New molecular biomarker discovery for diagnosis and prognosis in oral and oropharyngeal cancer Melchers, Lieuwe Jurjen

Transcriptie

1 University of Groningen New molecular biomarker discovery for diagnosis and prognosis in oral and oropharyngeal cancer Melchers, Lieuwe Jurjen IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below. Document Version Publisher's PDF, also known as Version of record Publication date: 2014 Link to publication in University of Groningen/UMCG research database Citation for published version (APA): Melchers, L. J. (2014). New molecular biomarker discovery for diagnosis and prognosis in oral and oropharyngeal cancer [S.l.]: s.n. Copyright Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons). Take-down policy If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim. Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum. Download date:

2

3 Het plaveiselcelcarcinoom van de mondholte en van de orofarynx (OOSCC) zijn twee van de meest voorkomende hoofd-hals plaveiselcelcarcinomen (HNSCC) met ongeveer nieuwe gevallen per jaar wereldwijd. In Nederland worden er ongeveer 1500 nieuwe gevallen per jaar gediagnosticeerd. De belangrijkste prognostische factor is het aan- of afwezig zijn van metastasen (uitzaaiingen) in de lymfklieren in de hals (lymfklierstatus). Metastasen in de hals komen voor in gemiddeld 50% van alle OOSCC patiënten. Echter met de huidige diagnostische beeldvormingstechnieken worden slechts 60-70% van de metastasen ontdekt. Dit komt met name door het missen van micrometastasen, metastasen kleiner dan 3 mm in diameter. Door de suboptimale detectie van metastasen wordt een aanzienlijk aantal patiënten over- of juist onderbehandeld. Overbehandeling is bijvoorbeeld het verrichten van een halsklierdissectie bij een patiënt die een klinische verdenking heeft op metastasen (cn+), maar waarbij na onderzoek van de lymfklieren door de patholoog, geen metastasen worden gevonden (pn0). Dit resulteert in verlies van kwaliteit van leven en toegenomen zorgkosten. Er is sprake van onderbehandeling indien metastasen niet gediagnosticeerd worden (cn0, maar in werkelijkheid pn+), waardoor de patiënt een regionaal recidief of afstandsmetastasen zal ontwikkelen. Dit leidt tot verlies van kwaliteit van leven, kortere overleving en toegenomen zorgkosten. Het is daarom belangrijk om in de primaire tumor betere voorspellers te vinden voor de lymfklierstatus. Een biologisch of moleculair kenmerk van de tumor, zoals de aan- of afwezigheid van een bepaald eiwit of mutatie kan gerelateerd zijn met het biologisch en daarmee klinische gedrag van deze tumor zoals het vormen van metastasen. We noemen dit een tumor biomarker. Er zijn al verschillende histopathologische biomarkers beschreven die zijn geassocieerd met lymfklierstatus maar deze biomarkers tonen wisselende voorspellende waarden en inter-beoordelaar variabiliteit. Indien biomarkers separaat gebruikt worden, hebben ze een matige voorspellende waarde voor het multistep metastaseringsproces in OOSCC. Biomarkers voor het voorspellen van respons op behandeling (zogenaamde prognostische markers) kunnen helpen om de meest optimale behandeling te kiezen voor een specifieke kankerpatiënt. Dit is in toenemende mate van belang aangezien er steeds meer personalized targeted therapy beschikbaar komt voor de behandeling van OOSCC. Hiervoor zijn medicijnen ontwikkeld die gericht zijn tegen een specifiek moleculair target dat aanwezig is in de tumorcel. Doel van deze dissertatie was om nieuwe moleculaire, biologische en histopathologische biomarkers in de primaire tumor te vinden, die een waarde hebben voor het voorspellen van de lymfklierstatus en van de prognose in patiënten met een mondholte- of orofarynxcarcinoom. Deze gegevens kunnen behulpzaam zijn om de behandelkeuze te optimaliseren. Om dit doel te bereiken hebben we een database geconstrueerd met hierin klinisch-pathologische-, therapie- en follow-up gegevens van meer dan 600 patiënten met meer dan 700 tumoren, waarvan tumorweefsel beschikbaar was in de archieven van de afdeling Pathologie van het Universitair Medisch Centrum Groningen. Bij patiënten met een pt1cn0 mondholte carcinoom (OSCC) wordt in het algemeen geen electieve halsklierdissectie uitgevoerd. Echter indien deze patiënten worden gevolgd met watchful waiting (strikte 6-weekse follow-up van de klinische lymfklierstatus), ontwikkelt circa 25% alsnog klinisch detecteerbare lymfkliermetastasen gedurende deze follow-up. De histopathologische biomarker tumor infiltratiediepte heeft een voorspellende waarde voor de lymfklierstatus in OSCC. Tot op heden is echter geen klinisch relevant afkappunt voor de infiltratiediepte vastgesteld. In hoofdstuk 2 is de infiltratiediepte van 212 pt1-2cn0 OSCC gemeten om de optimale afkapwaarde te bepalen als indicatie om een halsklierdissectie uit te voeren. De ware N status (truen status) werd gebaseerd op halsklierdissectie of minimaal twee jaar follow-up (watchful waiting). Er werd aangetoond dat de infiltratiediepte niet alleen verschilde tussen truen0 en truen+ cases, maar infiltratiediepte was ook een onafhankelijke voorspellende factor voor truen+ status. Door middel van ROC-analyse werd een afkapwaarde vastgesteld bij een infiltratiediepte van 4.59 mm. Gebruik van dit afkappunt in de groep van pt1cn0 OSCC resulteerde in een forse toename van correct behandelde patiënten, van 41% tot 76%. Daarom is onze aanbeveling dat een infiltratiediepte van 4 mm (een praktischer afkapwaarde met dezelfde voorspellende waarde), gebruikt moet worden als biomarker met een absolute indicatie voor het verrichten van een halsklierdissectie in pt1cn0 OSCC. Fotodynamische therapie (PDT) is een minimaal invasieve therapie, die gebruikt kan worden voor het behandelen van oppervlakkig groeiende tumoren. Een photosensitizer wordt intraveneus geïnjecteerd en lokaal geactiveerd door de tumor te bestralen met licht van een specifieke golflengte. Hierbij worden zuurstofradicalen gevormd welke tot celdood leiden. Doordat licht slechts beperkt doordringt in weefsel is curatieve behandeling beperkt tot tumoren met 5 mm infiltratiediepte. Er zijn geen vergelijkende studies tussen PDT en chirurgische therapie in OO- SCC uitgevoerd. Daarom is de behandelrespons van 156 OOSCC behandeld met PDT vergeleken met 91 chirurgisch behandelde ct1-2n0 OOSCC met 5 mm infiltratiediepte afkomstig uit onze database in hoofdstuk 3. Het deel tumoren met een complete respons verschilde niet tussen beide groepen. Echter lokale ziekte-vrije overleving na complete respons was langer en de noodzaak tot aanvullende behandeling lager in T2 OOSCC behandeld met chirurgie. Voor de T1 OOSCC verschilden alle uitkomstmaten niet significant tussen PDT en chirurgisch behandelde cases. Deze studie toonde aan dat PDT een effectieve behandelmodaliteit is bij de curatieve behandeling van een subgroep van ct1n0 OOSCC, geselecteerd op basis van een histopathologische biomarker ( 5 mm infiltratiediepte). Dit onderzoek maakt de weg vrij voor het opzetten van een gerandomiseerde studie waarin beide modaliteiten worden vergeleken. In hoofdstuk 4, werd een literatuuroverzicht gegeven van de biologische rol van het epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) in carcinogenese, tumorprogressie, metastasering en overleving van kankerpatiënten. EpCAM is een membraaneiwit dat tot overexpressie gebracht wordt in de meeste carcinomen. In HNSCC wordt EpCAM de novo tot expressie gebracht. Omdat dit eiwit celadhesie-eigenschappen heeft, is de expressie in de primaire tumor onderzocht op as

4 sociaties met de aanwezigheid van lymfkliermetastasen. In de literatuur zijn geen duidelijke associaties beschreven. In andere tumoren wordt EpCAM duidelijk geassocieerd met een beter of juist slechter ziektebeloop. Mogelijk is de rol van EpCAM afhankelijk van de specifieke cellulaire omgeving. Zo zijn er verschillende biologische functies van EpCAM beschreven in vitro: EpCAM is een celadhesie eiwit en een verhoogde expressie kan E-cadherin-gemedieerde celadhesie verstoren, maar EpCAM associeert ook met claudin-7 in een complex welke de adhesiefunctie verstoort en leidt tot proliferatie, cel motiliteit en metastasering. Het co-expressie patroon van deze drie gerelateerde eiwitten zou daarom een betere voorspeller voor lymfklierstatus kunnen zijn dan elk van deze drie markers separaat. In hoofdstuk 5 zijn de co-expressie patronen van EpCAM, E-cadherin en claudin-7 onderzocht in een groep van 227 OOSCC, om vast te stellen of deze patronen een betere voorspeller zijn voor de aanwezigheid van lymfkliermetastasen en regionale recidieven (lymfkliermetastasen die pas na de behandeling gediagnosticeerd worden) dan iedere marker separaat. Expressie werd vastgesteld in zowel het tumorcentrum als in het tumorfront. De co-expressie patronen van E-cadherin, EpCAM en claudin-7 toonden geen betere voorspellende waarde voor de lymfklierstatus dan de separate markers. Als individuele marker waren de afwezigheid van E- cadherin expressie en aanwezigheid van cytoplasmatische EpCAM expressie voorspellend voor de aanwezigheid van lymfkliermetastasen, maar deze voorspellende waarden waren niet onafhankelijk van de huidige klinische stadiëring. Een opmerkelijke bevinding was dat de afwezigheid van claudin-7 in het tumorcentrum een onafhankelijke voorspellende biomarker is voor het ontwikkelen van een regionaal recidief. Deze uitkomsten suggereren dat er geen klinisch relevant modulerend effect is van deze drie markers in OOSCC. Amplificatie van de chromosomale 11q13.3 regio komt frequent voor in HNSCC. Van de verschillende genen gelegen in dit amplicon correleert de expressie van het gen dat codeert voor het Fas-associated death domain (FADD) eiwit het beste met de amplificatiestatus. Overexpressie van FADD zou de tumorcel voordeel kunnen opleveren en daarom de drijvende kracht achter de amplificatie kunnen zijn (de driver mutatie). In hoofdstuk 6 is de expressie van FADD geanalyseerd in 177 grotendeels laat-stadium HNSCC die behandeld waren met chirurgie en postoperatieve radiotherapie. Hoge FADD expressie was geassocieerd met de aanwezigheid van lymfkliermetastasen, en het sneller ontwikkelen van afstandsmetastasen. FADD kan gebruikt worden als biomarker voor patiënten met een hoog risico op ontwikkeling van metastasen op afstand. Hoe FADD deze metastasen veroorzaakt is momenteel niet duidelijk. De aanwezigheid van hoog-risico humaan papilloma virus (hrhpv) in orofarynx plaveiselcelcarcinomen (OpSCC) is een marker voor een langere overall overleving. In verschillende landen wordt een toenemende, maar sterk wisselende incidentie van HPV-geassocieerde OpSCC beschreven. Recent is een gevalideerd tripel detectie algoritme beschreven, welke bestaat uit p16 immunohistochemie, hrhpv-ish en hrhpv-pcr. Dit algoritme detecteert klinisch rele- vante hrhpv infectie in het tumorweefsel. Er zijn echter nog geen complete cohorten getest met dit algoritme. In hoofdstuk 7 werd de prevalentie en voorspellende waarden van hrhpv vastgesteld met behulp van het tripel algoritme in een compleet historisch cohort van OpSCC, gediagnosticeerd in een periode van 16 jaren ( ) in het UMCG (n=193). Ook werd een groep van 176 OSCC getest. HrHPV-positiviteit was een onafhankelijke voorspeller voor langere ziekte-specifieke- en ziekte-vrije overleving. 24% van de OpSCC en <1% van de OSCC was hrhpv-positief. Een duidelijke toename gedurende de studieperiode werd gezien met 13% hrhpv-positieve cases in de eerste helft ( ), toenemend tot 30% hrhpv-positief in de tweede helft ( ). HrHPV kan gebruikt worden als prognostische marker in OpSCC, maar niet in OSCC. Detectietechniek, populatie selectiecriteria en type overlevingsanalyse kunnen de prevalentie en prognostische waarde van hrhpv in OpSCC beïnvloeden. Methylering van specifieke genen wordt gebruikt als biomarker voor diagnose en prognose in glioma en prostaatkanker. DNA methylering is een vorm van epigenetische genexpressie regulering. Hypermethylering leidt tot transcriptionele repressie en hypomethylering leidt tot reactivering van gentranscriptie. Door deze dynamische eigenschappen is methylering een mogelijk kandidaat mechanisme voor de dynamische genregulatie bij de metastasering van OOSCC. In hoofdstuk 8 is er gezocht naar nieuwe gemethyleerde biomarkers met een voorspellende waarde voor lymfklierstatus. Verschillende zoekstrategieën werden gebruikt om kandidaat markers (genen met een CpG eiland en een negatieve associatie met lymfklierstatus) te selecteren uit vier onafhankelijke microarray expressie studies die genen met significant verschillende expressie tussen N0 en N+ HNSCC identificeerden. Alle genen die in meer dan een van de vier studies gevonden waren werden geselecteerd, net als de vijf hoogst geplaatste genen uit de twee genome-wide studies. Verder werden de genen geselecteerd die functionele methylering (verhoogde expressie na behandeling met de demethylerende middelen dac/tsa) in vitro toonden en genen met een associatie met lymfklierstatus in baarmoederhalskanker, zoals eerder in ons lab onderzocht. Als laatste werden vier genen geselecteerd die geassocieerd waren met lymfklierstatus in de literatuur. In totaal werden er 24 genen geselecteerd, allemaal zonder eerder beschreven regulering door methylering. Nog eens vier genen die frequent methylering vertonen in HNSCC literatuur werden meegenomen in de analyse. De 28 genen werden onderzocht op hun voorspellende waarde voor de lymfklierstatus in een groep van 70 OOSCC. Na optimalisatie en screening toonden slechts 2/28 (7%) markers een voorspellende waarde voor lymfklierstatus. MGMT methylering was geassocieerd met pn0 status (p=0,02). DAPK1 methylering was geassocieerd met pn+ status (p=0,008). De twee markers gecombineerd toonden een sensitiviteit (89%) en specificiteit (41%) vergelijkbaar met de gen expressie profielen voor lymfklierstatus. Beide markers zijn eerder beschreven als gemethyleerd in HNSCC. De expressie van genen die het meest verschillend tot expressie komen tussen N0 en N+ cases, zoals vastgesteld in de microarray expressie studies, worden niet gereguleerd door methylering. Hoge expressie van Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) is frequent aanwezig in verschil

5 lende tumoren en heeft een sterke associatie met een slechte prognose. Ondanks de aanwezigheid van EGFR expressie in >95% van HNSCC, ondervindt slechts 10-16% van de patiënten voordeel van therapie gericht tegen het EGFR molecuul. EGFRvIII is een veelvoorkomende mutant van EGFR, met een deletie van exon 2-7. Expressie van EGFRvIII kan in het algemeen niet direct onderscheiden worden van de wildtype EGFR. Het verkorte EGFRvIII eiwit is continu actief en wordt niet goed afgebroken. EGFRvIII expressie is geassocieerd met een agressief fenotype en resistentie tegen chemo- en radiotherapie. De aanwezigheid van EGFRvIII is beschreven in HN- SCC en daarom zou EGFRvIII een biomarker kunnen zijn voor behandelrespons in HNSCC. Om de klinische relevantie van EGFRvIII als biomarker te onderzoeken, hebben we de prevalentie van dit eiwit in een grote serie van 531 HNSCC vastgesteld in hoofdstuk 9. Immunohistochemie voor EGFRvIII werd verricht en vergeleken met EGFR en EGFRvIII RNA expressie door middel van specifieke rt-pcrs. Geen van de 531 HNSCC bracht het EGFRvIII eiwit tot expressie. EG- FRvIII draagt daarom niet bij aan het maligne fenotype en is geen geschikte prognostische marker in HNSCC. De expressie welke wordt gerapporteerd in enkele kleine studies is waarschijnlijk veroorzaakt door immunohistochemische artefacten, die geassocieerd zijn met het gebruik van een streptavidine-biotine detectie methode