sporadische deleties en puntmutaties geen mutant mtdna aanwezig is, daalt de proportie van gemuteerde mtdna t.o.v. gezonde cellen (Taivassalo en Haller, 2004; 2005) en verhoogt de drempel waarop symptomen zich manifesteren. De voordelen van uithoudingstraining daarentegen, worden behaald door het verhinderen van de effecten van deconditionering (als gevolg van inactiviteit door inspanningsintolerantie) en door een stijging van de oxidatieve capaciteit van de spieren en mitochondriale biogenese. Deze laatste is geassocieerd met een stijging van de enzymes van het ETS, waardoor men een hogere capaciteit heeft om energie te genereren via de OXPHOS (Taivassalo en Haller, 2004). Hierdoor verbetert de levenskwaliteit van de patiënten en zijn ze in staat om submaximale inspanningen beter te verdragen (Taivassalo et al., 1998; 2006). Jeppesen et al. (2009) stelden bij patiënten een stijging vast in VO 2max en W max op een ergometer en deze voelden zich fysiek sterker na aerobe en uithoudingstraining. Er werd echter geen verandering gevonden in de verhouding gemuteerde/gezonde cellen. Jeppesen et al. (2009) concludeerden dat aerobe training een ongevaarlijke behandeling is voor mitochondriale myopathie patiënten. Taivassalo et al. (2006) besloten dat na een trainingsperiode van 14 weken zowel de submaximale inspanningstolerantie en piekcapaciteit, als het zuurstofverbruik en de -extractie van de skeletspieren verbeterden bij patiënten met mitochondriale myopathie, waarbij er geen veranderingen vastgesteld werden in de hoeveelheid mutant mtdna. De zuurstofextractie werd berekend aan de hand van het Fick-principe (VO 2,spier = Q m * (a-v)) nadat het hartminuutvolume via de herinademing Figuur 8 - Veranderingen in bloedlactaat en hartfrequentie tijdens 30 minuten van submaximale werklast voor en na 14 weken training (Taivassalo et al., 2006). van acetyleen werd bepaald en de VO 2 door middel van Douglas zakken. Vervolgens werd besloten dat na een extra trainingsperiode van 14 weken deze voordelige aanpassingen blijven bestaan. Als laatste concludeerde men dat detraining resulteert in een daling van de fysiologische aanpassingen tot op het niveau van de baseline. Deze fysiologische aanpassingen vinden plaats 16

25 LITERATUURSTUDIE op het perifere en centrale cardiovasculaire niveau (tabel 2) (Taivassalo et al., 1998). Dit resulteert in verbeteringen van aerobe capaciteit, hartfrequentie in rust en tijdens inspanningen, bloedlactaatconcentraties en ATP herstel (Taivassalo et al., 1998). De lagere bloedlactaatconcentraties zoals te zien op figuur 8, wijzen op een verbetering van de oxidatieve fosforylatie. De patiënten die deelnamen aan de studie verklaarden tevens een verbetering van hun levenskwaliteit. Aangezien er geen significante stijging in mutant mtdna merkbaar was na training, konden ook Taivassolo et al. (2006) besluiten dat er geen gevaren verbonden zijn aan submaximale uithoudingstraining bij patiënten met dezelfde mutaties als in het onderzoek. Taivassalo en Haller (2004) onderzochten de effecten van uithoudingstraining op de verhouding tussen wild-type (gezond) en gemuteerd mtdna. Het soort mtdna dat dominant aanwezig is in het weefsel, zal het meest toenemen bij de mitochondriale biogenese door uithoudingstraining en zal bijgevolg bepalen of deze strategie veilig is bij de patiënt. Tabel 2 - Effecten van aerobe training op aerobe capaciteit, hartfrequentie en bloedlactaat (Taivassalo et al., 1998). Ter besluit kan gesteld worden dat mitochondriale myopathieën een heel divers spectrum van ziektebeelden omvatten, waardoor diagnosestelling en therapieën moeilijk te bepalen zijn. Een biopsie wordt als gouden standaard gezien voor de diagnose, maar door ethische problemen kan dit niet wijdverspreid gebruikt worden bij patiënten met een vermoedelijke mitochondriale aandoening. Dit biedt een beweegreden voor het ontwikkelen van een valide en betrouwbare screeningstest. 17

26 LITERATUURSTUDIE 1.4. Perifere oxygenatie VO 2 -waarden worden als maat gebruikt om de hoeveelheid verbruikte O 2 tijdens een inspanning te meten. Stijging van de VO 2, die tijdens inspanning noodzakelijk is om de energievraag bij te houden, wordt op spierniveau bewerkstelligd door een toename van de spierperfusie en de perifere O 2 -extractie. Beide determinanten worden door middel van het Fick-principe samengebracht in de formule VO 2,spier = Q m * (a-v) O 2 (Wilmore et al., 2008). Met behulp van near-infrared spectroscopy (NIRS) kan het (a-v) O 2 -verschil gemeten worden, waardoor het O 2 -verbruik op een niet-invasieve manier gekwantificeerd wordt (Van Beekvelt et al., 2001). Dit wordt bewerkstelligd door de absorptie van lichtfotonen door hemoglobine (Hb), myoglobine (Mb) en cytochroom c oxidase in het spectrum van 700 tot 1000nm te meten. Aan de hand van de door NIRS gemeten concentratieverschillen in oxy[hb+mb], deoxy[hb+mb], totaal[hb+mb] en O 2 Hb-saturatie kan bijgevolg de efficiëntie van het oxidatieve systeem bepaald worden (Muthalib et al., 2010). Het is echter niet mogelijk veranderingen te onderscheiden in hemoglobine en myoglobine door de overlap van het spectrum (Van Beekvelt et al., 2002). Het merendeel (>90%) van de absorptie van NIRS is afkomstig van Hb (Fadel et al., 2003), waardoor het aandeel van Mb en cytochroom c oxidase kan verwaarloosd worden (Wilson et al., 1989; Mancini et al., 1994). De piekabsorptie voor deoxy[hb+mb] ligt op een golflengte van 760nm, die van oxy[hb+mb] op 850nm. De som van deze absorpties stelt de relatieve veranderingen in totaal[hb+mb] voor, wat het lokale bloedvolume weerspiegelt (Pereira et al., 2007). NIRS kan de oxygenatie van het bloed zowel in de kleine arteriolen en venules als in de capillairen en de intracellulaire sites van O 2 -transport en opname evalueren (Grassi et al., 2007). Het is echter niet mogelijk de oxygenatie in grote bloedvaten (doorsnede >1mm) te meten aangezien hier voldoende Hb aanwezig is om de stralingen volledig te absorberen (Fadel et al., 2003). De validiteit van near-infrared spectroscopy werd onder andere door Fadel et al. (2003) onderzocht, waarbij de meting van de spierperfusie vergeleken werd met de Doppler ultrasound techniek. De snelheid van de doorbloeding wordt bij deze meetmethode bepaald op basis van de terugkaatsing van geluidsgolven (Doppler effect) (Click et al., 2008). Uit deze studie bleek er een hoge correlatie (r = 0.80) te bestaan tussen beide meetmethoden. Andere onderzoekers vonden dan weer een hoge correlatie (r = 0.94) tussen de waarden verkregen via NIRS enerzijds en plethysmografie anderzijds (De Blasi et al., 1994; Homma et al., 1996). Aangezien deze laatste een omslachtige methode is die niet tijdens matige tot zware 18

27 LITERATUURSTUDIE inspanningen kan toegepast worden (Van Beekvelt, 2002; Fadel et al., 2003), en bovendien slechts de gehele doorbloeding van een lidmaat kan bepalen (Mancini et al., 1994), is NIRS een goed alternatief om de lokale spierperfusie te meten. Uit onderzoek van Mancini et al. (1994) bleek dat NIRS eveneens een valide techniek is voor het meten van het (a-v) O 2 -verschil. Hun studie toonde aan dat de deoxy[hb+mb]-waarden gemeten aan de hand van infrarood licht zeer sterk correleren (r = 0.92) met de veneuze zuurstofsaturatie. Bovendien biedt NIRS het bijkomend voordeel dat het een handig, veilig en economisch instrument is om tests mee uit te voeren (Chance and Bank, 1995). Het betreft hier echter een meettechniek waarbij de plaatsing van de probe heel nauwkeurig moet gebeuren door de grote gevoeligheid van de infraroodstraling. Wanneer de probe immers niet correct op de te meten spierbuik staat, kunnen er verschillen in oxy- en deoxy[hb+mb] ontstaan (Pereira et al., 2007). Bovendien kunnen er andere variabelen, zoals subcutaan adipoos weefsel, het infraroodsignaal verstoren (Van Beekvelt et al., 2001; Matsushita et al., 1998). Naast een valide methode, is NIRS zowel op cerebraal (Bhambhani et al., 2006; Pereira et al., 2007), als op spierweefsel (Pereira et al., 2007) betrouwbaar bewezen. Bij deze laatste werd de betrouwbaarheid van de spieroxygenatie en verandering in bloedvolume op verschillende spieren aangetoond, waaronder de gastrocnemius (Chance en Bank, 1995), de vastus lateralis (Bhambhani et al., 2001) en de erector spinae (Kell et al., 2004). Muthalib et al. (2010) toonden door middel van test-retests de betrouwbaarheid van NIRS aan op de biceps brachii tijdens oxygenatie-metingen. Ook op de onderarm werd de betrouwbaarheid van NIRS geverifieerd. Van Beekvelt et al. (2002) toonden aan dat zowel tijdens rust, als tijdens inspanning, de kwantitatieve metingen van de O 2 -consumptie door middel van NIRS in de musculus flexor digitorum superficialis betrouwbaar zijn. Ter conclusie wordt NIRS als een betrouwbare en valide methode aanvaard om op een nietinvasieve manier de saturatie en de hemodynamica van het bloed in verschillende spierweefsels tijdens inspanningen te meten (Pereira et al., 2007; Muthalib et al., 2010). Echter, in dit onderzoek worden enkel de deoxy[hb+mb]-waarden geanalyseerd. Er is immers twijfel omtrent de mogelijkheden van NIRS om waarden te etaleren i.v.m. spierperfusie omwille van de onmogelijkheid deze waarden relatief te analyseren en zo interindividuele vergelijkingen te kunnen maken. 19

28 LITERATUURSTUDIE 1.5. Fysiologische respons van mitochondriale myopathie patiënten op diverse inspanningstests Inspanningsintolerantie Patiënten met mitochondriale myopathie hebben uiteenlopende genetische defecten aan het elektronentransportsysteem die leiden tot een dysfunctie van de aerobe energievoorziening. Bijgevolg is inspanningsintolerantie (daling VO 2max en W max ) een vaakvoorkomend symptoom bij patiënten met mitochondriale myopathie (Jeppesen et al., 2003; Tarnopolsky et al., 2004). Volgens Grassi et al. (2007) zijn de lagere VO 2max en O 2 -extractie waarden echter ook voor een gering deel verklaarbaar door fysieke deconditionering als gevolg van deze inspanningsintolerantie. Een spierbiopsie wordt als de gouden standaard gezien voor de diagnose van mitochondriale myopathie (Finsterer, 1998), maar inspanningstests kunnen ingeschakeld worden als screeningsmethode om de diagnose van bepaalde randgevallen met mitochondriale myopathie te ondersteunen, zoals patiënten zonder karakteristiek fenotype Figuur 9 - Negatief exponentiële relatie tussen het percentage mutatie en het piek (a-v) O 2 -verschil (Taivassalo et al., 2003). (Tarnopolsky et al., 2004). Ook kunnen ze de mate van functionele aantasting van de spier bepalen (Taivassalo et al., 2003) en worden ze gebruikt als follow-up bij behandelingen (Taivassalo et al., 1998). Jeppesen et al. (2003) toonden aan dat een hoger percentage heteroplasmie van het spierweefsel gepaard gaat met een grotere inspanningsintolerantie, onafhankelijk van het type mutatie. Ook onderzoek van Taivassalo et al. (2003) toonde een negatieve exponentiële relatie aan tussen de hoeveelheid gemuteerd mtdna in de spier en de O 2 -extractie tijdens inspanning (figuur 9). Bij dit onderzoek werd het (a-v) O 2 -verschil indirect bekomen door het gemeten hartminuutvolume en VO 2 in de formule van Fick in te vullen. Tijdens inspanningen van de onderarm werd eveneens een matige correlatie (r = 0.50) aangetoond tussen het percentage heteroplasmie in de skeletspier en de desaturatie, die bepaald werd via bloedafname van de vena mediana cubiti (Hanish at al., 2006). Patiënten met een laag percentage gemuteerd DNA lopen tijdens inspanningstests bijgevolg meer risico op vals negatieve resultaten. Jensen et al. (2002) vonden echter geen correlatie, wat mogelijks verklaard kan worden door een dissociatie tussen het weefsel waar de moleculaire analyse werd uitgevoerd en het weefsel dat belast werd tijdens de test. 20

29 LITERATUURSTUDIE Inspanningstests Mitochondriale myopathie patiënten vertonen bij all-out fietstests een verminderde O 2 - extractie, vergeleken met de gezonde populatie (Taivassalo et al., 2003). Bijgevolg worden dergelijke inspanningstests aangewend als hulpmiddel bij de diagnosestelling van mitochondriale myopathie. De verminderde O 2 -extractie tijdens inspanning, die veroorzaakt wordt door genetische afwijkingen van het ETS, is verantwoordelijk voor de reductie van de VO 2 op spierniveau (Van Beekvelt et al, 1999). Dit oorzakelijk verband wordt verklaard aan de hand van het Fick-principe (VO 2,spier = Q m * (a-v)). In tegenstelling tot gezonde individuen, vergroot bij mitochondriale myopathie patiënten het arterio-veneus O 2 -verschil nauwelijks tijdens inspanning. Conform aan het Fick-principe stijgt de spierperfusie (Q m ) ter compensatie van de mitochondriale defecten bij looptests (Chance en Bank, 1995). Zowel het arterio-veneus O 2 -verschil, als de spierperfusie werden gemeten aan de hand van near-infrared spectroscopy (NIRS). Bij patiënten met mitochondriale myopathie wordt tijdens een fietsprotocol een hyperkinetische cardiale respons waargenomen (figuur 10) (Haller et al., 2000; Taivassalo et al., 2003; Tarnopolsky en Raha, 2005). Ondanks dit cardiale compensatiemechanisme, vertonen patiënten tijdens de fietstest een lagere maximale belasting dan gezonde personen (Vissing et al., 1996; Jeppesen et al., 2003). De limiterende factor van de inspanning bij mitochondriale myopathie patiënten is niet, zoals bij gezonde individuen, de O 2 -levering (Bassett, 2000), maar de O 2 -extractie, die door genetische defecten aangetast is (Taivassalo et al., 2001). Figuur 10 - Inspanningstest met stijgende intenstiteit - grotere relatieve stijging van het hartminuutvolume ten opzichte van de VO 2 (Tarnopolsky en Raha, 2005). Door de tekortkoming in O 2 -extractie ten gevolge van mitochondriale defecten, schakelen spieren bij patiënten tijdens inspanning sneller over op anaerobe energiesystemen (Elliot et al., 1989). De H + -accumulatie die hiermee gepaard gaat, leidt tot een metabole acidose die ervoor zorgt dat inspanningen vroegtijdig moeten stopgezet worden. Vissing et al. (1996) concludeerden dat niet het mobiliseren van de anaerobe energiebronnen, maar vooral een verhoogde afbraak van intramusculair glycogeen, die veroorzaakt wordt door een overdreven catecholaminerespons, de oorzaak is van de verhoogde lactaatwaarden bij mitochondriale myopathie patiënten tijdens inspanning. Patiënten met een ernstige mitochondriale afwijking bereiken reeds in rust of bij minieme inspanningen de lactaatdrempel (Elliot et al., 1989). Uit 21

30 LITERATUURSTUDIE Figuur 11 - Gemiddelde lactaatwaarden bij gezonde individuen (CO, ), patiënten met nietmitochondriale aandoening (nmm, ) en mitochondriale patiënten (MM, ) (Finsterer et al., 1997). onderzoek van Finsterer et al. (1997) blijkt dat de lactaat stress test (LST), waarbij subjecten aan een constant vermogen moeten fietsen, een bruikbaar indicator is voor de screening van mitochondriale myopathie (gevoeligheid 69%, specificiteit 90%). De patiënten vertonen op alle tijdstippen significant hogere lactaatwaarden dan de controlegroep (figuur 11). Deze waarden werden bevestigd door Vissing et al. (1996), terwijl Jeppesen et al. (2003) concludeerden dat de LST niet voldoende gevoelig is als diagnostische test. Dit onderzoek vertoont echter enkele hiaten (Finsterer, 2004). De buffering van lactaat gaat gepaard met een disproportionele CO 2 -productie, wat een verklaring geeft voor de hoge RER (Respiratory Exchange Ratio, VCO 2 /VO 2 ) bij mitochondriale myopathie patiënten, vergeleken met de werklast (Taivassalo et al., 2003; Tarnopolsky en Raha, 2005). Naast de anaerobe glycolyse, doen mitochondriale myopathie patiënten ook sneller beroep op de creatinefosfaat flux. De verhouding CrP op P i verandert bijgevolg zowel in rust als bij adaptatie aan inspanningen. Tijdens rust is er een reductie van CrP en na inspanningen is het CrP-herstel vertraagd (Tarnopolsky et al., 1997, 2004). Aerobe energielevering speelt een sleutelrol in de resynthese van ATP, waardoor deze energierijke verbinding eveneens trager aangevuld wordt bij mitochondriale patiënten. Niet enkel de bovenbeschreven all-out fietstests worden als hulpmiddel bij de diagnosestelling van mitochondriale myopathie gebruikt, maar ook testprotocols met handdynamometer worden gehanteerd. De voorarmtests bieden als voornaamste voordeel dat slechts een kleine spiermassa gemobiliseerd wordt, wat de cardiale belasting en eventuele cardiovasculaire risico s reduceert (Van Beekvelt et al., 1999). Conform aan de fietstests, werd bij het handknijpprotocol een verminderde O 2 -extractie geconstateerd bij patiënten, vergeleken met de gezonde populatie (Jensen et al., 2002; Hanish et al., 2006). Zowel bij de studie van Jensen et al. (2002), als bij Hanish et al. (2006), werd de veneuze saturatie bepaald na invasieve bloedafname. Uit de bloedanalyses van beide onderzoeken bleek eveneens, dat de patiënten tijdens inspanning geen significant hogere lactaatwaarden behaalden dan de gezonde 22

31 LITERATUURSTUDIE controlegroep. Ook de studie van Tarnopolsky et al. (2002) bevestigde deze resultaten. In elk van deze onderzoeken werd echter wel een verhoogde lactaatconcentratie in rust gevonden bij patiënten met een mitochondriale aandoening. Deze resultaten zijn tegenstrijdig met deze van de fietsprotocols, waar patiënten tijdens inspanning (Vissing et al., 1996) en afhankelijk van hun mitochondriale afwijking, soms tijdens rust (Elliot et al., 1989) verhoogde lactaatconcentraties vertoonden. De studie uitgevoerd door Van Beekvelt et al. (1999) deed eveneens beroep op een handknijpprotocol om tijdens inspanning een verschil in deoxygenatie te kwantificeren tussen patiënten en gezonde proefpersonen. Binnen dit onderzoek werd het O 2 -verbruik geregistreerd aan de hand van near infrared spectroscopy (NIRS). Afhankelijk van de O 2 -saturatie van Hb en Mb, zijn de absorptie-eigenschappen voor near-infrared (NIR) licht verschillend. Aangezien er in weefsels een evenwicht bestaat tussen de O 2 -extractie en de VO 2, kan aan de hand van deze niet-invasieve techniek de oxygenatie in een bepaald weefsel gemeten worden (Grassi et al., 2007). Van Beekvelt et al. (1999) bekeken hun resultaten echter absoluut - en niet relatief ten opzichte van de individuele maximale deoxygenatie, waardoor geen rekening gehouden werd met onder andere subcutaan vetweefsel. Grassi et al. (2007) onderzochten eveneens in welke mate near infrared spectroscopy (NIRS) kon aangewend worden als screeningsapparatuur voor mitochondriale myopathie. Bij dit onderzoek werd tijdens een fietstest met stijgende intensiteit tot uitputting de probe op de spierbuik van de musculus quadriceps vastus lateralis geplaatst, waardoor de O 2 -extractie in deze spier kon gemeten worden (Delorey, 2003). De deoxy[hb+mb]-waarden, die aan de hand van NIRS werden gekwantificeerd, werden procentueel uitgedrukt ten opzichte van de maximale deoxygenatie van de spier. Deze werd verkregen aan de hand van arteriële occlusie van de dij, waarbij een cuff tot 300mm Hg werd opgeblazen. Door het induceren van deze lokale hypoxie, was de musculus quadriceps femoris aangewezen op het verbruik van het aanwezige O 2 om de noodsituatie te doorstaan. Na enkele minuten, wanneer de verandering in deoxy[hb+mb] plafonneerde, werd de maximale deoxygenatie bereikt. Uit de resultaten tijdens inspanning bleek dat de procentuele veranderingen Figuur 12- Individuele waarden van concentratieverschillen van deoxy[hb+mb], verkregen m.b.v. NIRS tijdens inspanning met stijgende intensiteit. Waarden zijn procentueel uitgedrukt tegenover de deoxy[hb+mb]-waarden tijdens ischemie (Grassi et al., 2007). 23

32 LITERATUURSTUDIE van de deoxy[hb+mb]-waarden beduidend kleiner waren bij mitochondriale myopathie patiënten, vergeleken met de gezonde populatie (figuur 12). Ook de piekwaarde in verandering van deoxy[hb+mb] tussen patiënten en gezonde individuen is significant verschillend. Deze bevindingen bewijzen dat in tegenstelling tot gezonde individuen, waar de VO 2max hoofdzakelijk gelimiteerd wordt door de O 2 -levering (Bassett en Howley, 2000), bij mitochondriale myopathie patiënten de aangetaste oxidatieve fosforylatie de belangrijkste limiterende determinant is van de verminderde maximale aerobe capaciteit (Grassi et al., 2007). Bovendien werd een significante lineaire relatie gevonden tussen de verhouding van de hartfrequentie op VO 2 en piek deoxy[hb+mb]-waarden. Hoe lager de deoxy[hb+mb]- waarden, hoe hoger de cardiovasculaire respons (ratio HF/VO 2 ), wat een indirect bewijs vormt dat deoxy[hb+mb]-waarden de O 2 -extractie in de spier weerspiegelen. Ter besluit kan gesteld worden dat near-infrared spectroscopy de verminderde O 2 -extractie van de spier kan detecteren en kwantificeren (Grassi et al., 2007). Bij patiënten vormt dit het pathofysiologisch mechanisme dat verantwoordelijk is voor de verlaagde inspanningstolerantie en VO 2 -piek vergeleken met gezonde individuen, waardoor NIRS als screeningsmethode kan aangewend worden. Doordat het hier een niet-invasieve meetmethode bedraagt, biedt NIRS veel mogelijkheden bij de longitudinale evaluatie en opvolging van therapieën en aantastingen (Van Beekvelt et al., 1999; Grassi et al., 2007). 24

33 LITERATUURSTUDIE 1.6. Probleemstelling en hypothesen Aan de hand van near-infrared spectroscopy kan op een niet-invasieve manier de zuurstofextractie uit het bloed gedetermineerd worden. Aangezien bij mitochondriale myopathie patiënten dit aspect in de energievoorziening al dan niet gedeeltelijk defect is, kan NIRS gebruikt worden als screeningsmethode voor deze ziekte. Zoals eerder aangehaald, is een spierbiopt de gouden standaard voor het diagnosticeren van mitochondriale myopathie en worden inspanningstests hierbij beschouwd als een valabel hulpmiddel. Beide protocols brengen echter heel wat nadelen met zich mee. Zo is het nemen van een biopt een pijnlijke, invasieve ingreep en brengt het in sommige gevallen langdurig neveneffecten met zich mee. Daarnaast bieden inspanningstests tot uitputting op een fietsergometer niet altijd uitsluitsel en zijn dergelijke tests uiterst belastend voor de patiënten. Inspanningtests die echter slechts een beperkt deel van de spiermassa belasten, brengen een lagere cardiopulmonaire belasting met zich mee waardoor ze beter geschikt zijn als screeningstechniek. Uit onderzoek blijkt dat een handknijpprotocol een valide methode is om genetische defecten aan het elektronentransportsysteem op te sporen (Jensen et al., 2002). Onze hypothese luidt dat de evaluatie van de perifere zuurstofextractie in de voorarmspier, door middel van NIRS tijdens een handknijptest met toenemende belastingsintensiteit, een betrouwbare methode is om mitochondriale myopathie te screenen. 25

34 METHODEN EN TECHNIEKEN 2. Methoden en technieken 2.1. Betrouwbaarheid Populatie Om de betrouwbaarheid van huidig onderzoeksprotocol na te gaan, voerden 20 proefpersonen (studenten Lichamelijke Opvoeding) de handknijptest binnen een week tweemaal uit. De populatie bestond uit 12 vrouwen en 8 mannen met een gemiddelde lengte, lichaamsgewicht en leeftijd van respectievelijk 1.72 m (± 0.08), kg (± 9.49) en 24.4 jaar (± 7.90). De proefpersonen werden niet onderworpen aan exclusiecriteria en stemden allemaal in met het onderzoek na het lezen en goedkeuren van de informed consent (onafhankelijke Commissie voor Medische Ethiek, UZ Gent) Studiedesign De proefpersonen werden gevraagd het protocol tweemaal af te leggen binnen een periode van één week, om zo de invloed van mogelijke training en detraining te beperken. Voorafgaande aan het eigenlijke protocol, werd zowel de lichaamslengte, als het gewicht geregistreerd. Hiernaast werd met behulp van de Harpenden skinfold caliper de huidplooi van de onderarm gemeten, om zo de subcutane vetlaag van de proefpersonen in kaart te brengen. Deze meting werd, net als de test zelf, uitgevoerd aan de zijde van de dominante hand. Figuur 13 - Testopstelling in labo met NIRS en pneumatische cuff aangebracht op testpersoon. De proefpersonen werden gevraagd in liggende positie plaats te nemen op een fysiotherapeutische tafel (figuur 13). Met behulp van een handdynamometer werd de maximale handknijpkracht (Maximal Voluntary Contraction, MVC) van de subjecten bepaald door de hoogste meting van drie pogingen, met telkens één minuut rust tussen, als referentiewaarde te gebruiken. Vervolgens werd de probe van de NIRS-apparatuur aangebracht op de musculus flexor carpi ulnaris en flexor carpi radialis aan dominante zijde, 26

35 METHODEN EN TECHNIEKEN waarna deze afgedekt werd om verstoringen van het infraroodsignaal door daglicht te voorkomen. Om bij het retest-protocol een identieke locatie te garanderen, werd de positie van de probe gemarkeerd. Na het aanbrengen van de pneumatische cuff op de bovenarm van de dominante zijde, werd de druk opgevoerd tot een gestandaardiseerde 280 mmhg. Hierdoor oversteeg de extern aangebrachte druk de systolische bloeddruk, waardoor de distale bloedvoorziening afgesloten werd. Deze arteriële occlusie werd gestart op het ogenblik dat een basislijn bereikt werd in het deoxy[hb+mb]-outputsignaal van de NIRS-meting. Nadat een plateaufase bereikt werd voor de deoxy[hb+mb]-waarden, d.i. de maximale deoxy[hb+mb]-waarden, werd de cuff opnieuw gelost. Dit ging gepaard met een daling in deoxy[hb+mb] (zie figuur 17). Wanneer een tweede basislijn bereikt werd, kon het eigenlijke protocol aangevat worden. Dit bestond uit twee minuten ritmisch contraheren aan een frequentie van 1/2 Hz (1 sec contractie, 1 sec relaxatie), gevolgd door 1 minuut rust. Het protocol startte aan 20% MVC, waarna elke opeenvolgende belastingstrap met 10% MVC steeg. Deze stijgende intensiteit werd aangehouden tot het bereiken van vrijwillige uitputting. Finsterer et al. (2001) toonden aan dat inspanningstesten betere resultaten opleveren onder absolute belasting, terwijl Tarnopolsky et al. (2004) door het lage uithoudingsvermogen van mitochondriale myopathie patiënten opteerden voor een relatieve belasting. Aangezien deze test-retest uitgevoerd werd met het oog op het toepassen bij mitochondriale myopathie patiënten, werd deze laatste methode verkozen Vergelijkende studie Populatie Aan dit onderzoek namen 11 patiënten met mitochondriale myopathie deel, gerekruteerd door hun behandelende artsen. De patiëntenpopulatie bestond uit 4 vrouwen en 7 mannen met een gemiddelde leeftijd van 31 jaar (± 13.8). Hun gemiddelde lichaamslengte en gewicht waren respectievelijk 1.67 m (± 0.12) en 61.7 kg (± 17.1). De exclusiecriteria voor deze studie bedroegen diagnosestelling zonder biopt, wegens de onduidelijkheid van aanwezige spieraantasting. Voor elke patiënt werd een quasi sedentaire controlepersoon gezocht, die gematcht werd op zowel leeftijd (± 2 jaar) als geslacht. Door deze matching verschilden de proefpersonen niet significant van de controles qua leeftijd. Er werd niet gematcht op lichaamslengte en gewicht aangezien patiënten door hun stoornis een kleinere gestalte en een reductie in 27

36 METHODEN EN TECHNIEKEN lichaamsgewicht vertonen. De controlepopulatie bestond uit 7 mannen en 4 vrouwen met gemiddelde leeftijd van 31.6 jaar (± 13.4). Hun gemiddelde lichaamslengte en -gewicht bedroegen respectievelijk 1.77 m (± 0.10) en 78.7 kg (± 17.2). Na het rekruteren van de patiënten en controlepersonen werd hen een informed consent bezorgd met daarin de opzet van de huidige studie. Bij aanvang van de studie diende deze goedgekeurd en ondertekend te worden. De toelating voor dit onderzoek werd verleend door de onafhankelijke Commissie voor Medische Ethiek verbonden aan het UZ Gent Studiedesign De gehanteerde testmethodiek van deze studie is identiek aan het test-retest design. Voorafgaand aan het bepalen van de maximale handknijpkracht, werd bovendien een capillair bloedstaal afgenomen om de bloedlactaatconcentraties in rust te bepalen. Na de test werd een tweede staal geanalyseerd om zo eventuele veranderingen ten opzichte van de pre-meting te kunnen detecteren. Deze bloedlactaatmetingen werden nadien omgerekend tot plasmalactaatwaarden. Hartslagregistratie werd zowel voor als tijdens de test bijgehouden door middel van een Polar hartslagmeter Materiaal De lichaamslengte en het gewicht werden bij aanvang van de studie opgemeten. Met een Baty Harpenden huidplooimeter (figuur 14) werd vervolgens de subcutane vetlaag op vijf verschillende locaties opgemeten - zijnde subscapulair, suprailiacaal en ter hoogte van de biceps, triceps en de onderarm. Figuur 14 Harpenden huidplooimeter Figuur 15 - Saehan handdynamometer Vervolgens werd met behulp van een hydraulische handdynamometer (Saehan Corp Masan, Korea, figuur 15) de beste van drie pogingen gedetermineerd als maximale handknijpkracht. Op basis van deze waarde konden de absolute waarden van de opeenvolgende belastingen berekend worden. 28

37 METHODEN EN TECHNIEKEN De OxiplexTS Near-Infrared Spectroscopy-apparatuur (ISS, Champaign, Illinois) werd gehanteerd om de concentratie deoxy[hb+mb] in het bloed te kwantificeren. Door middel van infraroodstraling, uitgestuurd via een probe, werden de concentraties deoxy[hb+mb] in de werkende spieren gekwantificeerd (musculus flexor carpi ulnaris en flexor carpi radialis) en uitgedrukt in μm (figuur 16). Deoxy[Hb+Mb] werd als deoxygenatie-index genomen, aangezien ze relatief ongevoelig is aan veranderingen in het bloedvolume (Grassi et al., 2007). Figuur 16 - NIRS-apparatuur op voorarm (Van Beekvelt, 2002). De pre- en postbloedstalen werden met behulp van Analox (Analox Instruments LTD, Londen, UK) geanalyseerd ter bepaling van de lactaatconcentraties. Lactaat in het bloed werd nadien omgerekend tot plasmalactaatwaarden Analyse Data-analyse De output van het NIRS-signaal wordt op vier grafieken weergegeven, zijnde saturatie, oxy[hb+mb], tot[hb+mb] en deoxy[hb+mb]. Deze outputgegevens werden geïmplementeerd in Microsoft Excel om de data te kwantificeren (zie figuur 17). De deoxy[hb+mb]-waarden in de output werden geanalyseerd. Ter bepaling van de eerste basislijn (BL 1) werd het gemiddelde genomen van de laatste 30 seconden deoxy[hb+mb]- waarden voor de occlusie. Om vervolgens de maximale deoxygenatie te berekenen, werd de laatste 30-secondenwaarde tijdens de occlusie gezocht. Het gemiddelde van 30 seconden voor de start van het eigenlijke testprotocol werd als tweede basislijn (BL 2) genomen, om als referentiepunt te dienen voor veranderingen in deoxy[hb+mb] tijdens het verdere verloop van 29

38 Deoxy[Hb+Mb] (μm) METHODEN EN TECHNIEKEN het protocol. Tijdens de inspanningstest werd bij elke stijgende belastingsintensiteit de hoogste gemiddelde 10 seconden-deoxy[hb+mb]-waarde gezocht, die per stap de maximale deoxygenatie voorstelt. Aangezien deoxy[hb+mb]-waarden sterk inter-individueel variëren, werden veranderingen (ten opzichte van basislijn 2) tijdens het protocol procentueel voorgesteld ten opzichte van het verschil tussen basislijn 1 en maximale deoxygenatie (= 100%-waarde). Door het hanteren van twee basislijnen werd voorkomen dat veranderingen in het deoxy[hb+mb]-signaal veroorzaakt door de arteriële occlusie, een storende invloed hadden op de resultaten. Voor elke proefpersoon werden de deoxy[hb+mb]-waarden t.o.v. de tijd in een grafiek gezet om de data visueel overzichtelijk te maken (figuur 17) Deoxy[Hb+Mb] tijdens het testprotocol Arteriële occlusie Arteriële occlusie amplitude 20% MVC 30% MVC 40% MVC 50% MVC 60% MVC 70% MVC BL 1 BL Tijd (s) Figuur 17 Verloop van deoxy[hb+mb] van één proefpersoon gedurende het handknijpprotocol, gemeten a.d.h.v. NIRS Statistische analyse Om de resultaten statistisch te verwerken, werd gebruik gemaakt van IBM SPSS Statistics software versie 18 (SPSS, Inc., Chicago, IL). Resultaten met een p-waarde kleiner dan 0.05 werden als significant beschouwd. Er werd voor elke fase van het testprotocol een Gepaarde t-toets uitgevoerd om mogelijke verschillen tussen test en retest op vlak van MVC, arteriële occlusie amplitude en procentuele submaximale en maximale deoxy[hb+mb]-waarden te detecteren. Via een Lineaire Regressie werd de invloed nagegaan van subcutaan vetweefsel ter hoogte van de voorarm, op de arteriële occlusie amplitude en de maximale deoxygenatie. Om de betrouwbaarheid van het protocol na te gaan werd bij de test-retest een Intraclass correlation uitgevoerd voor elke belastingstrap. R-waarden groter dan 0.70 geven een goede 30

39 METHODEN EN TECHNIEKEN betrouwbaarheid van de handknijptest weer. Landis en Koch (1977) stelden ijkpunten vast om verschillende niveaus van betrouwbaarheid te definiëren. Een ICC kleiner dan of gelijk aan 0 betekent slecht betrouwbaar, ICC van 0 tot 0.20 is weinig betrouwbaar, ICC tussen 0.21 en 0.40 redelijk, ICC van 0.41 tot 0.60 matig, ICC tussen 0.61 en 80 substantieel en een ICC van 0.81 tot 1 is (bijna) perfect betrouwbaar. Binnen de vergelijkende studie tussen patiënten en controlepersonen werd met behulp van een Onafhankelijke t-toets het verschil nagegaan tussen de submaximale procentuele deoxy[hb+mb]-waarden van de opeenvolgende submaximale stappen. Vervolgens werd de maximale procentuele deoxy[hb+mb]-verandering bepaald en gekeken of deze significant verschillend was tussen de controlegroep en de patiëntenpopulatie. Eveneens werd geverifieerd of er een significant verschil merkbaar was in grootte van de occlusie tussen de patiënten en hun controles en of de lactaatconcentraties verschilden tussen beide populaties. In de Variatie analyse voor herhaalde metingen (Repeated Measures) werd nagegaan of tijd (pre-post) en groep (patiënten controles) de concentratieveranderingen van lactaat beïnvloedden. 31

40 MVC (kg) RESULTATEN 3. Resultaten 3.1. Test-retest betrouwbaarheid Maximale handknijpkracht De maximale vrijwillige contractie (MVC) van de proefpersonen verschilde niet significant tussen de test en de retest (p = 0.188) (figuur 18), met een gemiddelde waarde van respectievelijk 50.2 ± 10.7 kg en 48.5 ± 12.9 kg MVC 50,15 48, Test Retest Figuur 18 Gemiddelde waarden (± SD) voor de maximale handknijpkracht bij de test en retest. De MVC vertoonde een intraclass correlation (ICC) van 0.89, met p < Er is bijgevolg een bijna perfecte betrouwbaarheid tussen de MVC van de test en retest Arteriële occlusie amplitude Tussen test en retest werden geen significante verschillen gevonden voor de deoxy[hb+mb]- waarden van de arteriële occlusie amplitude (p = 0.191) (figuur 19). Het gemiddelde bedroeg bij de test en de retest respectievelijk ± µm en ± µm. De arteriële occlusie amplitude vertoont een bijna perfecte betrouwbaarheid tussen test en retest met ICC = (p < 0.001). 32

41 Deoxy[Hb+Mb] (μm) RESULTATEN Arteriële occlusie amplitude ,682 45, Test Retest 10 0 Figuur 19 Gemiddelde waarden (± SD) voor de absolute arteriële occlusie amplitude bij test en retest Submaximale en maximale procentuele deoxy[hb+mb]-waarden Voor elke submaximale belastingsintensiteit verschilden de procentuele deoxy[hb+mb]- waarden van test en retest niet significant (figuur 20, tabel 3). De analyse werd niet uitgevoerd voor de stappen aan 70% MVC, 80 % MVC, 90% MVC en 100% MVC, aangezien het aantal subjecten ontoereikend was om parametrisch te analyseren. Tabel 3 - P- en t-waarden van de verschillende submaximale belastingstrappen. 20% MVC 30% MVC 40% MVC 50% MVC 60% MVC (n = 20) (n = 20) (n = 20) (n = 20) (n = 19) p-waarde t-waarde

42 Deoxy[Hb+Mb] (%) RESULTATEN Submaximale procentuele deoxy[hb+mb]- waarden test-retest 20%MVC 30%MVC 40%MVC 50%MVC 60%MVC Submaximale belastingsintensiteit Test Retest Figuur 20 Gemiddelde waarden (± SD) voor de submaximale procentuele deoxy[hb+mb]-waarden per belastingstrap bij de test en retest. Uit de analyse van de submaximale procentuele deoxy[hb+mb]-veranderingen van de opeenvolgende belastingstrappen, bleek er vanaf 50% MVC een matige betrouwbaarheid te zijn tussen test en retest. De overige submaximale belastingsfasen waren weinig tot redelijk betrouwbaar (Landis en Koch, 1977) (tabel 4). Tabel 4 - Intraclass correlatie en p-waarden om de betrouwbaarheid van de test en retest te bekijken voor de verschillende submaximale belastingsstappen. 20% MVC 30% MVC 40% MVC 50% MVC 60% MVC ICC p-waarde ($) ($) (*) (**) De analyse van de maximale procentuele deoxy[hb+mb] leverde geen significant verschil op tussen test en retest (p = 0.706). De gemiddelde maximale procentuele deoxy[hb+mb] van de proefpersonen bedroeg bij de test ± 16.68%, ten opzichte van ± 17.38% bij de retest (figuur 21). 34

43 Maximale procentuele deoxy[hb+mb]- waarden - retest Deoxy[Hb+Mb] (%) RESULTATEN De maximale procentuele deoxy[hb+mb] vertoont een bijna perfecte betrouwbaarheid tussen test en retest met ICC = (p < 0.001) Maximale procentuele deoxy[hb+mb]- waarden test-retest 45,654 44, Test Retest Figuur 21 Gemiddelde waarden (± SD) voor de maximale procentuele deoxy[hb+mb]-waarden bij test en retest. 100,00 ICC test-retest 80,00 60,00 40,00 20,00 y = 0,9111x + 3,322 ICC = ,00 0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00 60,00 70,00 80,00 90,00 100,00 Maximale procentuele deoxy[hb+mb]-waarden - test Figuur 22 - Correlatie test-retest bij maximale procentuele deoxy[hb+mb]-waarden (ICC = 0.873). 35

44 Arteriële occlusie amplitude (µm) Arteriële occlusie amplitude (µm) RESULTATEN Invloed van de subcutane vetlaag op het deoxy[hb+mb]-signaal De dikte van het subcutane vetweefsel verklaarde bij de test 42.6% (Adjusted R Square = 0.426) van de variantie in het deoxy[hb+mb]-signaal van de arteriële occlusie amplitude, terwijl dit bij de retest 48.5% bedroeg (Adjusted R Square = 0.485). Deze variabele heeft een significant negatieve invloed op de grootte van de arteriële occlusie amplitude van het deoxy[hb+mb]-signaal (figuur 23a en b). Zowel bij de test als de retest was de invloed van het vetweefsel op het deoxy[hb+mb]-signaal van de arteriële occlusie amplitude significant (p = en p < 0.001) Invloed Vet - Test Adj R² = p = Invloed vet - Retest Adj R² = p < Dikte subcutaan vetweefsel onderarm (mm) Dikte subcutaan vetweefsel onderarm (mm) Figuur 23a - Invloed van subcutaan vetweefsel op de arteriële occlusie amplitude van deoxy[hb+mb]-waarden bij de test. Figuur 23b Invloed van subcutaan vetweefsel op de arteriële occlusie amplitude van deoxy[hb+mb]-waarden bij de retest. Wanneer de invloed van subcutaan vet op de maximale procentuele deoxy[hb+mb]-waarden geanalyseerd werd, bleek er zowel bij de test als de retest geen significante invloed te zijn (p = en p = 0.772). 36

45 MVC (kg) RESULTATEN 3.2. Vergelijkende studie Antropometrie proefpersonen De patiënten en controles verschilden niet significant qua leeftijd (p = 0.914). Zowel lengte als gewicht bleken significant te verschillen tussen beide groepen (respectievelijk p = en p = 0.032). De huidplooidikte van de onderarm daarentegen verschilde niet significant (p = 0.898) (zie tabel 5). Tabel 5 De gemiddelden (± SD) voor leeftijd, lengte, gewicht, BMI en huiplooidikte onderarm van patiënten en gematchte controlepersonen. Proefpersonen Leeftijd (jaar) Lengte (m) Gewicht (kg) Huidplooi (p = 0.914) (p = 0.034*) (p = 0.032*) onderarm (mm) (p = 0.898) Patiënten 31.0 ± ± ± ± 3.94 Controles 31.6 ± ± ± ± Maximale handknijpkracht De patiënten hadden een significant lagere MVC dan de controleproefpersonen (p = 0.004). De patiënten behaalden gemiddeld een maximale handknijpkracht van ± kg, terwijl de gezonde controlegroep gemiddeld ± kg bereikte (figuur 24). MVC ** ,75 53,09 Patiënten Controles Figuur 24 - Gemiddelde waarden (± SD) voor de maximale handknijpkracht bij patiënten en controles (** p 0.01). 37

46 Deoxy[Hb+Mb] (μm) RESULTATEN Arteriële occlusie amplitude De arteriële occlusie amplitude verschilde niet significant tussen de patiëntenpopulatie en de controlegroep (p = 0.929) (figuur 25), met gemiddelde waarden ± µm bij de patiënten en ± µm bij de controles. 60 Arteriële occlusie amplitude ,37 32,72 Patiënten Controles 10 0 Figuur 25 Gemiddelde waarden (± SD) voor de absolute arteriële occlusie amplitude bij patiënten en controles (p = 0.929) Submaximale en maximale procentuele deoxy[hb+mb] Voor de submaximale belastingsstappen werd een significant verschil gevonden voor 30% MVC, 40% MVC en 60% MVC (respectievelijk p = 0.027, p = en p < 0.001). Bij 20% MVC en 50% MVC werd een trend tot significantie waargenomen (respectievelijk p = en p = 0.069) (figuur 26, tabel 6). Vanaf 70% MVC was het aantal subjecten te laag om de data parametrisch te analyseren. 38

47 Deoxy[Hb+Mb]-waarden (%) RESULTATEN Submaximale procentuele deoxy[hb+mb]- waarden * * $ 20% MVC 30% MVC 40% MVC 50% MVC 60% MVC Submaximale belastingsintensiteit $ *** Patiënten Controles Figuur 26 Gemiddelde waarden (± SD) voor de submaximale procentuele deoxy[hb+mb]-waarden per belastingstrap bij patiënten en controles ($ 0.1 p 0.05, * p 0.05, *** p < 0.001). Tabel 6 - P- en t-waarden van de verschillende submaximale belastingsstappen. 20% MVC 30% MVC 40% MVC 50% MVC 60% MVC p-waarde < t-waarde De maximale procentuele deoxy[hb+mb]-waarden waren significant verschillend tussen patiënten en controles (p < 0.001). De gemiddelde maximale procentuele deoxy[hb+mb] lag significant hoger bij de controles in vergelijking met de patiënten (respectievelijk = ± % en = ± 9.12 %) (figuur 27). 39

48 Deoxy[Hb+M] (%) RESULTATEN Maximale procentuele deoxy[hb+mb]- waarden *** 68,87 60 Patiënten Controles ,00 0 Figuur 27 Gemiddelde waarden (± SD) voor de maximale procentuele deoxy[hb+mb]-waarden bij patiënten en controles (*** p < 0.001) Aantal doorlopen belastingstrappen De gemiddelde MVC waarbij de proefpersonen de inspanning beëindigden, bedroeg bij de patiënten 66 ± 13%, ten opzichte van 67 ± 9 % bij de controles. Deze waarden waren niet significant verschillend (p = 0.850) Lactaatmetingen De combinatie van groep (patiënten controles) en tijd (pre post) had geen significante invloed op de gemeten lactaatconcentraties (p = 0.363). Tussen de lactaatmeting voor en na de test was er wel een significant verschil merkbaar (p < 0.001). De gemiddelde lactaatwaarden na de test waren significant hoger dan de metingen ervoor (figuur 28). Zowel in de pretest als in de posttest verschilden de gemiddelde lactaatconcentraties niet significant tussen de patiënten en de controles. (met p-waarden respectievelijk en 0.217). De groep (patiënten-controles) had geen significant effect op de lactaatconcentraties (p = 0.278). 40

49 Plasmalactaatconcentratie (mmol/l) RESULTATEN Lactaatconcentraties 5 4,5 4 3,5 ** ** 3,78 3,15 3 2,5 2 1,5 2,26 2,02 Premeting Postmeting 1 0,5 0 Patiënten Controles Figuur 28 - Gemiddelde waarden (± SD) voor de plasmalactaatconcentraties van de pre- en post-meting bij patiënten en controles ( ** p 0.01). 41

50 DISCUSSIE 4. Discussie 4.1. Test retest betrouwbaarheid Essentieel in de ontwikkeling van een screeningstest is in eerste instantie het onderzoeken van de betrouwbaarheid van het voorgestelde protocol. Binnen deze studie met handdynamometer vertoonden de deoxy[hb+mb]-waarden van alle opeenvolgende submaximale stappen vanaf 50% MVC een goede betrouwbaarheid tussen test en retest. Aangezien hogere relatieve belastingsintensiteiten meer betrouwbaar zijn om de deoxy[hb+mb]-waarden te determineren (Muthalib et al., 2010), bestaat de sterkte van dit onderzoek eruit het protocol pas te beëindigen wanneer vrijwillige uitputting bereikt werd. Muthalib et al. (2010) toonden in hun onderzoek namelijk aan dat hogere relatieve belastingsintensiteiten een kleinere variatiecoëfficiënt vertonen voor de deoxy[hb+mb]-waarden, dan lagere procentuele belastingswaarden. Dit is te verklaren doordat de spierperfusie bij hogere inspanningen minder varieert door de toenemende intramusculaire druk, waardoor de variatie in het NIRSsignaal die van deze O 2 -toevoer afhankelijk is beperkt wordt (figuur 29) (Van Beekvelt et al., 2002; Muthalib et al., 2010) Figuur 29 (1) Krachtlevering tijdens het testprotocol, (2) Tissue Oxygenation Index (TOI), die de saturatie weerspiegelt en (3) totale hemoglobineconcentratieveranderingen. Figuur (a) geeft de veranderingen van de parameters weer tijdens het 30% MVC protocol, terwijl (b) het protocol aan 100% MVC voorstelt (Muthalib et al., 2010). 42

51 DISCUSSIE In tegenstelling tot wat Muthalib et al. (2010) aantoonden, vonden Van Beekvelt et al. (2002) tijdens hogere belastingsintensiteiten een lagere betrouwbaarheid in gemeten VO 2,spier. Tijdens dit onderzoek werd het testprotocol echter op drie opeenvolgende dagen uitgevoerd, waardoor spiervermoeidheid een mogelijke verklaring kan bieden voor deze tegenstrijdige bevindingen. Aangezien bij hogere belastingen bovendien ter compensatie meerdere spiergroepen gerekruteerd worden en bij dit onderzoek de werking van slechts één spier geanalyseerd werd, verschaft dit onderzoek geen eenduidige weergave van het musculair zuurstofverbruik. De keuze om het testprotocol tot vrijwillige uitputting uit te voeren, was tegenstrijdig met studies van onder andere Jensen et al. (2002) en Taivassalo et al. (2002), waar zowel de belastingsintensiteit als de duur van het protocol gestandaardiseerd werden. Bijgevolg kon bij deze onderzoeken niet met volledige zekerheid gesteld worden dat de persoonlijk maximale deoxy[hb+mb]-waarde bereikt werd. In huidig onderzoek werd geopteerd om de deoxy[hb+mb]-concentratie - bepaald met behulp van NIRS - te analyseren, aangezien deze het minst beïnvloed wordt door veranderingen in bloedvolume (Grassi et al., 2007). Aangezien de spierperfusie in dit onderzoek niet opgemeten werd, en andere data zoals de oxy[hb+mb]-waarden, saturatie en tot[hb+mb] hier een sterke invloed van ondervinden, werden deze parameters niet bestudeerd. De keuze binnen deze betrouwbaarheidsstudie voor de analyse van deoxy[hb+mb] verschilt van andere onderzoeken met NIRS op de voorarmspieren, waar de saturatie (Muthalib et al., 2010) en VO 2,spier (Van Beekvelt et al., 2002) geanalyseerd werden. Een bijkomend voordeel van de analyse van de deoxy[hb+mb]-waarden is de mogelijkheid om de 100%-waarde te determineren, waardoor de data relatief kunnen bekeken worden ten opzichte van eigen maximum. Deze 100%-waarde werd bepaald a.d.h.v. de arteriële occlusie die het eigenlijke testprotocol voorafging en een hypoxische noodsituatie in de voorarmspieren veroorzaakte. Conform aan de wet van Fick (VO 2,spier = Q m * (a-v) O 2 - verschil), werd door deze arteriële occlusie de spierperfusie (Q m ) stilgelegd, waardoor het arterio-veneus O 2 -verschil toenam door een stijging van de microvasculaire O 2 -extractie, om het dreigende zuurstoftekort te compenseren. Aangezien na een bepaalde tijd een afvlakking in het deoxy[hb+mb]-signaal merkbaar was, kon dit als 100%-waarde waarde beschouwd worden. Bijgevolg konden de veranderingen in deoxy[hb+mb]-waarden tijdens het eigenlijke handknijpprotocol procentueel bekeken worden ten opzichte van deze arteriële occlusie amplitude, die gebruikt werd als een maat voor maximale O 2 -extractie (Grassi et al., 2007). 43

52 DISCUSSIE In de literatuur bestaat er slechts één onderzoek dat gebruik maakt van een arteriële occlusie amplitude om deoxy[hb+mb]-waarden te kwantificeren bij een handknijptest. Van Beekvelt et al. (2001) werkten echter met een gestandaardiseerde arteriële occlusie van 45 seconden, wat te kort was om de maximale deoxy[hb+mb]-waarden te bereiken. Er werd tijdens de occlusie namelijk geen plateau waargenomen in deze waarden, waardoor de deoxy[hb+mb]- veranderingen tijdens het protocol ten opzichte van een foute maximale referentiewaarde werden bekeken. Hierdoor wordt getwijfeld aan de betrouwbaarheid van dit onderzoek. De beweegreden om de deoxy[hb+mb]-waarden relatief ten opzichte van de arteriële occlusie amplitude te bekijken, is de mogelijkheid om de uitkomsten van de test tussen verschillende proefpersonen te vergelijken. Grote inter-individuele verschillen in het ruwe deoxy[hb+mb]- signaal zorgen er namelijk voor dat de vergelijking van de absolute data niet relevant is, waardoor gekozen werd om de resultaten procentueel te bestuderen. Aangezien subcutaan vetweefsel een antropometrische parameter is waarbij grote interindividuele verschillen mogelijk zijn, werd de invloed van deze variabele op het deoxy[hb+mb]-signaal onderzocht. Immers, zoals blijkt uit figuur 30, wordt bij individuen met een dikkere subcutane vetlaag t.h.v. de NIRS-probe, de spierlaag in mindere mate gepenetreerd door de infraroodstraling. Hierdoor kan er minder straling geabsorbeerd worden door het spierweefsel en kan er bijgevolg minder deoxy[hb+mb] gekwantificeerd worden aan de hand van NIRS. Figuur 30 - Vereenvoudigde weergave van NIRS-straling bij een individu met een relatief dikke en een met een relatief dunne subcutane vetlaag (Van Beekvelt et al., 2001). Binnen deze studie toonden analyses aan dat het subcutaan vetweefsel voor 48.5% de variantie in absolute deoxy[hb+mb]-waarden verklaarde, waarbij bevestigd werd dat de deoxy[hb+mb]-waarden lager werden naarmate de dikte van de subcutane vetlaag toenam. 44