'Innate' lymfocyten: nieuwe spelers in immuungemedieerde

Transcriptie

1 FACULTEIT GENEESKUNDE EN GEZONDHEIDSWETENSCHAPPEN Academiejaar 'Innate' lymfocyten: nieuwe spelers in immuungemedieerde protectie versus immuungemedieerde pathologieën. Ulrike NOTTEBAERE Promotor: Prof. Dr. Leclercq Georges Masterproef voorgedragen in de 2 de Master in het kader van de opleiding MASTER OF MEDICINE IN DE GENEESKUNDE

2

3 FACULTEIT GENEESKUNDE EN GEZONDHEIDSWETENSCHAPPEN Academiejaar 'Innate' lymfocyten: nieuwe spelers in immuungemedieerde protectie versus immuungemedieerde pathologieën. Ulrike NOTTEBAERE Promotor: Prof. Dr. Leclercq Georges Masterproef voorgedragen in de 2 de Master in het kader van de opleiding MASTER OF MEDICINE IN DE GENEESKUNDE

4

5 TOELATING TOT BRUIKLEEN

6 VOORWOORD Deze masterproef werd geschreven tijdens het 4 e en 5 e jaar geneeskunde. Ik zou graag mijn promotor Prof. Dr. George Leclercq bedanken voor de hulp tijdens deze masterproef. Hij gaf tips, verbeterde mijn masterproef en ik kon er altijd terecht met vragen.

7 AFKORTINGENLIJST AHR aryl hydrocarbon receptor APC antigen presenterende cel CHILP common' helper 'innate' lymfoïde progenitor CILP common innate' lymfoïde progenitor cnk conventionele 'natural killer' EOMES eomesodermin GATA3 GATA-bindend proteïne 3 ID2 inhibitor van DNA binding 2 IFN interferon IL-7Rα interleukine 7 receptor α keten ILC innate' lymfoïde cel ILC2P ILC2 progenitor LIF leukemie inhiberende factor LPS Lipopolysaccharide LSIG Lin - Sca1 hi ID2 hi GATA3 hi LTi lymphoid tissue inducer NK natural killer' OVA ovalbumine RA retinezuur RAG recombinatie-activerend gen ROR retinoic acid receptor related orphan receptor' silp lamina propria van dunne darm STAT signal transducer and activator of transcription' TCF-1 T cel factor 1 TH TLR TSLP WT T helper toll like receptor thymisch stromaal lymfopoëtine wild type

8

9 INHOUDSTAFEL Toelating tot bruikleen... i Voorwoord... i Afkortingenlijst... iii 1 Abstract Inleiding Methodologie Resultaten Ontdekking ILCs Verschillende subpopulaties en vergelijking met T helper subpopulaties Groep 1 ILCs Groep 2 ILCs Groep 3 ILCs De rol van verschillende transcriptiefactoren in de differentiatie van ILCs ID Voorlopercellen TOX NFIL GATA TCF RORα RORγt T-bet AHR Rol van ILCs bij immuun-gemedieerde protectie... 27

10 4.4.1 Groep 1 ILC Groep 2 ILC Groep 3 ILC Rol bij immuun-gemedieerde pathologie De ziekte van Crohn Allergieën Obesitas Psoriasis Discussie Referentielijst... 39

11 1 ABSTRACT Onlangs werd een nieuwe soort innate immuuncellen ontdekt die afkomstig zijn van de common lymfoïde progenitor. Ze hebben geen receptoren die ontstaan door somatische recombinatie zoals B en T cellen. Men noemt deze cellen innate lymfoïde cellen (ILCs). Ze spelen een rol in de vroege respons tegen infectie, in de modulatie van het adaptieve immuunantwoord, in de ontwikkeling van lymfoïd weefsel, en in het herstel en de homeostase van weefsels. Men verdeelt deze ILCs in 3 groepen op basis van de verdeling van T helper (TH) populaties: groep 1, 2 en 3 ILCs. Ze zijn allemaal afhankelijk van ID2, een transcriptionele inhibitor van DNA binding, voor hun ontwikkeling. ID2 onderdrukt de transcriptie van E proteïnen die nodig zijn voor T en B cel differentiatie en geeft zo de voorkeur aan het ontwikkelen van ILCs. Groep 1 ILCs produceren interferon (IFN)-γ, een type 1 cytokine die mononucleaire fagocyten stimuleert. Er zijn cytotoxische ILC1s die eomesodermin (EOMES) tot expressie brengen. Dit zijn conventionele natural killer (cnk) cellen. Ze induceren apoptose in de aangevallen cellen door het loslaten van granules met perforine en granzyme. Niet-cytotoxische ILC1s zijn afhankelijk van T-bet voor hun differentiatie en produceren IFN-γ na stimulatie met IL-12 en IL-15. Groep 2 ILCs produceren type 2 cytokines (IL-5 en IL-13.) Ze dragen bij tot de afweer van parasitische helminth infecties. Ze zijn ook betrokken in het herstel van beschadigd respiratoir weefsel na acute infectie. Voor hun ontwikkeling zijn GATA3, RORα en T cel factor 1 (TCF-1) nodig. Ze interageren ook met CD4 + TH cellen zowel via cytokines als via antigenpresentatie door MHC klasse II moleculen. Groep 3 ILCs produceren IL-17 en/of IL-22 en zijn overwegend aanwezig in mucosaal weefsel. Ze zijn betrokken in de immuniteit tegen bacteriën zoals vb. Citrobacter rodentium. ILC3s interageren net als ILC2s met CD4 + TH cellen. Ze hebben voor hun ontwikkeling RORγt nodig, en blijven RORγt tot expressie brengen in een matuur stadium. Bij de ILC3s horen ook de lymphoid tissue inducer (LTi) cellen. Zij zijn cruciaal voor de formatie van secundaire lymfoïde organen tijdens de embryogenese. Ze initiëren de ontwikkeling van lymfoïd weefsel door de activatie van lokale stromale cellen. Ze produceren ook IL-17 en IL-22 na stimulatie en zouden dus ook een rol kunnen spelen in de activatie van de adaptieve immuniteit. Er bestaat ten slotte een groep ILCs die beschikken over een zekere plasticiteit en zich dus zowel als ILC1 en als ILC3 kunnen ontwikkelen. Dit wordt zowel gevonden in muis als mens. 1

12 ILCs hebben ook een invloed op bepaalde ziektebeelden. Bij de ziekte van Crohn is er een gestegen aantal ILC1s en een gestegen aantal ILC3s, die wel minder IL-22 produceren. Dit zou kunnen wijzen op een rol voor ILCs tijdens de pathogenese van de ziekte van Crohn. Bij allergieën zijn het vooral ILC2s die een rol spelen. Zonder ILC2s is de aangeboren respons tegen allergenen namelijk verzwakt. Ook in obesitas zijn het ILC2s die een rol spelen. Hier zorgen ze echter wel voor een beschermende factor. Ze verbruinen namelijk het vetweefsel, wat zorgt voor extra calorieverbruik. Als laatste bespreken we de rol van ILCs in psoriasis. In de huid van psoriasispatiënten bevindt zich namelijk een grotere fractie ILC3s en een kleinere fractie ILC2s in vergelijking met de huid van controlepersonen. Dit wordt beïnvloed door de behandeling. Zowel na behandeling met topische producten als na behandeling met anti-tnf antilichamen daalt de fractie ILC3s. Dit alles samen zou kunnen zorgen voor nieuwe therapeutische doelwitten bij bepaalde aandoeningen. 2

13 2 INLEIDING Om infecties te bestrijden, beschikt het lichaam over verschillende afweermechanismen. Als eerste vormen de huid en mucosale oppervlakten een fysische en chemische barrière tegen micro-organismen. Als pathogenen toch door de barrière geraken, worden ze aangevallen door het immuunsysteem. Als eerste reactie op een infectie is er het innate immuunsysteem. Een heel snel systeem dat niet verandert en dat de meeste infecties heel snel kan stoppen. Dit kan doordat cellen van het innate systeem verschillende patroonherkenningsreceptoren tot expressie brengen. Patroonherkenningsreceptoren binden met pathogeen geassocieerde moleculaire patronen, moleculaire structuren die voorkomen op het oppervlak van pathogenen, en initieert innate immuniteit. De belangrijkste elementen van het innate systeem zijn: proteïnen zoals mannosebindend lectine die niet-covalent binden op het oppervlak van pathogenen, proteïnen zoals complement die covalent binden op het oppervlak van pathogenen, fagocyten die pathogenen capteren en doden, mastcellen die het lokaal immuunantwoord versterken en ten slotte cytotoxische cellen die virus-geïnfecteerde cellen doden. We hebben ook een extra verdediging: de adaptieve immuniteit, die helpt als het innate immuunstelsel de infectie niet snel kan klaren en bestaat uit T en B lymfocyten die over antigen-specifieke receptoren beschikken. Er zijn dus heel veel verschillende T en B lymfocyten met een heel grote variatie aan receptoren. Die grote variatie ontstaat doordat T en B lymfocyten beschikken over recombinatie-activerende genen (RAGs), die een belangrijke rol spelen in het herschikken en recombineren van de genen van immunoglobulines en T cel receptoren. Het adaptieve immuunsysteem is trager dan het aangeboren immuunsysteem omdat cellen met de juiste specifieke receptor tijd nodig hebben om zich te vermenigvuldigen. Bij een tweede infectie kan het adaptieve immuunsysteem wel sneller reageren door langlevende geheugen B en T lymfocyten. (1) Naast de indeling innate en adaptief immuunsysteem bestaat er een tweede manier om het immuunsysteem in te delen, namelijk op basis van differentiatie. Alle immuuncellen zijn afkomstig van een hematopoëtische stamcel. Uit die stamcel ontstaan er 3 verschillende voorlopercellen: de erythroïde megakaryocyte progenitor die de voorloper is van rode bloedcellen en bloedplaatjes, de myeloïde voorloper waaruit granulocyten, monocyten en mastcellen ontstaan, en ten slotte de lymphoïde progenitor waaruit B-cellen ontstaan en een natural killer /T-cel progenitor, die de 3

14 voorloper is van T en NK-cellen. Het immuunsysteem bestaat dus uit myeloïde cellen en lymfoïde cellen. (1) Uit de myeloïde voorloper ontstaan onder andere granulocyten, monocyten en mastcellen. Granulocyten hebben cytoplasmatische granules die reactieve stoffen bevatten die micro-organismen doden en de inflammatie in gang zetten. Er bestaan 3 soorten granulocyten: neutrofielen, eosinofielen en basofielen. Neutrofielen capteren en elimineren micro-organismen, en behoren dus tot de fagocyten. Ze activeren ook de innate immuniteit en ze zijn heel kortlevend. Eosinofielen zorgen voor afweer tegen helminthen en andere parasieten. Basofielen werken ook tegen parasieten, maar zijn zeldzamer. Ook monocyten zijn myeloïde cellen. Monocyten zijn leukocyten die in het bloed circuleren. Ze migreren naar weefsels, waar cytokines worden geproduceerd en differentiëren daar tot macrofagen. Macrofagen zijn fagocyten die een langere levensduur hebben dan neutrofielen. Ze secreteren bovendien cytokines die neutrofielen en andere leukocyten aantrekken. Dendritische cellen ontstaan ook uit monocyten, maar hebben een andere functie dan macrofagen. Ze bevinden zich overal in het lichaam, capteren antigenen, en presenteren die aan T cellen in de lymfoïde organen. Hierdoor wordt het adaptieve immuunsysteem geactiveerd. Mastcellen zijn aanwezig in oppervlakkige weefsels en binden antigen-specifieke IgE antilichamen op hun celmembraan. Als IgE antilichamen binden met specifieke antigenen zorgen ze voor degranulatie van de mastcel. Hierbij wordt histamine en andere eiwitten vrijgesteld en wordt het lokaal immuunantwoord versterkt door andere cellen van het immuunsysteem aan te trekken. (1) Bij de lymfoïde cellen onderscheidt men ook verschillende types. B lymfocyten hebben een specifieke B cel receptor en zorgen voor humorale immuniteit. B cellen differentiëren in plasmacellen. Plasmacellen maken specifieke antilichamen aan, immunoglobulines, die binden aan antigenen. Dit leidt tot verschillende reacties: neutralisatie, opsonisatie, activatie van het complementsysteem en celgemedieerde toxiciteit. Geheugen B cellen blijven na het eerste immuunantwoord zeer lang leven, waardoor ze bij een 2 e aanval snel en adequaat kunnen reageren. T lymfocyten hebben een specifieke T cel receptor en matureren in de thymus. Er bestaan 3 types T lymfocyten: cytotoxische T cellen (CD8 + ), helper T (TH) cellen (CD4 + ) en geheugen T cellen. Cytotoxische T cellen vernietigen niet-lichaamseigen cellen: getransplanteerde cellen, geïnfecteerde cellen, tumorcellen,... Er zijn 3 subpopulaties helper T cellen: TH1, TH2 en TH17. TH1 4

15 cellen secreteren IL-2 en IFN-γ, en helpen met cellulaire immuniteit. TH2 cellen secreteren IL-4, IL-5 en IL-13, en interageren vooral met B-cellen om te helpen met humorale immuniteit. De TH17 cellen ten slotte secreteren vooral IL-17 en IL-22, hebben pro-inflammatoire eigenschappen en helpen met de immuniteit tegen extra-cellulaire pathogenen. NK-cellen zijn een derde type lymfoïde cellen: dit zijn ook cytotoxisch lymfocyten, maar zijn geen T cellen. Zij behoren, in tegenstelling met B en T lymfocyten, tot het innate immuunsysteem. Ze secreteren ook cytokines, namelijk IFN-γ. (1) Onlangs werd een nieuwe soort innate immuuncellen ontdekt die afkomstig is van de lymfoïde progenitor. Ze hebben geen receptoren die ontstaan door somatische recombinatie, ze hebben geen myeloïde of dendritische cel merkers, en ze hebben een lymfoïde morfologie. Deze cellen zijn niet-cytotoxische innate lymfoïde cellen (ILCs). Deze ILCs bevinden zich vooral in mucosale oppervlakten en de huid. Ze spelen een rol in de vroege respons tegen infecties, in de modulatie van het adaptieve immuunantwoord, in de ontwikkeling van lymfoïd weefsel, en in het herstel en homeostase van weefsels. (2, 3) In deze thesis zal een grondig literatuuroverzicht worden gegeven van deze innate lymfoïde cellen en hun rol in het immuunsysteem. Eerst worden de verschillende subpopulaties, hun fenotype, de aanwezige transcriptie factoren en gesecreteerde cytokines besproken. Dit wordt zowel besproken voor muis als voor mens. Hierbij wordt een vergelijking gemaakt met T helper subpopulaties. Vervolgens wordt hun rol in immuun-gemedieerde protectie besproken. Tot slot wordt de invloed van innate lymphocyten bij verschillende ziektes besproken. 5

16 3 METHODOLOGIE Om een globaal inzicht te krijgen in het onderwerp werden eerst reviews gezocht. Daarvoor werd gezocht op pubmed met de volgende zoekterm: Innate lymphoid cells. Daaruit kwamen te veel resultaten, daarom werden er een aantal filters ingesteld. In plaats van te zoeken in all fields werd enkel gezocht in title. Ook werd de filter aangezet om enkel reviews te bekomen. Daaruit kwamen 49 artikels waarvan op basis van titel en abstract 11 artikels werden geselecteerd. Om de inleiding te schrijven, werd gebruik gemaakt van de cursus Infectie en afweer uit 1 e bachelor geneeskunde gedoceerd door Prof. Dr. B. Vandekerckhove en het bijhorende handboek The Immune System van Peter Parham. Vervolgens werd gezocht op pubmed met de volgende zoekterm: Innate lymphoid cells [title/abstract] AND subsets [title/abstract]. Daaruit kwamen 94 artikels waarvan er 23 werden geselecteerd op basis van titel en abstract. Om daarna elke subset apart op te zoeken, werd eerst gezocht met de zoekterm ILC1. Daaruit kwamen 23 artikels waaruit 3 extra artikels werden geselecteerd die nog niet in de vorige selectie zaten. Als tweede werd gezocht met de zoekterm ILC2. Daaruit kwamen te veel resultaten waardoor NOT review werd toegevoegd. Hieruit kwamen 76 artikels waarvan er 17 werden geselecteerd op basis van abstract. Als laatste zoekterm werd ILC3 NOT review ingevoerd in pubmed. Daaruit kwamen 29 artikels waarvan 8 geselecteerd op basis van abstract. Via de referenties van het artikel van H. Spits et al.(3) over de nomenclatuur werden ten slotte 2 artikels bekomen die werden gepubliceerd vóór de naam innate lymphoid cell werd gebruikt, en dus onvindbaar waren via pubmed met de gebruikelijke zoektermen. Na het lezen van de artikels werd uiteindelijk besloten om 43 artikels te includeren. 6

17 4 RESULTATEN 4.1 ONTDEKKING ILCS Innate lymfoïde cellen zijn een familie van cellen die ontwikkelen via dezelfde ontwikkelingspathway. Ze werken mee aan immuniteit, weefselontwikkeling en remodellering. Ze hebben 3 gemeenschappelijke kenmerken: geen RAG afhankelijk herschikte antigen receptor, geen myeloïde en dendritische cel merkers en een lymfoïde morfologie. ILCs brengen toll-like receptoren (TLR) en IL-1R tot expressie, wat wil zeggen dat ze rechtstreeks de aanwezigheid van microbiële producten en inflammatoire signalen detecteren.(3, 4) De prototypes (die als eerste werden ontdekt in respectievelijk 1975 en 1997) zijn natural killer (NK) cellen en lymphoid tissue inducer (LTi) cellen. NK cellen staan in voor het vroege immuunantwoord tegen virussen en zijn betrokken in het immuunantwoord tegen kankercellen. LTi cellen zijn betrokken in de vorming van lymfeknopen tijdens de embryogenese. NK cellen en LTi cellen hebben dus een verschillende functie maar hebben allebei de algemene cytokine receptor γ-keten (IL-2Rγ) en de transcriptionele inhibitor van DNA binding 2 (ID2) nodig voor hun ontwikkeling. Deze worden verder besproken bij de ontwikkeling en differentiatie van ILCs. Recent werden verschillende andere innate lymfoïde cel (ILC) populaties geïdentificeerd die ook afhankelijk zijn van IL-2Rγ en ID2 voor hun ontwikkeling. Ze zijn afhankelijk van signalering door interleukine-7 receptor α-keten (IL-7Rα). Deze verschillende ILC populaties hebben cytokinesecretiepatronen die overeenkomen met de cytokinesecretiepatronen van T helper cellen en daarom werd voorgesteld om hun nomenclatuur op de T helpercellen te baseren. (3) Als voorbeeld bespreken we hier de ontdekking van NK22 cellen. Voor de ontdekking van ILCs waren er 2 soorten NK cellen bekend: CD56 dim NK cellen in het bloed die zorgen voor de lyse van cellen en CD56 bright NK cellen in de lymfeknopen die IFN-γ produceren om samen met dendritische cellen en T cellen de adaptieve respons in gang te zetten. Die zijn allebei NKp44 - NK cellen. Cella beschreef in 2009 een NK cel die NKp44 + is en die zich bevindt in mucosa geassocieerd lymfoïd weefsel, vb in de tonsillen en de Peyerse platen. Deze NKp44 + NK cellen zijn niet cytotoxisch en produceren geen IFN-γ zoals de gekende NK cellen. Ze produceren wel IL22 (zorgt voor mucosale 7

18 defensie), IL26 en leukemie inhiberende factor (LIF) (zorgen voor de activatie van epitheliale cellen). Daarom werden ze NK22 cellen genoemd. Nu worden deze NK22 cellen ingedeeld bij groep 3 ILCs, die verderop worden besproken. (3, 5) Net zoals in dit vorig voorbeeld werden eindeloos veel verschillende namen voor nieuw ontdekte ILCs gebruikt. Spits et al. (3) stelde een classificatie voor op basis van hun fenotype en hun functionele karakteristieken. De nomenclatuur is gebaseerd op TH cel nomenclatuur. Groep 1 bestaat uit ILCs die IFN-γ produceren. Groep 2 bestaat uit ILCs die type 2 cytokines produceren (inclusief IL-5 en IL-13) en die afhankelijk zijn van GATA-bindend proteïne 3 (GATA3) en retinoic acid receptor related orphan receptor α (RORα) voor hun ontwikkeling en functie. Groep 3 bestaat uit alle ILC subtypes die IL-17 en of IL-22 produceren en afhankelijk zijn van RORγt voor hun ontwikkeling en functie. Deze laatste groep is anders genoemd dan bij TH cellen, hun namen zijn afhankelijk van de cytokines die ze produceren, om verwarring te vermijden. Groep 3 ILCs kunnen namelijk zowel IL-17 of IL-22 alleen of beide cytokines samen produceren en kunnen ook het TH1 geassocieerde cytokine IFN-γ en het TH2 geassocieerde cytokine IL-13 produceren. (3) 4.2 VERSCHILLENDE SUBPOPULATIES EN VERGELIJKING MET T HELPER SUBPOPULATIES Groep 1 ILCs Groep 1 ILCs brengen de transcriptiefactor T-bet tot expressie en produceren type 1 cytokine IFN-γ, een potente stimulator van mononucleaire fagocyten voor antimicrobiële activiteit die effectief intracellulaire infecties controleert. Er zijn momenteel 3 groepen beschreven: IL-7Rα - conventionele NK (cnk) cellen, intra-epitheliale ILC1s en ex-rorγt + ILC3s. De laatste zijn afkomstig uit de ILC3 cellijn, maar zijn fenotypisch moeilijk te onderscheiden van ILC1s. Ze worden verder besproken bij groep 3 ILCs. Deze groepen zijn allemaal NKp46 +. cnk cellen zijn eomesodermin (EOMES) + RORγt-fate map (fm) -, ex-rorγt + ILC3s zijn EOMES - RORγt-fm + en de intra-epitheliale ILC1s zijn EOMES - RORγt-fm -. Een cel die RORγt-fm + is, heeft ooit tijdens de differentiatie RORγt tot expressie gebracht. De transcriptiefactoren die nodig zijn voor het ontwikkelen van deze NKp46 + EOMES - RORγt-fm - ILCs werden onderzocht en men vond hoge levels van Tbx21 (het gen dat codeert voor T-bet), Gata3 en Nfil3. In Tbx21 -/- muizen zijn er geen ILC1s en ook ILC3s hebben T-bet nodig voor hun differentiatie in NKp46 + ILC3s. Contrasterend 8

19 ontwikkelen intestinale cnk cellen wel en zijn zelf overgerepresenteerd in Tbx21 -/- muizen. Muizen deficiënt voor RORγt ontwikkelen cnk cellen en ILC1s maar geen NKp46 + ILC3s. Bij Eomes -/- muizen ontbreken alle cnk cellen, maar ze hebben wel een normale ontwikkeling van ex-rorγt + ILC3s en intra-epitheliale ILC1s. Bij Nfil3 -/- muizen ontbreken ook alle cnk cellen, en daarenboven is er ook een verminderde aanwezigheid van ILC1s en NKp46 + ILC3s. Deletie van Gata3 in NKp46 + cellen resulteert in de afwezigheid van intestinale ILC1s, maar cnk cellen en ILC3s zijn niet aangetast. (6-9) In het beenmerg bevinden zich ook NKp46 + NK1.1 + IL-7Rα + RORγt-fm - cellen die vroeger werden beschouwd als immature NK cellen. Nu wordt duidelijk dat dit ook een heterogene groep is, er kan namelijk een EOMES - en een EOMES + groep worden onderscheiden. EOMES - RORγt-fm - cellen hebben geen potentieel om te ontwikkelen in cnk of RORγt-fm + cellen maar blijven stabiel ILC1s. De EOMES + RORγt-fm + cellen differentiëren enkel in cnk cellen en niet in de andere 2 subsets. Als men EOMES - RORγt-fm - cellen in alymfoïde muizen transfereert, ontwikkelen zich enkel ILC1s. Dit bevestigt dus dat NK46 + NK1.1 + EOMES - RORγt-fm - cellen in het beenmerg voorlopers zijn van ILC1s. (6) cnk cellen cnk cellen zijn cytotoxische ILCs die door de loslating van granules met perforine en granzyme apoptose induceren in de aangevallen cellen. cnk cellen zijn IL-7Rα - in tegenstelling tot alle andere ILCs. cnk cellen (NKp44-) worden geactiveerd door IL-12 en IL-15. cnk cellen worden vaak ingedeeld bij groep 1 ILCs, maar ze vervullen slechts deels de criteria voor groep 1 ILCs want ze zijn niet afhankelijk van T-bet. Ze zijn ook niet afkomstig van de common helper-like innate lymphoïde progenitor (CHILP) wat indiceert dat cnk cellen differentiëren uit een andere cellijn. Ook GATA3, dat nodig is voor de differentiatie en het onderhoud van verschillende IL-7Rα + ILC cellijnen, is niet nodig voor cnk cellen. cnk cellen worden dus best beschouwd als cytotoxische ILCs, die gescheiden ontwikkelen van de cytokine-producerende helper-like ILCs. (5, 6) ILC1s en cnk cellen hebben wel functionele gelijkenissen: ze produceren allebei IFN-γ en ze expresseren allebei T-bet en gemeenschappelijke celoppervlaktemerkers zoals NKp46 en NK1.1. cnk cellen zijn wel cytotoxischer dan ILC1s. Mature cnk cellen zijn afhankelijk van de 9

20 transcriptiefactor EOMES en ILC1s niet. Immature cnk cellen hebben echter nog geen EOMES expressie en delen veel merkers met ILC1s. Het onderscheid met ILC1 kan niet worden gemaakt via CD127 en CD27, wel via de expressie van Eomes, Itgam (codeert voor CD11b (integrin αm) en leden van de Klra familie (receptoren van de Ly49 familie.) In pathologische condities, met vb. IL-15 en/of IL-2 inductie worden de fenotypische en functionele gelijkenissen groter tussen ILC1s en cnk cellen. Het is nog steeds niet helemaal duidelijk of ILC1s en NK cellen 2 totaal verschillende cellijnen betreffen. (2) ILC1s In het onderzoek van Fuchs et al. (7) werden intra-epitheliale ILC1 cellen onderzocht. Men isoleerde CD56 + cellen uit de menselijke tonsil mucosa. Ze werden geanalyseerd voor NKp44, CD103 en CD3. In de cellen die CD3 - zijn, worden 2 groepen geïdentificeerd: NKp44 + en NKp44 -. De NKp44 + groep kan verder worden onderverdeeld in CD103 + en CD De NKp44 - groep is bijna volledig CD De NKp44 + CD103 - groep produceert IL-22 na stimulatie met IL-23, dus die behoren tot de ILC3s. NKp44 + CD103 + en NKp44 - CD103 - produceren IFN-γ na stimulatie met IL-12 en IL-15, dus zij behoren tot groep 1 ILC. IL-18 stimulatie leidt niet tot IFN-γ productie wat hen onderscheidt van conventionele NK cellen. Ze produceren niet alleen IFN-γ maar ongeveer 50% van deze cellen bevat ook perforine en granzymes, wat wijst op cytotoxische activiteit. NKp44 + CD103 + ILC1s hebben ook andere intra-epitheliale merkers zoals CD160 en CD101, wat wijst op een intra-epitheliale locatie. Hun integrine profiel komt overeen met weefsel residente geheugen CD8 + T cellen terwijl dit wel verschilt bij NKp44 + CD103 - ILC3s en NKp44 - CD103 - ILC1s. Intraepitheliale ILC1s (NKp44 + CD103 + ILC1s) hebben TGF-β nodig om CD103 tot uiting te blijven brengen, wat doet vermoeden dat TGF-β de adhesie aan epitheel bevordert. (7) Na cultuur met IL-2 en IL-15 ontstaan slechts een aantal NKp44 + CD103 + ILC1s uit bloed NK-cellen. Dit suggereert dat intra-epitheliale ILC1s een andere ontwikkelingspathway hebben dan conventionele NK cellen. Om inzicht te krijgen in die pathway werd de expressie van verschillende transcriptiefactoren vergeleken. Zowel NKp44 + CD103 + als NKp44 - CD103 - cellen brengen T-bet en EOMES tot expressie, die ook nodig zijn voor de ontwikkeling en functie van conventionele NK cellen, maar niet RORγt of AHR, die ILC3 differentiatie bevorderen. (7) Men zocht vervolgens de tegenhanger van de humane intra-epitheliale ILC1s bij muizen. Dit kan niet met NKp44, want NKp44 wordt enkel tot expressie gebracht in mensen, en ook CD103 blijkt 10

21 niet adequaat te zijn, want deze wordt bijna niet gedetecteerd in CD3 - intra-epitheliale cellen. CD160 blijkt daarentegen wel een ideale merker, die wordt namelijk niet tot expressie gebracht in milt NK cellen in steady state en er wordt een onderscheidbare populatie van CD160 + NKp46 + NK1.1 + cellen gevonden intra-epitheliaal bij Rag1 -/- muizen. Deze populatie cellen produceert IFN-γ na stimulatie met IL-12 en IL-15, wat overeenkomt met hun menselijke tegenhanger. De nood aan bepaalde transcriptiefactoren werd onderzocht met behulp van knock-out muizen. Intra-epitheliale ILC1s ontwikkelen zich in Rorc -/- en Ahr -/- muizen, die geen ILC3s ontwikkelen. Deze cellen zijn daarentegen sterk gereduceerd in Nfil3 of Tbx21 knock-out muizen, wat de belangrijkste regulatoren zijn van NK-cellen. In bacterievrije muizen zijn normale hoeveelheden intra-epitheliale ILC1s aanwezig. Dit wijst erop dat deze cellen meer verwant zijn met NK-cellen dan met ILC3s, en zich ontwikkelen onafhankelijk van intestinale microbiotica. Ook bij muizen is bevestigd dat deze ILC1s een unieke groep zijn apart van conventionele NK cellen. Ze zijn namelijk niet aangetast in Il15ra -/- muizen terwijl conventionele NK cellen dan bijna niet aanwezig zijn. (7) Klose et al. (6) bestudeerden ook type 1 ILCs. Bij muizen vindt men in de NKp46 + NK1.1 + RORγt - cellen 3 groepen: EOMES + cnk cellen, NKp46 + RORγt-fm + ILC3s die RORγt hebben gedownreguleerd ( ex RORγt + ILC3s) en een derde niet-nk, niet-ilc3 NKp46 + T-bet + EOMES - RORγt-fm - ILC populatie. Die derde groep brengt NK cel receptoren tot uiting maar slechts een klein beetje Ly49 receptoren. Ze hebben de hoogste T-bet expressie van de 3 groepen, en ze brengen merkers tot uiting die ook worden gevonden op andere groepen helper-like ILCs zoals IL-7Rα, Thy1 en Kit. Om zeker te zijn dat deze cellen geen immature NK cellen zijn werden ze sterk gezuiverd en in alymfoïde muizen getransfereerd. Na 4 weken zijn die cellen nog steeds stabiele T-bet + EOMES - RORγt-fm - NKp46 + cellen. Dit toont aan dat dit een stabiel ILC groep is, zonder het potentieel om te differentiëren in andere NKp46 + ILC subsets. Deze ILC1s (T-bet + EOMES - RORγt-fm - NKp46 + ) hebben voor hun onderhoud en differentiatie geen IL-7 nodig maar wel IL-15, net zoals cnk cellen. (6) Samengevat zijn ILC1s cellen die voor hun differentiatie T-bet nodig hebben en die na stimulatie met IL-12 en IL-15 IFN-γ produceren. Ze ontwikkelen apart van cnk cellen en zijn te onderscheiden van cnk cellen doordat ze geen EOMES nodig hebben voor hun ontwikkeling. 11

22 4.2.2 Groep 2 ILCs Groep 2 ILCs worden gedefinieerd als ILCs die type 2 cytokines (IL-5 en IL-13) produceren. Type 2 immuniteit is nodig om te reageren op parasitische helminth infecties. Type 2 cytokines zorgen voor het orkestreren van eosinofielen, bekercelhyperplasie, mucussecretie en IgE productie. Deze cytokines zijn afkomstig van het aangeboren en het adaptieve immuunsysteem. Bij het aangeboren immuunsysteem waren tot voor kort enkel basofielen, eosinofielen en mastcellen bekend als bronnen voor type 2 cytokines. Door Neill et al. (10) werden de bronnen van IL13, een belangrijk type 2 cytokine tijdens het antwoord op helmints, onderzocht en werd een innate lymfocyt ontdekt die nuocyt werd genoemd. Nuocyten groeien of differentiëren niet onder invloed van dezelfde cytokines als basofielen en mastcellen, maar hebben IL-33 en IL-7 nodig. Ze hebben ICOS, T1/ST2, IL-17Br en IL-7Rα als oppervlaktemerkers. Alle nuocyten secreteren IL-13 en meer dan 70% van de nuocyten secreteren ook IL-5. Nuocyten en IL-13 zijn nodig om de helminth Nippostrongylus brasiliens uit te roeien en nuocyten zijn in staat om dit te doen zonder een andere bron van IL-13. In RAG2 -/- muizen slagen nuocyten er niet in om wormen te expulseren wat er op wijst dat T cellen nodig zijn voor hun werking. T cellen mediëren verlengde nuocytexpansie, migratie en overleving via tot nog toe onbekende mechanismen. Tijdens andere onderzoeken werden ook andere innate lymfocyten gevonden die type 2 cytokines produceren. Telkens werd een andere naam gegeven: natural helper cells, innate helper 2 cells, Die worden nu allemaal ingedeeld bij de groep 2 ILCs. (2, 3, 10) ILC2 ontwikkeling is, net zoals de andere ILCs, afhankelijk van de transcriptiefactor ID2 en de expressie van IL-2Rγ, maar niet van RAG recombinase. De transcriptiefactoren GATA3 (dat ook nodig is voor de ontwikkeling van TH2 cellen), RORα en T cel factor 1 (TCF-1) zijn nodig voor de ontwikkeling van ILC2s. ILC2s zijn gekenmerkt door de expressie van IL-7R (ook CD127 genoemd), Sca-1 en de IL-33 receptor ST2. ILC2s hebben IL-7 nodig voor hun ontwikkeling. IL-4 is niet nodig hiervoor, maar is wel essentieel om de ILC2 proliferatie te promoten. IL-25 en IL-33, beide geproduceerd door epitheliale cellen, zijn cruciaal voor de inductie en activatie van ILC2s zowel in muizen als mensen. Deze 2 cytokines zijn belangrijk in anti-helminth immuniteit en in allergische inflammatie. ILC2s produceren namelijk type 2 cytokines als antwoord op IL-25, IL-33 en thymisch stromaal lymfopoëtine (TSLP.) Groep 2 ILCs produceren niet alleen IL-5 en IL-13 maar ook IL-6 en IL-9. (2, 3, 10-13) 12

23 Groep 2 ILCs zijn betrokken in het herstel van beschadigd respiratoir weefsel na acute infectie. Dit wordt gemedieerd door de epidermale groeifactor amphiregulin, dat door groep 2 ILCs wordt geproduceerd. Naast hun protectieve eigenschappen zorgen deze cellen ook voor pathologie, vb. virus-gemedieerde allergische astma exacerbatie. ILC2s werken via verschillende pathways. Door de productie van IL-13 induceren ze epitheliale bekercellen om mucus te secreteren en dragen bij tot weefselherstel door amphiregulin te produceren. Door IL-5 en IL-9 te secreteren controleren ILC2s eosinofiele homeostase en mastcel activatie. Ook promoten ILC2s B cellen om antilichamen te produceren en activeren ze CD4 + cellen. ILC2s zijn ook in staat om verschillende andere pro-inflammatoire cytokines te produceren, inclusief IL-3, IL-8, IL-21, GM-CSF en CSF-1. Deze cytokines zouden ook een belangrijke rol kunnen spelen in het orkestreren van type 2 immuniteit. IL-3 kan kritisch zijn voor de groei en de differentiatie van CD34 + progenitor cellen in basofielen en mastcellen, en van monocyten in dendritische cellen. IL-8 is een potent chemokine voor neutrofielen. IL-21 reguleert de rekrutering van neutrofielen en monocyten en is ook betrokken in de pathogenese van allergische afwijkingen en auto-immuun ziektes door de controle van T en B cellen. GM-CSF is kritisch voor de overleving en activiteit van eosinofielen en neutrofielen. Overexpressie van GM-CSF leidt tot allergische sensitatie en luchtweginfectie. (3, 11, 14) Groep 2 ILCs interageren met CD4 + TH cellen. IL-2, die wordt geproduceerd door TH cellen, induceert ILC2 proliferatie en beïnvloedt de ILC2 cytokine productie (vb. meer IL-9). Activatie van ILC2s gaat wel die van TH cellen vooraf. Omgekeerd bespreken we hier de invloed van ILC2s op CD4 + T cellen. ILC2s hebben geen effect op rustende naïeve T cellen, maar na stimulatie met anti CD3/28 CD4 + antilichaam wordt er meer IL-4, IL-5 en IL-13 geproduceerd in de aanwezigheid van ILC2s dan in hun afwezigheid. De productie van IFN-γ verandert niet. Deze invloed is niet via IL-33, maar waarschijnlijk via contact-afhankelijke mechanismen. Dit werd ook onderzocht in een andere studie door Drake et al. (15) Zij onderzochten in een co-cultuur of het ILC2s zijn die CD4 + T cellen beïnvloeden of omgekeerd. IL-4 mrna niveaus zijn hoger in co-cultuur dan in monocultuur in ILC2s (x 13.2) maar niet in CD4 + T cellen. IL-5 mrna niveaus zijn sterk gestegen in CD4 + T cellen (x 29.7) en een beetje in ILC2s (x 2.1). IL-13 mrna is beperkt gestegen in zowel CD4 + T cellen (x 2.6) en in ILC2s (x 1.6). Men onderzocht hoe beide cellen mekaar beïnvloeden. 13

24 Door de 2 groepen cellen te splitsen in een onderste en bovenste kamer werd bewezen dat zonder contact geen van beide groepen worden beïnvloed. Eén van de moleculen die betrokken is, is OX40 ligand dat zich bevindt op ILC2s. OX40 bevindt zich op CD40 + cellen. Bij toevoegen van anti-ox40 ligand antilichaam in de co-cultuur is de IL-4, IL-5 en IL-13 productie verminderd. Er zijn wel nog andere co-stimulators want de cytokine productie is slechts deels geïnhibeerd. IL-4 geproduceerd door ILC2s speelt ook een belangrijke rol in de samenwerking tussen ILC2 en CD4 + T cellen. In een co-cultuur van IL-4 deficiënte ILC2s en wild type (WT) CD4 + T cellen is er een significante vermindering in zowel IL-5 als IL-13 productie in vergelijking met een co-cultuur met WT ILC2s en WT CD4 + T cellen. Ook in vivo werd de samenwerking van ILC2s en CD4 + T cellen bevestigd. In naïve Il7ra -/- muizen die deficiënt zijn voor zowel ILC2s en T cellen werden long ILC2s en CD4 + T cellen van niet gesensitiseerde muizen getransfereerd. Deze muizen werden vervolgens blootgesteld aan ovalbumine (OVA) antigen en bromelain (een cysteine protease) om een antigen-specifiek immuun antwoord te induceren. De grootte van het antwoord na het transfereren van CD4 + T cellen en ILC2s samen is groter dan na een aparte transfer. (15, 16) Bovendien kunnen ILC2s zich ook gedragen als antigen presenterende cellen (APCs). Ze brengen transscripts van MHC klasse II tot uiting, en kunnen in de aanwezigheid van antigen CD4 + T cel proliferatie induceren in de richting van TH2 cellen. Ook zonder MHC klasse II antigen presentatie blijven de TH2 polariserende effecten aanwezig. Verrassend hadden ILC2s ook in een TH1 bevorderend milieu het effect om CD4 + T cellen meer te laten prolifereren in TH2 cellen. Ook in vivo wordt hetzelfde resultaat bereikt: in de aanwezigheid van ILC2 is het aantal T cellen 18 keer hoger in het longweefsel van muizen. Ook werd gevonden dat de aanwezigheid van ILC2s de ontwikkeling van TH2-type antigen-specifieke CD4 + T cellen promoot in vivo na geïnhaleerde antigen blootstelling. Dit allemaal samen wijst erop dat ILC2s naast voor het zorgen voor de eerstelijnsdefensie via type 2 cytokine productie, ook belangrijk zijn voor de inductie van het adaptieve immuun antwoord. (15, 16) Huang et al. (11) ontdekten dat er naast de gewone ILC2s (hier nilc2 genoemd) ook nog een ander type ILC2 cellen bestaat. ST-2 + nilc2 cellen bevinden zich in de longen en andere weefsels en produceren cytokines en expanderen matig na IL-33 stimulatie. Er bestaat een tweede populatie IL-13 producerende ILCs die worden geïnduceerd door IL-25 stimulatie. Deze cellen hebben geen 14

25 ST-2 en brengen grote hoeveelheden KLRG1 tot expressie. Deze cellen worden iilc2s (inflammatoir) genoemd. iilc2s zijn detecteerbaar in naïeve muizen maar expanderen enorm na behandeling met IL-25. Na infectie met N. brasiliensis verschijnen iilc2s na 5 dagen voordat de inductie van TH2 cellen en de populatie-expansie van nilc2s gebeurt. De populatie-expansie van nilc2s is afhankelijk van iilc2s. Dat wijst erop dat iilc2s transiënte progenitors zijn van nilc2-achtige cellen. Een belangrijk verschil tussen nilc2 en iilc2 cellen is dat iilc2 cellen een zekere expressie (tussen die van nilc2 en ILC3) van RORγt hebben. Daarenboven bevinden nilc2s zich enkel in de longen en vet-geassocieerd lymfoid weefsel terwijl iilc2s zich op veel meer plaatsen bevinden. Effector CD4 + helper cellen hebben de mogelijkheid om hun cytokine-producerend fenotype aan te passen als antwoord op verschillende infectieuze uitdagingen. Men onderzocht of iilc2s ook die plasticiteit bezitten. Ze produceren na stimulatie met PMA en ionomycine zowel IL-13 als IL-17. Dat wijst er samen met de expressie van GATA3 en RORγt op dat iilc2s de mogelijkheid hebben om te ontwikkelen in zowel nilc2-achtige cellen als in ILC3-achtige cellen. (11) Groep 3 ILCs Groep 3 ILCs produceren net als TH17 cellen IL-17 en/of IL-22, zijn overwegend aanwezig in mucosaal weefsel en zijn betrokken in gelijkaardige immuniteit (vb. klaring van Citrobacter rodentium). Ze hebben ook allebei RORγt nodig voor hun differentiatie en/of ontwikkeling en hun functie. RORγt deficiënte muizen hebben dus geen groep 3 ILCs en hebben een duidelijke reductie van TH17 cellen. In tegenstelling tot de T helper cellen, die tijdens een matuur stadium RORγt downreguleren, blijft de expressie van RORγt door RORγt + ILCs stabiel. RORγt + ILCs bevinden zich vooral in de intestinale lamina propria. (17, 18) Bij onderzoek van de foetale levercellen worden 3 subsets van RORγt + ILCs gevonden, gekarakteriseerd door de expressie van RORγt en integrin α4β7. Die verschillende subsets worden gegenereerd uit foetale lever RORγt + cellen, en niet uit LTi cellen zoals eerst gedacht. Foetale RORγt + ILCs generen niet de adulte RORγt + ILCs, ze hebben namelijk slechts een halfleven van 22 tot 26 dagen. De adulte RORγt + ILCs komen voort uit een tot hier toe niet bekende precursor uit het beenmerg. Er is een belangrijke populatie verandering na de geboorte in de RORγt + ILCs. c-kit low IL-7Rα low cellen worden veel talrijker dan LTi cellen. Men dacht initieel dat dit afhankelijk 15

26 was van het koloniserende intestinale microbioom, maar dit werd weerlegd doordat bij muizen die onder continue antibiotica behandeling staan die shift ook plaatsvindt. (18) De expressie van NKp44 is het grootste verschil bij de celoppervlaktemerkers tussen tonsil RORC + ILCs en foetale lymfeknoop RORC + ILCs. Tonsil RORC + ILCs brengen NKp44 tot expressie en produceren IL-22. In de tonsillen worden geen IL17A transcripten gevonden. In de foetale lymfeknopen heeft de meerderheid van de RORC + ILCs geen NKp44 expressie. Daar worden dan ook weinig tot geen IL22 transcripten gevonden. Men vindt daar wel IL17a transcripten. Ook intestinale ILCs tonen hetzelfde. NKp44 + ILCs transcriberen IL22 terwijl NKp44 - ILCs heel lage hoeveelheden van IL22 transcripten bevatten. De adulte lymfeknopen werden ook onderzocht. Daar worden geen IL17a en IL22 transcripten gevonden, wat er op wijst dat daar geen actieve transcriptie plaatsvind. Na in vitro stimulatie met PMA en ionomycin kunnen wel detecteerbare levels (ELISA met detectielimiet = 31 pg/ml) van IL-22 gevonden worden, maar geen IL-17A. Dit leidt tot de hypothese dat secundaire lymfoïde organen een reservoir zijn voor ILCs die kunnen deelnemen aan inflammatoire responsen in een antigen onafhankelijke manier. (19) LTi cellen LTi cellen zijn het prototype van groep 3 ILCs. Ze zijn cruciaal voor de formatie van secundaire lymfoïde organen tijdens embryogenese. Ze initiëren de ontwikkeling van lymfoïd weefsel (lymfeknopen, Peyerse platen en intestinale geïsoleerde lymfoïde follikels) door de activatie van lokale stromale cellen. Ze brengen RORγt tot expressie, die ook de expressie van IL-17 in T cellen dirigeert. Ze produceren daarnaast ook IL-17A en IL-22 na stimulatie, waardoor ze ook een rol zouden kunnen spelen in het activeren van de aangeboren immuniteit. (3, 18) Van de Pavert et al. (20) onderzochten de ontwikkeling van secundaire lymfoïde organen, die gebeurt tijdens de embryogenese en afhankelijk is van LTi cellen. Ze onderzochten de invloed van cel-autonome signalering van retinezuur (RA) signalering in utero. RA is een vitamine A derivaat, die bindt aan heterodimeren die DNA binden. Bij muizen zorgt een verminderde inname van RA tijdens de zwangerschap voor een sterke vermindering in LTi cel differentiatie in secundaire lymfoïde organen. Dit gebeurt via een vermindering in Rorgt expressie na het binden van RA heterodimeren stroomopwaarts en in de Rorgt locus. (20) 16

27 IL-22 producerende ILC3s Men noemde de NKp44 + ILC3s ILC22s. ILC22s produceren IL-22, IL-26 en LIF, maar geen IL-17A. IL-22 zorgt voor mucosale defensie door proliferatie en cytokine secretie (IL10) van colon epitheelcellen. ILC22s zorgen voor meer activatie dan IL-22 alleen wat betekent dat ook IL-26, LIF en mogelijks onbekende factoren een belangrijke rol spelen. IL-26 en LIF activeren epitheliale cellen. ILC22s activeren signal transducer and activator of transcription (STAT) 3, dat celoverleving en proliferatie induceert, en ook STAT1. ILC22s induceren ook Bcl-3 en Bcl-6. Bcl-3 interactie met NFκB promoot transcriptie van proliferatieve genen, terwijl Bcl-6 zorgt voor proliferatie via de preventie van terminale differentiatie. ILC22s worden geactiveerd door IL-23, dat aangemaakt wordt door monocyten, dendritische cellen en macrofagen die geactiveerd worden door microbiële stimuli. (3, 5) In mucosa-geassocieerd lymfoïde weefsel in muizen bestaan 2 soorten NKp46 + cellen: NKp46 + NK1.1 + en NKp46 + NK Beide groepen produceren IL-22 na in vitro stimulatie met IL-23. In homeostatische omstandigheden worden er geen IL-22 producerende ILC3s gevonden in de lamina propria of intestinaal epitheel. Na infectie met C. rodentium worden na 6 dagen wel IL-22 producerende ILC3s gevonden in de lamina propria. In RAG-2-deficiënte muizen, die dus geen IL-22 productie van T cellen hebben, vindt men zowel voor als na infectie met C. rodentium IL-22 producerende ILC3s in intestinaal epitheel. (5) Plasticiteit tussen ILC1-ILC3s Bij mensen brengt de ILC1 subset geen KIT (ook CD117) tot expressie. Er zijn wel hoge levels T-bet en lage levels RORγt. De classificatie door IFN-γ productie staat onder discussie omdat er sprake is van plasticiteit tussen ILC1s en ILC3s. Om die plasticiteit te testen werden RORγt + foetale darm NKp44 + ILC3s gekweekt met IL-2 en IL-12. RORγt + foetale darm NKp44 + ILC3s verliezen inderdaad snel de expressie van NKp44 en c-kit wat indiceert dat ze differentiëren in ILC1s na stimulatie met IL-2 en IL-12. IL-12 is dus in staat om RORγt + T-bet dim ILCs te laten differentiëren in IFN-γ producerende RORγt - T-bet hi ILCs. Dit fenomeen is niet typisch voor ILCs want ook bij T cellen bestaat er een verschuiving van IL-17 en IL-22 producerende cellen naar IFN-γ producerende cellen. Ook omgekeerd hebben ILC1s de mogelijkheid om hun transcriptiefactor expressie profiel te veranderen. Bij muizen die deficiënt zijn voor T-bet zijn er weliswaar geen 17

28 NKp46 + groep 3 ILCs die IFN-γ produceren na activatie door IL-12. T-bet reguleert een stijging van IFN-γ en een daling van IL-17 productie. (3, 8) Figuur 1: Cytokines bij de verschillende groepen ILCs. Aan de linkerkant staan de cytokines die de ILCs stimuleren om de cytokines aan de rechterkant te produceren. 4.3 DE ROL VAN VERSCHILLENDE TRANSCRIPTIEFACTOREN IN DE DIFFERENTIATIE VAN ILCS Alle ILCs en adaptieve immuunsysteem lymfocyten komen voort uit de common lymfoïde progenitor (CLP). CLPs zijn Lin - ID2 - IL-7Rα + α4β7 - Flt3 + cellen. De differentiatie van CLP tot de verschillende subgroepen ILCs wordt hier besproken. (6) De verschillende ILC groepen gebruiken transcriptieprogramma s die vroeger al werden geïdentificeerd voor T helper cel populaties. Dit is het geval voor GATA3 (die nodig is voor TH2 cellen en ILC2) en RORγt (die nodig is voor TH17 en ILC3.) Er is wel een belangrijk verschil. Tijdens steady state condities brengen CD4 + T cellen geen GATA3 of RORγt tot uiting. Enkel na het binden van een specifiek antigen met TCR worden deze transcriptiefactoren opgereguleerd. 18

29 ILCs hebben GATA3 en RORγt nodig in de primaire lymfoïde organen, terwijl T cellen wel kunnen ontwikkelen in de afwezigheid van GATA3 en RORγt. (21) Figuur 2: Ontwikkeling ILCs. Dit is een hypothetisch model van de ontwikkeling van ILCs. Alle ILCs zouden ontstaan uit CLP door de expressie van ID2. Er bestaat nog geen zekerheid over het bestaan van een common innate lymfoïd progenitor (CILP), maar wel over de common helper innate lymfoïde progenitor (CHILP). Door verschillende transcriptiefactoren differentieert de CHILP vervolgens in 3 groepen: groep 1 ILCs, groep 2 ILCs en groep 3 ILCs. Doordat NK cellen niet uit de CHILP differentiëren maar wel afhankelijk is van ID2 vermoed men dat er een cel bestaat die als CILP kan worden beschouwd. Tussen groep 1 en groep 3 ILCs bestaat er een zekere plasticiteit ID2 Alle ILCs hebben ID2 nodig voor hun differentiatie. ID2 is de transcriptionele onderdrukker van DNA binding 2 en is lid van de helix-loop-helix familie van proteïnen die belangrijke functies hebben in de immuunceldifferentiatie. ID2 heterodimeriseert met E proteïnen die functioneren als transcriptie activators en onderdrukkers. Hierdoor zijn E proteïnen minder beschikbaar voor DNA 19

30 binding. ID2 wordt sterk geëxpresseerd in alle ILCs terwijl naïve T en B cellen geen of zeer lage hoeveelheden ID2 expresseren. ID2 deficiëntie resulteert in inhibitie van ILC ontwikkeling. (22, 23) Voorlopercellen Men ging in het beenmerg op zoek naar de voorloper van ILCs. In het beenmerg van muizen met een ID2 reporter allel is een groep ID2 + cellen aanwezig die geen merkers van mature hematopoëtische cellen hebben (Lin - ). Lin - ID2 + cellen brengen integrin tot expressie en kunnen verder opgesplitst worden in een CD25 + en CD25 - groep. De CD25 + α4β7 + cellen representeren ILC2 progenitors (ILC2P) die uniform IL-33R tot expressie brengen. Beide groepen brengen IL-7Rα, een receptor die op alle ILCs wordt gevonden (behalve op conventionele NK cellen), tot expressie. Als die Lin - ID2 + IL-7Rα + CD25 - α4β7 + cellen ILC progenitors zijn, mogen ze geen transcriptiefactoren van mature ILCs tot expressie brengen. Ze zijn inderdaad negatief voor RORγt, T-bet en EOMES, en hebben veel lagere niveaus GATA3 dan ILC2s. Om verder te onderzoeken of deze cellen effectief ILC voorlopers zijn, werden Lin - ID2 + IL-7Rα + CD25 - α4β7 + cellen gezuiverd en getransfereerd in alymfoïde muizen. Om te vergelijken deed men hetzelfde met CLPs en ILC2Ps. CLPs genereren Lin + (T en B cellen) en Lin - cellen in alle geteste organen. In muizen waarin ILC2Ps worden getransfereerd, worden enkel GATA3 high ILC2s gevonden, maar geen andere ILC groepen. De cellen afkomstig van Lin - ID2 + IL-7Rα + CD25 - α4β7 + cellen worden enkel gevonden in mucosale organen zoals dunne darm en lever en slechts heel weinig in milt of thymus. Daarenboven worden geen B en T cellen gevonden. Lin - ID2 + IL-7Rα + CD25 - α4β7 + cellen differentiëren in GATA3 + ILC2s, in beenmerg-resident ILC2Ps, in alle bekende RORγt + ILC3 populaties en in EOMES - niet-nk ILC1s. Men noemt deze cellen dus CHILP. (6, 21) Ook Constantinides et al.(24) ontdekten een ILC precursor in muis foetale lever en volwassen beenmerg. Die precursor is Lin - IL-7Rα + ckit + α4β7 high PLZF high. Transcriptionele analyse toont dat deze PLZF high cellen beschikken over de volgende transcriptiefactoren: ID2, GATA3 en RORα die nodig zijn voor ILC2 ontwikkeling, en Tcf7 die nodig is voor ILC2 en ILC3. Ze brengen ook grote hoeveelheid TOX tot expressie, wat nodig is voor de ontwikkeling van NK en LTi cellen. Er zijn ook lage maar detecteerbare hoeveelheden Tbx21 en RORC, transcriptiefactoren geassocieerd met ILC1 en ILC3, aanwezig. LTi en NK zijn weliswaar niet afhankelijk van PLZF voor hun ontwikkeling. Hun voorloper is ook Lin - IL-7Rα + ckit + α4β7 high. (24) 20

31 Yu et al. (25) vonden voorlopers die kunnen differentiëren in alle ILC subtypes bij muizen: NK cellen, niet-nk ILC1s, ILC2s en ILC3s: CXCR6 + αlp cellen. CXCR6 + αlp cellen differentiëren in alle ILCs inclusief NK cellen en niet in T en B cellen. We noemen deze cellen verder common innate lymfoïde progenitors (CILP). (25) TOX TOX is een HMG box transcriptiefactor die geëxpressseerd wordt in verschillende stadia van T cel ontwikkeling in de thymus. TOX wordt ook geëxpresseerd in LTi en NK cellen. In Tox -/- muizen ontwikkelen geen CD4 + T cellen en zijn LTi en NK cellen sterk gereduceerd. Tox -/- muizen hebben bijgevolg geen lymfeknopen. TOX is noodzakelijk voor de ontwikkeling van alle ILCs in muizen. TOX medieert namelijk de NFIL3-afhankelijke ILC ontwikkeling. (23, 25) NFIL3 De transcriptiefactor NFIL3 is noodzakelijk voor de ontwikkeling van ILC1s en NK cellen. Er wordt een belangrijk tekort aan ILC1s en NK cellen waargenomen in verschillende weefsels, inclusief dunne darm, long en milt van NFIL3-deficiënte muizen. Daarenboven zijn ook de ILC2s ernstig verminderd in het longweefsel van NFIL3-deficiënte muizen in vergelijking met WT muizen. Ook in het visceraal vetweefsel van NFIL3- deficiënte muizen is zowel het aantal als de functie van ILC2s drastisch verminderd. De overgebleven Nfil -/- ILC2s zijn wel in staat om te expanderen na behandeling met een IL-2-IL-2mAb complex. Dit wijst erop dat NFIL3 nodig is voor de ontwikkeling maar niet voor het functioneren van ILC2s. Een van de functies van ILC2s in de long is het recruteren van eosinofielen bij infectie. Men onderzocht of NFIL3 hierop een invloed had. In steady state is het aantal eosinofielen ongeveer gelijk in Nfil3 -/- muizen en WT muizen. Eosinofiele rekrutering is wel tweevoudig gereduceerd, wat een defect in ILC2s bevestigd. Ten slotte zijn ILC3s ook sterk verminderd in de lamina propria van de dunne darm en de dikke darm. Dit wordt ook waargenomen in de mesenterische lymfeknopen en in de milt van Nfil -/- muizen. Zowel CD4 + LTi cellen als NKp46 - en NKp46 + ILC3s zijn drastisch gereduceerd, wat de kritische rol van NFIL3 voor de ontwikkeling van alle types ILC3s demonstreert. De enkele ILC3s die wel aanwezig zijn, zijn niet in staat om IL-22 te produceren na ex vivo stimulatie met IL-23. NFIL3 is dus betrokken in de differentiatie van alle ILCs. (26, 27) 21