UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE. Academiejaar

Transcriptie

1 UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE Academiejaar DRACHT DOOR EMBRYOTRANSPLANTATIE BIJ DE MERRIE: BEÏNVLOEDENDE FACTOREN. door Stephanie SCHEEMAEKER Promotor: Prof. dr. P. Daels Literatuurstudie in het kader Copromotor: J. Govaere van de Masterproef 2014 Stephanie Scheemaeker

2

3 Universiteit Gent, haar werknemers of studenten bieden geen enkele garantie met betrekking tot de juistheid of volledigheid van de gegevens vervat in deze masterproef, noch dat de inhoud van deze masterproef geen inbreuk uitmaakt op of aanleiding kan geven tot inbreuken op de rechten van derden. Universiteit Gent, haar werknemers of studenten aanvaarden geen aansprakelijkheid of verantwoordelijkheid voor enig gebruik dat door iemand anders wordt gemaakt van de inhoud van de masterproef, noch voor enig vertrouwen dat wordt gesteld in een advies of informatie vervat in de masterproef.

4 UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE Academiejaar DRACHT DOOR EMBRYOTRANSPLANTATIE BIJ DE MERRIE: BEÏNVLOEDENDE FACTOREN. door Stephanie SCHEEMAEKER Promotor: Prof. dr. P. Daels Literatuurstudie in het kader Copromotor: J. Govaere van de Masterproef 2014 Stephanie Scheemaeker

5 VOORWOORD In mijn voorwoord wil ik graag een aantal mensen extra bedanken. Zij hebben allen op hun eigen manier bijgedragen in het tot stand komen van deze literatuurstudie. In het bijzonder wens ik mijn promotor, professor dr. Peter Daels, te bedanken. Eerst en vooral bedankt om mij te willen bijstaan als promotor! Ik ben u enorm dankbaar voor uw goede begeleiding, uw tijd, en uw kennis. Merci!!! Langs deze weg wens ik ook mijn copromotor, Jan Govaere, te bedanken om me te helpen bij de afwerking van mijn literatuurstudie. Bedankt om me te wijzen op een aantal belangrijke aandachtpunten. Ook dierenarts Ward De Bie verdient hier vermeld te worden. Bedankt om mij te laten kennismaken met de praktische kant van mijn onderwerp. Dit heeft mijn interesse in de voortplantingstechniek, embryotransplantatie, nog meer aangewakkerd. Mijn broer, Hans Scheemaeker, wil ik bedanken voor het nalezen van mijn literatuurstudie. Bedankt voor de inspanning en de tips. Graag wens ik mijn ouders te bedanken. Dankzij jullie krijg ik de kans om mijn droom in vervulling te laten gaan, namelijk dierenarts worden! Als laatste bedank ik mijn vrienden. Mede door jullie steun, vertrouwen en jullie vriendschap ben ik reeds aan mijn voorlaatste jaar diergeneeskunde bezig!

6 INHOUDSOPGAVE SAMENVATTING... 1 INLEIDING... 2 LITERATUURSTUDIE Invloed transplantatiemethode Chirurgisch versus niet-chirurgisch Chirurgische methode Niet-chirurgisch methode Conventionele techniek Techniek van Wilsher Resultaten Bekomen resultaten Invloed van de ervaring van de dierenarts Hygiëne Invloed van het sedativum Seizoen Bijkomende therapiën Progesteron NSAID Antibiotica Eigenschappen van het embryo Ouderdom Grootte Ontwikkelingsstadium Grootte Ouderdom Kwaliteit Bewaring van het embryo Gekoeld Medium Temperatuur Duur van bewaring Cryopreservatie Grootte en ontwikkelingsstadium embryo Cryoprotectant Techniek Slow-freezing Vitrificatie Conclusie Draagmerrie Type Leeftijd Type paard Reproductieve voorgeschiedenis Toestand genitaaltractus Conditiescore Synchronisatie draagmerrie Dagen geovuleerd draagmerrie Mate van sychroniteit draagmerrie versus donormerrie Beïnvloedende factoren op de embryoproductie Superovulatie Seizoen Hengst Aangewend sperma Keuze van de donormerrie Reproductieve voorgeschiedenis Leeftijd Tijdstip uterusspoeling postovulatoir Sport Inspanning... 26

7 BESPREKING REFERENTIELIJST BIJLAGEN... Tabel 1. Invloed van de embryotransplantatiemethode op het drachtigheidspercentage waargenomen op 12 tot 16 dagen en/of 50 tot 60 dagen dracht... Tabel 2. Invloed van de dag postovulatoir, waarop het embryo bij de draagmerrie wordt ingebracht, op het drachtigheidspercentage...

8 SAMENVATTING In de literatuur is men er het algemeen over eens dat synchronisatie van donor- en draagmerrie het belangrijkste aandachtspunt is binnen embryotransplantatie bij het paard. De drachtresultaten zijn optimaal indien de draagmerrie 1 dag vόόr (+ 1) tot 5 dagen na (- 5) de donormerrie ovuleert. Rekening houdend met dit tijdsvenster zijn de drachtresultaten het best als de draagmerrie reeds 3 tot 6 dagen is geovuleerd (Carnevale et al., 2000; Jacob et al., 2012). Een correcte transplantatietechniek, uitgevoerd volgens de regels, staat centraal in het bereiken van een maximaal drachtigheidspercentage. Bij het niet-chirurgisch inbrengen van het embryo is de ervaring van de dierenarts alsook het toepassen van asepsie positief gecorreleerd met het drachtigheidspercentage (Squires et al., 1982; Iuliano et al., 1985; Carnevale et al., 2000; Daels, 2007). Optimale drachtresultaten worden verkregen bij gebruik van een dag 7 embryo, dat zich in het (uitgekipt) blastocyststadium bevindt (Iuliano et al., 1985; Carnevale et al., 2000; Jacob et al., 2012). Een embryonale kwaliteit van graad 1 geeft aanleiding tot de beste drachtigheidspercentages (Carnevale et al., 2000). Voor behoud van de embryonale kwaliteit bij bewaring van het embryo is het van belang een correcte bewaringstemperatuur en bewaringsmethode te handhaven. Transplantatie van een gekoeld embryo (5 C) heeft geen verschil in drachtigheidspercentages ten opzichte van transplantatie van een vers embryo (Carney et al., 1991; Carnevale et al., 2000). Bij cryopreservatie van embryo s leidt slow-freezing alsook vitrificatie tot eenzelfde embryonale leefbaarheid (Hochi et al., 1995). De drachtigheidspercentages na transplantatie van een bevroren embryo zijn lager in vergelijking met transplantatie van een gekoeld embryo (Squires et al., 2003; Stout, 2012). Een verminderde uteriene tonus en een afwijkende uteriene omgeving bij de draagmerrie op moment van transplantatie gaan gepaard met een lager drachtigheidspercentage na embryotransplantatie (Carnevale et al., 2000). Aangezien deze abnormaliteiten voornamelijk voorkomen bij oudere merries, is het aangeraden merries jonger dan 15 jaar te selecteren (Carnevale en Ginther, 1992). Factoren met geen of onduidelijke invloed op de drachtresultaten na embryotransplantatie of factoren, die een invloed hebben op het percentage embryonale sterfte, zijn: seizoen en toediening van progestagenen, niet-steroïdale ontstekingsremmers of antibiotica. Er is geen verschil in drachtigheidspercentage naargelang de maand, tijdens dewelke het embryo wordt getransplanteerd (Iuliano en Squires, 1985; Carnevale et al., 2000). Wel treedt er meer embryonale sterfte op indien de embryotransplantatie tijdens de transitieperiode plaatsgrijpt (Carnevale et al., 2000). Toediening van progestagenen vόόr en na de embryotransplantatie zorgt voor minder embryonale sterfte (Willmann et al., 2011). Bij de verschillende auteurs is er onenigheid omtrent het aanwenden van niet-steroïdale ontstekingsremmers en antibiotica: ofwel leidt het tot een toename van het drachtigheidspercentage, ofwel heeft het geen invloed op het drachtigheidspercentage (Panzani et al., 2009; González et al., 2010; Koblischke et al., 2010). Kortom, bij embryotransplantatie zijn voornamelijk eigenschappen, gecorreleerd met het embryo en de draagmerrie, van groot belang om een optimaal drachtigheidspercentage te verkrijgen. 1

9 INLEIDING Embryotransplantatie is een voortplantingstechniek, waarbij een embryo van een donormerrie wordt ingebracht in een andere merrie, de draagmerrie. In de draagmerrie ontwikkelt het embryo zich verder. De verschillende indicaties voor embryotransplantatie zijn: 1) sportpaarden, opdat ze aan de competitie kunnen blijven deelnemen, 2) merries met een reproductieprobleem, 3) merries met een niet-reproductief gezondheidsprobleem en 4) jonge (tweejarige) merries. Naast deze indicaties is de mogelijkheid tot het verkrijgen van meerdere veulens per jaar van eenzelfde (waardevolle) merrie, een bijkomend voordeel van embryotransplantatie bij de merrie (Squires et al., 2003; Daels, 2007; Brinsko et al., 2011). Embryotransplantatie is voor de eerste maal toegepast bij de merrie in de jaren 70 (Squires et al., 2003). De voortplantingstechniek heeft een moeizame start gekend bij het paard in vergelijking met andere diersoorten, zoals het rund. Redenen voor deze tragere ontwikkeling zijn onder andere de terughoudendheid van de fokverenigingen, het gebrek aan een efficiënte methode voor de inductie van superovulatie, en de synchronisatie van de draagmerrie (Wilsher en Allen, 2004; Allen, 2005). Het is pas in de jaren 90 dat deze voortplantingstechniek sterke vooruitgang begint te boeken. Deze vooruitgang is er voornamelijk gekomen doordat de meeste fokverenigingen, met uitzondering van deze van de Engelse Volbloed en de Franse Draver, zich niet langer verzetten tegen het toepassen van embryotransplantatie bij de voortplanting (Allen, 2005). De belangrijkste landen, waar embryotransplantatie bij de merrie wordt toegepast, zijn de Verenigde Staten, Argentinië en Brazilië. Landen, waar embryotransplantatie minder intensief wordt uitgebaat, maar ook een belangrijke voortplantingstechniek is bij het paard, zijn: Australië, Canada, Duitsland, Frankrijk en Italië (Squires et al., 2003). De laatste jaren is de toepassing van embryotransplantatie bij de merrie ook in Noord-Europa sterk toegenomen. Dit is voornamelijk het gevolg van het beschikken over de mogelijkheid om embryo s gedurende 24 h koel te bewaren en te transporteren. Hierdoor is het mogelijk om een embryo te transporteren naar een erkende inrichting voor embryotransplantatie, zonder dat de eigenaar van het embryo over een draagmerrie moet beschikken (Daels, 2007). Volgens Scherzer et al. (2008) is embryotransplantatie bij het paard minder efficiënt ten gevolge van de bijzondere voortplantingsfysiologie van de merrie enerzijds, waarbij slechts één tot twee follikels per oestrische cyclus ovuleren, en de lage vitaliteit van paardenembryo s na invriezen en ontdooien anderzijds. De efficiëntie en het succes van embryotransplantatie bij de merrie is niet alleen afhankelijk van deze twee bovenstaande elementen. Het doel van deze literatuurstudie is dan ook om na te gaan welke factoren van invloed zijn op het drachtigheidspercentage na embryotransplantatie bij de merrie. 2

10 LITERATUURSTUDIE 1. INVLOED TRANSPLANTATIEMETHODE 1.1. CHIRURGISCH VERSUS NIET-CHIRURGISCH Het verkregen embryo kan zowel transcervicaal (niet-chirurgisch) als via een flankincisie of laparotomie ter hoogte van de linea alba (chirurgisch), worden ingebracht bij de geschikte draagmerrie. De twee verschillende werkwijzen op zich beïnvloeden het uiteindelijke drachtigheidspercentage bij de draagmerrie Chirurgische methode Embryotransplantatie (ET) via de chirurgische methode kan op twee manieren worden uitgevoerd: via een laparotomie ter hoogte van de linea alba, of via een flankincisie. Het is voornamelijk de laatste techniek, die in gebruik is. De chirurgische techniek, uitgevoerd via een flankincisie, is in de jaren 80 beschreven door Squires et al. (1982) en Iuliano et al. (1985). De ingreep gebeurt onder sedatie en met behulp van lokale infiltratieanesthesie. Voor het uitvoeren van de flankincisie wordt een verticale huidincisie van cm gemaakt. Met de incisie wordt gestart in het midden van de denkbeeldige lijn tussen de tuber coxae en de laatste rib, 10 cm ventraal van de lumbale dwarsuitsteeksels. Daarna worden de onderliggende buikspieren stomp gekliefd en het onderliggend peritoneum ingesneden. Via de gemaakte opening in het abdomen wordt het proximale derde deel van de uterushoorn geëxterioriseerd. Met een steriele naald wordt de uteruswand geperforeerd. Een steriele glazen pipet, die het embryo samen met 5 ml cultuurmedium bevat, wordt doorheen de gemaakte opening in de uterus geledigd Niet-chirurgisch methode Ook de niet-chirurgische methode kent twee uitvoeringswijzen: er is de conventionele techniek en de techniek van Wilsher (Wilsher en Allen, 2004). De voorbereiding van de draagmerrie is voor beide technieken gelijk. Bij de voorbereiding moet er grote zorg besteed worden aan de uitwendige hygiëne van de perineumstreek van de merrie. Allereerst wordt de staart van de draagmerrie aan de basis omzwachteld en opzij gefixeerd. Alvorens te beginnen met het reinigen van de perineumstreek moet het rectum geledigd worden. Ideaal gezien kan een steriele, niet-pluizende doek in het vestibulum vaginae worden ingebracht om te voorkomen dat er fecesdruppels in de vagina terechtkomen. Daarna worden het perineum, de vulva en het vestibulum vaginae zeer goed gereinigd met een oplossing van povidone-jood. Het is van belang deze antiseptische oplossing na de reiniging goed af te spoelen, opdat geen restanten achterblijven ter hoogte van de ventrale vulvacommissuur. Nadat alles afgedroogd is, worden het perineum, de vulva en het vestibulum vaginae met alcohol gereinigd (Squires et al., 1982; Wilsher en Allen, 2004; Brinsko et al., 2011). 3

11 Conventionele techniek Het embryo wordt in een steriel rietje, samen met 0,25 of 0,50 ml cultuurmedium, gebracht. De vloeistofkolom wordt onderbroken door minimum twee luchtbellen, waarbij het embryo zich tussen de twee luchtbellen in bevindt. De aanwezige luchtbellen in het rietje hebben een dubbel doel: de beweging van het embryo in het rietje minimaliseren en de uitdrijving van het embryo uit het rietje verzekeren (Carnevale et al., 2000; Brinsko et al., 2011). De conventionele transcervicale methode is reeds door verschillende onderzoekers beschreven (Squires et al., 1982; Iuliano et al., 1985; Carnevale et al., 2000; Daels, 2007; Brinsko et al., 2011). Het rietje met het embryo wordt in een cassoupipet geladen, waarna het achtereenvolgens omgeven wordt door een steriele, harde beschermhuls en flexibel plastiek omhulsel. De dierenarts, die twee paar steriele handschoenen draagt met daartussen de pipet, gaat met zijn hand intravaginaal en palpeert naar de portio vaginalis cervicis en het ostium uteri externum. Wanneer het ostium uteri externum is gelokaliseerd, wordt het beschermend plastiek omhulsel met de pipet geperforeerd. Al of niet onder vingerbegeleiding, wordt de inseminatiepipet doorheen het cervicaal kanaal begeleid over een afstand van ongeveer 5 cm. Daarna wordt de arm in het rectum gebracht om de uterus transrectaal op te tillen en de inseminatiepipet te begeleiden tot in het corpus uteri. Met behulp van de cassoupipet wordt het embryo vanuit het rietje in het corpus uteri gedreven Techniek van Wilsher Een alternatieve techniek voor de conventionele niet-chirurgische transplantatiemethode wordt voor het eerst beschreven en uitgevoerd door Wilsher en Allen (2004). Het doel van deze techniek is het bekomen van een vlotte passage van de cassoupipet doorheen het cervicaal kanaal met een minimum aan manipulatie van het geslachtsstelsel en een hoog niveau van steriliteit. Eenmaal alle hygiënische maatregelen in acht zijn genomen ter hoogte van de perineumstreek, wordt een steriel vaginaal speculum, het Polansky speculum, intravaginaal gebracht. Met behulp van een focale lichtbron kan de portio vaginalis cervicis zichtbaar worden gemaakt. Via het speculum wordt een aangepaste weefselklem, de Wilsher equine embryo transfer forceps, ingebracht (Figuur 1). De dierenarts grijpt met deze tang het ventrale deel van de portio vaginalis cervicis en trekt dit naar caudaal. Op deze manier komt de cervix uteri, en hiermede het cervicaal kanaal, in een rechte lijn te liggen met het corpus uteri. Fig. 1 De Wilsher equine embryo transfer forceps, die het ventrale deel van de portio vaginalis cervicis naar caudaal trekt (naar Wilsher en Allen, 2004). 4

12 Het te transplanteren embryo wordt in een inseminatiepipet gebracht, op dezelfde manier zoals beschreven bij de conventionele techniek. Bij deze techniek wordt het embryo door een groter volume aan cultuurmedium omgeven, namelijk 2,5 ml. Dergelijk groot volume wordt gebruikt, opdat het embryo niet blijft kleven aan het rietje bij het uitdrijven en bijgevolg verloren gaat (Allen, 2005). De inseminatiepipet, die omgeven wordt door een steriel plastiek omhulsel, wordt vervolgens via het speculum intravaginaal gebracht. Onder visuele controle wordt de pipet doorheen het ostium uteri externum in het cervicaal kanaal geschoven. Wanneer de pipet zich een vijftal cm in de cervix bevindt, wordt het plastiek omhulsel geperforeerd. In een vloeiende beweging wordt de pipet doorgevoerd tot in de uterus, waar het embryo wordt geplaatst. Daarna worden pipet, tang en speculum verwijderd uit het geslachtsstelsel van de merrie Resultaten De niet-chirurgische techniek van Wilsher is een veelbelovende methode: de hiermee verkregen drachtigheidspercentages zijn hoger in vergelijking met de klassieke methode. In de studie van Wilsher en Allen (2004) werd op dag 20 een drachtigheidspercentage van 85% bekomen. Dergelijk resultaat is, tot op het moment van de studie, nog niet verkregen met de conventionele transcervicale ET-techniek Bekomen resultaten Uit verschillende studies is gebleken dat het drachtigheidspercentage hoger is bij gebruik van de chirurgische ten opzichte van de niet-chirurgische methode (Castleberry et al., 1980; Iuliano et al., 1985; Carnevale et al., 2000; Wilsher en Allen, 2004). Een overzicht van drachtresultaten na ET via de chirurgische en niet-chirurgische techniek is te zien in Tabel 1 (zie bijlagen). Mogelijke oorzaken voor het mindere succes van de transcervicale methode zijn: de plaats in de uterus waar het embryo wordt gedeponeerd, de vrijstelling van prostaglandine F2 alfa (PGF2α) en/of oxytocine ten gevolge van manipulatie van de cervix met eventueel luteolyse, en contaminatie van de uterus onder progesteroninvloed leidend tot een infectieuze endometritis (Iuliano et al., 1985; Wilsher en Allen, 2004). In tegenstelling tot Wilsher en Allen (2004), stelt Koblischke et al. (2008) dat de stijging in PGF2α na ET niet te wijten is aan de manipulatie van de cervix bij de transcervicale methode, maar aan het optreden van een subklinische endometritis. Zoals reeds eerder vermeld werden met de chirurgische methode betere drachtresultaten bekomen in vergelijking met de niet-chirurgische methode. Ondertussen zijn de niet-chirurgische transplantatietechniek en de gebruikte materialen dermate geëvolueerd, dat de drachtresultaten deze van de chirurgische methode overtreffen. Mede door de verbeterde resultaten, maar ook wegens ethische overwegingen, wordt vandaag het embryo enkel nog via de niet-chirurgische techniek getransplanteerd (Brinsko et al., 2011; Vandenberghe et al., 2012). 5

13 1.2. INVLOED VAN DE ERVARING VAN DE DIERENARTS Het succes van een methode wordt grotendeels bepaald door de individuele wijze van uitvoering. Algemeen wordt aanvaard dat een dierenarts met meer ervaring een hoger drachtigheidspercentage verwerft (Squires et al., 1982; Iuliano et al., 1985). De ervaring van de dierenarts heeft voornamelijk significante verschillen bij de transcervicale methode. Volgens Stout (2006) zou dit te wijten zijn aan het onvermogen van de onervaren dierenarts om het embryo in de uterus te deponeren. Bij de chirurgische methode blijkt de variatie tussen dierenartsen geringer te zijn (Squires et al., 1999) HYGIENE Het is van allergrootste belang volkomen aseptisch te werken tijdens de manipulatie en het inbrengen van het embryo in de uterus van de draagmerrie. Eender welke contaminatie, die ontstaat tijdens het inbrengen van het embryo, gaat namelijk gepaard met embryonale sterfte. Daarnaast zijn, in het kader van de natuurlijke dekking of kunstmatige inseminatie (KI) en de embryonale spoeling, hygiënische maatregelen bij de donormerrie ook van belang om een gezond embryo te verkrijgen. Eenmaal een gezond embryo verkregen, moet het embryo op hygiënische wijze gemanipuleerd worden. Onder de manipulatie van het embryo worden alle handelingen gerekend vanaf het moment na de embryonale spoeling van de uterus van de donormerrie tot vόόr het inbrengen van het embryo in de uterus van de draagmerrie. Het inbrengen van het embryo in de uterus van de draagmerrie moet, zoals eerder aangehaald, volkomen aseptisch verlopen. In geval van de niet-chirurgische methode zijn er verschillende hygiënische maatregelen, die in acht moeten worden genomen, om asepsie te verzekeren. De volgende hygiënische maatregelen, bij de draagmerrie uitgevoerd, zijn van belang: het omzwachtelen van de staart, het rectaal verwijderen van de feces, het reinigen van de perineumstreek met een jodiumhoudende oplossing waarna dit afgespoeld wordt met water, het reinigen van de perineumstreek met alcohol, het omgeven van de transferpipet met een steriel plastiek omhulsel en het dragen van twee paar steriele rectale handschoenen door de dierenarts (Squires et al., 1982; Carnevale et al., 2000; Daels, 2007). Ondanks het zorgvuldig reinigen van de perineumstreek, met als doel de feces ter hoogte van de vulvastreek te verwijderen, zullen alsnog fecale restanten achterblijven in het caudale deel van het vestibulum vaginae. Via de transferpipet of de arm van de operator kan deze fecale contaminatie meegevoerd worden tot in de cervix en eventueel aanleiding geven tot endometritis. Zoals reeds eerder vermeld trachtten Wilsher en Allen (2004) dergelijke fecale contaminatie van het vestibulum vaginae te verminderen door het brengen van een steriele absorberende doek in het vestibulum vaginae alvorens het rectum te ledigen (Figuur 2). De handdoek absorbeert hierbij de naar binnen getreden feces en andere contaminaties. Na het ledigen van het rectum en het reinigen van de perineumstreek wordt de doek uit het vestibulum vaginae verwijderd. 6

14 Fig. 2 De aanwezigheid van een steriele, absorberende doek in het vestibulum vaginae (uit Wilsher en Allen, 2004). Indien bij deze bovenstaande handelingen toch onvoldoende aandacht aan hygiëne wordt besteed, kan dit leiden tot een, al of niet subklinische, endometritis (Vanroose et al., 2000; Wilsher en Allen, 2004; Koblischke et al., 2008; González et al., 2010). Of de ontstane endometritis tijdelijk is of persisteert, is afhankelijk van de effectiviteit van de uteriene klaring van de merrie en de grootte van de contaminatie. In geval het gaat om een infectieuze endometritis, speelt de resistentie van het infectieuze agens ook een rol (Troedsson, 1999) INVLOED VAN HET SEDATIVUM Tijdens het transcervicaal deponeren van het embryo in de uterus kan de draagmerrie al dan niet gesedeerd worden. Als sedativum kan onder andere gebruik gemaakt worden van acepromazine of xylazine (Fleury en Alvarenga, 1999; Foss et al., 1999; Carnevale et al., 2000; Wilsher en Allen, 2004; Panzani et al., 2009). Door de sedatie verslapt de vulva en wordt de merrie rustiger, waardoor ze minder reageert op de manipulaties van de dierenarts (Fleury en Alvarenga, 1999; Carnevale et al., 2000). Er is nog geen onderzoek gebeurd naar een negatieve invloed van het sedativum op het drachtigheidspercentage na ET. Wel werd in het onderzoek van Blanchard et al. (2010) opgemerkt dat intraveneuze toediening van acepromazine, xylazine en butorfanol vόόr de natuurlijke dekking, geen negatieve invloed had op het drachtigheidspercentage. 7

15 1.5. SEIZOEN Merries hebben een seizoensgebonden poly-oestrische cyclus. Dit wil zeggen dat de merrie tijdens het voortplantingsseizoen, dat in het noordelijk halfrond duurt van april tot september, meerdere oestrische cycli doorloopt (Hughes et al., 1975). Door een toename van de dagtemperatuur en het lengen van de dagen komt de ovariële activiteit bij de merrie op gang. Daarna wordt de merrie ongeveer om de 21 dagen hengstig. Bij het korten van de dagen neemt de folliculaire activiteit ter hoogte van de ovaria af om uiteindelijk in anoestrus te gaan (Sertich, 1989). Van februari tot maart en van september tot oktober is er sprake van de transitieperiode binnen het voortplantingsseizoen van de merrie (Nagy et al., 2000). Deze periode vormt de overgang van de winter anoestrus naar de normale cycliciteit respectievelijk de normale cycliciteit naar de winter anoestrus. De transitieperiode wordt gekenmerkt door lange, onregelmatige oestrische periodes (Ginther, 1974). Tijdens deze oestrische periodes komen meerdere kleine follikels van mm tot ontwikkeling, maar deze ovuleren niet. Ondertussen zijn de serum- en hypofysaire concentraties van het luteïniserend hormoon (LH) laag en van het follikel stimulerend hormoon (FSH) stijgend (Silvia et al., 1976). Om de transitieperiode van winter anoestrus naar normale cycliciteit in te korten zijn er verschillende opties: toename van de daglichtlengte of toediening van gonadotrofine releasing hormoon (GnRH), FSH-extract, progesteron al of niet gecombineerd met oestradiol of progestagenen (Wiepz et al., 1988). In het onderzoek van Carnevale et al. (2000) werd er bij de eerste drachtcontrole geen verschil gezien in drachtigheidspercentage na ET bij draagmerries die zich in de transitieperiode bevinden en behandeld worden met een progestageen (Altrenogest), ten opzichte van cyclische merries. Wel werd er een niet-significante hogere graad aan embryonale sterfte waargenomen indien ET plaatsgreep in de transitieperiode. In tegenstelling tot deze bevindingen merkten Iuliano et al. (1985) op dat het drachtigheidspercentage lager was indien ET werd uitgevoerd tijdens de transitieperiode. Belangrijk om weten is dat de draagmerries in de studie van Iuliano et al. (1985) niet hormonaal werden voorbereid indien het embryo werd getransplanteerd in de transitieperiode. Wat betreft de invloed van de maand in het voortplantingsseizoen, waarin ET wordt uitgevoerd, op het drachtigheidspercentage na ET, werd er in de studie van Iuliano en Squires (1985) en Carnevale et al. (2000) geen verband opgemerkt. Wel werd er in de studie van Iuliano en Squires (1985) een nietsignificante stijging van het drachtigheidspercentage gezien in geval van ET na één augustus. Men vermoedde echter dat deze stijging niet alleen veroorzaakt werd door het moment van ET tijdens het voortplantingsseizoen, maar gedeeltelijk ook door de bekwaamheid van de dierenarts. 8

16 2. BIJKOMENDE THERAPIËN 2.1. PROGESTERON Bij de merrie, die al of niet door ET drachtig is, is het progesteronhormoon de gehele dracht van belang. De eerste 40 dagen van de dracht is progesteron afkomstig van het primair corpus luteum (CL). Rond dag 37 vormen zich de endometriale cups, die equine chorion gonadotrofine (ecg) produceren. Het ecg houdt het primair CL in stand en zorgt voor de vorming van secundaire CL s. Tot dag 120 van de dracht produceren de secundaire CL s progesteron, waarna ze in regressie gaan. Ongeveer vanaf 60 dagen dracht worden er door de foetale gonaden progestagenen geproduceerd en gesecreteerd. Deze foetale progestagenen zijn tot het einde van de dracht aanwezig in de maternale circulatie (Hinrichs et al., 1987). In het kader van ET wordt soms geopteerd voor toediening van progestagenen aan de draagmerrie. Draagmerries, die niet in staat zijn een dracht in stand te houden wegens een te lage progesteronproductie door het corpus luteum of na ovariëctomie, komen hiervoor in aanmerking. De behandeling met progestagenen start reeds vijf dagen vόόr ET en moet gedurende de eerste 100 tot 120 dagen van de dracht dagelijks worden toegediend aan de draagmerrie (Brinsko et al., 2011). Er is nog geen literatuur voorhanden, die een invloed van het exogeen progestageen op het drachtigheidspercentage na ET beschrijft. Wel hebben Willmann et al. (2011) het effect van een oraal progesteronpreparaat, namelijk Altrenogest (Regu-Mate ), op de ontwikkeling van het embryo bij een normale dracht onderzocht. Eerst en vooral werd er geen invloed, uitgaande van de exogene progestagenen, op het drachtigheidspercentage waargenomen. Daarnaast werd opgemerkt dat de progesteron behandeling geen invloed had op de embryonale ontwikkeling tot dag 22 (ovulatie op dag 0). Tussen dag 30 en 45 werd wel een verschil gezien in embryonale ontwikkeling tussen de nietbehandelde en de behandelde merries. Zo vertoonden de behandelde merries van 4 tot 8 jaar en merries ouder dan 8 jaar kleinere respectievelijk grotere embryo s ten opzichte van niet-behandelde merries uit dezelfde leeftijdscategorie. Het toegediend progestageen zorgt namelijk voor het wegvallen van de negatieve correlatie tussen de leeftijd van de merrie en de diameter van het embryo. Hierbij valt te benadrukken dat het exogeen progestageen niet rechtstreeks de embryonale groei stimuleert, maar zorgt voor een algemene ondersteuning van de embryonale ontwikkeling. Met de studie kwam men tot de conclusie dat toediening van progestagenen aan oudere merries of merries met een voorgeschiedenis van veel embryonale sterfte zorgt voor een ondersteuning van de embryonale ontwikkeling met minder embryonale sterfte tot gevolg. Zoals hierboven reeds vermeld worden progestagenen ook toegediend aan draagmerries, die een bilaterale ovariëctomie hebben ondergaan (Brinsko et al., 2011). Bij dergelijke merries ontbreekt een endogene progesteronproductie, waardoor deze draagmerries enkel met behulp van exogene progestagenen een dracht in stand kunnen houden. In de studie van Hinrichs et al. (1987) werd opgemerkt dat bij deze gesteriliseerde merries, waaraan progesteron werd toegediend vanaf 5 dagen 9

17 vόόr ET tot 100 dagen dracht, een normale dracht, partus, colostrumproductie, lactatie en moedergedrag aanwezig waren NSAID Na ET kan aan de draagmerrie niet-steroïdale ontstekingsremmers (NSAID s) worden toegediend. Het aanwenden van NSAID s na ET kent twee indicaties: de vrijstelling van PGF2α ter hoogte van de uterus inhiberen en de eventueel ontstane, steriele endometritis onderdrukken. De steriele endometritis ontstaat door trauma, veroorzaakt door de transferpipet bij het inbrengen van het embryo in de uterus (Foss et al., 1999). Aanvankelijk werd gesteld dat de PGF2α-vrijstelling ter hoogte van de uterus een gevolg was van de manipulatie van de cervix tijdens het niet-chirurgisch inbrengen van het embryo (Handler et al., 2003). In de studie van Koblischke et al. (2008) werd deze hypothese verworpen en verondersteld dat de PGF2α-vrijstelling veroorzaakt werd door een inflammatie van het endometrium. Deze endometriale inflammatie kan geïnduceerd worden door het ingebrachte embryo, het gebruikte transportmedium en/of bacteriële contaminatie. Koblischke et al. (2008) bestudeerden de invloed van de NSAID s, meclofenamaat en flunixine meglumine, op het drachtigheidspercentage na ET. In de studie werd opgemerkt dat beide ontstekingsremmers de embryonale ontwikkeling niet beïnvloeden: er was geen verschil in ontwikkelingsstadium en diameter van het embryo tussen de behandelingsgroep en de groep merries, die geen NSAID werden toegediend (de controlegroep). Een aantal merries uit de controlegroep ondergingen luteolyse als gevolg van een toegenomen productie van cyclo-oxygenase 2 (COX-2) en bijgevolg vrijstelling van PGF2α. Deze PGF2α-vrijstelling gebeurde onafhankelijk van een bacteriële contaminatie van het endometrium en leidde tot het beëindigen van de dracht. In de behandelingsgroep werd de productie van COX-2 door de NSAID s onderdrukt, zodat luteolyse niet optrad. Uit de studie van Koblischke et al. (2008) bleek dat meclofenamaat efficiënter is in het onderdrukken van de PGF2α-productie dan flunixine meglumine. Naast suppressie van de PGF2αproductie, werd ook de productie van prostaglandine E (PGE), uitgaande van het embryo, onderdrukt. PGE is echter van belang voor de maternale herkenning van het embryo en stimuleert de intrauteriene migratie tussen dag 9 en 16 (ovulatie op dag 0). In de preventie van endometritis na ET is het gebruik van meclofenamaat te verkiezen boven flunixine meglumine, omdat meclofenamaat de PGEproductie minder inhibeert. In een daaropvolgende studie van Koblischke et al. (2010) werd aangetoond dat behandeling van de draagmerries met NSAID s (eenmaal flunixine meglumine intraveneus en 3 dagen lang tweemaal daags vedaprofen per oraal) leidt tot een toename van het drachtigheidspercentage na transcervicale ET. Hieruit werd geconcludeerd dat behandeling met NSAID s na ET een routine moet worden (Koblischke et al., 2008; Koblischke et al., 2010). Daarentegen stelden Panzani et al. in 2009 geen verbetering van de drachtigheidspercentages vast bij gebruik van flunixine meglumine als NSAID. Volgens Panzani et al. (2009) is gebruik van NSAID s na ET onnodig. 10

18 2.3. ANTIBIOTICA In geval van ET wordt veelal vόόr en na de transplantatie profylactisch antibiotica toegediend aan de draagmerrie. Dit vermindert het risico op het optreden van een (subklinische) endometritis ten gevolge van bacteriële contaminatie van de uterus, veroorzaakt gedurende het inbrengen van het embryo in de uterus (Stout, 2006). In de studie van Panzani et al. (2009) werd procaïne benzylpenicilline dagelijks intramusculair geïnjecteerd tot drie dagen na ET. Ondanks deze antibioticumbehandeling werd er geen verbetering van de drachtigheidspercentages opgemerkt ten opzichte van nietbehandelde merries. In tegenstelling hiermee bekwamen González et al. (2010) hogere drachtigheidspercentages na ET bij eenmalig intraveneus gebruik van een fluoroquinolone, namelijk enrofloxacine, bij gezonde merries die gevoelig zijn aan endometritis. Zowel procaïne benzylpenicilline en enrofloxacine bezitten een breedspectrum activiteit. Eventueel ligt het verschil in de bevindingen van Panzani et al. (2009) en González et al. (2010) omtrent het drachtigheidspercentage, in de toedieningswijze (intramusculair versus intraveneus), de behandelingsfrequentie of de farmacokinetiek van beide antibiotica. Een nadeel aan het profylactisch gebruik van antibiotica is dat het de ontwikkeling van antibioticumresistentie bij veel voorkomende, pathogene uteriene bacteriën in de hand werkt (González et al., 2010). 3. EIGENSCHAPPEN VAN HET EMBRYO 3.1. OUDERDOM De ouderdom van het embryo wordt bepaald door het moment van uterusspoeling postovulatoir. De embryonale leeftijd heeft ook een invloed op het drachtigheidspercentage na ET. Deze invloed is meer uitgesproken in geval van niet-chirurgische ET ten opzichte van chirurgische ET (Iuliano et al., 1985). Iuliano et al. (1985) en Jacob et al. (2012) merkten de hoogste drachtigheidspercentages op bij nietchirurgische transplantatie van dag 7 embryo s. Dag 6 embryo s gingen gepaard met lagere drachtigheidspercentages, doordat deze kleiner en hierdoor meer fragiel zijn ten opzichte van dag 7 embryo s. Terwijl dag 8 en dag 9 embryo s gepaard gingen met lagere drachtigheidspercentages wegens hun grootte. Dag 8 en 9 embryo s kunnen namelijk wegens hun grotere diameter makkelijker beschadigd worden door het aangewend materieel. In het onderzoek van Fleury en Alvarenga (1999) werd er net geen verschil in drachtigheidspercentages waargenomen bij niet-chirurgische transplantatie van dag 7, 8 en 9 embryo s GROOTTE ONTWIKKELINGSSTADIUM Het drachtigheidspercentage na ET wordt ook beïnvloed door het ontwikkelingsstadium van het getransfereerd embryo. De verschillende ontwikkelingsstadia zijn de volgende: morula, vroege blastocyst, blastocyst en uitgekipte blastocyst (Figuur 3). Het vroegste ontwikkelingsstadium, dat kan worden uitgespoeld, is de morula. De morula bestaat uit totipotente stamcellen. Dit zijn cellen, die op zichzelf kunnen uitgroeien tot een volledig nieuw organisme. De morula ontwikkelt zich verder tot blastocyst. Deze kenmerkt zich door de aanwezigheid van een holte gevuld met vocht, de blastocoele. 11

19 In de periferie van de blastocyst bevindt zich een celmassa, de embryoblast of kiemschijf, van waaruit zich het embryo vormt. Het geheel wordt omgeven door de trofoblast, die het foetaal deel van de placenta vormt. Bij een vroege blastocyst is de blastocoele nog klein en onduidelijk in tegenstelling tot de verder ontwikkelde blastocyst (Cornillie, 2010). Op dag 6 of 7 van de dracht wordt bij het paardenembryo een acellulair kapsel gevormd tussen de trofoblast en de zona pellucida. Dit stevig anti-adhesief kapsel, bestaande uit glycoproteïnes, neemt, na uitkippen van de blastocyst uit de zona pellucida, in dikte toe. De aanwezigheid van het kapsel laat een zekere flexibiliteit van het embryo toe tijdens de migratie, fixatie en oriëntatie in de uterus (Ginther, 1998). Fig.3 Ontwikkelingsstadia van het paardenembryo (naar Brinsko et al., 2011). Het ontwikkelingsstadium van het embryo is afhankelijk van de dag van spoelen postovulatoir. Bij het uitvoeren van de uteriene spoeling op dag 6 of 7 (ovulatie op dag 0) kan het embryo zich in het morula stadium bevinden. Een vroege spoeling op dag 6 kan ook leiden tot een vroege blastocyst. Een vroege blastocyst, blastocyst of een uitgekipte blastocyst wordt verkregen bij spoeling op dag 7 of 8. Terwijl een uteriene spoeling op dag 9 enkel aanleiding heeft tot een uitgekipte blastocyst (Brinsko et al., 2011). In de studie van Carnevale et al. (2000) werd een lager drachtigheidspercentage opgemerkt bij transplantatie van embryo s in het morula stadium ten opzichte van de andere ontwikkelingsstadia. Men dacht dat het tegenvallend drachtigheidspercentage bij deze morula s niet zozeer het gevolg was 12

20 van het ontwikkelingsstadium zelf, maar van een vertraagde ontwikkeling bij de embryo s. De embryo s, die werden gebruikt in de studie, waren voornamelijk verkregen door uteriene spoeling op dag 7 of 8. De kans dat 7 of 8 dagen oude embryo s zich dan nog in het morula stadium bevinden is klein en is eerder te wijten aan een vertraagde ontwikkeling. De vertraagde embryonale ontwikkeling kan het gevolg zijn van een intrinsiek defect van het embryo, van een inseminatie postovulatoir, of van een voedingsarme omgeving in de tuba uterina of de uterus van de donormerrie respectievelijk draagmerrie. In diezelfde studie werd een hoog drachtigheidspercentage, namelijk 64,2%, bekomen op dag 12 bij transplantatie van een vroege blastocyst. Dit ging echter gepaard met een hoog percentage embryonale sterfte, zodat op dag 50 het drachtigheidspercentage gedaald was naar 47,7%. Hoge drachtigheidspercentages met een geringe embryonale sterfte tussen dag 12 en dag 50 werden verkregen bij transplantatie van embryo s als (uitgekipte) blastocyst. Er kan worden besloten dat transplantatie van embryo s met een ontwikkelingsachterstand weinig succesvol is. Daarentegen is het beter om, al of niet uitgekipte, blastocysten te transplanteren: inbrengen van embryo s in dit ontwikkelingsstadium geeft de hoogste drachtigheidspercentages en gaat gepaard met een geringe embryonale sterfte GROOTTE OUDERDOM Een belangrijke factor, die bepalend is voor het drachtigheidspercentage na ET, is de grootte van het embryo. De embryonale diameter heeft voornamelijk een invloed op het drachtigheidspercentage in geval van een niet-chirurgische ET (Iuliano et al., 1985; Carney et al., 1991). Bij een zich normaal ontwikkelend embryo is de diameter positief gecorreleerd met de ouderdom van het embryo. Anders uitgedrukt: hoe ouder het embryo en dus hoe later de uteriene spoeling postovulatoir plaatsgrijpt, hoe groter de embryonale diameter is (Iuliano et al., 1985). Deze theorie gaat echter niet op voor embryo s met een ontwikkelingsachterstand. Onderontwikkelde embryo s, ook wel small-for-age embryo s genoemd, hebben een significant kleinere diameter dan normaal ontwikkelde embryo s van dezelfde leeftijd. Ginther et al. (1985) toonden aan dat deze te kleine embryo s gepaard gaan met een grotere embryonale sterfte en dus een lager drachtigheidspercentage. De vertraagde groei van de embryo s werd door Willmann et al. (2011) verklaard door de leeftijd van de donormerrie: er trad namelijk een vertraagde embryonale ontwikkeling op bij donormerries ouder dan 8 jaar. Zoals reeds eerder aangehaald meenden Carnevale et al. (2000) dat deze ontwikkelingsachterstand te wijten was aan een intrinsiek defect van het embryo, een postovulatoire inseminatie of een tekort aan voeding in het geslachtsapparaat van de donor- en draagmerrie. Kortom, om de slaagkansen bij transplantatie van een te klein embryo zo goed mogelijk in te schatten, moet naast de leeftijd van het embryo, ook de leeftijd van de donormerrie in acht worden genomen. 13

21 In de studies van Iuliano et al. (1985) en Carney et al. (1991) werd aangetoond dat ET van embryo s groter dan 1,7 mm overeenstemt met een lager drachtigheidspercentage ten opzichte van kleinere embryo s. Volgens Iuliano et al. (1985) en Stout (2003) is dit voornamelijk te wijten aan het materiaal, aangewend voor het inbrengen van het embryo. Dit materiaal is namelijk niet aangepast voor transplantatie van grote embryo s: bij gebruik bestaat er een grote kans op beschadiging van het embryo, wat gepaard gaat met een verminderde embryonale leefbaarheid. Om embryo s, die te groot zijn voor het transferrietje, te transplanteren, kan daarom gebruik gemaakt worden van aangepast materiaal (Jasko, 2002). In dit geval is het drachtigheidspercentage onafhankelijk van de embryonale diameter KWALITEIT Om de embryonale kwaliteit kwantitatief uit te drukken, werd door McKinnon et al. (1988) een scoresysteem opgesteld. Aan de hand van dit scoresysteem kan op objectieve wijze de embryonale leefbaarheid en de kans op drachtig zijn van de draagmerrie na ET worden beoordeeld (Carney et al., 1991). Op basis van de morfologie van het embryo wordt er een graad van 1 tot 4 toegekend (Figuur 4). Een graad 1 embryo is excellent en heeft geen morfologisch abnormaliteiten. Een embryo met enkele kleine afwijkingen, zoals een onregelmatige vorm of enkele geëxtrudeerde blastomeren, wordt als goed beschouwd en krijgt graad 2. Bij graad 3 embryo s, die als matig worden bestempeld, zijn de morfologische afwijkingen opvallend. Zo kunnen we bij deze matige embryo s het volgende aantreffen: degenererende cellen, een gecollabeerde blastocoele alsook geëxtrudeerde blastomeren. De minst kwalitatieve embryo s zijn graad 4 embryo s, die gedegenereerd of onbevrucht zijn (Carnevale et al., 2000; Brinsko et al., 2011). Fig. 4 Vroege blastocyststadia met verschillende gradatie (naar Brinsko et al., 2011). 14

22 De kwaliteit van het embryo beïnvloedt in sterke mate het drachtigheidspercentage na ET. Algemeen kan worden gesteld dat het drachtigheidspercentage positief gecorreleerd is met de kwaliteit van het embryo. Dit werd aangetoond door Carney et al. (1991) en Carnevale et al. (2000): ET van graad 3 en graad 4 embryo s gaat duidelijk gepaard met een lager drachtigheidspercentage op dag 12 en dag 50 (ovulatie op dag 0) ten opzichte van graad 1 en graad 2 embryo s. In dezelfde studie van Carnevale et al. (2000) werden nauwelijks verschillen opgemerkt in de drachtigheidspercentages op dag 12 bij gebruik van graad 1 en graad 2 embryo s. Wel werd, bij echografisch onderzoek op dag 50, opgemerkt dat bij graad 2 embryo s, wegens hun minieme afwijkingen, meer embryonale sterfte optreedt dan bij graad 1 embryo s. 4. BEWARING VAN HET EMBRYO Embryo s, die als vers worden geclassificeerd, worden binnen het uur na uterusspoeling getransplanteerd in de geschikte draagmerrie. Deze verse embryo s kunnen gedurende een uur bij kamertemperatuur worden bewaard in een specifiek medium, namelijk Dulbecco s fosfaatgebufferde zoutoplossing met 10% foetaal kalfserum (Carnevale et al., 1987; Carney et al., 1991). Indien het embryo 6 tot 24 h in dit medium wordt bewaard bij kamertemperatuur, leidt dit tot een verminderde drachtigheidspercentage na ET volgens Douglas (1982) en Imel (1981). Niet alle paardenfokkers zijn in staat om een vers embryo ter plaatse te transplanteren in een gesynchroniseerde draagmerrie. Dit komt doordat niet alle fokkers over de mogelijkheden beschikken om draagmerries te onderhouden. In dergelijke omstandigheden is het aangewezen om het verkregen embryo te transporteren naar een erkend station voor ET, waar er wel (synchrone) draagmerries zijn gestald (Carney et al., 1991; Squires et al., 1999; Squires et al., 2003). Opdat de levensvatbaarheid van het embryo niet in het gedrang komt tijdens het transport, moet deze dan ook op de correcte manier bewaard worden. Dit kan op twee manieren: gekoeld of via cryopreservatie GEKOELD Medium Voor bewaring van embryo s langer dan een uur werd vroeger voornamelijk geopteerd voor vergast Ham s F10 medium met 90% stikstofgas (N 2 ), 5% koolstofdioxide (CO 2 ) en 5% zuurstofgas (O 2 ), waaraan 10% foetaal kalfserum is toegevoegd (Carnevale et al., 1987; Carney et al., 1991; Squires et al., 2003). Vanuit praktisch oogpunt gezien is de bereiding van het vergast Ham s F10 medium in veldomstandigheden niet ideaal. Om deze reden werd door verschillende onderzoekers naar een alternatief bewaringsmedium gezocht. Als bewaringsmedium wordt nu gebruik gemaakt van Ham s F10 medium gebufferd met hydroxyethylpiperazine-ethaansulfonaat (HEPES), Embryo Holding Solution (EmCare ) of Vigro Holding Plus. In vergelijking met het vergast Ham s F10 medium merkten Carnevale et al. (1987), bij gebruik van HEPES gebufferde Ham s F10 medium, een aantal verschillen op: een verminderde embryonale kwaliteit, een tragere groei van het embryo na 24 h bewaring, en een lager drachtigheidspercentage na transplantatie. In de studies van McCue et al. (2000) en Moussa et al. (2002) werd een vergelijking 15

23 gemaakt omtrent de embryonale leefbaarheid en het drachtigheidspercentage na ET tussen de commerciële media, Embryo Holding Solution en Vigro Holding Plus, enerzijds en het vergast Ham s F10 medium anderzijds. Bewaring van embryo s in Embryo Holding Solution of Vigro Holding Plus, elk op basis van een zwitterionische buffer, ging gepaard met eenzelfde embryonale leefbaarheid en bijgevolg gelijkaardige drachtigheidspercentages na ET Temperatuur De uitgespoelde embryo s, die zich in een bewaarmedium bevinden, worden afgekoeld en bewaard bij een temperatuur van 5 C. Achtereenvolgens wordt het geheel in een geïsoleerde container (vb. Equitaner) geplaatst, opdat het embryo goed afgeschermd wordt tegen externe factoren waaronder licht en te koude/warme temperaturen (Carnevale et al., 1987; Carney et al., 1991; Squires et al., 2003). In de studie van Herrera et al. (2014) werd waargenomen dat de leefbaarheid van embryo s, bewaard in Dulbecco s fosfaatgebufferde zoutoplossing aan 32 C gedurende een tiental uren, behouden blijft. Verder is er weinig literatuur beschikbaar, die de invloed van bewaring van het gekoeld embryo bij verschillende temperatuur op het drachtigheidspercentage na ET bestudeert Duur van bewaring De bewaringsduur van het gekoeld embryo, opdat de embryonale kwaliteit en het drachtigheidspercentage na ET nauwelijks wijzigt, is afhankelijk van het gebruikt medium en de bewaringstemperatuur. De duur van bewaring loopt op tot 24 h wanneer het embryo bewaard wordt aan 5 C in vergast Ham s F10 medium, Embryo Holding Solution of Vigro Holding Plus. Bewaring van embryo s in HEPES gebufferde Ham s F10 medium bij 5 C gedurende 24 h is ook mogelijk, maar zoals eerder vermeld leidt dit tot lagere drachtigheidspercentages in vergelijking met de andere media (Carney et al., 1991; Squires et al., 2003). Fleury et al. (2002) toonden aan dat transplantatie van embryo s, bewaard in HEPES gebufferde Ham s F10 medium bij C gedurende minstens 18 h, geen negatieve invloed heeft op het drachtigheidspercentage na ET. In het onderzoek van Carney et al. (1991) en Carnevale et al. (2000) werd aangetoond dat het drachtigheidspercentage na transplantatie niet verschilt bij gebruik van verse embryo s enerzijds en embryo s die bewaard worden in vergast Ham s F10 medium bij 5 C gedurende 24 h anderzijds. Kortom, er is geen verschil in embryonale leefbaarheid tussen een vers en een gekoeld embryo, indien het embryo maximum 24 h bij 5 C bewaard wordt CRYOPRESERVATIE Cryopreservatie of invriezen van embryo s brengt verschillende voordelen met zich mee. Zo maakt het internationaal transport van (genetisch waardevolle) embryo s mogelijk. Daarnaast verdwijnt de nood om voor elk gespoeld embryo een gesynchroniseerde draagmerrie direct ter beschikking te hebben. Een ander voordeel van deze bewaringsmethode is de mogelijkheid om embryo s, afkomstig van waardevolle jonge merries, die zichzelf nog moeten bewijzen, te gaan bewaren in een soort van 16

24 donorbank voor embryo s totdat de merries hun waarde bewezen hebben. Uiteindelijk kan cryopreservatie ook toegepast worden om, alvorens het embryo te transplanteren, eerst na te gaan of het embryo drager is van een genetisch defect. Hiervoor kan het embryo dan tijdelijk ingevroren worden tot de resultaten bekend zijn (Squires et al., 2003; Stout, 2012). Cryopreservatie van embryo s kan op twee verschillende manieren worden toegepast. Enerzijds is er de conventionele methode, waar het embryo traag wordt ingevroren ( slow-freezing ). Anderzijds kan het embryo ook via vitrificatie of verglazing worden bewaard. De overlevingskansen na ontdooien van het embryo, die via cryopreservatie wordt bewaard, zijn afhankelijk van de grootte en het ontwikkelingsstadium van het embryo enerzijds en het gebruikte cryoprotectant anderzijds. Er moet vermeld worden dat de embryonale leefbaarheid, en bijgevolg de drachtigheidspercentages na ET, steeds lager is na ontdooien van ingevroren embryo s in vergelijking met gekoelde embryo s (Squires et al., 2003; Stout, 2012) Grootte en ontwikkelingsstadium embryo De grootte van het embryo, en hiermee gepaard gaand het ontwikkelingsstadium, is een beperkende factor voor cryopreservatie. In geval van vitrificatie is de grootte van het embryo van meer belang dan wanneer het embryo traag wordt ingevroren. Zo werd door Slade et al. (1985), Eldridge-Panuska et al. (2005), Carnevale (2006), Barfield et al. (2009) en Scherzer et al. (2011) opgemerkt dat bij traag invriezen van grotere embryo s de kans op dracht, na ontdooien en ET, groter was ten opzichte van embryo s die vitrificatie hadden ondergaan. Enkel embryo s in een vroeg ontwikkelingsstadium (morula, vroege blastocyst), waarvan de diameter kleiner is dan 300 µm, kunnen ingevroren worden (Czlonkowska et al., 1985; Slade et al., 1985). Om dergelijke embryo s te verkrijgen, moet de uterusspoeling reeds plaatsgrijpen kort nadat het embryo de tuba uterina heeft verlaten. De spoeling moet daarom in de loop van dag 6 (ovulatie op dag 0) uitgevoerd worden. Indien te vroeg gespoeld, bestaat het risico dat het embryo nog aanwezig is in de tuba uterina. Terwijl te laat spoelen eventueel leidt tot het verkrijgen van een te groot embryo voor cryopreservatie (Stout, 2003). Weinig embryo s groter dan 300 µm overleven het proces van cryopreservatie. Het weinig permeabel, acellulair kapsel, dat op dag 6 of 7 onder de zona pellucida van het paardenembryo wordt gevormd, zou hiervoor een oorzaak zijn. Wegens de aanwezigheid van het kapsel wordt er te weinig cryoprotectant opgenomen, waardoor de embryonale cellen onvoldoende beschermd zijn tijdens de cryopreservatie. Hierbij wordt een positieve correlatie opgemerkt tussen de dikte van het kapsel en het aantal dode embryonale cellen na cryopreservatie (Squires et al., 1999) Cryoprotectant Bij het invriezen van embryo s is het van belang een cryoprotectant aan het medium toe te voegen. Indien dit niet gebeurt, overleeft het embryo het invriesproces niet. Gedurende het invriezen van het embryo worden er zowel intra- als extracellulair kleine ijskristallen gevormd. Tijdens het ontdooien treedt er rekristallisatie op, waarbij de kleine ijskristallen versmelten tot grotere ijskristallen met cellyse 17