Microscopie van directe preparaten voor de dermatologische praktijk

Transcriptie

1 Microscopie van directe preparaten voor de dermatologische praktijk Herziene tweede druk 2014 Liesbeth van der Raaij-Helmer en Sjan Lavrijsen

2 Microscopie van directe preparaten voor de dermatologische praktijk Herziene tweede druk 2014 Liesbeth van der Raaij-Helmer en Sjan Lavrijsen

3 Colofon Inhoudsopgave Alle rechten voorbehouden. Niets uit deze uitgave mag worden verveelvoudigd, opgeslagen in een geautomatiseerd gegevensbestand, of openbaar gemaakt, in enige vorm of op enige wijze, hetzij elektronisch, mechanisch, door fotokopieën of opnamen, hetzij op enige andere manier, zonder voorafgaande schriftelijke toestemming van de uitgever. Voor zover het maken van kopieën uit deze uitgave is toegestaan op grond van artikel 16b Auteurswet j het Besluit van 20 juni 1974, Stb. 351, zoals gewijzigd bij Besluit van 23 augustus 1985, Stb. 471 en artikel 17 Auteurswet, dient men de daarvoor wettelijk verschuldigde vergoedingen te voldoen aan de Stichting Reprorecht (Postbus 3051, 2130 KB Hoofddorp). Voor het overnemen van (een) gedeelte(n) uit deze uitgave in bloemlezingen, readers en andere compilatiewerken (artikel 16 Auteurswet) dient men zich tot de uitgever te wenden. Samensteller(s) en uitgever zijn zich volledig bewust van hun taak een betrouwbare uitgave te verzorgen. Niettemin kunnen zij geen aansprakelijkheid aanvaarden voor drukfouten en andere onjuistheden die eventueel in deze uitgave voorkomen. Uitgever: 2014 LUMC, afdeling Huidziekten, Leiden Eerste druk 2004 Tweede druk, herziene druk, 2014 Vormgeving, druk en bindwerk: 1Bureau reclame / vormgeving / dtp, Alkmaar Auteur: Liesbeth van der Raaij-Helmer Auteur: Dr. Sjan Lavrijsen, dermatoloog Beeld & Presentatie: Thomas Donker Redactiesecretariaat: Ada Brouwer Afdeling Huidziekten Leids Universitair Medisch Centrum, Albinusdreef ZA Leiden Voorwoord 7 Deel 1: Preparaten Tabel 1: Type preparaat met indicatie 9 1. oppervlakkige schimmelinfecties (dermatofytosen) 1. dermatomycosen - KOH-preparaat onychomycosen (tinea unguium) - KOH-preparaat trichomycosen (tinea capitis en- barbae) - KOH-preparaat trichomycosen (tinea capitis, - barbae en trichomycosis aillaris) - KOH-preparaat gistinfecties en overige 5. gistinfecties (candidiasis en pityrosporum-infectie) - KOH-preparaat / methyleenblauwpreparaat folliculitis (pityrosporum-folliculitis, acneïforme folliculitis en bacteriële folliculitis) - methyleenblauwpreparaat erythrasma - KOH-preparaat soa en fluor 8. urethritis (gonorroe, niet-specifieke urethritis) herpes infectie - Tzanck-preparaat syfilis - fysiologisch zoutpreparaat van prikkelserum fluor (bacteriële vaginose, trichomoniasis) - fysiologisch zoutpreparaat fluor (candidiasis, bacteriële vaginose en trichomoniasis) - methyleenblauwpreparaat epizoönozen 13. scabies - KOH-preparaat Demode folliculitis - KOH-preparaat pediculosis pubis- en capitis droogpreparaat prurigo parasitaria droogpreparaat oyuriasis - plakbandpreparaat 26 ISBN: NUR: 871 Omslagillustratie: Voorkant: boven - multinucleaire reuscellen; rechtsonder - Neisseria gonorrhoe; linksonder - Candida species Achterkant: boven - Malassezia species; rechtsonder - Trichofyton species; linksonder - scabiesmijt 4 5

4 Deel 2: Handleiding Microscoop 5. Handleiding lichtmicroscopie 27 Deel 3: Kleurmethoden Tabel 2: Verwerking diagnostische materiaal KOH-preparaat Tzanck-preparaat Methyleenblauwpreparaat Gram-preparaat Fysiologisch zoutpreparaat Plakbandpreparaat Donkerveldpreparaat (fysiologisch zoutpreparaat met prikkelserum) 47 Tabel 3: Benodigheden 50 Referenties 54 Voorwoord Met behulp van eenvoudig cytologisch/mycologisch onderzoek kan vaak snel een diagnose worden gesteld van huidinfecties en SOA. Soms is snelle diagnostiek nodig. We denken hierbij o.a. aan verdenking op een herpes infectie, de diagnostiek van uretritis en genitale ulcera. Ook bij verdenking op scabiës is een snelle diagnostische methode van groot belang. Daarnaast kan het cytologisch onderzoek een goedkoop en snel hulpmiddel zijn bij de differentiële diagnostiek van pustuleuze huidafwijkingen bij de neonaat. Men dient rekening te houden met het feit dat deze diagnostiek niet altijd erg specifiek en sensitief is en daarom soms gevolgd dient te worden door aanvullend onderzoek zoals kweek of PCR. Deze handleiding borduurt voort op het boek: Atlas dermatomycosen; diagnostiek en behandeling (1) en illustreert naast de directe diagnostiek van dermatomycosen ook het directe onderzoek van folliculitis, SOA, fluor etc. Aanvankelijk was deze informatie in een waaier vorm gegoten. In de tweede editie is gekozen voor een ander formaat en zijn enkele onderwerpen toegevoegd. In het hoofdstuk Handleiding lichtmicroscopie staat beschreven hoe de lichtmicroscoop het beste ingesteld kan worden bij het bekijken van deze preparaten. Vervolgens wordt beschreven hoe deze preparaten gemaakt kunnen worden en welke materialen men hier voor nodig heeft. A.P.M. Lavrijsen,

5 Tabel 1 Type preparaat met indicatie KOH-preparaat 1. Verdenking dermatomycose: dermatofyt - Candida species - Malassezia species 2. Verdenking scabies - demodefolliculitis: schurftmijt - Demode 3. Verdenking erythrasma - trichomycosis: Corynebacterium species Tzanck-preparaat Deel 1 Preparaten 1. Verdenking herpes virus infectie (type 1,2 en 3) bij patiënt met verminderde afweer 2. Verdenking eczema herpeticum 3. Verdenking cutane leishmaniasis 4. Pustuleuze erupties bij de neonataal (differentiatie bacteriële, virale en mycotische infecties en niet infectieuze dermatosen zoals erythema toicum neonatorum eosinophilicum, transiente neonatale pustuleuze melanose en infantiele acropustulose) Methyleenblauwpreparaat 1. Folliculitis: differentiatie acne vulgaris, pityrosporum folliculitis, bacteriële folliculitis, demodefolliculitis 2. Verdenking pityriasis versicolor (plakbandpreparaat) 3. Verdenking orale candidiasis 4. Urethritis bij man: gonorroe, niet-specifieke urethritis 5. Pustel / bulla: differentiatie bacteriële infectie, steriele pustel / bulla 6. Fluor: differentiatie candidiasis vaginalis, bacteriële vaginose, normale flora (Lactobacillus) Gram-preparaat 1. Gonorroe ter ondersteuning van het methyleenblauwpreparaat als het om gramnegatief diplokokken (N. gonorrhoeae) gaat, vooral bij veel mengflora bacteriën 2. Verdenking ulcus molle (gramnegatieve staafjes) Fysiologisch zoutpreparaat 1. Fluor: verdenking trichomoniasis en bacteriële vaginose 2. Niet op therapie reagerende urethritis bij een man: verdenking trichomoniasis Plakbandpreparaat 1. Peri-anale jeuk 2. Wormpjes (Enterobius vermicularis of aarsmaden) gezien rond de anus, op perineum of op de ontlasting 3. Verdenking pityriasis versicolor (methyleenblauwpreparaat) Donkerveldpreparaat (fysiologisch zoutpreparaat met prikkelserum) 1. Ulcus genitaal of perianaal (oraal niet specifiek, wegens spirocheten in de mond (commensaal) 2. Condylomata lata 8 9

6 1 Oppervlakkige schimmelinfecties (Dermatofytosen) 1. dermatomycosen 1 Oppervlakkige schimmelinfecties (Dermatofytosen) 2. onychomycosen (tinea unguium) 1. KOH-preparaat huidschilfers 2. KOH-preparaat nagels a. Overzicht mycelium (netwerk gevormd door schimmeldraden hyfen). a. Overzicht mycelium in nagelpreparaat na (minimaal 2 uur) opweken. b. Mozaïekstructuur die gevormd wordt door kristalachtige, niet-doorlopende structuren, b. Schimmeldraden helder, doorzichtig met septa, fijn tot grof of kralenketting of losse welke vaak met de randen vande epitheelcellen meelopen: geen of behandelde c. sporen: dermatofyt. schimmelinfectie. c. Schimmeldraden (hyfen) helder, doorzichtig met septa: past bij Trichophyton rubrum d. Vele ringvormige, zeer grove sporen, er zijn nauwelijks schimmeldraden te zien: (humane dermatofyt). Schimmeldraden helder, doorzichtig met septa: dermatofyt. Scopulariopsis brevicalis (niet-dermatofyt, moeilijk tot niet oraal te behandelen). d. Schimmeldraden (hyfen) helder, doorzichtig met septa of kralenketting of losse sporen: past bij Trichophyton mentagrophytes (humane dermatofyt)

7 1 Oppervlakkige schimmelinfecties (Dermatofytosen) 3. trichomycosen (tinea capitis en tinea barbae) 1 Oppervlakkige schimmelinfecties (Dermatofytosen) 4. trichomycosen (tinea capitis, - barbae en trichomycosis aillaris) 3. KOH-preparaat haren 4. KOH-preparaat haren a. Schimmeldraden in de haren. a. Haar vol met kleine sporen ("zak vol knikkers"): Microsporum canis, (animale dermatofyt, b. In de 1040 vergroting van a. ziet men schimmeldraden als kralenkettingen: Trichophyton mentagrophytes (animale dermatofyt, bron kleine dieren zoals cavia). c. bron honden en langharige katten). b. Rondom de haar (ectotri) zijn hoekige sporen zichtbaar die kralenkettingen vormen: In de haar (endotri) zijn de schimmelsporen zichtbaar, buiten de haar de schimmeldraden. d. In de 1040 vergroting van c. ziet men in de haar kleine ronde sporen, welke enigszins oplichten en lijken op erythrocyten: Trichophyton violaceum (eotische dermatofyt). Andere Trichophyton verrucosum (animale dermatofyt, bron vee, meestal runderen). c. Vastzittende deposities aan de haar, typische roodbruine verkleuring: Corynebacterium tenuis (bacteriële infectie: trichomycosis aillaris). eotische dermatofyten geven hetzelfde beeld

8 2 Gistinfecties en overigen 5. gistinfecties (candidiasis en malassezia-infectie) 5. KOH-preparaat huidschilfers (a,b,c), plakband/ methyleenblauwpreparaat (d) 2 Gistinfecties en overigen 6. folliculitis (pityrosporum-folliculitis, acneïforme folliculitis en bacteriële folliculitis 6. Methyleenblauwpreparaat uitstrijk a. Cellen met een donkere rand en licht van binnen: Malassezia species. a. Overzicht 1010 kan passen bij candida. b. Rechte of licht gebogen staafvormige bacterie: Propionibacterium acnes. b. In de 1040 vergroting van a. ziet men kronkelige dunne draden (pseudohyfen) met c. kolonies gistcellen ("druiventrosjes"): Candida albicans. c. Kokken in "druiventrosjes": Staphylococcus aureus (in Gram-kleuring zijn kokken grampositief). Gistcellen met een witte hof en korte draadjes (pseudohyfen), ook wel "meatballs met spaghetti" genoemd: Malassezia species. d. Gistcellen en korte draadjes (pseudohyfen), ook wel "meatballs met spaghetti" genoemd: Malassezia species

9 2 7. Gistinfecties en overigen erythrasma 3 Soa en fluor 8. uretritis (gonorroe, niet-specifieke urethritis) 7. KOH-preparaat huidschilfers 8. Uitstrijk (écoulement) a. Kluwens van hele fijne draadjes met aan het uiteinde een klein zwart puntje: Corynebacterium minutissimum (bacteriële infectie). b. Methyleenblauwpreparaat van huidschilfers (een methyleenblauwpreparaat van huidschilfers is bewerkelijk en niet routinematig). Fijne, lichtblauwe draadjes met donkere puntjes: Corynebacterium minutissimum. a. Methyleenblauwpreparaat. Leukocyt met diplokokken (boon- of niervormig) intracellulair: Neisseria gonorrhoeae (gonorroe). b. Gram-preparaat. Leukocyt met gramnegatieve diplokokken (boon- of niervormig) intracellulair: Neisseria gonorrhoeae (gonorroe). c. Methyleenblauwpreparaat. Meer dan 10 leukocyten per gezichtsveld (10100), minimaal 2 gezichtsvelden: niet-specifieke urethritis

10 3 Soa en fluor 3 9. herpes infectie Soa en fluor 10. syfilis 9. Tzanck-preparaat uitstrijk (May-Grünwald-Giemsa-kleuring) a. Gezwollen celkern van epitheelcel met heldere perinucleaire hof, donker paars tot roodachtig gekleurd. De celkern is 3 à 5 maal groter dan een normale kern: reuscel (verdacht voor infectie door herpessimplevirus of door varicellazostervirus). b. Meerkernige en opgezwollen epitheelcellen: multinucleaire reuscellen (verdacht voor infectie door herpessimplevirus of door varicellazostervirus). 10. Fysiologisch zoutpreparaat van prikkelserum (microscopische opname met een donkerveldcondensor) a. Heel fijne draadjes met 8-12 windingen en een elegante knik bij deling. De bacteriën maken een spiraalvormige beweging ("kurkentrekker") in het preparaat: Treponema pallidum

11 3 Soa en fluor 11. fluor (bacteriële vaginose en trichomoniasis) 3 Soa en fluor 12. fluor (candidiasis, bacteriële vaginose en trichomoniasis) 11. Fysiologisch zoutpreparaat (fluor) 12. Methyleenblauwpreparaat uitstrijk a. Plaveiselepitheelcellen die bedekt zijn met heel fijne staafjes zodat het membraan van de a. Gistcellen met een lichte rand en donkere kern. Dunne, lange, donkerblauw gekleurde draden opgebouwd uit korte draden (pseudohyfen): Candida albicans. cel een rafelig aspect toont: clue-cellen: Gardnerella vaginalis (anaërobe bacterie). b. Bewegende eencellige amoeben met zweepdraden of flagellen: Trichomonas vaginalis. c. b. Plaveiselepitheelcellen die bedenkt zijn met hele fijne staafjes zodat het membraan van de cel een rafelig aspect toont: clue-cellen: Gardnerella vaginalis (anaërobe bacterie). Idem als b c. Lange dikke staafjes (gram positief) met de neiging tot draadvorming: Lactobacillus (Döderlein-bacillen)

12 4 Epizoönozen 13. scabies 4 Epizoönozen 14. demode folliculitis 13. KOH-preparaat huidschilfers 14. KOH-preparaat huidschilfers a. Vrouwelijke mijt in huidschilfer - actieve infectie: Sarcoptes scabiei hominis (schurftmijt). a. Wormachtige parasieten in schilfers: Demode folliculorum (haarfollikelmijt). b. Ei van schurftmijt met inwendige structuur - actieve infectie. b. Een vergroting van een haarfollikelmijt. c. Lege eierschalen van schurftmijt, opengeklapt - behandelde of actieve infectie

13 4 Epizoönozen pediculosis pubis en - capitis Epizoönozen 16. prurigo parasitaria 15. Droogpreparaat haren 16. Droogpreparaat a. Krab-achtige parasieten met een platte brede vorm: Phthirus pubis (schaamluis). Schaamluis komt voor op de behaarde gebieden van het gehele lichaam inclusief wimpers, maar niet op het behaarde hoofd. b. Krab-achtige parasieten met een lang gerekt lijf. 1 a 2 mm langer dan de schaamluis: Pediculus humanis capitis (hoofdluis). Hoofdluis komt alleen op behaarde hoofd voor. c. Ei met kroontje vastzittend aan een haar: volle neet van luis. d. Ei zonder kroontje vastzittend aan haar: lege neet van luis. a. Achtpotige parasiet, ze zijn enigszins verwant aan mijten en spinnen. Van spinnen onderscheiden ze zich o.a. doordat er geen duidelijke scheiding is tussen kopborststuk en achterlijf: Iodes ricinus (teek). b. Vlo met snor en kraag: Ctenocephalides felis (kattenvlo)

14 4 17. Epizoönozen oyuriasis Deel 2 Handleiding lichtmicroscopie 17. Plakbandpreparaat a. Ovale eieren met dubbelwandige rand: Enterobius vermicularis (aarsmade)

15 5 Handleiding lichtmicroscopie 5 Handleiding lichtmicroscopie Instellen lichtmicroscoop vooraf aan gebruik (kan verschillen per microscoop) Zet de microscoop aan (11). Met de knop (12) aan de zijkant kan de licht intensiteit geregeld worden. Schuif met de oculairs (1) zover uit elkaar dat je met beide ogen één beeld ziet. Met de dioptrie ring wordt de brilsterkte ingesteld. Normaal staat deze op nul. (Bij sommige microscopen is dit het getal dat tussen de oculairs wordt weergegeven.) Beoordeling preparaten KOH-preparaten Het condensordiafragma (5) wordt dichtgedraaid om contrast te verkrijgen. Het materiaal wordt opgezocht met het 4 objectief. Met de macrometerschroef (9) wordt het materiaal scherp gesteld. De fijne-instelling gebeurt met de micrometerschroef (8). Daarna wordt het te beoordelen materiaal eerst met het 10 objectief bekeken. Met het 40 objectief wordt het materiaal nog eens nauwkeurig beoordeeld. Bij het 40 objectief kan het condensordiafragma (5) iets opengedraaid worden. Leg een willekeurig preparaat op de kruistafel (3) en draai het 10 objectief voor. Stel het preparaat scherp met de macrometerschroef (9) en de micrometerschroef (8). Hierna het preparaat weghalen. Het lichtvelddiafragma (6) wordt dichtgedraaid. Stel met de condensorknop (10) de condensor hoogte zo in dat er een scherpbegrensde heldere (12-hoekige) ring wordt gezien en centreer de lichtbundel met de centreerknoppen (13). Vervolgens wordt het lichtvelddiafragma (6) weer geheel opengedraaid. Het te onderzoeken preparaat wordt nu op de kruistafel (3) gelegd. Gekleurde preparaten Bij gekleurde preparaten zoals methyleenblauw, Giemsa en Gram wordt het condensordiafragma (5) opengedraaid. Eventueel de lichtsterkte met de daarvoor bestemde knop (12) iets dempen. Het materiaal wordt opgezocht met het 4 objectief. Met de macrometerschroef (9) wordt het materiaal scherp gesteld. De fijne-instelling gebeurt met de micrometerschroef (8). Daarna wordt er op het materiaal een druppel immersie-olie aangebracht, waarna het olie-immersie objectief (100) voor gedraaid wordt en de lichtintensiteit wordt met de daarvoor bestemde knop (12) maimaal gezet

16 5 Handleiding lichtmicroscopie 5 Handleiding lichtmicroscopie Afbeelding 1 Afbeelding

17 5 Handleiding lichtmicroscopie Op afbeelding 1 en 2 zijn de onderdelen doormiddel van nummers weergegeven. Onderdelen microscoop 1. Tubus met twee oculairs: onderdeel van het lenzensysteem waardoor je kijkt. Het vergroot meestal 10 en heeft een instelbare dioptrie ring. 2. Revolver met objectieven: onderdeel van het lenzensysteem, waardoor het preparaat verder wordt vergroot. Er zijn meerdere objectieven: zoals 4, 10, 20, 40, 60 en 100 (dit is het olie-immersie objectief). 3. Kruistafel met preparaathouder. 4. Condensor: concentreert het licht van de lichtbron. 5. Condensordiafragma regelt het contrast (de resolutie) van de microscoop. 6. Lichtvelddiafragma 7. Knop bediening kruistafel: hiermee kan het preparaat van links naar recht en van voren naar achteren verschoven en doorzocht worden. 8. Macroschroef voor de grove scherpstelling. 9. Microschroef voor de fijne scherpstelling. 10. Condensorknop 11. Aan/uit knop 12. Lichtintensiteit knop 13. Centreerknoppen Deel 3 Kleurmethoden 32 33

18 Tabel 2 Verwerking diagnostisch materiaal Materiaal KOH-preparaat Tzanck-preparaat methyleenblauwpreparaat Gram-preparaat fysiologisch zoutpreparaat plakbandpreparaat donkerveldpreparaat droogpreparaat Hard Huidschilfers Haren Nagels Plakband (anaal of schilfers) Parasieten Zacht Uitstrijk pus (pustel) Uitstrijk vesikelbodem 6 KOH-preparaat Indicatie: 1. Verdenking dermatomycose: dermatofyt - Candida species - Malassezia species. 2. Verdenking scabies - demodefolliculitis: schurftmijt - Demode. 3. Verdenking erythrasma - trichomycosis: Corynebacterium minutissimum - Corynebacterium tenuis. Materiaal verzamelen en afleveren: Huidschilfers: Het te onderzoeken materiaal wordt bij voorkeur afgenomen ter plaatse van de overgang van de klinisch aangedane naar de klinisch gezonde huid omdat de schimmel in het centrum van een dermatomycose vaak al is verdwenen. Bij het afnemen worden schilfers in de richting van de gezonde huid losgetrokken zodat deze overgang aangedane gezonde huid kan worden beoordeeld. Het materiaal kan worden afgenomen met een scalpel (verhoornde huid) en (splinter)pincet (zachte huid). Geen objectglaasje in verband met risico van trauma na breken van het glaasje. Vooral kleine schilfertjes en vesikel/blaardakmateriaal zijn bijzonder geschikt. Indien lokaal zalven of crèmes zijn gebruikt kan de huid vooraf aan het afnemen van schilfers worden schoongemaakt met alcohol. Bij verdenking op scabies wordt met een scalpel een gangetje uitgeschraapt, eventueel wordt met de dermatoscoop de juiste plek bepaald. Prikkelserum (ulcus) Fluor (uitstrijk vagina) Ecoulement (ulcus) Uitstrijk mond / tong Deppreparaat / huidbiopt Haren: Bij verdenking van een tinea capitis - trichomycose is het belangrijk om naast huidschilfers ook aangetaste haren van het aangedane huidgebied met een pincet uit te trekken voor zowel het directe preparaat als voor schimmelkweek. Afgeknipte haren zijn onbruikbaar omdat de schimmel zich meestal in de basis van de haar en / of in de haarwortel bevindt. Vaak laten aangedane haren zich makkelijk uittrekken. Bij verdenking trichomycosis aillaris, welke wordt veroorzaakt door een Corynebacterium, kun je haren afknippen omdat de bacteriën rondom de haarschacht zitten

19 6 KOH-preparaat 6 KOH-preparaat Nagels: Het nagelmateriaal bij voorkeur zo proimaal mogelijk afnemen ter plaatse van de overgang van het klinisch aangedane naar het klinisch gezonde deel van de nagel en probeer daarbij zowel een gedeelte van de bovenkant als de onderkant van de nagel te verzamelen. Wanneer de totale nagel is aangedaan kan men materiaal verkrijgen door het afschrapen van de oppervlakkige nagel en het afnemen van subunguale hyperkeratose. Uitvoering: Benodigdheden: zie benodigdhedentabel (blz: 50-53) Materiaal (huidschilfers of nagel stukjes of haren) worden gelegd op een objectglaasje. Breng een druppeltje 20% KOH-oplossing naast het materiaal en hierop een dekglaasje. De 20% KOH-oplossing is gekozen omdat een lagere concentratie het materiaal onvoldoende verweekt en een hogere concentratie eerder kristalliseert waardoor het preparaat moeilijker te beoordelen is. Het preparaat wordt eerst met het 10 maal objectief beoordeeld, vervolgens het preparaat aandrukken, eventueel verwarmen en daarna nogmaals met het 40 maal objectief beoordelen. Vooral bij nagels, welke indien nodig eerst klein worden gemaakt met een nageltang zal de inweektijd langer zijn vanwege het harde materiaal. Daarom wordt elk KOH-preparaat, dat in eerste instantie negatief beoordeeld is na 2 à 3 uur nogmaals onderzocht. Het KOH-preparaat wordt bewaard in een petrischaal met triangel. De preparaten kunnen zo gedurende een week bewaard worden. De preparaten beslist niet vochtig maken of in de koelkast bewaren. Om KOH-preparaten voor langer tijd te kunnen bewaren kunnen de randen van het dekglaasje worden afgesloten met bijvoorbeeld malinol. Interpretatie: Preparaat van: Microscopisch beeld: Kan passen bij: Huidschilfers, Nagels, Haren Huidschilfers, Huidschilfers, Nagels, Haren Hyfen (schimmeldraden) of sporen Ovale en ronde gistcellen met pseudohyfen Kluwen van zeer fijne draadjes met aan uiteinde zwart puntje - Corynebacterium minutissimum Mijten of eieren Candida (gistcellen + pseudohyfen) Deposities rondom haren (Corynebacterium tenuis) Luizen en neten *Malassezia gisten hebben een halo in KOH-preparaat. **Candida gisten zijn meestal scherpbegrensd en meestal peervormig. Anthropofiele dermatofyt Zoöfiele dermatofyt Non-dermatofyt Malassezia species* infectie / Pityriasis versicolor Erythrasma Scabies mijt Demode mijt Candidiasis** Trichomycosis aillaris Hoofdluis Schaamluis **Indien een preparaat negatief is kan bij verdenking op een candida-infectie altijd materiaal voor kweek afgenomen worden

20 7 Tzanck-preparaat snel (Hemacolor ) 7 Tzanck-preparaat snel (Hemacolor ) Inleiding: De oorspronkelijke kleurtechniek van Tzanck is vanwege de duur (± 30 minuten) minder geschikt voor microscopische sneldiagnostiek. De kleuring met behulp van Hemacolor is veel sneller. Indicatie: 1. Herpes infectie bij patiënt met verminderde afweer. Met deze techniek kan er geen onderscheid gemaakt worden tussen een infectie met een varicellazostervirus en een herpessimplevirus. 2. Eczema herpeticum. 3. Cutane leishmaniasis (aanvullend aan histologisch onderzoek) 4. Differentiaal diagnose van pustuleuze erupties bij de neonaat (differentiatie bacteriële, virale en mycotische infecties en niet infectieuze dermatosen zoals erythema toicum neonatorum eosinophilicum, transiënte neonatale pustuleuze melanose en infantiele acropustulose. Materiaal verzamelen: Pustel: Met steriele naald of scalpel mesje (nr. 15) pustel openen en het pus zo dun mogelijk op een objectglaasje uitstrijken. Blaasje verdenking herpes infectie: Materiaal afkomstig van een vers blaasje - liefst niet ouder dan 72 uur. Open het blaasje en schrap met een mesje materiaal van de blaarbodem en strijk dit uit op een objectglaasje. (resterend blaarvocht kan eventueel voor aanvullend onderzoek worden gebruikt). Ulcus: verdenking leishmaniasis: Deppreparaat van een huidbiopt of uitstrijk van de ulcusrand. Uitvoering: Benodigdheden: zie benodigdhedentabel (blz: 50-53). Uitstrijk aan de lucht laten drogen. Het glaasje ongeveer 1 seconde in de vloeistof per indoping in de volgende volgorde. Bakje 1 met fieervloeistof (methanol): 5 maal indopen Bakje 2 met Hemacolor 2 (rode kleurreagens): 3 maal indopen Bakje 3 met Hemacolor 3 (blauwe kleurreagens): 3 maal indopen Bakje 4 met bufferoplossing ph 7,2: 2 maal 10 seconde indopen. Eerst overtollige vloeistof aan de zijkant van het glaasje op filteerpapier weg laten lopen. Drogen met föhn of aan de lucht (beslist niet drogen met filtreerpapier). Indien het materiaal droog is, dit bekijken onder het microscoop. Eerst het materiaal opzoeken met de 10 objectief. Beoordelen met de 100 objectief en olie. Klassieke Tzanck-preparaat (May-Grünwald-Giemsa-kleuring) Uitvoering: Benodigdheden: zie benodigdhedentabel (blz: 50-53). Uitstrijk aan de lucht laten drogen. Plaats het object glaasje op het rekje in de kleurbak. Kleur het materiaal 3 minuten met Tzanck-oplossing A (May-Grünwald-oplossing), gebruik hierbij een filter. Afspoelen met leidingwater uit spuitfles. Kleur het materiaal nu 2 minuten Tzanck-oplossing B (50% May -Grünwald-oplossing) hiervoor kan dezelfde filter worden gebruikt. Spoel af met leidingwater. Kleur het materiaal nu 10 minuten met een mengsel van Tzanck-oplossing C (4% Giemsaoplossing), dit mag zonder filter. Spoel af met leidingwater. Drogen voorzichtig met föhn of aan de lucht (beslist niet drogen met filtreerpapier). Indien het materiaal droog is, dit bekijken onder het microscoop. Eerst het materiaal opzoeken met de 10 objectief en beoordelen met de 100 objectief met immersie-olie

21 7 Tzanck-preparaat snel (Hemacolor ) 8 Methyleenblauwpreparaat Interpretatie: Preparaat van: Microscopisch beeld: Kan passen bij: Blaasjesbodem* Papuleuzelaesie of ulcera Pustuleuze eruptie (neonatus) Acantholytische epitheelcel met gezwollen celkern en heldere perinucleaire hof. De celkern is 3 à 5 groter dan een normale kern (reuscel - balloon cel ) Meerkernige epitheelcel (multinucleaire reuscel), soms toont de gezwollen kern inclusie lichaampjes /vacuolen Amastigoten (ééncellig organisme zonder zweepdraad) intracellulair in macrofagen (biopt) Bacteriën Malassezia (gisten) Candida (gisten) Schimmeldraden Eosinofiele granulocyten Neutrofiele granulocyten Verdacht voor infectie door herpessimplevirus of door varicellazostervirus Cutanea leishmaniasis Bacteriële aandoening Malassezia (pityrosporon) folliculitis Candidasis Trichophytie * Bij voorkeur een vers blaasje niet ouder dan 3 dagen (tenzij patient immuungecompromitteerd is). Indien het Tzanck-preparaat negatief is kan er nog sprake zijn van een oude herpes infectie. Overweeg in die situatie een PCR. Erythema toicum neonatorum, eosinofiele pustuleuze folliculitis, incontinentia pigmenti Transiente neonatale pustuleuze melanose Infantiele acropustulose Indicatie zacht materiaal*: 1. Folliculitis: differentiatie acne vulgaris, pityrosporum folliculitis, bacteriële folliculitis. 2. Verdenking orale candidiasis. 3. Urethritis bij man: gonorroe, niet-specifieke urethritis (o.a. Chlamydia). 4. Pustel / bulla: differentiatie bacteriële infectie, steriele laesie 5. Fluor: differentiatie candidiasis, bacteriële vaginose, overgroei normale flora (Lactobaccillus). 6. Verdenking pityriasis versicolor (plakbandpreparaat). Biologisch materiaal verzamelen en afleveren: Urethritis / fluor: Met een steriele öse materiaal afnemen en op een objectglaasje uitstrijken. Blaar / pustel: Blaar / pustel met een steriele naald of scalpelmesje (nr. 15) openen en de pus uitstrijken op een objectglaasje. Uitstrijk mond en tong. Uitvoering: Benodigdheden: zie benodigdhedentabel (blz: 50-53). Het dunne uitgestreken materiaal op het glaasje wordt gefieerd boven een vlammetje (het objectglaasje met materiaal 3 door het vlammetje halen). Plaats het glaasje in een kleurbakje (bv. coplin) gevuld met methyleenblauw 30 seconden tot maimaal 2 minuten kleuren. Het glaasje afspoelen met leidingwater uit de spuitfles of injectiespuit en opvangen in afvalbakje. Het preparaat wordt onder de microscoop bekeken, eerst met het 5 of 10 objectief het materiaal op zoeken en scherp stellen. Vervolgens wordt er een druppeltje immersie-olie op het materiaal gedaan en daarna met het 100 objectief beoordeeld. ** Met de 10 objectief zoeken naar grote cellen met een gezwollen kern (balloon cells) of naar multinucleaire cellen. Verifiëren of verder zoeken met de 100 objectief

22 8 Methyleenblauwpreparaat 9 Gram-preparaat (Gram-colorkit) Preparaat van: Microscopisch beeld: Kan passen bij: Folliculair gebonden pustel Plaque mond/ tong Urethra man/vrouw (Cervi vrouw) Blaarvocht Fluor Gebogen staafjes (coryneforme bacteriën) Malassezia species Bacteriën Candida Diplokokken intracellulair in groepjes in de leukocyten Leukocyten zonder bacteriën (tenminste 10 leukocyten / gezichtsveld in drie niet aangrenzende gezichtsvelden) Leukocyten zonder bacteriën (ten minste 5 tot 10 leukocyten / gezichtsveld in drie niet aangrenzende gezichtsvelden) Leukocyten zonder bacteriën (minder dan 5 leukocyten / gezichtsveld in drie niet aangrenzende gezichtsvelden) Leukocyten Leukocyten met bacteriën Candida (gisten of pseudohyfen) (kleine gistcellen zonder pseudohyfen) Bacteriën epitheelcellen met vage celmembraan en vol met fijne bacteriële staafjes (cluecellen) Acne vulgaris Pityrosporum folliculitis Bacteriële folliculitis* * Candidiasis Positief gonorroe * Niet-specifieke urethritis Verdacht voor nietspecifieke urethritis Niet verdacht voor niet-specifieke urethritis Steriel Bacteriële infectie** Candidiasis (Candida albicans) (Candida glabrata) Bacteriële vaginosis Gardnerella vaginalis Inleiding: Alle kokken zijn grampositief behalve de Neisseria gonorrhoeae en de Neisseria meningitides. Deze zijn gramnegatief. Voor diagnostiek van N. gonorrhoeae infectie kan daarom volstaan worden met een methyleenblauw preparaat. (Voor beoordeling van een kolonisatie met staafjes kan alleen een onderscheid gemaakt worden tussen grampositief (blauw) en gramnegatief (rood) middels Gramkleuring.) Indicatie: 1. Verdenking gonorroe als het methyleenblauw-preparaat naast diplococcen veel mengflora laat zien. 2. Ulcus molle (gramnegatieve staafjes). 3. Döderlein overgroei (grampositieve staafjes) bij overmatig wassen, maar ook in herstelfase. 4. Differentatie tussen grampositieve bacteriën en gramnegatieve bacteriën. Biologische materiaal verzamelen en afleveren: Urethritis / fluor: Dit wordt met een steriele öse afgenomen en zo dun mogelijk op een objectglaasje uitgestreken. Blaar / pustel: Deze met een steriele naald of scalpelmesje (nr. 15) openen en de pus zo dun mogelijk uitstrijken op een objectglaasje. Verdenking ulcus molle: Bij het maken van dit preparaat wordt het materiaal één kant op uitgestreken. Teveel gram positieve staafjes (Lactobacillus) Overmatig wasgedrag * Een positieve uitslag van gonorroe ondersteunen met een kweek of PCR. ** Bacteriële aandoening: Kokken in groepjes - waarschijnlijk Stafylococcus aureus Kokken in ketens - waarschijnlijk streptokokken Overige bacteriën -geen uitspraak 42 43

23 9 Gram-preparaat (Gram-colorkit) 10 Fysiologisch zoutpreparaat Uitvoering: Benodigdheden: zie benodigdhedentabel (blz: 50-53). Het uitstrijkje fieren boven een vlam. Leg het glaasje op het rekje en druppel de kleuroplossing op het glaasje. Oplossing 1c: 1 minuut. Afspoelen met leidingwater. Oplossing 2: 1 minuut. Afspoelen met leidingwater. Oplossing 3 (doel ontkleuring): 2 maal 15 seconde totdat er geen blauwe kleurstof meer afkomt. Afspoelen met leidingwater. Oplossing 4: 15 à 30 seconden. Afspoelen met leidingwater en met de föhn drogen. Het preparaat wordt onder de microscoop bekeken, eerst met het 5 of 10 objectief om het materiaal op te zoeken en scherp te stellen. Vervolgens wordt er een druppeltje olie op het materiaal gedaan en daarna met het 100 objectief beoordeeld. Indicatie: 1. Fluor: verdenking infectie met Trichomonas vaginalis, Gardnerella vaginalis of Candidiasis vaginalis. 2. Niet op therapie reagerende urethritis bij een man: verdenking trichomoniasis. Biologisch materiaal verzamelen en afleveren: Urethritis / fluor: Dit wordt met een steriele öse afgenomen en gebracht in een druppel fysiologisch zout op een objectglaasje. Hierna wordt dit objectglaasje direct afgedekt met een dekglaasje zodat het preparaat niet kan uitdrogen. Uitvoering: Benodigdheden: zie benodigdhedentabel (blz: 50-53). Meteen onder de microscoop bekijken met het 10 objectief en vervolgens met het 40 objectief. Interpretatie: Interpretatie: Preparaat van: Microscopisch beeld: Kan passen bij: Urethra man Cervi vrouw Fluor vrouw Ulcus genitalia etern / perianaal Gramnegatieve diplokokken intracellulair in groepjes in leucocyten Gramnegatieve diplokokken intracellulair in groepjes in leucocyten Te veel grampositieve staafjes (Lactobacillus) Haemophilus ducreyi (gramnegatieve staafjes in visschoolformatie of Railroadtracks ) Positief gonorroe* Positief gonorroe* Overmatig wasgedrag Ulcus molle Preparaat van: Microscopisch beeld: Kan passen bij: Vagina / urethra Vagina Bewegende eencellige protozoa met flagellen Epitheelcellen vol bacteriën en vage celmembraan (clue cellen) Candida (gisten of pseudohyfen) * Bij verdenking Gardnerella vaginalis kan eventueel een aminetest uitgevoerd worden Trichomonas vaginalis Gardnerella vaginalis (bacteriële vaginose) * Candidiasis (Candida species) * Een positieve uitslag van gonorroe bijvoorkeur ondersteunen met een kweek of PCR

24 11 Plakbandpreparaat 12 Donkerveldpreparaat (fysiologisch zoutpreparaat met prikkelserum) Inleiding: Enterobius vermicularis infecties worden vaak geclusterd gevonden in gezinnen, kleuterscholen en crèches. Met name kinderen kunnen veel hinder ondervinden van een infectie. Na behandeling zal een kind daarom vaak snel een herinfectie oplopen als niet zijn directe omgeving wordt mee behandeld. Indicatie: 1. Peri-anale jeuk 2. Wormpjes (Enterobius vermicularis of aarsmaden) gezien rond de anus, op perineum of op de ontlasting. 3. Verdenking pityriasis versicolor (methyleenblauwpreparaat). Biologisch materiaal verzamelen en afleveren: Met behulp van stukjes transparante plakband (cellotape) materiaal van perianale regio verzamelen. Er moet geen gerasterd Scotch tape doch geheel helder, doorzichtig plakband (cellotape) gebruikt worden. De arts drukt een stuk doorzichtig plakband met de plakzijde op verschillende plaatsen tegen de perianale huid. Vervolgens wordt het plakband op een objectglas geplakt. Parasitologisch faeces onderzoek op oyuren is onbetrouwbaar. Indicatie verdenking lues: 1. Ulcus genitaal of perianaal (oraal niet specifiek, wegens mond spirocheten (commensaal). 2. Eantheem verdacht voor lues stadium II. 3. Condylomata lata. Biologisch materiaal verzamelen en afleveren: Spirochaeten zijn zeer besmettelijk. Zowel bij het afnemen van het materiaal als bij het bekijken van de preparaten handschoenen dragen. Afname prikkelserum van ulcus: Ulcus goed schoonmaken: met een in fysiologisch zout gedrenkt gaasje enkele malen hard over de bodem te wrijven. Daarna met öse de bodem uitkrabben, wachten op het prikkelserum dat dan verschijnt en dit op een objectglaasje in een druppel fysiologisch zout brengen, waarna een dekglaasje over de druppel wordt gebracht. Op deze manier worden er drie onafhankelijke glaasjes gemaakt welke direct worden bekeken. Indien het preparaat negatief is maar klinisch er een sterke verdenking is, dan kan er op 2 daaropvolgende dagen een nieuw preparaat gemaakt worden (of neem materiaal voor een PCR af). NB. als een ulcus molle in de differentiaal diagnose staat, vooraf aan het maken van een donkerveld preparaat, het preparaat maken voor onderzoek op Haemophilus ducreyi (ulcus molle). Uitvoering: Benodigdheden: zie benodigdhedentabel (blz: 50-53). Het materiaal beoordelen op oyuren met behulp van de microscoop. Met 10 objectief vergroting screenen en met de 40 objectief verifiëren. Opmerking: bij negatieve uitslag kan een herhaling van het onderzoek gewenst zijn. Interpretatie: Preparaat van: Microscopisch beeld: Kan passen bij: Anus Oyuren (eieren van Enterobius vermicularis Enterobius vermicularis (aarsmaden) 46 47

25 12 Donkerveldpreparaat (fysiologisch zoutpreparaat met prikkelserum) 12 Donkerveldpreparaat (fysiologisch zoutpreparaat met prikkelserum) Uitvoering: Benodigdheden: zie benodigdhedentabel (blz: 50-53). Instellen microscoop voor donkerveld (afhankelijk van microscoop): Voor het aanbrengen van de donkerveldcondensor, de objectiefhoogte afstellen met een "gewoon" preparaat en daarna het objectief 10 voordraaien. Condensor naar beneden draaien, het kleine schroefje rechts, losdraaien en condensor eruit schuiven (trekken). De droge donkerveldcondensor (in de lade van de microscooptafel) erin schuiven en weer vastdraaien met het kleine schroefje rechts (achter de grote schroef). Het te onderzoeken preparaat op de kruistafel leggen en de condensor omhoog draaien tot er beeld verschijnt. 40 objectief voordraaien en met microschroef beeld scherp stellen. Maimale belichting van het materiaal realiseren door de condensorknop op de juiste hoogte te draaien. Bekijken preparaat (handschoenen dragen in verband met besmettelijkheid spirochaeten). De preparaten ( 3 à 4) afzoeken gedurende ± 25 minuten naar spirocheten met 8 a 12 fijne windingen die een kurkentrekkerachtige beweging maken. Bij een vers ulcus zie je ze ook nog een knikkende beweging maken. Interpretatie: Preparaat van: Microscopisch beeld: Kan passen bij: Ulcus, eantheem, condylomata lata Treponema pallidum, spirocheten met 8 a 12 fijne windingen die een kurkentrekker-achtige beweging maken en knikkende beweging. * Ondersteunen met serologie eventueel PCR op spirochaeten. Lues* Herstellen oorspronkelijke instelling van lichtmicroscoop: Glaasjes in de biologische afvalcontainer deponeren. Microscoop en tafel schoonmaken met 70% ethanol of snelwerkend, gebruiksklaar desinfectieschuim. De "gewone" condensor terug plaatsen. Een preparaat op de kruistafel leggen. Het diafragma van de lamphouder dichtdraaien en de condensor omhoog draaien tot een kleine lichtcirkel aanwezig is. De rand van de cirkel moet scherp zijn, dit is te krijgen door de condensor hoger of lager te draaien. Het diafragma van de lamphouder weer geheel opendraaien en de lichtmicroscoop is weer goed afgesteld

26 Tabel 3 Benodigheden Tabel 3 Benodigheden Microscoop + benodigheden KOH-preparaat Tzanck-preparaat snel methyleenblauwkleuring Gram-kleuring fysiologisch zoutpreparaat plakbandpreparaat donkerveldpreparaat Reagentia en oplossingen KOH-preparaat Tzanck-preparaat snel methyleenblauwkleuring Gram-kleuring fysiologisch zoutpreparaat plakbandpreparaat donkerveldpreparaat Microscoop Objectief 4 of 5 Objectief 10 Objectief 40 Objectief 100 (oil) Donkerveld condensor DCD 0,92-0,8 Immersie-olie 518 N (Zeiss, cat nr , 20 ml) 20 % Kaliumhydroide oplossing (KOH 20%) Hemacolor Rapid staining (kleuringskit, Merck, cat. nr ) Fysiologisch zoutoplossing ( 0,9 % natriumchlorideoplossing, apotheek) Gedestilleerd water 1 liter (apotheek) Löffler s methyleenblauwoplossing (Merck, cat.nr , 500 ml) Gram-color modified, phenol-free (kleuringskit, Merck, cat.nr ) 70% ethanol of snelwerkend, gebruiksklaar desinfectieschuim (apotheek) Malinol (Canadabalsam synthetisch of alternatief: nagellak) 50 51

27 Tabel 3 Benodigheden Tabel 3 Benodigheden Overige materialen Handschoenen Plakband (doorzichtig) Föhn Brander (alternatief: Tafel- of handaansteker ) () Tissue Petridish met glazen triangel (alternatief: plastic bakje met twee cockailprikkers) Injectiespuit (1 ml of 2,5 ml) Druppelfles, 50 ml, donker met glazen pipetje (VWR cat.nr of alternatief; bruin glazen flesje met injectiespuit, 1 ml) Objectglaasjes (76 26 mm) KOH-preparaat Tzanck-preparaat snel methyleenblauwkleuring Gram-kleuring fysiologisch zoutpreparaat plakbandpreparaat donkerveldpreparaat Alternatieve reagentia en oplossingen Tzanck-test klassiek, Gramkleuring en KOH Tzanck-oplossing A: May-Grunwald-stockoplossing (Merck, cat.nr , 500 ml) Giemsa-stockoplossing ( Merck, cat.nr , 100 ml) dinatriumwaterstoffosfaatoplossing (Merck, Cat.nr , 1000 ml, stockoplossing. 1/15mol/l= 0,067 M) Kaliumdiwaterstoffosfaatoplossing (Merck, Cat.nr , 1000 ml, stockoplossing. 1/15mol/l=0,067 M) Kalium/natrium fosfaat buffer,0067 M ph 7,2 t.b.v. May-Grunwald-Giemsakleuring 28 ml Kaliumdiwaterstoffosfaat ( KH2PO4) af 72 ml Dinatriumwaterstoffosfaat (Na2HPO4) af 900 ml Gedestileerd water Stel op ph 7,2 Tzanck-oplossing B) 25 ml May-Grunwald-stockoplossing 25 ml Kalium/natrium fosfaat buffer,0,0067 M, ph 7,2 Tzanck-oplossing C) 1 ml Giemsa-stockoplossing 24 ml Kalium/natrium fosfaat buffer, 0,0067 M, ph 7,2 KOH-preparaat Tzanck-test Gram-kleuring Dekglaasjes (24 32 mm of mm) Nageltang of nagelschaar Pincet (stompe punt) Pincet (scherpe punt) Scalpelmesje (nr 21) Gram A: Gram Cristalviolet (Biomerieu, color, cat.nr , 2000 ml Gram B: Lugol-oplossing (apotheek of Merck, cat.nr , 1000 ml) Gram D: Fuchsine N 0,2% oplossing (Boom Meppel, cat.nr , 1000 ml) Gram C: 96% ethanol (apotheek) Scalpelhouder Trechter Spuitfles met water (alternatief: injectiespuit 25 ml) 20 % KOH-oplossing: 50 ml KOH 40 % verdunnen met 50 ml gedestilleerd water Kleurbak type coplin PP met schroefdop (alternatief: urinepotje met schroefdeksel ) Jerrycan (kunststof voor opvangen afval kleurstofoplossing) 52 53

28 Referenties 1. Dekker S.K., Hogewoning A.A., Haan M. de, Staats C.C.G. Atlas dermatomycosen, Diagnostiek en behandeling, Lavrijsen A.P.M., Raaij-Helmer E.M.H. van der, Bergman W., Brouwer A., Douw van der Krap P.F. Microscopie van directe preparaten voor de dermatologische praktijk, Hart T., Shears P. Color atlas of medical microbiology, Vries H.J.C de, Doornum G.J.J. van, Ba C.J. et al. Multidisciplinaire richtlijn seksueel overdraagbare aandoeningen voor de 2e Lijn, Nederlandse Vereniging voor Dermatologie en Venereologie, Folkers E., Oranje A.P. Een snelle diagnostische test (Tzanck-test) ter uitsluiting van herpesvirusinfecties bij blaasjes, blaren en pustels. Ned Tijdschr Gesneeskd 1985: 129: nr

29