Endogeen voorkomen van anabole steroïden bij paarden

Transcriptie

1 UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE Academiejaar Endogeen voorkomen van anabole steroïden bij paarden door Anneleen Michielsen Promotoren Prof. Dr. Ir. Lynn Vanhaecke Onderzoek uitgevoerdin kader Anneleen Decloedt van de Masterproef 2015 Anneleen Michielsen

2

3 VRIJWARINGSCLAUSULE Universiteit Gent, haar werknemers of studenten bieden geen enkele garantie met betrekking tot de juistheid of volledigheid van de gegevens vervat in deze masterproef, noch dat de inhoud van deze masterproef geen inbreuk uitmaakt op of aanleiding kan geven tot inbreuken op de rechten van derden. Universiteit Gent, haar werknemers of studenten aanvaarden geen aansprakelijkheid of verantwoordelijkheid voor enig gebruik dat door iemand anders wordt gemaakt van de inhoud van de masterproef, noch voor enig vertrouwen dat wordt gesteld in een advies of informatie vervat in de masterproef.

4 UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE Academiejaar Endogeen voorkomen van anabole steroïden bij paarden door Anneleen Michielsen Promotoren Prof. Dr. Ir. Lynn Vanhaecke Onderzoek uitgevoerd in kader Anneleen Decloedt van de Masterproef 2015 Anneleen Michielsen

5 Voorwoord Hier wil ik een moment nemen om iedereen te bedanken die op een directe of indirecte wijze heeft meegewerkt aan het tot stand komen van deze masterproef. Anneleen Decloedt, mijn promotor, wens ik in de eerste plaats te bedanken voor haar begeleiding en advies. Dit heeft een duidelijke meerwaarde betekend voor mijn onderzoeksstage. Daarbij gaat ook mijn dank uit naar Lynn Vanhaecke voor haar finale nazicht en advies, zodat ik mijn onderzoek tot een goed einde kon brengen. Daarnaast wil ik ook mijn ouders, Annick Meurant en Paul Michielsen en mijn oma Helena Van Bulck bedanken voor hun hulp, interesse, steun en voor het nalezen van mijn tekst. Bij verschillende problemen stonden ze klaar met hun advies of om te luisteren. In het bijzonder een woord van dank voor paardeneigenaars waar ik urinestalen mocht gaan verzamelen. Dit was zonder hen nooit gelukt. Tot slot wil ik ook Heidy van Duffel, Dominique Rombouts, Aurelia Van Ransbeeck en Amanda Wens bedanken voor hun steun en interesse.

6 Inhoudstafel Samenvatting... 1 Inleiding... 2 Literatuurstudie ANDROGENE-ANABOLE STEROIDEN ALGEMEEN CHEMISCHE STRUCTUUR EN SYNTHESE VAN STEROÏDHORMONEN DOPING EN WETGEVING GESCHIEDENIS ANDROGENE-ANABOLE STEROÏDEN DOPINGCONTROLE BOLDENONE NANDROLONE Materiaal en methoden STAALNAME NORMALISATIE VAN DE DENSITEIT STAALVOORBEREIDING: EXTRACTIE HYDROLYSE VAN GLUCURO-EN SULFO-GECONJUGEERDE COMPONENTEN VASTE FASE EXTRACTIE (SPE) WASSEN HEROPLOSSEN VAN HET EXTRACT UHPLC-MS/MS ANALYSE Data analyse Resultaten Discussie Besluit Bronnen... 41

7 Samenvatting De androgene-anabole steroïden (AAS) of anabolica omvatten alle synthetisch afgeleide producten van het hormoon testosteron: het belangrijkste, mannelijke geslachtshormoon. Deze AAS hebben een sterke anabole activiteit waardoor ze het potentieel bezitten om ingezet te worden als doping om prestaties in de sport te verbeteren. Wegens het potentieel om wedstrijdresultaten te vervalsen, alsook de hieraan gekoppelde gezondheidsrisico s, verbieden de overkoepelende sportorganisaties zoals IFHA en FEI het gebruik van AAS. Om dit te kunnen handhaven is er een sterke behoefte aan gevoelige analysetechnieken. Dankzij de evolutie van deze technieken kunnen er reeds lage concentraties opgespoord worden (tot 0,2 ng/ml urine). Deze zeer lage concentraties kunnen echter ook endogeen geproduceerd worden. Binnen deze studie werd het voorkomen van endogene AAS in een populatie van 80 onbehandelde paarden onderzocht. De meeste paarden in de studie waren actief in de wedstrijdsport. De urinestalen werden geëxtraheerd en geanalyseerd volgens een vooraf gevalideerde methode voor de detectie van AED, ADD, α-boldenone, β-boldenone, testosteron en progesteron met een triple quadrupole massapectrometer. De resultaten werden vervolgens genormaliseerd voor de densiteit, op basis van de specifieke dichtheid bepaald van elk urinestaal. Bij ruinen en merries bleek de individuele variatie groter dan initieel aangenomen. Naast een hogere β- testosteronconcentratie bij hengsten dan bij merries of ruinen, werd ook de aanwezigheid van β- boldenone bevestigd bij hengsten. Bij enkele merries of ruinen werden uitzonderingen opgemerkt zoals de aanwezigheid van ADD of AED. ADD werd in deze studie bij 1 merrie waargenomen. AED kwam echter in meer gevallen voor bij ruinen (4) en merries (3). In enkele gevallen werd ook β- boldenone waargenomen bij ruinen (3) en merries (2). De aanwezige concentratie aan progesteron in de onderzochte populatie was laag bij alle paarden. Sleutelwoorden: Anabolica, steroïden, urine, paard, doping 1

8 Inleiding Om een eerlijke competitie en het welzijn van de deelnemende dieren te garanderen, worden er bij sportpaarden geregeld onaangekondigde dopingcontroles uitgevoerd (Toutain, 2010; Decloedt et al., 2015; Wong en Wan, 2014). De screening naar verboden producten gebeurt aan de hand van urine, bloed of haar (Houghton en Maynard, 2010; Müller, 2010; Strano-Rossi et al., 2013; Decloedt et al., 2015). De lijst met verboden producten voor wedstrijdpaarden wordt opgesteld door regulerende organisaties zoals de International Federation of Horseracing Authorities (IFHA) voor renpaarden en de Fédération Equestre Internationale (FEI) voor de Olympische disciplines (Toutain, 2010). Deze lijst met verboden producten is zeer uitgebreid en omvat zowel β2-agonisten, verdovende middelen, tranquillizers, lokale anesthetica, stimulerende middelen als anabole-androgene steroïden (AAS) (Decloedt et al., 2015; FEI 3, 2015). Rond AAS werd reeds veel wetenschappelijk onderzoek verricht aangezien deze bij racepaarden regelmatig misbruikt worden en omwille van hun rol bij de voortplanting van het paard (Decloedt et al., 2015). Testosteron, het voornaamste mannelijke geslachtshormoon, is het best gekende hormoon binnen de AAS (Evans, 2004). Met de ontrafeling van de chemische structuur van testosteron werd de synthese van afgeleiden mogelijk. Deze derivaten worden de (synthetische) anabole-androgene steroïden (AAS) of anabolica genoemd (Leme de Souza en Hallak, 2011). Deze derivaten beschikken over een meer uitgesproken anabole werking, waardoor deze in de sportwereld illegaal worden ingezet om de prestaties van zowel humane atleten als dieren te verbeteren. De toename van de spiermassa is kenmerkend voor anabolica (Hartgens en Kuipers, 2004; Maravelias et al., 2005; Parr et al., 2010). Andere AAS die nauw verwant zijn aan testosteron qua structuur, zijn β-boldenone (afkorting), androst-1,4diene-3,17dione (ADD) en androst-4-ene-3,17-dione (AED). AED is een intermediair product in de endogene synthese van testosteron, de andere stoffen zijn verkrijgbaar als anabole preparaten op de illegale markt (Decloedt et al., 2015). Aan het gebruik van anabolica kunnen nadelen verbonden zijn onder de vorm van mogelijke gezondheidsrisico s (Bahrke en Yesalis, 2004; Maravelias et al., 2005). Deze gevaren, gecombineerd met de mogelijkheden voor het vervalsen van prestaties in de sport, hebben geleid tot een ban van de anabolica in de sportwereld. De twee voornaamste regulatorische organen in de paardensport, FEI en IFHA, houden zich bezig met het uitstippelen van het beleid inzake doping en de controleprogramma s voor de detectie van verboden middelen (Toutain, 2010). Door de routinematige controles die op wedstrijden worden uitgevoerd, is er een noodzaak aan de ontwikkeling van technieken om het gebruik van verboden middelen zoals anabolica op te sporen (Schänzer W.,1996; Müller, 2010). De technieken evolueren over de tijd, waardoor substanties en hun metabolieten die eerder niet gedetecteerd konden worden, nu wel kunnen ontdekt worden dankzij de toegenomen gevoeligheid van de beschikbare testen (Houghton en Maynard, 2010). 2

9 Anabolica zoals testosteron en boldenone, die via de controle kunnen worden aangetoond, zouden echter ook een endogene oorsprong kunnen kennen vanwege de lage concentraties die waargenomen kunnen worden (Houghton en Maynard, 2010). Ze kunnen ontstaan door vorming vanuit andere endogeen geproduceerde steroïden zoals de vorming van boldenone uit testosteron bij hengsten (Houghton en Maynard, 2014). Daarnaast kunnen endogene anabolica mogelijks ook gevormd worden uit fystosterolen afkomstig uit de voeding. Door de verhoogde gevoeligheid van de nieuwe generatie technieken is het mogelijk om zeer lage concentraties te detecteren (Gray et al., 2013; Houghton en Maynard, 2014). De verbeterde technieken leiden echter mogelijks ook tot vals-positieve resultaten, doordat er eveneens endogene geproduceerde stoffen worden gedetecteerd. De vraag rijst dan of er, met de huidige gevoelige analysemethoden, mogelijk drempelwaarden ontwikkeld moeten worden in plaats van de eerder gehanteerde nultolerantie. Tot op heden konden anabolica, zoals boldenone, onder natuurlijke omstandigheden enkel bij hengsten worden teruggevonden. Voor merries en ruinen geldt echter nog steeds de nultolerantie voor boldenone en voor testosteron werd er bij merries (55 ng/ml) en ruinen (20 ng/ml) wel een drempelwaarde bepaald (Popot et al., 2008). In deze studie werd onderzoek verricht naar het endogeen voorkomen van verschillende AAS bij een populatie van 80 onbehandelde paarden van zowel hengsten, merries als ruinen. Deze stalen werden afgenomen bij zowel paarden die in de sport actief zijn (dressuur, jumping of drafrennen), alsook dekhengsten en recreatiepaarden. Door een grote variatie aan types van paarden, kan een inschatting gemaakt worden van de werkelijke endogene productie aan AAS. 3

10 Literatuurstudie 1. ANDROGENE-ANABOLE STEROIDEN 1.1. ALGEMEEN Definitie Androgene-anabole steroïden (AAS) (kortweg anabolica genoemd) omvatten alle synthetische, afgeleiden van het mannelijke hormoon testosteron (Brower K.J., 2002; Bahrke en Yesalis, 2004; Evans, N.E., 2004) (Figuur 1). AAS werden ontwikkeld om een maximale anabole activiteit te bekomen, met minimale androgene activiteit (Evans, N.E., 2004; Barnard et al., 2010). Onder anabolische activiteit vallen de hypertrofische processen ter hoogte van de spieren, waarbij de verhoogde stikstofretentie, eiwitsynthese en het gebruik van energie voor synthese in plaats van vetopslag de belangrijkste kenmerken zijn (Hartgens en Kuipers, 2004; Maravelias et al., 2005; Parr et al., 2010). De androgene activiteit uit zich in het ontwikkelen en behouden van de mannelijke primaire en secundaire geslachtskenmerken zoals de ontwikkeling van de mannelijke geslachtsorganen en mannelijk gedrag (Brower K.J., 2002; Hartgens en Kuipers, 2004; Parr et al., 2010). Bij vrouwelijke individuen, zowel mens als dier, kan eveneens testosteron teruggevonden worden, weliswaar aan lagere concentraties dan bij mannelijke dieren (Schänzer W.,1996). Waar bij mannelijke dieren de productie van testosteron plaatsvindt in de testes, ter hoogte van de Leydig cellen en in kleine hoeveelheden in de bijnier (Schänzer W., 1996; Parr et al., 2010), zal bij het vrouwelijke individu testosteron geproduceerd worden in het ovarium, de bijnier (Schänzer W., 1996; Parr et al., 2010) en in de placenta (Parr et al., 2010). De rol van testosteron varieert afhankelijk van het levensstadium waarin een individu zich bevindt, maar blijft gedurende het ganse leven aanwezig. Tijdens de embryonale fase zal testosteron belangrijk zijn voor de ontwikkeling van het mannelijke fenotype (Evans, N.E., 2004). In de puberteit is dit hormoon dan weer verantwoordelijk voor de ontwikkeling van secundaire mannelijke geslachtskenmerken (groei van de penis, ontwikkeling van de skeletspieren en de geslachtsdrift en de spermatogenese) (Dence J.B., 1980; Evans, N.E., 2004). Bij volwassen individuen is testosteron verantwoordelijk voor de regulatie van verschillende fysiologische processen zoals erythropoëse, spiereiwitmetabolisme, beenmetabolisme, seksuele en cognitieve functies (Evans, N.E., 2004). Figuur 1. De chemische structuur van testosteron. Verandering aan de A-ring veranderen de anabole of androgene eigenschappen (Van Rossum J.M., 1988). 4

11 1.1.2 Werkingsmechanisme AAS Globaal gezien heeft elke cel receptoren voor AAS (Bahrke en Yesalis 2004). De binding van AAS op de receptoren is afhankelijk van het type cel en de precieze locatie van de cel in het lichaam (Bakrke en Yesalis, 2004; Maravalias et al., 2005; Duntas en Popvic, 2013). De gevoeligheid van de binding of de interactie met enzymen zijn bepalend zijn voor het effect (Hartgens en Kuipers, 2004; Maravalias et al., 2005). Het steroïde zelf bepaalt dus niet het effect (Bahrke en Yesalis, 2004). Zoals eerder aangegeven kan het effect van AAS onderverdeeld worden in een anabool en een androgeen effect (Brower K.J., 2002; Evans N.E., 2004; Parr et al., 2010). Het algemene werkingsmechanisme van AAS dat momenteel aanvaard wordt, wordt weergegeven in figuur 2 (Hartgens en Kuipers, 2004). Wanneer het hormoon diffundeert in de doelcel zijn er twee mogelijke reactiepaden die de steroïden kunnen volgen. Welk reactiepad gevolgd zal worden, is afhankelijk van de aanwezige enzymen (Bahrke en Yesalis, 2004; Hartgens en Kuipers, 2004). Organen zoals de geslachtsklieren, de huid, de longen, de prostaat, de hersenen en bot- en vetweefsel, die een hoge activiteit aan het enzym 5α-reductase hebben, zullen voornamelijk de androgene effecten van de AAS tot uiting brengen. In organen waar dit enzym een lagere activiteit bezit, de hart- en skeletspieren, zullen eerder de anabole effecten van AAS tot uiting komen (Bhasin et al., 2001; Hartgens en Kuipers, 2004). Figuur 2. Algemeen werkingsmechanisme AAS in de lichaamscel. T = testosteron, DHT = dihydrotestosteron, E= 17-βoestradiol, rec = receptor, DHT-rec= dihydrotestosteronreceptorcomplex, T-rec= testosteronreceptorcomplex, E-rec = oestradiolreceptorcomplex (Naar Hartgens en Kuipers, 2004). Het 5α-reductase-enzym speelt een belangrijke rol gezien het testosteron (T) omzet naar zijn meer actieve vorm dihydrotestosteron (DHT) (Bhasin et al., 2001; Hartgens en Kuipers, 2004; de Ronde, 2008; Sjöqvist et al., 2008; Duntas en Popovic, 2013). Deze omzetting gebeurt vlak na diffusie in de cel en net voor de binding aan de specifieke receptor in de cel. 5

12 De binding aan de receptor vindt plaats in het cytoplasma zodat er een specifiek steroidereceptor complex gevormd wordt (Hartgens en Kuipers, 2004; Sjöqvist et al., 2008). Dit complex zal in de celkern de transcriptie van specifieke genen regelen, waardoor de mrna- en bijgevolg ook de proteïnesynthese beïnvloed zal worden (Bahrke en Yesalis, 2004; Evans N.E., 2004, Hartgens en Kuipers, 2004; Maravelias et al., 2005; Duntas en Popovic, 2013). In skeletspieren zal dit complex de transcriptie van genen moduleren die verantwoordelijk zijn voor de groei van spieren. Daarnaast toonde de studie van Evans (2004) ook aan dat het aantal receptoren kan toenemen bij een verhoogde blootstelling aan AAS. Naast het 5α-reductase-enzym bevindt ook het aromatase-enzym zich voornamelijk in de cellen van het vetweefsel en sommige cellen van het centraal zenuwstelsel, Leydig en Sertoli cellen (Bahrke en Yesalis, 2004; Hartgens en Kuipers, 2004; Duntas en Popovic, 2013). Dit enzym is verantwoordelijk voor de omzetting van AAS naar 17-βoestradiol(E). Dit vrouwelijke hormoon bindt op de receptor en vormt dan het oestrogeenreceptorcomplex (E-Rec). De effecten van deze laatste complexen komen voornamelijk tot uiting in het vetweefsel (Hartgens en Kuipers, 2004) Invloed AAS op fysiologische processen Het anabole effect van de AAS zal voornamelijk aangrijpen op de skeletspieren (Evans N.E., 2004; Hartgens en Kuipers, 2004; Ros et al., 2007; Duntas en Popovic, 2013). Het artikel van Evans N.E. (2004) geeft aan dat het anabole effect van testosteron op de skeletspieren bij mensen dosisgebonden is, er treedt een dosisafhankelijke hypertrofie of vergroting van de spiervezels op, zonder toename van het aantal cellen van de type I- en type II-vezels. Echter, bij een latere studie van Hartgens en Kuipers bij mensen (2004), wordt er voornamelijk een effect op type II-vezels waargenomen. De studie bij paarden van Hyyppä et al. (1995), waarbij Finse dravers behandeld werden met nandrolone, geeft aan dat er een toename was van het type IIa-vezels, de snelle oxidatieve spiervezels. Er kon echter geen verbetering gevonden worden van de prestaties ten opzichte van de controlegroep. Deze studie geeft naast de toename in type IIa-vezels eveneens een verhoging van het aantal rode bloedcellen weer, want de paarden hadden een verhoogde erythropoëse. Dit effect ontstond door de verhoogde afgifte van erythropoëtine (EPO) in de nier en een verhoogde gevoeligheid voor EPO. Door het verhoogde aantal rode bloedcellen is er een verhoogde capaciteit om zuurstof te transporteren, wat alsnog een invloed kan hebben op de prestaties (Hyyppä et al., 1995). Een andere studie van Hyppä uit 2001 bij paarden toonde aan dat er, naast de toename van het aantal type IIa-vezels, ook een toename was van de diameter van de type I-vezels. Deze studie rapporteerde eveneens dat er een toename van het aantal rode bloedcellen plaatsvond, maar maakte wel de bedenking dat de toename van het aantal rode bloedcellen en dus de zuurstoftransportcapaciteit, pas optrad na een langdurige behandeling met een hoge dosis AAS. 6

13 Tot slot is er niet enkel een anabole invloed op het spierweefsel meetbaar, ook collageen en bot zijn weefsels waarop de anabole activiteit van AAS wordt uitgeoefend. In de zachte weefsels wordt de synthese van collageen gestimuleerd. Deze stimulatie is evenredig met de toegediende dosis. In het botweefsel zal de testosterontoediening werken via een direct onderdrukkend effect van de osteoclasten, waardoor de densiteit van het bot verhoogt (Evans N.E., 2004) Neveneffecten Bij de mens werden reeds verschillende neveneffecten beschreven ten gevolge van het gebruik van anabolica. Ernstige cardiovasculaire nevenwerkingen zoals thrombose, aritmie, linker ventriculaire hypertrofie en acuut hartfalen kunnen optreden (Evans, 2004, Hartgens en Kuipers, 2004; Maravelias et al., 2005; Ros et al., 2007; Strano-Rossi et al., 2013). Naast de hartgerelateerde aandoeningen kunnen er ook gedragsproblemen zoals agressie, depressie en psychose voorkomen (Bahrke en Yesalis, 2004; Evans, 2004; Hartgens en Kuipers, 2004; Maravelias et al., 2005; Duntas en Popovic, 2013). Huidproblemen zoals acne, striae, alopecie en hirsutisme zijn eveneens vaak terugkomende neveneffecten van anabolicagebruik (Evans, 2004; Hartgens en Kuipers, 2004; Maravelias et al., 2005). Daarnaast werd er een effect op het endocriene en reproductieve systeem vastgesteld. Door de geïnduceerde negatieve feedback op de hypothalamus-hypofyse-gonaden as treedt een daling van het luteïniserend hormoon (LH) en follikelstimulerend hormoon (FSH) op. Uiteindelijk zal dit leiden tot een verminderde endogene testosteronproductie (Bahrke en Yesalis, 2004; Evans, 2004; Maravelias et al., 2005; Kicman, 2010; Fitch, 2012; Duntas en Popovic, 2013). Het effect hiervan zal zich uiten in hypogonadisme, steriliteit, verminderde spermatogenese, verminderde spermamotiliteit, abnormale morfologie van het sperma en mogelijk zelfs infertiliteit (Bahrke en Yesalis, 2004; Evans, 2004; Kicman, 2010). Bij paarden werden ook gedragsproblemen zoals agressie vastgesteld (Hyppä, 2001). Problemen van een andere orde die men bij paarden kan waarnemen, zijn de problemen op endocrinologisch niveau met testikelatrofie en verminderde spermakwaliteit (Squires et al., 1982; Soma et al., 2007). 1.2 CHEMISCHE STRUCTUUR EN SYNTHESE VAN STEROÏDHORMONEN Klassificatie van de verschillende steroïden Structureel kunnen de steroïdhormonen onderverdeeld worden in twee grote groepen. De eerste grote groep bevat zowel de vrouwelijke geslachtshormonen als de mannelijke geslachtshormonen, met onder andere progesteron en oestrogenen enerzijds en testosteron en androstenedion (AED) anderzijds (Figuur 3) (Montgomery R. et al., 1980). De tweede grote groep bestaat uit de corticosteroïden waartoe onder meer cortisol, aldosteron en corticosteron behoren (Figuur 4). 7

14 Figuur 3.Mannelijke en vrouwelijke geslachtshormonen (Naar Montgomery et al., 1980). Figuur 4. Mineralo- en glucocorticoiden (Naar Montgomery et al., 1980). De basis van alle steroïdhormonen is de perhydrocyclopentanofenantreenstructuur, die enkel uit koolstof- en waterstofatomen bestaat (Dens J.B., 1980; Montgomery R. et al., 1980; Schänzer W., 1996). De ringen A, B en C zijn cyclohexaanringen en ring D is de cyclopentaanring (Figuur 5) (Dens J.B., 1980). Figuur 5. Eenvoudige basisstructuur van de steroïden, perhydrocyclopentanofenantreenring. De zes stereocentra worden aangegeven met * (Uit Tantuco et al., 2000). 8

15 Op basis van de zijketens en functionele groepen verbonden aan de basisstructuur, kan nog een andere (op de structuur gebaseerde) indeling van de steroïdhormonen gemaakt worden. De eerste groep (oestrogenen en androgenen) onderscheidt zich van de andere steroïdhormonen, doordat deze geen koolstofatoom hebben op C17 van de D-ring. In deze groep kunnen we de oestrogenen van de androgenen onderscheiden doordat oestrogenen enerzijds een fenolische A-ring hebben en anderzijds de hydroxylgroep op C-3 van de A-ring behouden. Dit staat in contrast met de tweede groep van steroïdhormonen, die in de A groep enkel een dubbele binding hebben tussen C-4 en C-5 en daarnaast ook een ketogroep gebonden hebben op C-3 ( Montgomery et al., 1980) (Figuur 6). Figuur 6. Indeling van de steroïdhormonen in groepen. De indeling gebeurt op basis van de zijketens en functionele groepen die verschillend zijn voor de verschillende hormonen (Naar Montgomery et al., 1980) Synthese van de steroïdhormonen Cholesterol is het meest voorkomende sterol in het lichaam van mensen en dieren. Naast zijn aanwezigheid als structurele component van celmembranen, worden er vanuit cholesterol galzuren en steroïdhormonen geproduceerd (Montgomery R. et al., 1980; Parr et al., 2010). Cholesterol (Figuur 7) kan enerzijds opgenomen worden uit de voeding en zo rechtstreeks gebruikt worden door het lichaam. Anderzijds kan cholesterol ook gesynthetiseerd en opgeslagen worden als estervorm om later gebruikt te worden (Dence, 1980; Montgomery et al., 1980; Kicman, 2010). De synthese van cholesterol in de weefsels gebeurt vanuit acetyl-coa dat aangevoerd wordt vanuit aminozuren, vetzuren en koolhydraten (Montgomery et al., 1980; Kicman, 2010). 9

16 Figuur 7. Structuur cholesterol (Uit Carnegie Mellon, 2006). De lever is de grootste producent van cholesterol, maar ook de darmen leveren een groot aandeel. Cholesterol dat gebruikt wordt voor de synthese van steroïdhormonen, kan lokaal bijkomend geproduceerd worden in de cortex van de bijnier, de ovaria en de testes (Montgomery et al., 1980). De synthese van cholesterol wordt in drie grote fasen onderverdeeld. In de eerste fase zal acetly-coa omgezet worden naar een intermediair dat bestaat uit 6 C-atomen en het 3-hydroxy-3 methylglutaryl- CoA (HMG-CoA). In de tweede fase zal het gevormde HMG-CoA omgezet worden naar squaleen, een acyclische molecule met 30 C-atomen. Als laatste en derde fase zal squaleen omgezet worden naar het cyclische cholesterol, wat uit 27 C-atomen bestaat (Dence, 1980; Montgomery et al., 1980). Voor deze verschillende reacties zijn verschillende enzymen nodig die gevormd worden in het endoplasmatisch reticulum van de cel. Om cholesterol te vormen zijn er naast enzymen ook andere substraten nodig. De substraten die de energie voor de reactie voorzien om een molecule cholesterol te vormen zijn 18 mol acetyl-coa, 36 mol ATP en 16 mol NADPH (Montgomery et al., 1980). Cholesterol zal voornamelijk omgezet worden naar galzuren. Slechts een klein deel van de gesynthetiseerde cholesterol zal omgezet worden naar steroïdhormonen, maar de kleine fractie waaruit de steroïdhormonen gevormd worden, is wel van groot belang voor de fysiologie van het lichaam (Montgomery et al., 1980). De vorming van steroïdhormonen start wanneer cholesterol wordt vrijgegeven uit de hydroxylatiereactie en cholesterol initieel omgevormd wordt naar pregnolon en progesteron. Vanuit deze twee precursoren zullen de andere steroïdhormonen gevormd worden (Dence, 1980; Montgomery et al., 1980; Parr et al., 2010; Baker et al., 2014) (Figuur 8). De enzymen die het proces van cholesterol naar het steroïdhormoon katalyseren, zijn van fundamenteel belang in de regulatie (Baker et al., 2014). De omzetting van cholesterol naar pregnolon wordt gekatalyseerd door het enzym desmolase. In deze reactie wordt een fragment afgeknipt ter hoogte van C20. Vanuit pregnolon vormt zich dan progesteron door migratie van de dubbele binding van ring B (positie 5,6) naar ring A op positie 4,5. Daarnaast wordt de hydroxylgroep op C3 omgevormd naar een ketogroep (Dence, 1980; Montgomery et al., 1980; Baker et al., 2014) (Figuur 8). 10

17 cholesterol pregnolon progesteron 17-α-OH-progesteron Androstenon testosteron 17-β-oestradiol Figuur 8. De omzetting van cholesterol naar AAS (Naar Montgomery et al., 1980). Progesteron kan vervolgens ter hoogte van C17 gehydroxyleerd worden met de vorming van 17αhydroxyprogesteron. Van hieruit zijn er ook verschillende reactiepaden mogelijk. Ten eerste kan de groep op C17 verwijderd worden wat de vorming van androsteron geeft. Vervolgens kan dit hormoon omgezet worden tot testosteron door de reductie van de ketogroep op C17 naar een hydroxylgroep (Dence, 1980; Montgomery et al., 1980; Kicman, 2010; Baker et al., 2014). Testosteron kan op zijn beurt verder omgezet worden naar 17-β-oestradiol, wat het belangrijkste hormoon van de oestrogenen is (Dence, 1980; Montgomery et al., 1980; Baker et al., 2014). 17-β-Oestradiol speelt een belangrijke functie bij vruchtbaarheid en voortplanting, maar speelt daarnaast ook een belangrijk rol bij het botmetabolisme (NVKC, 2010). Bij deze omzetting wordt de A- ring geoxideerd tot een fenolring, waarbij de ketogroep wordt omgezet tot een hydroxylgroep (Dence, 1980; Montgomery et al., 1980; Baker et al., 2014). 11

18 Een tweede mogelijke reactie is de vorming van cortisol vanuit 17α-hydroxyprogesteron. Hierbij zal 17α-hydroxyprogesteron gehydroxyleerd worden op de positie C21 en C11 (Dence, 1980; Montgomery et al., 1980; Baker et al., 2014). Ten derde kan een geheel ander reactiepad gevolgd worden vanuit progesteron: namelijk de vorming van aldosteron (een mineraloglucocorticoïd), die een belangrijke rol speelt bij het regelen van de bloeddruk (Figuur 4) Biotransformatie en excretie van steroïdhormonen De metabolisatie van steroïdhormonen naar hun excretieproducten vindt plaats in de lever (Montgomery et al., 1980). De biotransformatie van steroïdhormonen kunnen we onderverdelen in twee fasen. In de eerste fase wordt het hormoon enzymatisch getransformeerd naar polaire stoffen om zo de substantie te inactiveren en om te zetten naar substanties die het lichaam makkelijker kunnen verlaten. In deze fase treedt oxidatie, hydrolyse of reductie op en de geproduceerde metabolieten worden aangeduid als fase I-metabolieten (Schänzer, 1996; Buiarelli et al., 2005). In de tweede fase (de conjugatiefase) conjugeert de componenten of fase I metabolieten met stoffen zoals glucuronaat of sulfaat om zo oplosbare geconjugeerde producten te vormen die het lichaam kunnen verlaten via urine of feces, de zogenaamde fase II metabolieten (Schänzer, 1996; Buiarelli et al., 2005). Deze reacties worden enzymatisch gecontroleerd (Schänzer, 1996). Bij dopingcontroles kan gezocht worden naar deze geconjugeerde excretieproducten (Buiarelli et al., 2005). Niet alle AAS conjugeren. In urine kunnen zowel vrije als geconjugeerde excretieproducten onderscheiden worden (Schänzer, 1996). De regelgeving verwijst meestal naar de gedetecteerde som van vrije en geconjugeerde steroïden bij het opleggen van grenswaarden. 12

19 2. DOPING EN WETGEVING 2.1.GESCHIEDENIS ANDROGENE-ANABOLE STEROÏDEN Androgene-anabole steroïden worden vaak geassocieerd met dopinggebruik in de sportwereld, maar kennen ook een aantal therapeutische toepassingen (Clark & Henderson, 2003; Evans, 2004; Barnard et al., 2010; Parr et al., 2010; Strano-Rossi et al., 2013). De therapeutische toepassing waarvoor anabolica oorspronkelijk werden ingezet, waren aandoeningen waarbij de patiënt gewicht verloor. Het oorspronkelijke doel van anabolica was immers een verhoogde proteïnesynthese te weeg brengen (Evans, 2004; Barnard et al., 2010; Parr et al., 2010). Deze toepassingen werden echter onvoldoende wetenschappelijk ondersteund, waardoor vele producten niet meer toegestaan zijn voor dergelijk gebruik (Barnard et al., 2010). Naast het therapeutische gebruik werden anabolica ook illegaal gebruikt. In de sportwereld vonden ze hun intrede onder de vorm van doping (Schänzer W., 1996; Toutain P.L., 2010; Strano-Rossi et al., 2013). Het woord doping wordt voor het eerst vernoemd in 1889 in een Engels woordenboek, maar ook daarvoor waren er al pogingen om de sportprestaties te beïnvloeden. Testosteron werd één van de hoofdspelers van de AAS in het dopinggebruik (Müller, 2010). Testosteron werd pas voor het eerst geïsoleerd uit de testes van stieren in 1935 door David et al. De chemische synthese van testosteron uit cholesterol werd datzelfde jaar onafhankelijk van elkaar ontdekt door Butenandt & Hanish en Ruzicka & Wettstein (Schänzer, 1996; Müller, 2010). De identificatie van testosteron gebeurde pas later. Deze opheldering maakte het mogelijk om vanaf dan synthetische producten te ontwikkelen door structurele veranderingen in de ontdekte molecule aan te brengen via verestering en alkylering. Hierdoor ontstaat de mogelijkheid om producten met een hoger potentieel anabool effect dan de natuurlijke producten te ontwikkelen (Schänzer, 1996; Evans, 2004). Ruzicka et al. waren in 1935 voor het eerst in staat het synthetische testosteron te reproduceren (Schänzer, 1996; Müller, 2010). In de jaren 60 wordt het misbruik van anabole-androgene steroïden bij atleten om hun fysieke prestaties te verbeteren bekend. Het gebruik van medicatie om prestaties te verbeteren was al langer bekend, maar door de introductie van AAS steeg het misbruik exponentieel (Sjövist et al., 2008). Dit leidde in 1974 tot een uitsluiting van alle AAS door het Internationaal Olympisch Comité (IOC). Een maatregel die later ook door nationale en internationale sportfederaties werd overgenomen (Schänzer W., 1996; Ayotte, 2010; Müller, 2010; Fitch, 2012). In 1984 werd testosteron ook verbannen door het IOC en alle andere sportfederaties (Schänzer W., 1996; Ayotte, 2010; Müller, 2010). De ontwikkeling van gevoelige testen om AAS op te sporen werd noodzakelijk (Schänzer W., 1996; Müller, 2010). 13

20 2.2. DOPING EN REGELS Niet alleen mensen worden aanzien als atleten, maar ook dieren. Paarden worden op regelmatige basis voor sportdoeleinden ingezet (dressuur, jumping, eventing, polo en rensport), maar ook honden (rennen, sledesport, jagen) (Houghton en Maynard, 2010; Toutain P.L., 2010) en kamelen (rensport) zijn dieren waarmee veel gewerkt wordt in de sport (Toutain P.L., 2010). Sportpaarden moeten voldoen aan hoge fysieke eisen en een competitieve instelling hebben om zich te kunnen meten met anderen. Via speciale fok- en trainingsprogramma s worden dieren met deze eigenschappen geselecteerd en verder gestimuleerd door training. Met behulp van medicatie kan er getracht worden om deze eigenschappen te beïnvloeden (Toutain P.L., 2010). De uitdaging van dopingcontrole bij dieren is groter dan bij humane atleten (Toutain P.L., 2010; Wong en Wan, 2014). Humane atleten zullen hun toevlucht tot doping zoeken om hun prestaties te verbeteren, terwijl er bij dieren soms ook doping wordt gebruikt om net de prestaties te verminderen om zo de resultaten van het dier negatief te beïnvloeden. De doping kan toegediend worden door de eigenaar of trainer van het dier om de uitslag van een wedstrijd te vervalsen (Houghton en Maynard, 2010; Toutain, 2010; Wong en Wan, 2014). Naast de beïnvloeding van de prestaties op een positieve of negatieve manier, kan echter ook accidentele doping plaatsvinden (Ungemach, 1985). Accidentele doping kan optreden door fouten bij het toedienen van medicatie. Er kan immers overdracht van medicatie optreden via de voederemmer of door excretieproducten van een behandeld paard dat op dezelfde weide staat als het paard dat op wedstrijd gaat (Ven, 2015). Los van het misbruik van verboden middelen dient men ook rekening te houden met gebruik van medicatie voor therapeutische doeleinden. Dit laatste houdt diergeneeskundige medicatie in, maar ook off label use van humane medicatie bij dieren. Deze producten kunnen ook ingezet worden om de prestaties van de dieren te beïnvloeden, waardoor eveneens screening voor deze producten noodzakelijk is (Wong en Wan, 2014). Bij dieren is er natuurlijk de moeilijke balans tussen behandeling met medicatie wanneer het noodzakelijk is voor het welzijn van het dier en het behoud van de integriteit van de sport (Houghton en Maynard, 2010; Wong en Wan, 2014). Vooral wanneer er gegokt wordt in een sport, zoals bijvoorbeeld bij racepaarden, is het belangrijk dat het beeld en de geloofwaardigheid van de sport niet in het gedrang komen (Houghton en Maynard, 2010; Toutain P.L., 2010; Wong en Wan, 2014). Het primaire doel van de instanties die waken over het gebruik van doping in de paardensport (FEI en IFHA) is het manipuleren van de prestaties van paarden te verhinderen (Toutain P.L., 2010). Daarnaast willen ze de dieren beschermen en waken over hun welzijn (Ungemach, 1985; Toutain P.L., 2010). De IFHA wenst dat de paarden die deelnemen aan wedstrijden moeten kunnen presteren zonder de invloed van enige medicatie (Houghton en Maynard, 2010) en verbiedt net als de FEI naast de verboden substanties en zijn verwanten ook stoffen die de aanwezigheid van verboden substanties kunnen maskeren. Door dit verbod ontstond het anti-doping programma (Kioussi et al., 2013). 14

21 De standaarden waaraan het anti-doping programma moet voldoen zijn ethiek en eerlijkheid om ervoor te zorgen dat de competities eerlijk verlopen. Daarbij komt bovendien dat dieren beschermd moeten worden (Toutain P.L., 2010). De FEI (2015) vervolledigt zijn prgramma met waarden zoals gezondheid, karakter en opleiding, het plezier en de vreugde van de sport, de uitmuntendheid in de sport, toewijding aan de sport, respect voor de regels, respect voor zichzelf en voor andere sporters, moed en solidariteit. De FEI stelt dat doping rechtstreeks tegen de essentie van de sport in gaat. Wat onder doping valt, werd door de FEI opgelijst en gereglementeerd (FEI, 2015). De FEI deelt de lijst van verboden stoffen op in twee groepen: enerzijds de verboden producten die niet gebruikt mogen worden bij paarden in competitie en dus onder geen enkele omstandigheid teruggevonden mogen worden in het lichaam en anderzijds de tweede groep, de groep van de gecontroleerde substanties, geneesmiddelen met actieve substanties die gebruikt mogen worden voor therapeutische doeleinden, onder toezicht van een dierenarts. Deze actieve stoffen mogen echter niet teruggevonden worden in de paarden wanneer deze deelnemen aan evenementen georganiseerd door de FEI, omdat ze mogelijk de prestaties van de paarden kunnen beïnvloeden (FEI 2, 2015; Wong en Wan, 2014). Naast deze stoffen worden ook alle chemisch structureel verwante stoffen op de lijst gezet voor verboden gebruik bij paarden in de sport, alsook alle stoffen met een gelijkaardig biologisch effect (Kioussi et al., 2013; FEI 2, 2015). Anabolica bevinden zich op de lijst van verboden stoffen (FEI, 2015) (Tabel 1). 15

22 Tabel 1. Lijst van anabolica welke op de lijst van verboden substanties 2015 van de FEI staan. De substanties met drempelwaarde* zijn boldenone, nandrolone en testosteron. Voor boldenone bedraagt deze 15 nanogram vrij en geconjugeerd boldenone per milliliter urine bij mannelijke paarden. Ook voor testosteron is er een drempelwaarde ingesteld. Bij ruinen bedraagt deze 20 nanogram vrij en geconjugeerd testosteron per milliliter urine. Bij merries is er een grens van 55,5 nanogram per milliliter (Popot et al., 2008; FEI 3, 2015). Nandrolone heeft een drempelwaarde van een nanogram per milliliter urine bij ruinen en merries. Bij hengsten ligt de toegestane drempelwaarde voor nandrolone hoger, namelijk 45 nanogram per millilter urine. (Jabroski, 2008). 17α-Hydroxy dromostanolone Methandriol normethandrolone progesterone MALES androstenediol drostanolone Methandrostenolone oxabolone androstenedione (AED) (endogene component) epiternbolone Methenolone Oxandrolone bolandiol ethinylestradiol Methyldienolone oxymesterone bolasterone ethylestrenol Methylnortestosterone oxymetholone Boldenone* fluoxymesterone Methyltestosterone paramethadione boldione formebolone Methyltrienolone Prostanozol calusterone fuzazabol Mibolerone Stanozolol clostebol gestrinone Nandrolone* (nortestosterone) Stenbolone danazol hydroxytestosterone Norandrostenediol testosteron* dehydrochlorometh yltestosterone dehydrochlorotesto sterone desoxymethyltestos terone mestanolone Norandrostenedione tetrahydrogestrinone (THG) mesterolone Norbolethone tibolone methandienone Norclostebol trenbolone Er zijn geen anabolica geregistreerd op de lijst van gecontroleerde substanties voor Deze lijst wordt elk jaar 90 dagen voorafgaand aan 1 januari, wanneer hij effectief ingaat, bekend gemaakt (FEI 3, 2015). Met de huidige gevoelige technieken kunnen echter zeer lage concentraties gedetecteerd worden. De nultolerantie kwam onder druk te staan. Bij hengsten kan boldenone immers endogeen gevormd worden uit testosterone (Ho et al., 2004; Popot et al., 2008). Deze bedraagt 15 ng vrij en geconjugeerd boldenone per ml urine bij mannelijk intacte paarden (hengsten) (Ho et al., 2004; Popot et al., 2008; FEI 3, 2015). Voor testosteron is er ook een drempelwaarde ingesteld. Bij ruinen bedraagt deze 20 ng vrij en geconjugeerd testosteron per ml urine. Bij merries is er een grens van 55,5 ng/ml (Popot et al., 2008; FEI 3, 2015). Nandrolone of één van zijn metabolieten heeft een drempelwaarde van 1 ng/ml bij ruinen en merries en bij hengsten 45 ng/ml urine (Jabroski, 2008). 16

23 2.3. DOPINGCONTROLE Laboratoria Parallel met het ontstaan van specifieke programma s om de sport te beschermen, steeg de nood aan goed uitgeruste laboratoria en geavanceerde technieken om verboden substanties te kunnen opsporen. Vooral tijdens de 20 e eeuw werden de technieken voor het opsporen van dopingmisbruik stelselmatig beter. Hierdoor verbeterde de detectie en controle van doping in de sport (Houghton en Maynard, 2010). De laatste 30 jaar zijn er ook veel ontwikkelingen geweest in de farmaceutische industrie, waardoor er verschillende geneesmiddelen met een verhoogde potentie zijn bijgekomen die ook opgespoord dienen te worden (Houghton en Maynard, 2010; Müller, 2010). Bovendien moet voor goede dopingcontroles het labo geaccrediteerd zijn, ofwel de formele erkenning van het laboratorium waar stalen geanalyseerd wat van fundamenteel belang is (Müller, 2010; Kioussi et al., 2013; Wong en Wan, 2014) Staalname Bij een controle van een staal wordt er gezocht naar het terugvinden van de substantie zelf, een metaboliet van de substantie, een isomeer van de substantie zelf of zijn metaboliet (Houghton en Maynard, 2014; FEI 2, 2015). Verschillende matrices zijn geschikt als staal voor dopingcontroles. Testosteron en zijn gerelateerde producten verlaten het lichaam voornamelijk via de urine (Parr et al., 2010), maar ook bloedstalen worden onderzocht. Urine wordt verzameld door opvangen terwijl het paard plast, dus zonder een urinesonde te plaatsen. Opvangen van urine gebeurt bij voorkeur na het werk (FNCF, 2015). Voor het verzamelen van een bloedstaal op serum, wordt wel een handeling uitgevoerd namelijk het aanprikken van de vena jugularis (Houghton en Maynard, 2010; Müller, 2010; Strano-Rossi et al., 2013). Veel substanties worden eveneens in het haar geïncorporeerd, waardoor haar gebruikt kan worden voor dopingcontrole (Müller, 2010; Strano-Rossi et al., 2013). Tijdens de staalvoorbereiding wordt een opzuivering van het staal nagestreefd, alsook de enzymatische hydrolyse van sulfaat- en glucuronideconjugaten (type II metabolieten) (Houghton en Maynard, 2010; Kioussi et al., 2013). Anabolica worden vaak toegediend onder de vorm van een ester (Clark en Henderson, 2003 ; Yuan et al., 2011; Gray et al., 2013). De estervorm vertraagt de degradatie en zorgt voor een langdurige werking na injectie van het steroïde (Clark en Henderson, 2003). Indien een intact ester kan gedetecteerd worden tijdens de analyse, dan is per definitie de exogene toediening aangetoond. Maar deze esters metaboliseren snel in het lichaam, waardoor deze zelden teruggevonden worden in urine (Yuan et al., 2011; Gray et al., 2013). De verbetering van de opsporingstechnieken heeft bijgedragen tothet reduceren van het benodigde volume van het te onderzoeken staal (Houghton en Maynard, 2010). Overeenkomstig met de technische ontwikkelingen werden de detectielimieten ook steeds lager. In de jaren 80 kwam het besef dat ook endogene steroïden en hun afgeleiden of gevormde steroïden vanuit de voeding gedetecteerd kunnen worden (Houghton en Maynard, 2014). 17

24 3. ENDOGENE VORMING ANDROGENE-ANABOLE STEROÏDEN De gemeten concentraties endogene AAS in de urine kunnen sterk variëren tussen verschillende individuen. Deze variatie is voornamelijk geslachtsgebonden, maar het kan ook samenhangen met de leeftijd, abnormale fysiologische toestand of trauma (Gray et al., 2013). Aangezien deze endogene producten steeds van nature aanwezig zijn in het lichaam (Müller, 2010; Houghton en Maynard, 2014), moet er een drempelwaarde vastgelegd worden vanaf wanneer men de aangetroffen concentraties als te hoog beschouwd en wanneer er dus met andere woorden sprake is van exogene toediening. Deze drempelwaarden voor endogene AAS werden bepaald door de FEI en IFHA. Deze uitgevoerde studie heeft als doel om een beter inzicht te verwerven over endogene producties van AAS bij paarden, aangezien er een enorme variatie bestaat in de componenten welke teruggevonden kunnen worden in de urine. Hierdoor is het niet altijd eenvoudig om de richtlijn aan te houden. Hoe beter het inzicht in deze producties, hoe beter de drempelwaarden afgestemd kunnen worden op de realiteit. Van drie AAS (nandrolone, boldenone en testosteron) werd reeds aangetoond dat zij endogeen kunnen voorkomen bij het paard. Deze endogene AAS kunnen het aantonen van exogeen toegediende AAS bemoeilijken (Soma et al., 2011; Yuan et al., 2011; Moeller en Stanley, 2012 Gray et al., 2013). Bij hengsten kan er van nature een hoge concentratie aan testosteron in de urine en plasma teruggevonden worden (Soma et al., 2011; Gray et al., 2013). Boldenone is ook detecteerbaar in lage concentraties bij hengsten (Ho et al., 2004; Popot et al., 2008; Gray et al., 2013). Bij ruinen (gecastreerde hengsten) en merries worden soms echter ook lage concentraties teruggevonden hoewel hier nog een nultolerantie geldt (Gray et al., 2013; Houghton en Maynard, 2014). In de jaren 80 werd nandrolone voor het eerst gedetecteerd in de urine van onbehandelde hengsten en drachtige merries (Houghton en Maynard, 2014). Bij niet-drachtige merries en ruinen kon tot op heden, nadrolone niet gedetecteerd worden, tenzij het exogeen toegediend wordt (Gray et al., 2013) BOLDENONE De detectie van boldenone (1,4-androstadieen-17β-ol-3-one of dehydrotestosteron) (Sgoifo Rossi et al., 2004; Ros et al., 2007) tijdens een controle bij paarden of runderen werd lang beschouwd als een bewijs van illegale dopingtoediening (Ros et al., 2007). Boldenone wordt voornamelijk toegediend omwille van zijn anabole farmacologische activiteit en zorgt voor een verhoogde stikstofretentie, eiwitsynthese en verhoogde afgifte van erythropoëtine in de nier (Decloedt et al., 2015). Naast het feit dat boldenone exogeen kan worden toegediend als anabool agens, is er echter ook de mogelijkheid van endogene productie (Ros et al., 2007; Cannizzo et al., 2007). Sinds de jaren 80 ontstond het besef dat AAS ook uit de voeding (fytosterolen) kunnen ontstaan en dus ook gedetecteerd kunnen worden. Door dit besef kwam er veel onderzoek in de richting van de vorming van endogene AAS uit voeding (Houghton en Maynard, 2014). 18

25 Deze omzetting van β-sitosterol (fytosterol) (Figuur 9) kan gebeuren door micro-organismen (De Brabander et al., 2004; Ros et al., 2007). De zijketen op C17 van de D-ring van β-sitosterol kan worden afgebroken. De sterolmolecule kan dan vervolgens omgezet worden naar anabole steroïden zoals testosteron en boldenone (Ros et al., 2007). Figuur 9. Chemische structuur van β-sitosterol (Uit De Brabander et al., 2004). Naast het feit dat endogene AAS kunnen gevormd worden uit de voeding (fytosterolen), kunnen deze eveneens ontstaan uit andere endogene steroïden. Zo kan boldenone gevormd worden uit testosteron (Gray et al., 2013; Houghton en Maynard, 2014). Endogeen gevormd boldenone wordt voornamelijk waargenomen bij hengsten (niet-gecastreerde paarden) welke dus ook een hogere concentratie aan testosteron bezitten (De Brabander et al., 2004; Popot et al., 2008; Gray et al., 2013). De structuur van boldenone is sterk gelijkend op die van testosteron. Een dubbele binding op C1-C2 is het enige wat boldenone van testosteron onderscheidt (De Brabander et al., 2004; Le Bizec et al., 2006; Ho et al., 2004; Cannizzo et al., 2007). Deze omzetting vormt de voornaamste verklaring voor het endogeen voorkomen van boldenone bij hengsten. Steroïden die eveneens sterk aansluiten bij boldenone en testosteron zijn hun respectievelijke precursoren: androsta-1,4-diene-3,17-dione (ADD) en androst-4- ene-3,17-dione (AED) (De Brabander et al., 2004) (Figuur 10). De laatste jaren wordteen stijging waargenomen in de detectie van AAS. Hiervoor kunnen er verschillende verklaringen naar voor geschoven worden. Sinds de jaren 90 zijn dierlijke vetten in de voeding van dieren volledig vervangen door plantaardige vetten naar aanleiding van de dioxinecrisis en na de crisis van Boviene Spongiforme Encephalopathie (gekkenkoeienziekte). Daarnaast zijn de analytische technieken sterk verbeterd, waardoor lagere concentraties vandaag de dag wel meetbaar zijn, die men vroeger niet kon meten (De Brabander et al., 2004). Het prohormoon ADD kan in het lichaam omgezet worden tot boldenone via het enzym 17βhydroxysteroidedehydrogenase /17-oxo-reductase. Dit enzym bestaat in verschillende iso-vormen die elk een individuele specificiteit hebben (Popot et al., 2008). 19

26 Figuur 10. Chemische structuur van β- boldenone, testosteron, ADD en AED (Naar De Brabander et al., 2004). Het is van essentieel belang om de endogene productie van boldenone grondig te bestuderen, omdat boldenone ook misbruikt kan worden als doping (De Brabander et al.,2004). Ho et al. (2004) geeft aan dat boldenone voornamelijk als zijn fase II metaboliet, het 17β-geconjugeerde sulfaat, in de urine het lichaam verlaat. (Ho et al., 2004; Pu et al., 2004). Boldenone is dan ook één van de cruciale componenten die gedetecteerd zal worden in deze studie. Naast boldenone wordt ADD ook vaak gebruikt als doping als prohormoon. De Brabander et al. (2004) geven in hun artikel aan dat ADD een groter anabool potentieel heeft dan boldenone zelf. De Brabander et al. (2004) voegt daaraan toe dat het onderscheid tussen de vrije vorm van 17β-boldenone en de geconjugeerde vorm het eerste punt is waar men het verschil kan maken tussen endogeen gevormde boldenone en exogeen toegediend, waarbij deze laatste geëxcreteerd worden onder de vrije vorm van 17β-boldenone. Dit kan mogelijk een methode zijn om gedopeerde paarden te identificeren. Dit wordt ook aangegeven door Cannizzo et al. (2007) en Le Bizec et al. (2006). Boldenone wordt geëxcreteerd als 17β-conjugaat door de hydrolyse met 17β-glucuronidase. De voornaamste metabolieten van boldenone die kunnen worden teruggevonden zijn: 17β-hydroxy-5β-androst-1-en-3-one, 5β-androst-1-ene-3α,17β-diol en 3αhydroxy-5β-androst-1-en-17-one (Figuur 11)(Schänzer, 1996). Figuur 11. Metabolisme van Boldenone. 1. Boldenone 2. 17β-hydroxy- 5βandrost-1-en-3-one 3. Androsta-1,4-diene-3,17-dione 4. 5β-androst-1-ene-3α,17βdiol 5. 5β-androst-1-ene-3,17-dione 6. 3α-hydroxy-5β-androst-1-en 17-one 3 en 5 zijn slechts intermediaire structuren en worden niet geëxcreteerd in de urine (Uit Schänzer, 1996). 20

27 3.2. NANDROLONE De structuur van het anabole-androgene steroïde nandrolone of 19-nortestosteron werd voor het eerst gesynthetiseerd in 1950 (Balssa et al., 2011). Nandrolone is een zeer potent AAS wat de reden is voor zijn misbruik en deze component werd dan ook door de IFHA en FEI verbannen uit de sport (Balssa et al., 2011). In de jaren 80 werden nandrolone en zijn metabolieten voor het eerst gedetecteerd in de urine van gezonde, niet-behandelde hengsten (Houghton en Maynard, 2010; Guan et al., 2012) en later ook in de urine van drachtige merries (Houghton en Maynard, 2014). Bij niet-drachtige merries en ruinen kan nandrolone tot op heden niet gedetecteerd worden, tenzij het exogeen toegediend werd (Gray et al., 2013). Net als voor boldenone werden er drempelwaardes vastgelegd, aangezien zowel nandrolonesulfaat als boldenonesulfaat in de urine van onbehandelde paarden aangetoond konden worden (Yamada et al., 2007; Kicman, 2010 Guan et al., 2012; Gray et al., 2013; FEI 3, 2015). De drempelwaarde bedraagt de verhouding van beide metabolieten. Deze ratio moet 1/1 zijn. Helaas is er veel individuele variatie mogelijk (Yamada et al., 2007). Nandrolone of 19-nortestosteron volgt voornamelijk het metabolische reactiepad van testostosteron. De voornaamste metabolieten van nandrolone zijn: 3α-hydroxy-5α-estran-17-one en 3α-hydroxy-5βestran-17-one (Schänzer, 1996). Deze laatste is het belangrijkste metaboliet van nandrolone (Balssa et al., 2011). Daarnaast is er ook het isomeer 3β-hydroxy-5α-estran-17-one, dat als 3β-sulfaat kan gedetecteerd worden in urine (Schänzer, 1996) (Figuur 12) (Yamada et al., 2007). Figuur 12. Metabolisme van Nandrolone. 1. Nandrolone, 2. 3α-hydroxy-5αestran-17-one 3. 3α-hydroxy-5β-estran-17-one 4. 3β-hydroxy-5α-estran-17-one (Uit Schänzer, 1996). 21