Differentiatie van natural killer lymfocyten: wat zijn de cruciale factoren?

Transcriptie

1 FACULTEIT GENEESKUNDE EN GEZONDHEIDSWETENSCHAPPEN Academiejaar Differentiatie van natural killer lymfocyten: wat zijn de cruciale factoren? Anthony LAMBELIN Promotor: Prof. Dr. Georges Leclercq Co-promotor: Dr. Sylvie Taveirne Scriptie voorgedragen in de 2 de Master in het kader van de opleiding MASTER OF MEDICINE IN DE GENEESKUNDE

2 Auteursrecht I

3 Voorwoord Twee jaar geleden heb ik gekozen voor dit onderwerp voor mijn masterscriptie, omdat ik altijd al geboeid ben door het bestuderen van pathways in allerlei domeinen van geneeskunde. Bij het lezen van de korte inhoud over deze scriptie was mijn nieuwsgierigheid dan ook direct geprikkeld. Ik moet echter toegeven dat ik maar weinig benul had waaraan ik begonnen was, zeker tijdens het eerste deel van de thesis. Het schrijven van deze thesis begon dan ook zeer moeizaam en is uitgegroeid tot een geheel leerproces gedurende twee jaar, waarbij ik achteraf gezien een opmerkelijke evolutie in efficiëntie bemerkte bij mezelf naarmate de thesis vorderde en er langzaam een structuur ontstond in de voordien heersende chaos. Deze thesis was dan ook nooit tot stand gekomen zonder de hulp van enkele mensen. Hier zou ik dan ook graag enkele personen mijn oprechte dank willen betuigen voor hun hulp en tijd die zij hebben geboden gedurende deze twee jaar voor het verwezenlijken van dit werk. Allereerst zou ik graag mijn co-promotor Dr. Sylvie Taveirne uitvoerig willen bedanken. Zij heeft het meeste tijd besteed om mij te leiden en helpen doorheen deze scriptie. Enerzijds gaf ze mij ruimte voor mijn eigen inbreng in de thesis te steken, anderzijds greep zij op tijd in wanneer ik slecht bezig was, gaf ze mij tips, aanwijzingen, en toch dat duwtje in de rug dat ik af en toe nodig had. Ook was ze altijd opmerkelijk snel met het antwoorden op hulpvragen, nalezen en terugsturen van stukken tekst, waarvoor nogmaals mijn dank. Daarnaast wil ik ook mijn promotor, Prof. Dr. Georges Leclercq bedanken voor zijn hulp bij deze thesis. Altijd vriendelijk, hulpvol en met een duidelijk doel voor ogen gaf hij ook aanwijzingen als leidraad en aanpassingen waar nodig om het niveau van deze masterscriptie op te krikken. Tenslotte zou ik nog Michèle Tack en Bram Cornette willen bedanken voor hun steun, hulp bij vragen en een kritische blik doorheen de gehele periode. II

4 Inhoudstafel Auteursrecht... I Voorwoord... II Abstract Inleiding Het immuunsysteem NK cellen Algemeen Activatie en inhibitie signalisatiepathways en NK cel receptoren Educatie en maturatie van NK cellen NK cellen als therapie Innate Lymphoïd Cells Groep Groep Groep Transcriptiefactoren Doelstelling van de masterthesis Methodologie Inleiding Resultaten Resultaten Ontwikkeling van hematopoëtische stamcel tot multipotente progenitor cellen Muis HSC Mens HSC Transcriptiefactoren Ontwikkeling van multipotente progenitor cellen tot common lymphoid progenitors en common myeloid progenitors Muis CLP Mens CLP CMP Alternatief: lymphoid-primed multipotente progenitor Transcriptiefactoren... 23

5 3.3 Ontwikkeling van common lymphoid progenitor tot NK cel progenitor Muis NKP Transcriptiefactoren T cel vs B cel ontwikkeling Ontwikkeling van NK cel progenitor tot immature NK cel Muis ink Mens ink Transcriptiefactoren Ontwikkeling van immature NK cel tot mature NK cel Muis mnk Mens mnk Transcriptiefactoren Discussie Referenties Bijlagen... A 6.1 Bijlage 1... A 6.2 Bijlage 2... B 6.3 Bijlage 3... C 6.4 Afkortingenlijst... D Vertrouwelijkheid en overdracht van recht... F

6 Abstract Inleiding: Natural killer (NK) cellen werden voor het eerst beschreven in 1975 en werden ingedeeld als cellen van het aangeboren immuunsysteem, maar wel als lymfocyten door hun verschillende kenmerken. NK cellen staan vooral bekend voor het doden van tumorcellen en virus-geïnfecteerde cellen, die geen MHC-I aan hun oppervlak vertonen. Verder zijn er ook NK cellen gezien die vooral functioneren door secretie van cytokines. Over NK cellen in hun finaal, matuur en functionerend stadium, is al heel wat onderzoek naar gedaan; naar functies, eigenschappen en fenotypische kenmerken. Maar de evolutie van NK cellen is nog niet volledig tot in detail opgehelderd. Naast fenotypische kenmerken van de verschillende stadia heerst er nog veel onduidelijkheid rond welke transcriptiefactoren inspelen op al deze stadia. Daarbij moet rekening gehouden worden met het feit dat artikels en zeker reviews dikwijls niet duidelijk zijn over hun studiepopulatie, mens of muis, in hun resultaten. Ook worden gevonden resultaten vaak voorgesteld als geldend voor zowel mens als muis. Het is belangrijk dat resultaten bij mens en muis duidelijk van elkaar gescheiden zijn, aangezien hieromtrent al enkele verschillen zijn aangetoond, op vlak van transcriptiefactoren alsook andere domeinen. Resultaten: Hier worden alle reeds gevonden transcriptiefactoren die een rol spelen in de ontwikkeling van NK cellen opgesomd, met achtereenvolgens de stadia van hematopoëtische stamcel naar common lymphoid progenitor, naar NK cel progenitor, naar immature en als laatste mature NK cel. Telkens wordt een vergelijking van reeds bestaande kennis bij de muis tegenover deze van de mens uiteengezet. Discussie: Globaal kan gezegd worden dat over muis NK cel ontwikkeling al veel meer kennis bestaat in verband met fenotypes en transcriptiefactoren, dan bij de mens het geval is. Verder onderzoek is nodig om alle stappen en mechanismen in de evolutie van NK cellen te begrijpen, zeker aangezien NK cellen nu ook vaak in therapiën betrokken worden. 1

7 1. Inleiding 1.1 Het immuunsysteem Het immuunsysteem bij alle vertebraten (vissen, vogels, reptielen, amfibiën en zoogdieren), en dus ook bij de mens, bestaat uit 2 componenten: het aangeboren en het verworven immuunsysteem. Cellen van het aangeboren immuunsysteem zijn aanwezig bij alle multicellulaire organismen, dus ook bij ongewervelde dieren. Deze cellen van het aangeboren immuunsysteem expresseren pattern recognizing receptoren (PRR) die pathogeengeassocieerde moleculaire patronen (PAMP) herkennen. Interactie tussen een PRR en een PAMP leidt tot directe activatie van het aangeboren immuunsysteem. Deze geactiveerde immuuncellen zullen het pathogeen fagocyteren, en ze zullen ook cytokines, chemokines en antimicrobiële moleculen synthetiseren en secreteren. De gesecreteerde cytokines en chemokines brengen andere immuuncellen naar de plaats van infectie en leiden ook tot activatie van deze cellen. Twee belangrijke celpopulaties van het aangeboren immuunsysteem zijn macrofagen (dit zijn monocyten die uit het bloed naar weefsels gemigreerd zijn) en natural killer (NK) cellen. Andere witte bloedcellen die tot het aangeboren immuunsysteem behoren, zijn granulocyten, bestaande uit neutrofielen, basofielen en eosinofielen, dendritische cellen (DC) en mastcellen. Zowel macrofagen als dendritische cellen kunnen pathogenen fagocyteren, gevolgd door antigeen processing en antigeen presentatie aan T cellen. Deze cellen noemt men daarom ook antigeen-presenterende cellen (APC) en zij vormen een link tussen het aangeboren en het verworven immuunsysteem. Dendritische cellen zijn vaak terug te vinden als APCs, samen met macrofagen en B cellen. Ze zijn noodzakelijk voor activatie van het verworven of adaptief immuunsysteem. Dit adaptief systeem is alleen aanwezig in gewervelden, en wordt gekenmerkt door een zeer grote verscheidenheid aan antigeen receptoren, die in tegenstelling tot het aangeboren immuunsysteem ontstaan door somatische recombinatie (VDJ recombinatie). Ze kunnen ingedeeld worden in 2 soorten lymfocyten: T cellen en B cellen. De activatie van deze cellen is dus afhankelijk van APCs, meer bepaald de activatie van T-lymfocyten is afhankelijk van herkenning van antigeen peptiden op deze APCs door de T cel receptor (TCR). Deze antigeen peptiden voorzien de T cel van informatie omtrent de oorsprong van het antigeen. Indien deze aangeboren immuunherkenning afwezig is, kunnen deze lymfocyten van het adaptief immuunsysteem dus niet geactiveerd worden. Zo worden bijvoorbeeld zelf-antigenen niet 2

8 herkend door het aangeboren immuunsysteem en als gevolg ook geen co-stimulatoire signalen tot expressie gebracht (1). Activatie van lymfocyten, meer bepaald T cellen, is afhankelijk van 2 signalen: signaal van de TCR zelf bij herkenning van een antigeen peptide, en een costimulatoir signaal gegeven door de APCs bij binding van liganden B7.1 (CD80) en B7.2 (CD86) op receptoren CTLA-4 en CD28 respectievelijk. Dit gebeurt zowel bij mens als bij muis (2). Bij activatie vertonen T cellen expressie van CD40 ligand (CD40L), dat als costimulatoir signaal functioneert voor B cellen, op voorwaarde dat deze een antigeen peptide vertonen dat door deze T cellen herkend wordt (Figuur 1) (3). T cellen die eigen antigenen zouden herkennen en er reactie op geven, worden bij maturatie verwijderd in de thymus (1). Figuur 1: T-B cel interactie. Bij binding en verwerking van een antigeen door een APC (hier een B cel) brengt deze B7.2 en B7.1 tot expressie. Bij interactie met een rustende T cel en daaropvolgend interactie van B7-2 met CD28 en B7-1 met CTLA-4, wordt de T cel geactiveerd. De geactiveerde T cel kan op zijn beurt CD40L tot expressie brengen, wat als co-stimulatoir signaal werkt bij de activatie van B cellen (4). 1.2 NK cellen Algemeen Naast T cellen en B cellen worden ook NK cellen geclassificeerd als lymfocyten. NK cellen werden voor het eerst beschreven in 1975 en later gedefinieerd als aangeboren effector lymfocyt. Hun indeling bij lymfocyten is op basis van hun morfologie, expressie van vele lymfoïde merkers en oorsprong uit de gemeenschappelijke lymfoïde progenitor (CLP, zie verder) cel in het beenmerg. Ze maken daarentegen wel deel uit van het aangeboren immuunsysteem door afwezigheid van antigeen-specifieke receptoren en hun receptoren zijn ook niet afhankelijk van somatische recombinatie zoals gezien bij B en T cellen. NK cellen 3

9 worden vooral aangetroffen in bloed, milt, lever, long en beenmerg en ze maken ongeveer 10% van lymfocyten in de periferie van de mens uit (5-7). Ze delen een gemeenschappelijk killingmechanisme met CD8 + cytotoxische T cellen, namelijk het vrijlaten van granules die granzymes en perforine bevatten. Het binnendringen van deze granzymes in de target cel induceert een caspase-afhankelijke en onafhankelijke pathway die beide leiden tot apoptose (8). Een ander mechanisme is het triggeren van de apoptose pathway in de target cel door receptor-ligand interactie, dit kan door secretie van tumor necrosis factor-α (TNF-α) dat op de cel bindt, of via direct contact tussen NK en target cel wat leidt tot signalisatie door TNFrelated apoptosis-inducing ligand (TRAIL) en/of Fas ligand (8, 9). Deze cytotoxiciteit is vooral weggelegd voor het merendeel (ongeveer 90%) van NK cellen (CD56 dim, zie verder), terwijl de minderheid (ongeveer 10%) van NK cellen (CD56 bright ) weinig tot geen cytotoxische activiteit vertonen en vooral veel cytokines produceren (10). Het verschil met naïeve T cellen in verband met het killing-mechanisme is dat mature NK cellen klaar zijn voor een directe respons als effector cellen. Deze lytische respons kan getriggerd worden in enkele minuten zonder transcriptie, translatie of proliferatie Activatie en inhibitie signalisatiepathways en NK cel receptoren Om tot respons over te gaan moet de NK cel eerst potentieel verdachte cellen herkennen. NK cel herkenning houdt in dat er eerst een binding komt met potentiële doelwitten dit worden target cellen genoemd waarna balans tussen activerende en inhiberende signalen bepaalt of de NK cel blijft en tot respons overgaat of zich losmaakt en verder zoekt naar nieuwe target cellen. Het gaat meestal om herkenning van tumorcellen of virus-geïnfecteerde cellen die NK cellen aanzetten tot spontane cytotoxiciteit. Deze cellen vertonen namelijk geen of een verlaagde expressie van major histocompatibility complex klasse I (MHC-I) moleculen op hun celoppervlak. Bij de mens wordt dit Humaan leukocyten antigeen (HLA) genoemd. Het niet tot expressie brengen van MHC-I is een veelgebruikt mechanisme van tumoren of virussen om T-cel herkenning te ontwijken. NK cellen worden actief geïnhibeerd wanneer ze cellen tegen komen die wel MHC-I tot expressie brengen, maar dit kunnen ook abnormale cellen zijn. De hoeveelheid MHC-I op een target cel is recht evenredig met de graad van inhibitie, doordat NK activatie bepaald wordt door de balans tussen het aantal activerende en inhiberende signalen (zie verder) (6, 7). Naast hun secretie van granzymes en perforine, staan NK cellen bekend voor het produceren van interferon (IFN)-γ, een type 1 cytokine dat T cel en macrofaag antwoord versterkt. Daarbij worden nog andere cytokines gesecreteerd zoals TNF-α, IL-5, IL-10 en IL-13; groeifactoren zoals GM-CSF, G-CSF, IL-3; en chemokines 4

10 zoals CCL2, CCL3 (MIP-1α), CCL4 (MIP-1β), CCL5 (RANTES), XCL1, CXCL8 (IL-8) (11, 12). IL-10 wordt bijvoorbeeld gesecreteerd in situaties van chronische of systemische inflammatie, die dan respons van T cel en macrofaag vermindert. Buiten het beïnvloeden van macrofaag en T cel antwoord, beïnvloeden NK cellen ook dendritische cellen, zoals het elimineren van immature DCs of het stimuleren van DC maturatie (Figuur 2) (12, 13). Figuur 2: De functies van NK cellen. NK cellen herkennen gestresseerde cellen al dan niet met aanwezigheid van antilichamen erbij (blauw). Activatie van NK cellen resulteert in inductie van apoptose van de target cel, en productie van cytokines en chemokines. Het meest geproduceerde cytokine is IFN-γ, dat macrofaag en T cel antwoord versterkt (groen). Maar ook IL-10 wordt gesecreteerd bij chronische of systemische inflammatie, die macrofaag en T cel antwoord vermindert (rood). Ook kunnen NK cellen interageren met DCs, waarbij ze immature DCs elimineren, of maturatie ervan bevorderen en zo een verbeterde antigeen presentatie aan T cellen verzekeren (12). è Inhiberende en activerende receptoren Activatie of inhibitie van NK cellen is afhankelijk van het aantal signalerende, dus na ligandbinding, activerende of inhibitorische receptoren op de NK cel. Wanneer een NK cel met een normale cel bindt, herkent de inhibitorische receptor het MHC-I peptide en geeft inhibitie en dus preventie van activatie van de NK cel. Deze inhibitie gebeurt via een immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif (ITIM) in het cytoplasmatisch domein van de NK receptor. Het tyrosine-residu van dit ITIM wordt bij ligand binding gefosforyleerd, hoogstwaarschijnlijk door een Src kinase, en fosfatasen worden via hun Src homology domain 2 (SH2-domein) gerekruteerd. Deze fosfatasen kunnen zijn: SH2-containing protein-tyrosine phosphatase 1 (SHP1), SHP2 en SH2-containing inositol polyphosphate 5-5

11 phosphatase (SHIP). SHIP zorgt voor preventie van aanhoudende Ca 2+ signalen. SHP1 en SHP2 zorgen voor verminderde fosforylatie van verschillende signaalproteïnen. Dit leidt uiteindelijk tot defosforylatie van VAV1, wat een blok geeft van de propagatie van activerende signalen. Daarenboven lopen er nog andere downstream signalen parallel hiermee, waardoor synergistische activatiesignalen nodig zijn om de drempelwaarde van inhibitie te overschrijden (6, 14, 15). De voornaamste inhibitorische receptoren zijn Ly49 receptoren bij de muis, Killer cell immunoglobulin-like receptoren (KIR) bij de mens en CD94/NKG2A bij beiden (zie verder) (Tabel 1). Daarnaast hebben NK cellen ook enkele activerende receptoren om effector functies te vervullen. Zij bevatten een immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM). Er bestaan drie soorten adapter proteïnes die een ITAM bevatten namelijk FcεRIγ, CD3ζ en DAP12. Bij activatie van deze adapter proteïnen en fosforylatie van het ITAM worden Syk en ZAP70 gerekruteerd via hun SH2 domeinen, en veroorzaken Ca 2+ influx, degranulatie en transcriptie van cytokine en chemokine genen (Tabel in bijlage 1) (6, 16, 17). Inhiberende receptoren Ly49 receptor genen bevinden zich op muis chromosoom 6. Er zijn zeven Ly49 receptoren beschreven die een ITIM bevatten. Daarentegen zijn er twee receptoren, Ly-49D en Ly-49H, die ITAMs bevatten en aldus een activerende functie uitoefenen (6, 18, 19). Killer cell immunoglobulin-like receptoren (KIR), waarvan de genen zich bij mensen op chromosoom 19q13.4 situeren, zijn de menselijke varianten van Ly49 receptoren bij de muis. Ze bezitten 2 of 3 immunoglobuline-achtige domeinen extracellulair (KIR2D of -3D). Er bestaat ook een activerende tegenhanger die associeert met DAP12 (6, 20). KIR2DL4 onderscheidt zich het meest, doordat deze zowel inhiberend (via ITIMs) als activerend (via een ITAM) kan functioneren (21). CD94/NKG2 receptoren zijn inhibitorische receptoren in mens en muis, waarvan de genen bij de mens te vinden zijn op chromosoom 12p12.3-p13.2 en bij muis op chromosoom 6. CD94 kunnen als heterodimeren, gelinkt aan NKG2A, C of -E tot expressie komen, waarbij CD94/NKG2A inhibitorisch werkt, terwijl CD94/NKG2C en CD94/NKG2E activerend werken via DAP12. Humane CD94/NKG2 receptoren binden HLA-E, deze van de muis binden Qa1 (6, 22, 23). 6

12 Leukocyte immunoglobulin-like receptors (LILRs of LIRs), of CD85, zijn minder talrijk bij de mens; van de 13 genen, gelokaliseerd op chromosoom 19q13.4, coderen enkel genen LILRB1 en LILRB2 voor inhibitorische receptoren, en daarbovenop komt enkel LILRB1 tot expressie op NK cellen. LILRB1 (of LIR1) wordt variabel tot expressie gebracht op perifere NK cellen (0-75%), een deel van de T cellen, maar vooral sterk en uniform op B cellen en monocyten, waar ze waarschijnlijk hun grootste rol spelen (6, 24). Muis-equivalenten van deze receptoren (PIR) worden niet tot expressie gebracht op NK cellen (25). Killer cell lectin-like receptor G1 (KLRG1) is een inhiberende NK receptor bij mens en muis met als liganden cadherines (E-, N- en R-cadherine) (26). Activerende receptoren De eerst gekende activerende NK receptor is CD16 of FcγRIIIα, een receptor voor de Fc (constante) regio van immunoglobuline G. Deze kan bij mensen associeren met FcεRIγ en/of CD3ζ, bij de muis enkel met FcεRIγ (6, 27). De NKG2D receptor herkent liganden structureel gerelateerd met MHC-I zoals MICA, MICB en UL-16-binding proteins (ULBP) 1, ULBP2, ULBP3, ULBP4 bij de mens. Muis liganden voor de NKG2D receptor zijn; retinoic acid early transcript-1 (Rae1) moleculen (α, β, γ, δ, ε), UL16-binding-like transcript-1, histocompatibility 60 (H60) moleculen en murine ULBP-like transcript 1 (MULT1) (28). Genen voor deze receptor bevinden zich op mens chromosoom 12p12.3-p13.2 en muis chromosoom 6 (6). Waar de muis over een lange en korte isovorm van NKG2D receptoren beschikt, kent de mens alleen de lange isovorm (29, 30). 2B4 receptoren, ook CD244 genoemd, met als ligand CD48 situeren zich op humaan chromosoom 1q22 en muis chromosoom 1. Ze komen tot expressie op alle NK cellen, en enkele subpopulaties van T cellen bij muis en mens. Bij de mens echter worden deze receptoren ook nog op monocyten en basofielen aangetroffen. Wat hun functie betreft blijken 2B4 receptoren zowel activatie als inhibitie uit te oefenen, afhankelijk van de isovorm van de receptor en het stadium van NK cel maturatie (6, 31, 32). Natural cytotoxicity receptors (NRCs) NKp46, NKp30, NKp44 en NKp80 zijn activerende receptoren, met zowel gemeenschappelijke als specifieke liganden voor NRCs onderling. Studies tonen aan dat NRCs een zeer grote invloed hebben bij het elimineren van tumorcellen. 7

13 NKp30 op zich speelt ook een rol bij NK cel-dc interacties, die leiden tot apoptose of maturatie van DCs (33, 34). DNAX accessory molecule 1 (DNAM-1) receptor, ook gekend als CD226, is een activerende receptor. Deze is terug te vinden op humaan chromosoom 18q22.3 en wordt tot expressie gebracht op 50% van de NK cellen, op T cellen, een deel van de B cellen, monocytes en trombocyten (33). Liganden zijn CD112 (ook polio virus receptor, PVR, genoemd) en CD155 (nectin-2), en deze komen soms verhoogd tot expressie op tumorcellen (35). Daarenboven verzorgt DNAM-1 ook een stabiele interactie tussen NK en target cel (33). NKR-P1 receptoren, of CD161, herkennen non-mhc liganden, en bij de muis zijn er 5 genen op chromosoom 6 die voor deze receptoren coderen, nl. NKR-P1A, -B, -C, -D en F. NKR- P1B/D receptoren bevatten een ITIM, terwijl NKR-P1C associeert met een ITAM, en de anderen zijn waarschijnlijk ook activerende receptoren. NKR-P1C wordt bij de muis door alle NK cellen en een deel van de T cellen tot expressie gebracht (6, 36). Mensen daarentegen vertonen maar één NKR-P1A gen (ook CD161 genoemd) op chromosoom 12, en deze receptor komt tot expressie op een deel van de perifere NK cellen maar veel uitgebreider op T cellen (37). Paired Ig-like receptoren (PILR) zijn terug te vinden bij mens en muis met hun gen op chromosoom 7 en 5 respectievelijk, en PILR-L (CD99) als ligand. De PILRα receptor heeft een inhibitorische functie terwijl de β-vorm een activerende receptor is (38). Ze worden vooral gevonden in myeloïde lijn bij mensen. Maar, in tegenstelling met muis PILRβ, die wel op NK cellen aanwezig is, is PILRβ is nog niet gedetecteerd op menselijke NK cellen (6) Educatie en maturatie van NK cellen è Educatie Voordat NK cellen met al deze verschillende receptoren optimaal functioneren, moeten ze een proces ondergaan als onderdeel van hun maturatie tot volwaardige NK cellen. Dit proces wordt educatie genoemd en kenmerkt zich door het stochastisch uiten van KIR of Ly49 receptoren, ook self-recognizing inhibitory receptors (SRIRs) genoemd. Dit zijn inhibitorische NK receptoren die eigen, self MHC-I herkennen en via negatieve signalen NK cellen inactiveren en zo verhinderen van auto-immuniteit. Deze NK cellen kunnen later cellen die geen expressie van eigen MHC-I vertonen (dit wordt missing-self genoemd), herkennen en doden. Er zijn 4 modellen voorgesteld voor NK cel educatie (Figuur 3) (7, 39): 8

14 1) Arming model: NK cellen worden functioneel competent na signalen van inhibitorische receptoren door herkenning van MHC-I. Dit model gaat er van uit dat NK cellen van nature hyporesponsief zijn en inhibitorische receptoren een nieuwe instructieve rol hebben (40). De term licensing wordt door sommigen als synoniem gebruikt, maar anderen beschouwen deze term als een apart model en wordt het arming model samen met het volgend model gezien (41). 2) Disarming model: NK cellen die geen inhibitorische receptoren bezitten, zijn niet in staat tot zelf-tolerantie, wat resulteert in een vorm van anergie door chronische activatie. Deze theorie stelt dat NK cellen van nature responsief zijn, en inhibitorische receptoren hun normale, inhibitorische rol spelen. Dit model kan gestaafd worden doordat NK cellen die potentieel autoreactief zijn niet verwijderd, maar tot een hyporesponsieve status voor stimulatie gebracht worden. Dit is het geval bij mens of muis NK cellen die geen receptoren voor MHC-I bevatten, of gewoon geen MHC-I moleculen op zich bezitten (41, 42). 3) Cis-interactie model: Wanneer Ly49 receptoren MHC-I in cis binden (op hetzelfde celmembraan), worden deze Ly49 receptoren gesekwestreerd en verhinderd om naar de immunologische synaps te verplaatsen. Hierdoor wordt de algemene inhibitorische invloed verminderd en worden NK cellen meer responsief. Het is nog niet duidelijke of alle Ly49 receptoren, laat staan KIRs, in cis kunnen binden (43). 4) Rheostat model: Dit lijkt op het arming en disarming model, maar waar deze laatste modellen stellen dat NK cellen ofwel AAN ofwel UIT staan, gaat dit rheostat model ervan uit dat er een kwantitatieve manier is van educatie. Hierbij kunnen NK cellen meer of minder responsief zijn naarmate er meer of minder inhibitorische signalen zijn. Via dit model blijken NK cellen dus getuned, afgestemd, te worden; hoe groter de inhibitorische invloed van de receptoren is, hoe groter ook de mogelijke NK cel activatie en respons (44). Tevens blijken NK cellen zich ook aan te passen aan hun omgeving, waarbij in steady-state vooral NK cellen met inhibitorische receptoren voor MHC-I (SRIRs) de hoogste respons vertonen, maar bij infecties worden NK cellen met weinig inhibitorische self-receptoren meer gemobiliseerd (12, 45). 9

15 Figuur 3: Modellen van NK cel educatie. Gedurende de maturatie van NK cellen, vertonen deze self-recognizing inhibitory receptors (SRIR) die eigen MHC-I liganden herkennen. Zij promoten de NK cel educatie om een volwaardige cytotoxische reactie tegen een abnormale cel uit te oefenen. 1) Rheostat model, expressie van meer dan 1 SRIR versterkt de educatie; 2) Cis interactie, interactie tussen SRIRs en MHC-I op het NK cel oppervlak verhindert de SRIR zich naar de immuun synaps te verplaatsen; 3) Arming/licensing model, NK cellen worden functioneel competent na signalen van de SRIR na herkenning van eigen MHC-I; 4) Disarming model, NK cellen die geen SRIRs bezitten, zijn niet in staat tot zelf-tolerantie, wat resulteert in een vorm van anergie door chronische activatie (7). è Maturatie Hiernaast spelen activerende cytokine receptoren zoals IL-15R, IL-2R, IL-21R ook een rol in de ontwikkeling en effector functie van NK cellen. In het bijzonder is IL-15 nodig voor maturatie en overleving van de NK cel (12). Er is vastgesteld dat bij organismen die MHC tot expressie brengen en zo NK cel educatie handhaven, NK cellen ook een priming signaal nodig hebben voor het uitoefenen van hun effector functie. Dit kan gemedieerd worden via IL-15, gepresenteerd door IL-15R op DCs, wat zorgt voor een goede cytotoxiciteit en IFN-γ secretie. Dit immuunantwoord kan nog versterkt worden bij combinatie met IL-12. Daarnaast is er ook secretie van IL-18, die NK cellen primed voor een betere productie van IFN-γ na stimulatie door IL-12. Deze priming en interacties met IL-12 zijn aangetroffen bij zowel mens als muis (46, 47). Verder zijn cytokine receptoren gelinkt met My88, een adaptor proteine, ook belangrijk voor maturatie, zo bijvoorbeeld IL-18R voor het hierboven beschreven IL-18. Bij de mens is ook IL-1R, voor IL-1β, aangetroffen als cytokine receptor gelinkt met My88, nodig voor behoud van immature NK cellen in mucosa (12, 48). Wanneer men immature van mature NK cellen wil onderscheiden, wordt de expressie van CD56 op het celoppervlak onderzocht. Zowel NK cellen met weinig CD56 moleculen op hun oppervlak 10

16 (CD56 dim ) als met veel CD56 expressie (CD56 bright ), worden tot op heden beschouwd als volledig gematureerde NK cellen, alhoewel hier enige onduidelijkheid over bestaat en er wordt veronderstelt dat CD56 bright overgaat tot CD56 dim. CD56 dim NK cellen maken 90% uit van de perifere NK cellen en zijn vooral van belang bij cytotoxiciteit door de eerder vermelde secretie van perforine en granzymes, TNF-α of direct cel contact. CD56 bright NK cellen maken 5-15% van de periferie uit en bevinden zich vooral in secundaire lymfoïde organen of weefsels. Deze hebben een grotere rol bij secretie van cytokines en vertonen geen cytolytische activiteit (7, 49). Bij muizen worden mature NK cellen gekenmerkt door expressie van NK1.1 en DX5, en zijn er geen twee mature subsets (50). Uit onderzoek is vastgesteld dat ook NK cellen een soort van geheugen hebben, maar niet zo uitgebreid als de andere lymfocyten (T en B cellen). Er is wel nog veel onzekerheid over bijvoorbeeld het mechanisme, hoe lang dit geheugen effectief aanhoudt (verschillende resultaten tussen studies), en wat dit kan betekenen met betrekking tot therapeutische doeleinden (7, 51, 52) NK cellen als therapie Aangezien NK cellen immuniteit verschaffen tegen virus-geïnfecteerde cellen en tumorcellen die geen MHC-I vertonen kunnen deze ook als behandeling worden ingezet. Therapie met gebruik van NK cellen wordt vooral ingezet tegen kanker. Er zijn verschillende opties om NK cellen als therapie te gebruiken; 1) Variaties in KIR/HLA verhouding (dit is de interactie tussen KIRs en eigen MHC-I, bij de mens HLA genoemd) hebben een invloed op NK activiteit. Zo wordt vastgesteld dat bij allotransplantatie, door een mismatch tussen KIR en zijn MHC klasse 1, deze NK cellen niet geïnhibeerd worden, maar normale cellen hebben niet voldoende activerende moleculen om ze te activeren, terwijl virus- en kankercellen dit wel hebben met als gevolg eliminatie van virus- en kankercel. Een variatie hierop zijn autologe transplantaties met gebruik van anti-kir antilichamen die KIRs blokkeren, en dus ook geen binding met MHC-1 aangaan, wat hetzelfde effect teweegbrengt (53, 54). Zo is vastgesteld dat een hematopoëtische stamceltransplantatie (HSCT) ter bestrijding van leukemie vanuit een allotransplant veel succesvoller is wanneer de ontvanger 1 HLA haplotype verschilt/mist met de donor cellen (55); 2) Het stimuleren van NK-cel gemedieerde antibody dependent cellular cytotoxicity (ADCC) activiteit via het samenstellen van antilichamen en het gecombineerd gebruik hiervan (56); 3) Genetische manipulatie van NK cellen zodat deze chimere antigeen receptoren (CARs) tot expressie brengen die target-cel -specifieke NK cel activatie uitlokken (57). Dit verloopt beter met NK cellen dan met T cellen omdat hun levensduur korter is, en bij T cellen leidt dit tot blijvende reactiviteit (7); 4) Bepaalde 11

17 immunomodulerende drugs die cytotoxiciteit en cytokine productie van NK cellen verhogen, zoals lenalidomide en bortezomib (58, 59). 1.3 Innate Lymphoïd Cells Sinds enkele jaren wordt een nieuwe indeling gebruikt waarin NK cellen ook hun plaats krijgen. Ze behoren nu tot de innate lymphoid cells (ILCs). ILCs hebben 3 grote kenmerken: afwezigheid van receptoren die afhankelijk zijn van recombinatie door recombination activating gene (RAG), afwezigheid van myeloïde en dendritische fenotypische merkers, en hun lymfoïde morfologie. Prototypische populaties van deze ILCs zijn NK cellen en lymphoid-tissue inducer cellen (LTi), respectievelijk verantwoordelijk voor vroege immuunrespons en formatie van lymfeknopen en Peyerse platen tijdens embryogenese. Beiden zijn afhankelijk van IL-2Rγ-keten en inhibitor van DNA binding 2 (Id2), een transcriptionele repressor, voor hun ontwikkeling (60) Groep 1 Groep 1 ILCs is gekenmerkt door productie van cytokine IFN-γ en onmogelijkheid van T h 2 en T h 17 cel-geassocieerde cytokines secretie. Typisch voor deze groep zijn NK cellen door hun secretie van IFN-γ. Bij de muis vertonen deze NK cellen NKp46 en soms ook NK1.1 expressie. NKp46 komt echter ook voor op IL-22 producerende cellen behorende tot groep 3 ILCs (zie verder), en is bijgevolg niet specifiek voor groep 1. Bij de mens vertonen deze NK cellen CD16, CD56 en CD94, maar CD56 wordt ook gevonden op IL-22 producerende cellen van groep 3, en dus ook niet specifiek voor groep 1 (60). Naast NK cellen worden ook, zowel in mens als muis, ILC1s aangetroffen, een subset verschillend van NK cellen maar wel behorend tot groep 1 ILCs (61). NK cel ontwikkeling worden in grote mate gereguleerd door T-bet (Tbx21) samen met eomesodermin (Eomes), terwijl ILC1 subset ontwikkeling vooral door T-bet gereguleerd wordt, maar ook retinoic acid receptor-related orphan receptor γt (RORγt) heeft een zekere invloed, wat de belangrijkste transcriptiefactor (TF) is voor groep 3. Dit toont aan dat er een zekere plasticiteit heerst tussen groep 1 en groep 3 (60, 62) Groep 2 Groep 2 ILCs is afhankelijk van IL-7 en transcriptiefactoren GATA3 en RORα voor hun ontwikkeling en functie. Ze produceren Th2 cel-geassocieerde cytokines (type 2 cytokines) zoals IL-5 en IL-13 bij stimulatie door IL-25, IL-33, of thymus stromaal lymfopoëtine (TSLP) (63-65). Deze ILCs zijn belangrijk bij resistentie tegen en expulsie van nematoden (vooral IL- 12

18 13), en herstel van beschadigd weefsel na infectie; direct via amfireguline, of indirect via IL-5 en IL-13 (60, 65). Bij muizen worden 2 groepen onderscheiden; nuocyten en aangeboren type 2 helper cellen (I H 2), bevinden zich in lever, beenmerg, longen en darmen (66, 67). Bij de mens daarentegen is maar 1 groep teruggevonden, ILC2s genaamd. Deze zijn ontdekt in foetaal en volwassen longen en darmen. ILC2s brengen ST2 (IL-1RL1) en IL-17RB tot expressie, componenten van de IL-33 receptor en de IL-25 receptor respectievelijk. Net zoals bij muis groep ILCs zijn ze afhankelijk van GATA-3 voor hun ontwikkeling en functie (68) Groep 3 Groep 3 ILCs is gekenmerkt door productie van IL-17(A) en/of IL-22. Ze zijn afhankelijk van RORγt en IL-7Rα-signalisatie voor hun ontwikkeling en RORγt speelt ook een rol voor hun functie. De typische cellen van deze groep zijn LTi cellen, die zowel IL-17 als IL-22 kunnen produceren (60, 69). Muis LTi cellen worden gekenmerkt door afwezigheid van T, B en myeloïde merkers, maar expressie van integrine α4β7, CD45, CD4, lymfotoxine-α (LT-α) en LT-β, alsook chemokine- en cytokinereceptoren CD127 (IL-7Rα) en CD117 (c-kit) (70). Mens LTi cellen zijn gelijkaardig aan deze van de muis, behalve dat humane LTi cellen allemaal CD4 negatief zijn. Ze worden aangetroffen in foetaal mesenterium, volwassen lymfeknopen, milt, darm en tonsillen (69). Buiten hun eerder vermelde rol bij formatie van lymfeweefsel tijdens embryogenese, zijn postnatale LTi cellen ook belangrijk bij formatie van geïsoleerde lymfoïde follikels (ILFs) in de darm na herkenning van PAMPs op commensalen, om zo intestinale homeostase te behouden (71). Ook blijken postnatale LTi cellen betrokken bij herstel van beschadigde lymfeknopen na acute virale infectie, bij scheiding van B en T cel zones in de milt architectuur, en bij generatie van CD4 T cellen (72, 73). Een andere subset van groep 3 ILCs wordt gekenmerkt door expressie van NKp46 en productie van IL-22 maar niet IL-17A, en worden in de studie van Cella et al. als NK22 cellen bestempeld (74). Andere benamingen voor deze cellen zijn ILC3s, ILC22, NCR22, NKR-LTi, LTi-achtige NK cellen of NKp46 + RORγt + ILCs. Vroeger werden deze NK22 cellen als een NK-subset beschouwd maar ze vertonen vele verschillen zoals afwezigheid van cytolytische eigenschappen, inhibitorische receptoren bij mens, Ly49 receptor bij muis, en productie van IFNγ. Ze bevinden zich in dunne darm, colon, lymfeknopen van het mesenterium en lever (5, 60, 74). Productie van IL-22 door NK22 cellen wordt gestimuleerd door IL-23 bij mens en muis, terwijl inductie van IL-22 bij de muis door IL-12 en IL-18 wordt vervuld (75). IL-25 daarentegen, geproduceerd door intestinale epitheelcellen, induceert een daling van de IL-22 productie (76). De IL-22 receptor bevindt zich uitsluitend op epitheelcellen, en binding 13

19 induceert productie van cytokines, microbiële peptiden en mucines (5). IL-22 speelt een belangrijke rol in de afweer van bacteriën in de darm, vermindert de schade door het immuunsysteem bij hepatitis, en zorgt voor behoud van de immuniteit en integriteit bij eosinofiele luchtwegontsteking en inflammatoire darmziekte (IBD) (77, 78). Daarnaast worden deze NK22 cellen ook beschreven in een rol tegen tumoren, met name het modificeren van de tumor vasculatuur (met verhoogde expressie van adhesiemoleculen), waardoor immuuncellen makkelijker kunnen invaderen en de tumor opruimen (79). Er bestaat nog een subset behorend tot groep 3 ILCs maar verschillend van LTi en NK22 cellen door afwezigheid van expressie van CD4, CD117 en NKp46 op hun oppervlak. Deze cellen worden ILC17 genoemd en zijn gespecialiseerd in productie van IL-17, maar daarnaast zijn ze ook in staat IL-22 en IFNγ te produceren (60, 80). IL-17 is een pro-inflammatoir cytokine dat neutrofielen rekruteert en productie van cytokines en antimicrobiële peptiden stimuleert. Net zoals IL-22 heeft ook IL-17 een beschermende functie bij intestinale infectie en inflammatie (5). Soortgelijke ILC17 cellen zijn ook beschreven bij de mens, met echter andere celoppervlakte merkers (69). Uit deze gegevens blijkt dat groep 3 ILCs over een zeer heterogene groep aan subsets beschikt, waarbij subgroepen ofwel IL-17 en/of IL-22 produceren, ofwel IL-17, IL-22 en IFNγ (60). Deze bovengenoemde 3 groepen ILCs hebben niet altijd een beschermende functie, maar kunnen - wat ook niet zelden voorvalt bij andere componenten van het immuunsysteem - bij dysregulatie bijdragen tot auto-immuunziekten, allergieën en fibrosis. Zo is dysregulatie van zowel IL-17 als IL-22 gelinkt met auto-immuunziekten als psoriasis, reumatoïde arthritis en inflammatoire darmziekte (IBD). Een chronische productie van type 2 cytokines, door groep 2 ILCs, geeft aanleiding tot allergische luchtwegaandoeningen, inflammatoire darmziekten en ook excessieve fibrosis en weefselremodellering. Hierbij zijn zowel activatiefactoren IL-25 en IL-33 als effectoren IL-5 en IL-13 bij betrokken (5). Er bestaan ook gegevens die aantonen dat LTi cellen (aangetrokken door chemokine CCL21, gesecreteerd door tumoren) in staat zijn het stroma van een tumor te reprogrammeren tot het lymfoïde type, waardoor rejectie van de tumor verhinderd wordt (81). 1.4 Transcriptiefactoren Transcriptiefactoren (TFs) zijn moleculen, proteïnes, die de activiteit van een transcriptie van bepaalde DNA-sequenties naar mrna positief of negatief beïnvloeden. Dit voltrekt zich door het promoveren of inhiberen van RNA-polymerase, dat de transcriptie uitvoert. TFs bezitten 14

20 een structuur waarbij bepaalde regio s dienen voor binding van DNA, terwijl andere regio s een positief of negatief signaal vesturen. TFs binden op regio s, sequenties, die net vòòr genen liggen die ze reguleren. Deze regio s kunnen enhancer- (kan overal op het gen voorkomen, stroomop- of afwaarts) of promotorregio s (een paar bases opwaarts van de beginsequentie, hierop bindt ook RNA-polymerase) zijn. Zelf worden TFs gereguleerd op 2 manieren, namelijk door regulatie van synthese en activatie van TFs (82). 1.5 Doelstelling van de masterthesis In de inleiding werden oppervlakkig de karakteristieken, functies, classificatie en toepassing in therapie van NK cellen uitgelicht. Een ander groot aspect van NK cellen is hun ontwikkeling. Hoe ontstaan deze NK cellen precies, welke stappen ondergaan ze vanaf de hematopoëtische stamcel om uiteindelijk tot mature en functionerende NK cellen te differentiëren? De hoofddoelstelling van deze thesis is te achterhalen welke transcriptiefactoren bij elk stadium van cruciaal belang zijn, en wat de grote verschillen tussen muis NK cellen, waarover reeds veel studies bestaan, en de humane NK cellen, waar men minder kennis van heeft, zijn. 2. Methodologie Alle artikels zijn verkregen via Pubmed of Google Scholar. 2.1 Inleiding Vooraleer aan de inleiding te beginnen werden als basis een tien- tot vijftiental reviews gelezen om algemene informatie over het immuunsysteem en meer bepaald NK cellen te vergaren. Bij het uitkiezen van deze reviews werd gekeken naar recentheid, waarbij enkel diegene werden gekozen die minder dan 5 jaar oud waren, tenzij van uitstekende kwaliteit. Zo werd bijvoorbeeld de review van L. Lanier NK Cell Recognition, daterend van 2005, toch ook opgenomen door zijn uitgebreidheid en kwaliteit aan informatie (6). Uit deze reviews werd bij relevante informatie voor de inleiding bijbehorende referenties opgezocht en nagelezen en de best passende en meest gerefereerde artikels werden gebruikt voor het schrijven van de inleiding. Deze originele artikels werden niet gefilterd op jaartal. Ook werd gebruikt gemaakt van related citations van reeds gebruikte artikels voor het vinden van gelijkaardige artikels. 15

21 2.2 Resultaten Voor de resultaten werd eerst de opbouw gekozen in verschillende stappen, namelijk de overgangen van HSC naar MPP, van MPP naar CLP/CMP, van CLP tot NKP, van NKP tot ink en van ink tot mnk (zie resultaten), waarbij telkens bijbehorend fenotype en transcriptiefactoren die op dat stadium inwerken, bij zowel muis als mens, werden uitgeschreven. De fenotypes werden gevonden op basis van originele artikels waarnaar gerefereerd werd in de reviews gevonden bij de inleiding, en andere artikels door het invoeren van combinaties van zoektermen zoals NK cell, differentiation, maturation, development, lymphoid cell, phenotypes, hematpoietic stem cell, multipotent progenitor cell et cetera. Bij relevante artikels na screening werden via de sneeuwbalmethode met related citations gelijkaardige artikels gevonden. Bij elk stadium werden telkens de meest geciteerde artikels diagonaal gelezen, de best passende opgenomen en van daaruit voldoende informatie verzameld voor het beschrijven van de desbetreffende fenotypes. Voor fenotypes van de mens werd er beroep gedaan op related citations van reeds gebruikte artikels en vervolgens de filter Humans ingesteld, waarna abstracts van relevante titels werden doorgenomen tot representatieve artikels werden aangetroffen. Indien dit weinig resultaten opleverde werden ook zoektermen stadium X voor het desbetreffende stadium en Human ingevoerd op Pubmed en Google Scholar, om vervolgens dezelfde methode als reeds beschreven toe te passen. Voor het verkrijgen van artikels met betrekking tot verschillende TFs werden eerst enkele reviews geraadpleegd om een beeld te verkrijgen van het aantal TFs nodig voor volledige NK cel ontwikkeling. Hiervoor werden reviews uit de inleiding gebruikt, alsook nieuwe reviews bekomen door een combinatie van zoektermen zoals hierboven aangehaald (zie zoektermen fenotype) maar aangevuld met de term transcription factor. Vervolgens werden de meest gerefereerde artikels bij elke TF gescreend en gebruikt als basis voor de sneeuwbalmethode met related citations voor het vinden van meer relevante artikels. Voor resultaten over diezelfde TFs bij humane NK cellen, werden deze related citations gefilterd op Human. Ook werden zoektermen transcription factor X voor de desbetreffende TF, Human en NK cell opgegeven voor het vinden van andere relevante artikels over TFs en hun invloed op menselijke NK cellen. Hier zijn alle TFs nodig voor ontwikkeling van mature functionerende NK cellen vanuit HSCs opgesomd, inclusief verschillen en gelijkenissen tussen muis en mens in de reeds bestaande kennis hierover. 16

22 3. Resultaten Zie bijlage 1 en 2 voor een schema van de verschillende stadia van NK cel ontwikkeling met de verschillende fenotypes en noodzakelijke TFs in elk stadium bij muis en mens respectievelijk. 3.1 Ontwikkeling van hematopoëtische stamcel tot multipotente progenitor cellen De 2 belangrijkste eigenschappen van hematopoëtische stamcellen (HSCs) zijn 1) hun capaciteit tot zelfvernieuwing, en 2) dat ze tot alle soorten bloedcellen kunnen uitgroeien. Ondanks deze definitie van HSCs, worden multipotente progenitorcellen (MPPs), die niet aan zelfvernieuwing doen, ook als HSCs beschouwd. HSCs bevinden zich hoofdzakelijk in het beenmerg, bij de mens zijn ze voor studies ook gepreleveerd uit navelstrengbloed (83, 84). Bij zowel mens als muis is CD34 (de homoloog bij muis is mcd34) een wel gekende merker voor HSCs (en progenitor cellen van alle cellijnen), waarbij HSCs met lange termijn zelfvernieuwing (zie hieronder) een lage CD34 expressie, en korte termijn zelfvernieuwende HSCs een grote expressie van CD34 vertonen (85) Muis HSC De meest primitieve HSCs vertonen Thy-1.1 low, stem cell antigen 1 + (Sca-1 + ), Lineage /low (Lin -/low ) (ze bezitten nog geen oppervlaktemerkers waardoor ze tot een specifieke cellijn zouden behoren), c-kit + (ook CD117 genoemd) als celoppervlaktemerkers. Deze cellen worden als LSK (Lin -/low Sca-1 + c-kit + ) cellen afgekort. HSCs kunnen onderverdeeld worden in 3 subgroepen, die elkaar opvolgen in de tijd: lange termijn zelfvernieuwende HSCs worden beschouwd als meest primitieve HSCs. Hieruit vloeien korte termijn zelfvernieuwende HSCs voort, die op hun beurt overgaan in multipotente progenitor cellen die geen merkbare mogelijkheid tot zelfvernieuwing meer vertonen (83, 86). Deze groepen kunnen onderscheiden worden door verschillende merkers. De eerste groep, lange termijn zelfvernieuwende HSCs, wordt fenotypisch gekenmerkt door Mac-1 - (of CD11b - ) CD4 c-kit + op hun celoppervlak en neemt ongeveer 0,007% van het beenmerg in. Deze gaan over in korte termijn zelfvernieuwende HSCs, die Mac-1 low CD4 vertonen en nemen 0,01% van het beenmerg in. De laatste groep zonder zelfvernieuwende eigenschappen, de multipotente progenitor cellen, vertoont een Mac-1 low CD4 low fenotype en neemt 0,03% in. 17

23 In deze studie van Morrison et al. bezitten alle drie de subgroepen buiten de hierboven beschreven merkers nog steeds het basis fenotype met celoppervlaktemerkers Thy-1.1 low Sca- 1 + Lin /low die de meest primitieve HSCs kenmerken (83). Een andere studie van Christensen et al. toont nog een andere merker aan ter onderscheid van de 3 subgroepen namelijk receptor tyrosine kinase Flk-2 (86). Christensen et al. tonen aan dat expressie van Thy-1.1 gedownreguleerd wordt bij opeenvolgende subgroepen. Bij lange termijn HSCs wordt Flk-2 niet tot expressie gebracht, en treft men een Thy-1.1 low Flk-2 - fenotype aan. Korte termijn HSCs vertonen een Thy-1.1 low Flk-2 + fenotype en dus wel expressie van Flk-2. De derde subgroep vertoont geen expressie meer van Thy-1.1 en bezit een Thy Flk-2 + fenotype, en zijn MPPs zonder zelfvernieuwing. Wel stelt deze studie dat deze derde groep functioneel meer matuur is dan de hierboven beschreven Mac-1 low CD4 low MPPs, en dus downstream van deze groep kunnen liggen, of een alternatieve pathway vanaf korte termijn HSCs vormen. Er wordt niet vermeld of dit Thy Flk-2 + fenotype ook op Mac-1 low CD4 low MPPs terug te vinden is (86) Mens HSC Humane HSCs, bestudeerd in navelstrengbloed en beenmerg, vertonen Lin - CD34 + CD38 - op hun celoppervlak, en de meest primitieve HSCs brengen ook CD90 (Thy1) tot expressie. Deze humane Lin - CD34 + CD38 - HSCs kunnen onderverdeeld worden in 3 subgroepen op basis van hun CD90 en CD45RA expressie, namelijk CD90 + CD45RA -, CD90 - CD45RA - en CD90 - CD45RA +. Deze drie groepen vertonen een hiërarchie en blijken respectievelijk downstream van elkaar te liggen, waarbij CD90 + CD45RA - cellen lange termijn zelfvernieuwing vertonen, CD90 - CD45RA - cellen een gedaalde capaciteit tot zelfvernieuwing vertonen, en CD90 - CD45RA + cellen geen capaciteit tot zelfvernieuwing vertonen. Majeti et al. stellen dat CD90 - CD45RA - cellen op basis van hun multipotente eigenschappen, incomplete zelfvernieuwing en plaats downstream van CD90 + CD45RA - cellen, geschikte kandidaat humane MPPs zijn. Deze studie van Majeti et al. stelt ook dat er voorlopig niet geweten is welke plaats CD90 - CD45RA + cellen innemen in de hematopoëtische hiërarchie (84). Een andere studie van Galy et al. toont een CD34 + Lin - CD45RA + populatie aan die, ondanks hun eveneens myeloïde differentiatie potentieel, beter in staat is om T cellen en NK cellen te genereren dan de CD34 + Lin - CD45RA - populatie. Deze cellen hebben dus lymfoïd en myeloïd potentieel, maar hebben zich afgesplitst van de erythroïde lijn en bezitten ook geen lange termijn zelfvernieuwingscapaciteit meer. Ze worden verondersteld nog verder onderverdeeld te kunnen worden in myeloïde en lymfoïde progenitors (87). 18

24 3.1.3 Transcriptiefactoren - Scl en Lyl1 Het stem cell leukemia gen Scl, codeert voor een basic helix-loop-helix (bhlh) TF. Deze wordt ook soms voorgesteld als SCL/TAL1, omdat de eerste ontdekking plaatsvond bij T cel acute lymfoblastische leukemie (TAL). Deze transcriptiefactor blijkt van belang voor vorming van de HSCs zowel bij mens als muis. Indien men echter bij adulte muis HSCs het Scl gen verwijderde, vertoonden deze wel nog lange termijn zelfvernieuwing, enkel korte termijn zelfvernieuwing was gereduceerd. Hieruit kan geconcludeerd worden dat Scl belangrijk is voor formatie, maar niet behoud van adulte HSCs. De Scl TF speelt een rol in differentiatie tot erythrocyten en megakaryocyten, maar niet voor lymfoïde of myeloïde ontwikkeling, en wordt tot expressie gebracht op alle cellen die erythrocyt-potentieel hebben, zoals HSCs, MPPs, MEPs en CMPs (zie verder). Op immature of mature cellen die geen erythrocytpotentieel hebben zijn Scl transcriptiefactoren niet terug te vinden. Ook bij de mens zijn deze resultaten gevonden, en Scl komt ook alleen maar tot expressie op cellen die erythroïd potentieel bezitten. Een andere maar zeer gerelateerde TF is Lyl1, met een bijna identiek bhlh domein, en zo ook gelijkaardige DNA- en proteïne-binding eigenschappen. Wel bleek Lyl1 weinig invloed te hebben op vorming van HSCs, doordat HSCs van Scl knock-out muizen niet gered konden worden van snelle apoptose ondanks expressie van Lyl1. Lyl1 bleek een grotere rol te spelen bij functionaliteit en dus behoud van adulte muis HSCs, waar Slc dan weer weinig invloed op had, buiten deze op korte termijn zelfvernieuwing. Ook bij de mens is Lyl1 teruggevonden, maar zijn functies zijn nog niet uitvoerig onderzocht (88, 89). - GATA-2 De GATA-2 TF behoort tot de GATA familie samen met GATA-1 en GATA-3. Ze herkennen gelijkaardige of identieke GATA-motieven in promotorregio s van verschillende genen. Expressie van GATA-2 bij de muis is gezien op HSCs, vroege progenitorcellen, megakaryocyten en mastcellen. Bij afwezigheid van GATA-2 in muis wordt een daling van MPPs opgemerkt, alsook het aantal mastcel precursoren en een totale afwezigheid van mastcellen. De enkele MPPs die nog overleven hebben een geringe capaciteit tot proliferatie en de meeste sterven. Dit duidt op een rol van GATA-2 in overleving en proliferatie van vroege HSCs. Hiernaast blijkt GATA-2 een rol te spelen in de expansie van mastcel 19

25 precursoren, alsook in differentiatie van mastcellen. Tevens is aangetoond dat GATA-2 onnodig is in ontwikkeling van lymfoïde cellen, terminale neutrofiel differentiatie, erythroïde of macrofaag differentiatie (90). Bij de mens worden HSCs en progenitorcellen in rustfase (in G 0 -fase van de celcyclus, is niet gelijk aan groeistop) gekenmerkt door verhoogde expressie van GATA-2. Als GATA-2 expressie kunstmatig verhoogd wordt in humaan navelstrengbloed, treft men een blok in de proliferatie van HSCs en progenitorcellen aan. Het mechanisme hierachter blijkt onder andere repressie van de TF MEF (zie verder) te zijn, maar dit is nog niet volledig opgehelderd, en andere factoren spelen ook een rol. Deze studie van Tipping et al. geeft voor muis HSCs en progenitorcellen dezelfde resultaten (91). - Heptad Sinds enkele jaren is er ook een verzameling van TFs gevonden die onderling samengroepen tot een heptad (7 TFs) en zo een gecombineerde interactie uitoefenen op verschillende stadia van HSCs en de eerste progenitorcellen in een volgend stadium (CMP en CLP, zie verder). Deze TFs zijn FLI1, ERG, GATA2, RUNX1, SCL/TAL1, LYL1, en LMO2. Deze cluster van 7 TFs bindt dan genmotieven zoals ETS, GATA, E-BOX, en RUNX. Deze heptad werd teruggevonden bij mens en muis, met bijbehorende target gen regio s. Daarbovenop werden, bij zowel mens en muis, ook interacties tussen transcriptiefactoren FLI1, GATA2, SCL/TAL1 en RUNX1 onderling gevonden (92, 93). 3.2 Ontwikkeling van multipotente progenitor cellen tot common lymphoid progenitors en common myeloid progenitors Muis CLP De Lin - IL-7Rα + Thy1.1 - Sca-1 low c-kit low populatie in het beenmerg van de muis vertoont veel potentieel om over te gaan tot B- en T cellen, en ze bevatten ook common lymphoid progenitor cellen (CLPs) die meer dan alleen B- en T cellen kunnen opleveren, zoals NK cellen. Doordat ze helemaal geen capaciteit tot myeloïde differentiatie vertonen, versterkt dit hun CLP potentieel. De receptor α keten van interleukine-7 (IL-7Rα), die een complex vormt met de gemeenschappelijke cytokine receptor γ keten, medieert ook signalen die zorgen voor overleving van T cel precursoren en het bevorderen van immunoglobuline zware keten herschikking (IgH) in B cel precursoren (94). Verder kan lage of afwezige expressie van merkers c-kit en Thy-1 ook bijdragen om muis CLPs te identificeren (95). 20

26 3.2.2 Mens CLP Een merker voor humane CLPs is CD7, waarbij de CD7 + subpopulatie van CD34 + CD38 - cellen in navelstrengbloed een duidelijke evolutie naar lymfoïde lijnen vertoond en geen potentiële ontwikkeling naar myeloïde of erythrocytaire lijnen bezit. Wel vertoonde deze subpopulatie geen expressie van Pax-5, een specifieke transcriptiefactor voor B cel ontwikkeling, en evenmin expressie van het CD3ε gen, dat belangrijk is voor T/NK cel differentiatie. Daarbovenop is ook DNA polymerase terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) afwezig, waarvan expressie één van de eerste stappen naar lymfoïde ontwikkeling is. Hieruit besluit men dat deze CD34 + CD38 - CD7 + populatie zich in een vroeger stadium bevindt dan de eerste B- of T cel progenitoren (95). Een andere studie van Galy et al. stelt als kandidaat voor humane CLPs in het beenmerg de CD34 + Lin - CD10 + populatie voor, die enkele gelijkenissen vertoont met de CD34 + CD38 - CD7 + populatie (uit het navelstrengbloed). Deze cellen bezitten evenmin mogelijkheid tot erythroïde of myeloïde differentiatie, en ontwikkellen zich tot B cellen, T cellen, NK cellen en dendritische cellen. Dit toont tevens aan dat DCs ontwikkelingsgerelateerd dichter aanleunen bij de lymfoïde cellijn dan de myeloïde. Een verschil met de CD7 + populatie hierboven beschreven is dat bij de CD34 + Lin - CD10 + populatie 97% van de cellen ook CD38 tot expressie brengt (87). Wel is aangetoond dat er bij de CD34 + CD38 - CD7 + populatie uit navelstrengbloed ook cellen bestaan die CD10 tot expressie brengen en niet uitsluitend tot de lymfoïde lijn beperkt zijn. Er bestaat zelfs een identieke CD34 + Lin - CD10 + populatie in het navelstrengbloed met myeloïde en erythroïde differentiatiemogelijkheid, waaruit te concluderen valt dat CD10 een verschillend discriminerend vermogen heeft voor lymfoïde restrictie afhankelijk van zijn aanwezigheid in navelstrengbloed of in het beenmerg (95). Daarbovenop is er ook bewijs dat T cellen, B cellen, NK cellen en DCs gegenereerd kunnen worden uit CD34 + Lin - CD10 - cellen van het menselijk beenmerg, hoewel minder efficiënt dan de CD10 + populatie. Dit valt te verklaren doordat de CD34 + Lin - CD10 - subset verschillende progenitoren bevat die stroomopwaarts van de CD34 + Lin - CD10 + subset liggen en dus precursoren ervan zijn (87). Een opmerkelijk verschil tussen mens en muis is dat humane CLPs (in de hierboven beschreven populaties) geen expressie van IL-7Rα vertonen (87, 95). Een CD34 + Lin - IL-7Rα + populatie uit het beenmerg vertoont wel Pax-5 en TdT expressie en stelt waarschijnlijk een verder gedifferentieerd B cellijn stadium voor (95). 21

27 3.2.3 CMP Indien men de IL-7Rα - celpopulatie bekijkt in het beenmerg van de muis zijn er op basis van expressie van oppervlaktemerkers Fcγ receptor-ii/iii (FcγR) en CD34 drie subpopulaties te onderscheiden: FcγR low CD34 +, FcγR low CD34 - en FcγR hi CD34 +. Als de specifieke differentiatie van elk van de drie subpopulaties apart onderzocht wordt, kan tot de conclusie gekomen worden dat de FcγR low CD34 - populatie uitsluitend kolonies blijkt voort te brengen die megakaryocyten en erythrocyten bevatten en op basis hiervan omschreven worden als megakaryocyt/erythrocyt lineage-restricted progenitors (MEPs). Onderzoek van de FcγR hi CD34 + populatie toont enkel differentiatie tot granulocyten en macrofagen, waardoor deze subpopulatie granulocyt/macrofaag lineage-restricted progenitors (GMPs) worden genoemd. De FcγR low CD34 + populatie vertoont geen zelfvernieuwingscapaciteit en differentieert tot GMPs en MEPs, waardoor ze dus stroomopwaarts ligt van de andere twee. Op basis daarvan wordt de FcγR low CD34 + populatie tot common myeloid progenitors (CMP) benoemd (96) Alternatief: lymphoid-primed multipotente progenitor De studie van Adolfsson et al. op muizen stelt dat cytokine tyrosine kinase receptor Flt3 een alternatieve route voor HSC ontwikkeling mogelijk maakt, die plaatsvindt vòòr de CLP en CMP stadia. Lange termijn zelfvernieuwende HSCs vertonen een LSK + CD34 low/- Flt3 - fenotype, terwijl korte termijn zelfvernieuwende HSCs LSK + CD34 + Flt3 - zijn. De populatie waar deze studie op doelt is de LSK + CD34 + Flt3 + populatie, die zowel myeloïd als lymfoïd potentieel bezit. Daarentegen bezitten deze cellen de mogelijkheid niet meer tot ontwikkeling naar megakaryocten en erythrocyten, waardoor reeds een eerste stap in de evolutie van HSCs gemaakt is. Aan deze populatie wordt de naam lymphoid-primed multipotente progenitor (LMPP) toegewezen. Tevens is een verhoogde IL-7Rα expressie vastgesteld, wat hun lymfoïde potentieel versterkt. Hun blijvende expressie van PU.1 en G-CSFR, belangrijk bij de ontwikkeling van granulocyten en monocyten, bewijst hun myeloïde potentieel. Deze studie stelt dan ook een alternatief model van HSC evolutie voor (figuur 4), waarbij LMPPs een stadium vòòr CLPs vormen en ook verder kunnen ontwikkelen naar GMPs (97). Later zijn in deze LMPP populatie toch nog megakaryocytaire en erythrocytaire voorlopercellen gevonden, wat indruist tegen de gevonden resultaten uit de studie van Adolfsson et al. Dit blijken echter uitzonderingen op de regel te zijn, en enkel zeldzame LMPPs bezitten nog megakaryocyt/erythroïd potentieel, waarschijnlijk doordat er nog een klein aantal 22

28 multipotente cellen aanwezig is in de LMPP populatie. De overgrote meerderheid van cellen differentieert nog steeds naar GMPs en CLPs (98). Figuur 4: Huidige en alternatieve modellen voor HSC en cellijn ontwikkeling. A) Het huidige, normale model, met de overgang van MPP naar CMP en CLP. B) Een alternatief model, waarbij een ST-HSC bij verlies van MEP potentieel overgaat tot een LMPP die dan bij verlies van GMP potentieel verder evolueert tot CLP. C) Een samengesteld model van A en B. (ST-)HSC: (short-term) hematopoietische stamcel; MPP: multipotente progenitor; LMPP: lymphoid-primed multipotente progenitor; CMP/CLP: common myeloid/lymphoid progenitor; MEP: megakaryocyt-erythrocyt progenitor; GMP: granulocyt-macrofaag progenitor(97) Transcriptiefactoren - PU.1 en GATA-1 Bij de muis zijn TFs PU.1 (Spi-1), die behoort tot de Ets-familie, en GATA-1 belangrijk voor de ontwikkeling van HSCs naar granulocyten, monocyten en lymfoïde cellen (CLP), en CMPs respectievelijk. Deze PU.1 + cellen kunnen granulocyte/monocyte/lymphoid progenitors (GMLPs) genoemd worden. Muis PU.1 + GMLPs differentiëren uitsluitend naar CLPs en GMPs en bezitten geen MEP potentieel meer. Daarenboven blijkt PU.1 bij de muis ook van belang te zijn bij zelfvernieuwing van HSCs. PU.1 wordt al op een laag niveau tot expressie gebracht op CD34 - LT-HSCs en CD34 + MPPs, om hun behoud te regelen, en blijft geëxpresseerd op de CMP en CLP stadia. TF GATA-1 daarentegen is nodig voor ontwikkeling naar megakaryocyt/erythrocyt en geeft aanleiding tot CMPs, welke precursoren zijn voor MEPs en GMPs. Dit toont aan dat GMPs geproduceerd kunnen worden volgens 2 verschillende pathways via deze transcriptiefactoren. In tegenstelling tot PU.1 komt GATA-1 23

29 niet tot expressie op CD34 - LT-HSCs en het grootste deel van CD34 + MPPs. PU.1 en GATA- 1 interageren met elkaar om hun effect uit te oefenen. Zo is het blokkeren van PU.1 door GATA-1 een cruciale stap in de ontwikkeling van erythrocyten. Dit gebeurt via binding van GATA-1 met PU.1 op het domein waar normaal het co-activatie proteïne c-jun op bindt, en dit laatste dus verhinderd wordt, alsook de activatie van PU.1. Omgekeerd wordt ook GATA- 1 geblokkeerd door PU.1, die een binding met GATA-1 aangaat bij differentiatie naar de myeloïde of lymfoïde lijn. Ook bij de mens zijn deze twee transcriptiefactoren teruggevonden met dezelfde regulerende functies: PU.1 zorgt voor ontwikkeling van myeloïde cellen en lymfocyten (B cellen), en GATA-1 voor ontwikkeling van erythrocyten. PU.1 en GATA-1 worden al tot expressie gebracht op MPPs (98, 99). - Ikaros en Aiolos Het Ikaros gen codeert voor een familie van zinc finger TFs die noodzakelijk zijn voor ontwikkeling van het lymfoïd immuunsysteem en later meer specifiek voor T cel maturatie. Dit gen kan voor het eerst opgemerkt worden in pluripotente HSCs en later nog in hoge expressie op maturerende lymfoïde cellen. Deze Ikaros proteïnen bestaan uit 6 isovormen, die gemeenschappelijke C-terminale en een combinatie van verschillende N-terminale zinc fingers bevatten, waarbij N-terminale nodig zijn voor het binden van DNA-sequenties en C- terminale zorgen voor homo- en heterodimeren tussen Ikaros isovormen onderling. Door knock-out muizen voor deze transcriptiefactor te bestuderen is gebleken dat dit gen een essentiële factor is tijdens de eerste stappen van lymfoïde specificatie, maar ook voor normale ontwikkeling van thymocyten. Aiolos is ontdekt als een homoloog van het Ikaros gen, en dan vooral met de grootste isovorm Ik-1, en is weerhouden voor expressie binnen de lymfoïde cellijn. Het is een activerende TF in homodimere vorm, maar heterodimeren met Ikaros isovormen, buiten de Ik-1 isovorm gerekend, zijn minder actief. Aiolos wordt teruggevonden in de late foetale thymus en volwassen lymfoïde organen van de muis. Deze transcriptiefactor wordt maar voor het eerst tot expressie gebracht in MPPs maar verhoogt sterk naarmate deze verder in B en T lymfoïde cellijnen differentiëren. Zo wordt in de vroege hematopoëse enkel Ikaros tot expressie gebracht en leidt pluripotente HSCs naar het CLP stadium. Hierdoor wordt Aiolos tot expressie gebracht en vormt heterodimeren met Ikaros complexen, die nu actiever zijn dan Ikaros homodimeren, en reguleren zo differentiatie naar B en T precursoren. Daarna wordt Aiolos nog sterker tot expressie gebracht en laat verdere ontwikkeling van lymfocyten toe. 24

30 Uiteindelijk zien we in mature B cellen, waar de expressie van Aiolos domineert, homodimere complexen van Aiolos (100). In de ontwikkeling van NK cellen dragen deze dus voornamelijk bij tot ontwikkeling van CLP, maar in de daaropvolgende stadia reguleren ze vooral differentiatie naar B en T cellen. Ook bij mensen vinden we Ikaros en Aiolos terug, allebei belangrijk in ontwikkeling van lymfoïde lijnen, en Aiolos zoals bij de muis in het bijzonder voor B cel ontwikkeling. Het Ikaros gen bevindt zich bij de mens op de korte arm van chromosoom 7 (p ) terwijl dit bij de muis op chromosoom 11 te vinden is. Er is een 95% homogeniteit tussen de sequenties van mens en muis Ikaros, en bij beiden konden 6 isovormen teruggevonden worden. Het menselijk Aiolos gen vertoonde 86% homogeniteit in vergelijking met muis Aiolos, en bevindt zich op chromosoom 17q11.2 (101, 102). - GATA-1, NF-E2 en C/EBPα Belangrijke transcriptiefactoren die myeloïde differentiatie bevorderen zijn GATA-1, NF-E2 en C/EBPα. Wel worden deze maar in kleine mate teruggevonden op CMPs zelf. GATA-1 is belangrijk bij ontwikkeling van erythrocyten en megakaryocyten, en NF-E2 is belangrijk voor maturatie van megakaryocyten. Zij worden dan ook in grote mate tot expressie gebracht bij MEPs. C/EBPα is betrokken bij maturatie van granulocyten en wordt zeer sterk teruggevonden bij GMPs (96). 3.3 Ontwikkeling van common lymphoid progenitor tot NK cel progenitor Muis NKP Een belangrijke stap in de ontwikkeling naar NK cel is expressie van een functioneel IL-15 receptor complex. Dit bestaat uit IL-15Rα, IL-2Rβ en de IL-2Rγ-keten. Op basis van expressie van deze β keten van de IL2 receptor, ook CD122 genoemd, gebeurt identificatie van de vroegste NKP in het muis beenmerg. CD122 blijkt niet alleen een bekende merker van NK cellijn specificiteit te zijn, maar is ook een essentiële stap voor volledige ontwikkeling van de NK cel. De studie van Rosmaraki et al. stelt tevens dat het tot expressie brengen van NK1.1 en DX5 een belangrijk kenmerk van mature NK cellen is, waardoor de in het beenmerg gevonden subset met Lin - CD3 - CD122 + NK1.1 - DX5 - expressie als eerste muis NK cel progenitor (NKP) bestempeld kan worden. Ze vertonen geen lytische activiteit, samen met een uitgesproken immatuur fenotype, zoals afwezigheid van Ly49 receptoren, leden van de NKR-P1 familie en lage tot geen aanwezigheid van CD2, CD90 en 2B4 (103). Fathman et al. hebben hierbovenop ook nog de expressie van CD27 en CD244, merkers gezien bij vroege 25

31 hematopoëtische cellen alsook mature NK cellen, aangetoond bij het verfijnen van NKPs. Na verfijning worden deze rnkps genoemd, met een Lin - CD27 + CD244 + CD122 + Flk2 - fenotype en vertonen dus ook CD122, wat aansluit met eerder vermelde resultaten (104). Ook zijn reeds bipotente NK/T progenitoren gevonden in muis thymus met het CD122 + NK1.1 - DX5 - fenotype, maar de relevantie hiervan binnen de ontwikkeling van de NK cellen staat nog niet op punt, omdat ook athymische muizen een normale NK cel differentiatie vertonen (103). NK/T progenitoren kunnen zowel T cellen als NK cellen genereren. Deze NK cellen kunnen differentiëren in de thymus zelf, net zoals T cellen, of zoals het merendeel van NK cellen bij de muis, in het beenmerg. De ontwikkeling van T cellen vanuit NK/T progenitoren is Notchafhankelijk (zie verder), maar ontwikkeling van zowel beenmerg als thymische NK cellen is onafhankelijk van Notch signalisatie. Deze bipotente NK/T progenitorcellen zijn niet alleen aanwezig tijdens de ontwikkeling, maar worden ook gevonden in adult beenmerg en zijn dus onderdeel van de volwassen hematopoëse. Ongeveer 40% van de CD122 + NK1.1 - DX5 - NKPs zijn positief voor expressie van IL-7Rα. Het is aangetoond dat thymus NK cellen IL-7 afhankelijk zijn voor ontwikkeling, terwijl beenmerg NK cellen onafhankelijk zijn van IL-7 (105) Mens NKP Volgens de studie van Miller et al. wordt bij de mens CD7 als oppervlaktemerker herkend voor NKPs en daaropvolgende stadia. Een lage expressie van CD7 (CD7 dim ) wordt vastgesteld bij NKPs, en deze expressie verhoogt tot een CD7 bright expressie op mature NK cellen. Stijging van CD7 expressie gaat gepaard met verhoogde efficiëntie van deling, vermindering van nood aan IL-2 voor generatie van NK cellen, stijging van de expressie van IL-2 receptor (IL2Rβ) alsook daling van nood aan contact met beenmerg stroma voor verdere differentiatie van NK cellen. Contact met het beenmerg is ook nodig voor inductie van CD2 op NK cellen. CD2 staat gekend voor zijn rol in de activatie van NK en T cellen, alhoewel CD2 bij T cellen eerder geïnduceerd wordt door de thymus in plaats van het beenmerg (106). Ook bij de mens vinden we bipotente NK/T progenitorcellen terug in de thymus (107). De studie van Yu et al. heeft echter vastgesteld dat CD122 expressie ook op humane NKPs kan teruggevonden worden (via flow cytometrie na kweek gedurende 10 dagen in een Flt3 ligand omgeving), die dan verder differentiëren in reactie op IL-15. Dit CD34 bright CD122 + fenotype wordt geïnduceerd door Flt3 ligand (FL) en c-kit ligand (KL) op hun type 3 tyrosine kinase receptoren, Flt3 en c-kit respectievelijk. Deze liganden zorgen voor expansie van NKPs, maar niet voor differentiatie (dit gebeurt door IL-15). Wel tonen de resultaten aan dat FL een 26

32 grotere invloed uitoefent op deze expansie in vergelijking met KL, dat op zijn beurt meer invloed uitoefent op volwassen CD56 bright cellen (zie verder). Zonder expansie van deze NKPs door FL en KL kan echter geen CD122 expressie gedetecteerd worden bij de mens, waarschijnlijk omdat dit onder de detecteerbare grens ligt (108). Gedurende lange tijd werd er verondersteld dat net zoals bij muis, ook bij de mens het beenmerg de belangrijkste plaats is waar NK cel ontwikkeling geschiedt. Echter bestaat er sinds enkele jaren twijfel hierover. Een studie van Freud et al. toont aan dat een CD34 dim CD45RA + NKP subset uit het beenmerg migreert en in een perifere lymfeknoop verblijft waar verdere ontwikkeling tot CD56 bright NK cellen plaatsvindt. Het is niet zeker in welke mate organen zoals lever, milt en lymfeknopen een rol spelen in ontwikkeling van NK cellen, maar deze alternatieve plaatsen naast het beenmerg bestaan en zijn nodig voor het vervullen van bepaalde aspecten ervan (109) Transcriptiefactoren - Ets-1 Ets-1 behoort tot de Ets familie van helix-draai-helix (niet hetzelfde als bhlh) TFs (samen met PU.1 en MEF). Ze binden purinerijke DNA motieven die een GGA-kern bezitten. Eerdere studies op muizen hebben aangetoond dat Ets-1 niet noodzakelijk is voor ontwikkeling van mature T (CD4 + of CD8 + ) en B cellen, alsook monocyten, megakaryocyten, neutrofielen en erythrocyten. Wel speelt Ets-1 bij een rol in ontwikkeling van NK cellen, afgeleid uit verminderde aantallen in de milt en gedaalde cytolytische activiteit van NK cellen bij afwezigheid van Ets-1. Het mechanisme achter deze regulatie, alsook op welk stadium precies Ets-1 ingrijpt, is nog niet met zekerheid gekend. Als mogelijke verklaringen voor de regulatie, suggereren Barton et al. dat ofwel Ets-1 gewoonweg de expressie van genen nodig voor ontwikkeling of overleving reguleert, waarbij het evengoed expressie van cytokines kan zijn die op hun beurt de differentiatie van NK cellen regelen. Een andere mogelijkheid was dat Ets-1 misschien expressie van enkele proximale signaal transductie moleculen zou regelen die instaan voor ontwikkeling van thymocyten en NK cellen, met de grootste invloed op de laatst genoemde (110). De studie van Ramirez et al. toont aan dat Ets-1 bij de muis instaat voor regulatie van expressie van Id2 en T-bet, die nodig zijn voor differentiatie van NK cellen (111). Het is aangetoond dat Ets-1 expressie vroeger in de ontwikkeling van NK cellen voorkomt dan Id2. Daarnaast speelt Ets-1 ook een rol in expressie en functie van NK cel receptoren, die nodig zijn voor lyse gemedieerd door NK cellen. Een laatste grote functie van Ets-1 volgens Ramirez et al. bestaat erin de drempelwaarde in te stellen voor cytokine- 27

33 responsiviteit van NK cellen, waarbij er een status van chronische activatie ontstaat bij deficiëntie van Ets-1. De controle van Ets-1 expressie is nog niet volledig gekend, men opteert dat deze via feedback kan gebeuren of via zichzelf (111). Ets-1 is bij de mens ook aanwezig maar weinig onderzoeken werden reeds gedaan naar hun rol in NK ontwikkeling, de meeste studies handelen over hun al dan niet betrokkenheid bij B en T cel ontwikkeling. Wel is gezien dat expressie van Ets-1 onderhevig is aan IL-2 en IL-15 stimulatie (112). - TOX Thymocyte selection-associated HMG box factor (TOX) werd initieel opgemerkt in de differentiatie van thymocyten en wordt uitgedrukt tijdens specifieke stadia van T cel ontwikkeling in de thymus. TOX is specifiek nodig voor ontwikkeling van CD4 T cellen, maar niet van CD8 T cellen. Daarnaast speelt TOX ook een rol in ontwikkeling van NK en LTi cellen. Zoals TOX tot expressie komt bij CD4 + thymocyten, is deze sterk tot expressie gebracht op immature NK cellen in het beenmerg en is belangrijk voor hun verdere ontwikkeling. Of TOX ook bij LTi cellen in een bepaald stadium verhoogd tot expressie komt is niet geweten. Doordat TOX een rol speelt in de ontwikkeling van LTi cellen is deze ook van belang voor formatie van Peyerse platen en perifere lymfeknopen (zie inleiding). Wel is aangetoond dat in afwezigheid van TOX er toch nog enkele Peyerse platen teruggevonden kunnen worden, doch schaarser en kleiner, dit in tegenstelling tot Id2 deficiëntie, waarbij totaal geen Peyerse platen meer aanwezig zijn. Het mechanisme waarmee differentiatie van NK cellen en LTi cellen gepromoot wordt is nog niet helemaal duidelijk (113). Ook bij de mens vindt men TOX terug bij ontwikkeling van NK cellen. De studie van Yun et al. toont aan dat expressie van TOX verhoogd is bij de vroege stadia van NK cel ontwikkeling, en expressie verlaagt naarmate de maturatie vorderde, wat impliceert dat TOX een rol speelt bij NK differentiatie, maar niet bij NK maturatie. Meer bepaald de IL-15 afhankelijke ontwikkeling van humane NK cellen wordt beïnvloed door TOX. Bij downregulatie van het TOX gen bleek het aantal NK cellen gedaald, maar hun cytotoxiciteit en IFN-γ bleef gespaard. Ook bleek expressie van T-bet (zie verder) gedaald bij downregulatie van TOX (114). - Bcl11b Belangrijk om te vermelden is de TF Bcl11b, een zinkvinger proteïne. Deze is vooral van belang voor ontwikkeling van vroege T cellen. Bij knock-out muizen voor dit gen is vastgesteld dat thymocyten de neiging hebben om NK cellijn moleculen tot expressie te 28

34 brengen. Deze omvorming tot NK-achtige cellen wordt reprogrammering genoemd en de cellen zelf worden geïnduceerde T-tot-NK cellen genoemd (ITNK). De ITNK cellen vertonen naast hun fenotype ook gelijkaardige killing eigenschappen als NK cellen. Dit wijst erop dat Bcl11b vooral T cel specifieke genen promoot en ontwikkeling van NK cellen onderdrukt. Bij de mens is deze TF ook reeds ontdekt, maar dan vooral in context van T cel ontwikkeling (115) T cel vs B cel ontwikkeling Stroomafwaarts van het CLP stadium kunnen CLPs differentiëren naar ofwel B cellen, T cellen of NK cellen. De studie van Haddad et al. stelt enkele vroege lymfoïde precursoren (ELP) voor, gevonden in humaan navelstrengbloed; de subset met een CD34 + CD45RA hi CD7 + fenotype vertoonde neiging om naar de T/NK cellijn te differentiëren en deze met een CD34 + CD45RA hi Lin - CD10 + fenotype kwam overeen met pro-b cellen. Wel stelllen Haddad et al. dat geen van deze bovengenoemde populaties CLPs kunnen zijn, omdat ze niet elk afzonderlijk over de capaciteit beschikken om te differentiëren naar gelijk welke lymfoïde cellijn (T, B of NK cel), en daarbovenop myeloïde differentiatie uitgesloten is (116). T cel: Notch1 Zeer belangrijk blijkt de TF Notch1 te zijn, die een obligate en selectieve rol speelt in ontwikkeling van T cellen vanuit CLPs. Notch1 staat in voor het kritisch signaal dat T versus B cellijn bepaalt, waarbij één van de twee cellijnen gepromoot wordt ten koste van de andere (geen B maar wel T cellen bij aanwezigheid Notch1, en geen T maar wel B cellen bij afwezigheid van Notch1). Voor elke andere lymfoïde of de gehele myeloïde cellijn ontwikkeling is Notch1 overbodig (117). B cel: Pax5 Bij B cellen is het vooral Pax5 die de belangrijkste TF blijkt te zijn voor differentiatie van de vroegste B cel precursoren naar de B cellijn. Het is aangetoond dat Pax5 het B cel equivalent van Notch1 bij T cel ontwikkeling is (zie hierboven), waarbij expressie van Pax5 de Notch1 transcriptie inhibeert (en omgekeerd). Wel vertoont Pax5 geen verstorende invloed op NK cel ontwikkeling, wat hoogstwaarschijnlijk te verklaren valt doordat TF Id2 de stroomopwaarts liggende TF E2A, nodig voor ontwikkeling van de vroegste B cel precursoren, inactiveert (118). 29

35 3.4 Ontwikkeling van NK cel progenitor tot immature NK cel Muis ink In lijn met het hierboven beschreven CD122 + NK1.1 - DX5 - fenotype van muis NKP cellen, blijkt dat het CD122 + NK1.1 + DX5 - fenotype intermediaire levels van oppervlaktemerkers vertoont (zie Mens ink ), samen met een gemiddelde cytotoxiciteit. Deze cellen worden immature NK cellen (ink) genoemd. Dit geeft aanleiding tot het model van NKPs (met NK1.1 - DX5 - ) > NK1.1 + DX5 cellen > NK1.1 + DX5 + cellen die als mature NK cellen aanzien worden (103) Mens ink De humane NK cellen vertonen amper of geen expressie van CD122, NK1.1 of DX5, maar vertonen geleidelijk aan CD56 bright expressie, samengaand met stijgende cytokine productie en natuurlijke cytotoxiciteit. Wat wel hetzelfde is bij muis en mens NK cel ontwikkeling is het geleidelijk, op een niet-willekeurige volgorde verwerven van NK cel receptoren. Hierbij zijn CD161 (NKR-P1) en NKp46 bij de eerste detecteerbare receptoren, gevolgd door CD94, wat tevens samengaat met de capaciteit om IFN-γ te produceren, en als laatste CD16 (FcγRIIIα) en KIR (Ly49 receptoren bij de muis). Andere merkers die men beoordeelt op intermediaire NK cel stadia zijn CD2, CD7, CD11b (Mac-1), CD117 (c-kit) en NKp44 (119) Transcriptiefactoren - Nfil3/EBP4 Nfil3, ook wel EBP4 genoemd, is een leucine-zipper TF, en is bij de muis belangrijk voor ontwikkeling van NK cellen uit NKPs, maar er zijn ook aanwijzingen dat deze een rol speelt bij IL-3 afhankelijke overleving van B cellen, bij transcriptionele controle van het circadiaans ritme van zoogdieren, bij groei en overleving van motorneuronen, expressie van de von Willebrand factor, en osteoblasten functie. Als Nfil3 expressie doorheen de muis lymfoïde lijn bekeken wordt, vindt men deze terug op IL-15 afhankelijke NK cellen, natural killer T lymfocyten (NKT) - dit zijn cellen die gemeenschappelijke kenmerken/eigenschappen van zowel T als NK cellen vertonen (bijvoorbeeld een T cel receptor en receptoren van de NK cellijn) en voornamelijk in de thymus ontwikkelen - en CD8 + memory T cellen. De EBP4 expressie blijft hoog gedurende NK ontwikkeling naar mnks, wat kan wijzen op een rol bij behoud van hun functie. Daarnaast beïnvloedt EBP4 expressie van GATA-3 en Id2, in die zin 30

36 dat een hoge expressie van EBP4 resulteert in een verhoogde expressie van GATA-3 en Id2. Beiden komen ze, zoals EBP4, reeds tot expressie op NKPs en in stijgende lijn naarmate de cel zich verder in de NK ontwikkeling bevindt. Doordat Id2 expressie onderhevig blijkt te zijn aan EBP4 functie, ligt deze laatste hoger stroomopwaarts dan Id2 in NK differentiatie (120). Bij de mens zijn nog maar weinig studies uitgevoerd naar functies en expressie van E4BP4. Wel is deze aanwezig, en al teruggevonden op humane NKPs, en andere NK cellen uit de decidua, navelstrengbloed, en perifeer bloed. De hoeveelheid E4BP4 mrna in deciduale CD34 + cellen is vergelijkbaar met deze van mature deciduale NK cellen. De aanwezigheid van E4BP4 in deciduale CD34 + cellen kan mogelijks een gevolg zijn van IL-15/IL-15R interactie. T cellen vertonen geen E4BP4 en B cellen in zeer lage aantallen, wat aantoont dat E4BP4 voor het overgrote deel tot de NK cellijn behoort (121). - Runx proteïnen Er bestaan 3 soorten Runx transcriptiefactoren namelijk Runx1 (AML1 en Cbfa2), Runx2 (AML3 en Cbfa1) en Runx3 (AML2 en Cbfa3), die expressie van bepaalde genen controleren door het interageren met co-activators of co-repressors. Al deze leden van de Runx familie bezitten een gemeenschappelijk Runt-domein dat bindt op een target sequentie samen met een common beta subunit (CBFβ). Het is geweten dat muis Runx1 een rol speelt bij de ontwikkeling van HSCs, megakaryocyten, B cellen, T cellen, en NKT cellen, en dat Runx3 van belang is bij CD8 T cel ontwikkeling. De studie van Ohno et al. toont aan dat vooral Runx3 van belang is bij muis NK cel ontwikkeling, vanaf het NKP stadium tot en met mature NK cellen (122). De studie toont dat acquisitie van CD122, een merker voor de NKPs, en maturatie van NK cellen door expressie van Ly49 familie, Mac-1 en CD43 moleculen, onder controle staat van Runx proteïnen, waarbij Runx deze positief beïnvloedt. Daarnaast werd ook aangetoond dat Runx proteïnen de productie van IFN-γ negatief beïnvloeden. Hierdoor is deze TF moeilijk bij 1 bepaald stadium te plaatsen maar beïnvloedt hij de NK cel ontwikkeling over de hele lijn (122). Bij de mens zijn Runx proteïnen geïdentificeerd bij regulatie van KIR genen voor NK cellen. De studie van Trompeter et al. gebruikt de AML benaming voor het aanduiden van de Runx proteïnen (123). Er is vastgesteld dat het vooral AML2 (overeenkomend met Runx3 zoals bij de resultaten van de muis) is dat bindt op de KIR promotor regio, wat aanduidt dat NK cellen meer AML2 dan AML1 of AML3 tot expressie brengen. Opvallend is dat alle drie de AML proteïnen een inhiberende invloed vertonen op expressie van KIR bij menselijke NK cellen, door binding op de promotor regio (123). 31

37 3.5 Ontwikkeling van immature NK cel tot mature NK cel Muis mnk Mature NK cellen (mnk) van de muis vertonen een CD122 + NK1.1 + DX5 + fenotype. Hiernaast hebben deze cellen ook een maximale expressie van Ly49, CD94/NKG2 en NKR- P1 familie receptoren. Verder is er ook een verhoogde expressie van 2B4, CD2, CD90, CD43 en Mac-1 (CD11b) (50, 103) Mens mnk Net zoals bij muis mnk cellen worden ook mens mnk cellen gekenmerkt door maximale expressie van receptoren en merkers die slechts intermediaire niveaus van expressie kenden bij ink cellen. mnk cellen vertonen expressie van CD161, NKp46, CD94, CD16 en KIRs. Het belangrijkste verschil met de muis is hier dat mens mnk cellen uit twee subsets bestaan; CD56 dim en CD56 bright cellen. Deze eerste is, zoals reeds eerder vermeld, belangrijk voor cytotoxiciteit, terwijl de tweede vooral een rol speelt bij proliferatie en cytokine productie. In het perifeer bloed is vooral de CD56 dim subpopulatie aanwezig, met hoge expressie van CD16 en KIRs. De studie van Freud et al. speculeert op basis van fenotypische en functionele eigenschappen dat de CD56 dim populatie misschien wel het laatste stadium van NK cel maturatie is, volgend op het CD56 bright stadium, maar er is nog geen bewijs om deze hypothese te staven (119) Transcriptiefactoren - GATA-3 GATA-3 expressie wordt al teruggevonden op HSCs, en verder op CLPs, pro- en pre-t cellen en Th2 CD4 + cellen. Deze transcriptiefactor vervult een essentiële rol bij ontwikkeling van T cellen, meer bepaald Th2 cellen door productie van type 2 cytokines (IL-4, IL-5 en GM-CSF) te promoten, terwijl productie van type 1 cytokines (IFN-γ en TNF) geïnhibeerd wordt (124, 125). Hiernaast vertoont GATA-3 ook enkele rollen bij muis NK differentiatie, zo speelt deze een rol bij transitie van het CD11b low (Mac-1 low )/CD43 low (markers van maturatie) naar het CD11b hi /CD43 hi stadium van NK cellen. GATA-3 promoot ook IFN-γ (type 1 cytokine) productie van NK cellen, wat paradoxaal is met de invloed van GATA-3 op T cellen (zie hierboven). Wel vertoont GATA-3 geen invloed op ontwikkeling van de natuurlijke cytotoxiciteit van de NK-cellen, enkel dus op productie van IFN-γ. Ook homeostase van NK 32

38 cellen in de lever is onderhevig aan expressie van GATA-3, met een gedaald aantal NK cellen bij GATA-3 knock-out, wat samen met eerdere resultaten van gedaalde T cel migratie naar lymfeknopen bij GATA-3 deficiëntie, suggestief is voor een rol van GATA-3 in distributie van muis T en NK cellen naar verschillende weefsels. Bij afwezigheid van GATA-3 worden ook geen immature T cellen in de thymus gevonden. Daarbij wordt wel NK cel ontwikkeling gezien, echter zonder huizing in de thymus, wat suggereert dat GATA-3 een rol speelt in de kolonisatie van vroege toegewijde lymfoïde progenitoren of reeds T cel progenitoren naar de thymus. Dit toont aan dat er geen obligate pathway vanuit de thymus nodig is voor NK differentiatie (125). GATA-3 is ook terug te vinden bij de mens, met vermoedelijk gelijkaardige effecten in de ontwikkeling (124). - Id2 De inhibitor van DNA binding 2 (Id2) is een helix-loop-helix transcriptiefactor, aanwezig bij zowel mens als muis, nodig voor NK ontwikkeling en als antagonist van E proteïne-activiteit fungeert. Dit gebeurt door binding met E proteïnen en zo preventie van binding tussen E proteïnen en DNA op de E-box binding sequenties, doordat Id proteïnen niet over een DNAbinding domein beschikken. E proteïnen E12 en E47 worden gecodeerd door het E2A gen, en zijn essentieel voor ontwikkeling van toegewijde B cel progenitoren, dit door inductie van de vroege ( early ) B cel factor (EBF) en daaropvolgend activatie van Pax5. Andere E proteïnen zijn E2-2 en HEB, waarbij HEB een rol speelt in ontwikkeling van vroege T cellen, en verhinderen van ontwikkeling van NK cellen. Id2 heeft 2 functies zowel bij mens als muis: enerzijds sekwestreren van E proteïnes en zo ontwikkeling van B en T cellen verhinderen; en anderzijds, zeker als Id2 samen met IL-15 tot expressie gebracht wordt, het verhogen van het aantal NKPs en het drijven naar ontwikkeling van mature NK cellen (107, 126). Ondanks dat bij de muis Id2 expressie zeer sterk verhoogd wordt bij overgang van CLP naar NKP, is echter vastgesteld dat muis Id2 niet van belang is bij ontwikkeling van NKPs (maar dus wel bij stijging van het aantal NKPs), maar vooral belangrijk is voor ontwikkeling van mnk cellen in het beenmerg van de muis (126). Bij een deletie van Id2 wordt het aantal NKPs niet verstoord, maar ook niet uitgebreid, terwijl de ontwikkeling tot mature NK cel wel verstoord is. Wel is vastgesteld dat bij muizen de NK cel ontwikkeling in de thymus niet gestoord is bij Id2 deficiëntie. Dit wordt toegeschreven aan het feit dat alle thymische NK cellen van de muis IL-7Rα (CD127) vertonen, terwijl dit bij de mens maar een kleine fractie van de thymus NK cellen is. De cellen die CD127 tot expressie brengen zouden een ander pad van ontwikkeling volgen, dat onafhankelijk is van Id2. Daarnaast is Id2 ook nodig voor ontwikkeling van 33

39 lymfeknopen, Peyerse platen en nasaal-geassocieerd lymfoïd weefsel, alsook ontwikkeling van LTi cellen nodig om deze secundaire lymfoïde organen te vormen. Ook Id3 heeft gelijkaardige effecten op inhibitie van T cel ontwikkeling en de stimulatie van NK cel ontwikkeling, en wordt al teruggevonden vanaf het NKP stadium. Bij het opkomen van Id2 wordt een gelijktijdige daling van Id3 expressie vastgesteld, en Id2 wordt meer dan Id3 tot expressie gebracht op thymuscellen, en bij Id3 deletie waren de defecten in lymfopoëse niet zo ernstig. Dit laat suggereren dat Id2 de hoofdantagonist is van E proteïnes in mnk, en dat Id2 en Id3 misschien wel samen de meer immature NK cellen regelen (107, 126). - MEF Myeloid Elf-1-like factor (MEF), ook Elf4 genoemd, behoort tot de Ets-familie van helixdraai-helix transcriptiefactoren (zoals ook PU.1 en Ets-1). MEF wordt zowel op myeloïde als op lymfoïde cellen tot expressie gebracht. Bij afwezigheid van MEF in de muis wordt een opvallende daling in het aantal NKT cellen gezien, alsook een daling in het aantal NK cellen, en ook de functie van NK cellen is aangetast, met gedaalde IFN-γ en perforine secretie en de onmogelijkheid om tumorcellen zonder MHC-I expressie te lyseren. De ontwikkeling van NKT cellen in de thymus is het meest aangetast door MEF deficiëntie. Daarbuiten kan MEF ook een rol spelen in regulatie van lysozyme-expressie van epitheelcellen op mucosale oppervlakten. MEF speelt daarentegen geen rol in ontwikkeling van B en T cellen, maar zorgt bij deficiëntie wel voor een verminderde cytolytische activiteit bij CD8 + T cellen, dat niet te wijten is aan afwijkingen in het perforine-gen (127). Bij de mens zijn er nog weinig onderzoeken verricht naar de invloed van MEF op NK cellen, maar MEF is wel al teruggevonden bij mensen bijvoorbeeld met betrekking tot zijn invloed op lysozyme expressie op epitheelcellen of positieve invloed op activatie van IL-8. Lysozyme is belangrijk bij de aangeboren immuniteit op de mucosale oppervlakten tegen pathogenen. IL-8 is een chemokine dat een rol speelt bij chemotaxis van neutrofielen, agiogenese en stamcel mobilisatie (128, 129). - IRF IRF-2 IFN regulatory factor (IRF)-2 is bij de muis belangrijk voor overleving van immature CD11b low DX5 hi NK cellen, zodat deze verder kunnen matureren en naar perifere lymfoïde organen kunnen migreren. Zo worden bij afwezigheid van IRF-2 NK cellen in de periferie vastgesteld met zeer immature fenotypes, alsook weinig Ly49 receptor-expressie. In het 34

40 beenmerg zelf daarentegen wordt bij IRF-2 deficiëntie een meer matuur fenotype waargenomen, namelijk tot het CD11b low DX5 hi fenotype met een iets groter Ly49 repertoire, maar volledig gematureerde (CD11b hi DX5 hi ) NK cellen blijven afwezig zowel in beenmerg als in milt. Hierdoor wordt IRF-2 een rol in maturatie van perifere NK cellen toegewezen. Tevens vertonen deze bijna mature NK cellen in het beenmerg een verhoogde graad van (premature) apoptose, wat afwezigheid van gematureerde NK cellen verklaart, alsook de inefficiënte distributie naar de periferie. Indien het om een ontwikkelingsblokkade zou gaan, zou er een ophoping van immature NK cellen vastegesteld worden. Doordat IRF-2 een transcriptie-activerende rol op het celcyclus gereguleerde histone H4 gen heeft, is IRF-2 mogelijks betrokken bij celcyclus controle. Een IRF-2 deficiëntie heeft dan als gevolg dat er een cyclusarrest ontstaat, met vervroegde apoptose als gevolg. Verder wordt de G2 +, A + en D + variant van Ly49 receptoren in verhoogde expressie in het beenmerg teruggevonden bij IRF-2 deficiëntie, wat correleert met NK cellen in een CD11b low stadium. De Ly49I variant daarentegen, wordt bijna niet gezien in zowel beenmerg als milt NK cellen, wat mogelijks verklaard kan worden doordat Ly49I pas in een later NK cel stadium tot expressie komt. Hier kan ook een tot nu toe nog ongekende rol voor IRF-2 in schuilen. Ondanks deze maturiteitsafwijkingen, is de cytotoxiciteit van de immature NK cellen zowel in beenmerg als milt normaal gebleven. Als verklaring hiervoor stelt men voor dat verwerving van natuurlijke cytotoxiciteit gebeurt in vroege stadia, terwijl productie van IFN-γ pas op gang komt bij overgang van CD11b low naar CD11b hi. De studie van Taki et al. stelt ook vast dat IRF-2 stroomafwaarts van IL-15 inwerkt op NK cellen, en onafhankelijk van elkaar. NK cel aantallen in het beenmerg zijn namelijk een tienvoud meer bij IRF-2 deficiëntie dan bij IL-15 deficiëntie, alsook Ly49 varianten G2, A en I waren afwezig bij IL-15 knock-out muizen. Er bestaat ook een kleine gelijkenis tussen GATA-3 deficiëntie en IRF-2-deficiënte met betrekking tot NK cel fenotypes, maar GATA-3 speelt eerder een rol in inductie van maturatie, terwijl immature cellen overleven door IRF-2 signalisatie (130). IRF-1 Verder wordt bij IRF transcriptiefactoren ook nog IRF-1 opgemerkt. IRF-1 speelt niet zozeer direct een rol in ontwikkeling van NK cellen, maar is vooral van belang voor behoud en functie van de radioresistente cellen in het beenmerg, die nodig zijn voor interactie en daaropvolgende ontwikkeling van NK cellen. Het is aangetoond dat IRF-1 instaat voor activatie van de IL-15 promotor via binding met een 13-basenpaar sequentie, en dus van inductie van translatie van het IL-15 gen. Zoals reeds eerder vermeld, is IL-15 zeer belangrijk 35

41 voor de ontwikkeling van NK cellen. Ontwikkeling van NKT cellen is niet aangetast bij IRF-1 knock-out muizen, doordat dit plaastvindt in een andere omgeving dan bij NK cellen. Doordat IRF-1 deficiëntie zowel het behoud van beenmergcellen als inductie van transcriptie van het IL-15 gen aantast, heeft dit als gevolg dat ook NK cel ontwikkeling aangetast wordt, maar niet de NKPs zelf (131). Eerder werd al aangetoond dat IRF-1 tot repressie wordt gebracht door IRF-2, en dat IRF-2 daardoor een oncogeen potentieel heeft, door het proapoptotisch effect van IRF-1 te blokkeren (130). Bij de mens zijn er nog geen studies over het effect van IRF-1 of IRF-2 op NK cel ontwikkeling teruggevonden. Wel zijn de TFs al ontdekt bij de mens, namelijk op chromosomen 5q31.1 en 4q35.1 voor IRF-1 en IRF-2 respectievelijk (132). - T-bet De T-bet TF, gecodeerd uit het Tbx21 gen, maakt deel uit van de T-box familie van TFs gekenmerkt door een 200 basenparen lang DNA bindend domein, de T-box genoemd. T-bet wordt bij de muis tot expressie gebracht op Th1 cellen, maar niet op Th2 cellen. Zowel CD4 + T als CD8 + T als dendritische cellen vertonen een ernstig defect in productie van IFN-γ bij afwezigheid van T-bet. Bij B cellen heeft T-bet een controle over transcriptie van het IgG2a gen. Een afwezigheid van T-bet geeft bij de muis ook een daling van perifere NK cellen en NKT cellen, en de aanwezige cellen zijn niet tot het laatste stadium van maturatie ontwikkeld (zie verder). NK en NKT cellen kennen een verschillende precursor cel, waardoor T-bet onafhankelijk werkt in beide groepen. Wel werkt T-bet in op gelijkaardige stadia van de verschillende groepen, namelijk om finale maturatie te vervullen. T-bet deficiëntie bij muis NK cellen resulteert in een lichte daling van IFN-γ, perforine en granzyme B productie. Hierbovenop zijn NK cellen zoals eerder vermeld niet volledig tot het eindstadium gematureerd, waardoor cytolytische eigenschappen al zeker niet volledig op punt staan. Bij NKT cellen is er door afwezigheid van T-bet helemaal geen IFN-γ productie meer te vinden. Dit valt te verklaren doordat NKT cellen pas in het eindstadium expressie van IFN-γ verhogen. Ook dient opgemerkt te worden dat de TF Eomesodermin (zie verder) niet aanwezig is bij NKT cellen maar wel bij NK cellen. Deze zou mogelijks de inefficiënte IFN-γ productie bij T-bet afwezigheid deels compenseren in de vroegere stadia, terwijl T-bet zelf nodig zou zijn voor het behoud van deze actie. De daling van perifere aantallen bij T-bet deficiëntie is bij NKT cellen ernstiger dan bij NK cellen. Dit valt te verklaren doordat NKT cellen pas in het eindstadium CD122 tot expressie brengen en het voorlaatste stadium deze 36

42 oppervlaktereceptor niet bezit, en aldus niet adequaat kunnen reageren op IL-15. IL-15 is bij deze cellen noodzakelijk ter proliferatie en perifeer behoud. In tegenstelling tot de NKT cellen, is bij NK cellen deze daling in de perifirie niet te wijten aan het onvermogen te reageren op IL-15, aangezien deze NK cellen wel CD122 tot expressie brengen en kunnen dus wel prolifereren in reactie op IL-15. Men ziet een verhoogde turnover van perifere NK cellen, met gestegen expressie van activatiemerker CD69, en een daaropvolgende spontane apoptose. Hiervoor zijn verschillende hypothesen opgesteld: 1) ofwel is T-bet belangrijk voor maturatie en perifere homeostase van NK cellen (deficiëntie geeft spontane activatie en apoptose); 2) of T-bet is verantwoordelijk voor de overleving van NK cellen (maar ook IL-15 heeft deze rol al); 3) of de daling van perifere NK cellen is te wijten aan een gedaalde migratie uit het beenmerg. Dit laatste argument kan gestaafd worden doordat een lichte stijging van NK cellen in het voorlaatste stadium te vinden is in het beenmerg, samen met het feit dat verminderde expressie van CD43 en integrines wordt vastgesteld, die belangrijk zijn voor cel-cel adhesie en migratie processen. De eerste hypothese kan gestaafd worden door het feit dat overexpressie van T-bet opnieuw verhoogde perifere NK cellen vertoonde, samen met een volledige maturatie. De expressie van IRF-2, MEF en Ets-1 zijn normaal bij afwezigheid van T-bet, waardoor aangenomen wordt dat deze stroomopwaarts van T-bet functioneren. Opmerkelijk is dat zowel bij muis als mens twee Ets-bindingsplaatsen gevonden worden bij de proximale promotors van T-bet, wat de mogelijkheid wekt dat Ets TFs (MEF, PU.1, Ets-1) expressie van T-bet kunnen regelen. Drie target-genen van T-bet zijn perforine, granzyme B en Runx1 (133). Bij de mens zijn studies rond T-bet en zijn plaats bij imuuncellen minder uitgebreid, en de meeste studies handelen over zijn rol bij CD4 + en CD8 + T cellen. De studie van Knox et al. toont echter aan dat ook bij de mens T-bet expressie verhoogt naarmate perifere cellen verder differentiëren en matureren. Het gaat hier over CD4 +, CD8 + αβ-t cellen, NKT cellen, NK cellen, en memory en plasmablast B cellen. Deze studie suggereert ook een essentiële rol voor T-bet (en Eomes, zie verder) in perifere terminale differentiatie, gestaafd door de bevinding dat bij deficiëntie van deze TFs, de capaciteit voor differentiatie en acquisitie van effector functies sterk daalt. Verder wordt vastgesteld dat een groot deel van de γδ-t cellen zowel T- bet als Eomes tot expressie brengt en dit suggereert dat deze TFs hier ook instaan voor productie van IFN-γ en andere functies. Bij NK cellen ziet men een upregulatie van T-bet low ink cellen naar T-bet hi mature CD56 bright NK cellen (134). 37

43 - Eomes De TF Eomesodermin (Eomes) is ook een T-box transcriptiefactor, en nauw verwant aan T- bet in zijn functies. Zo reguleert Eomes samen met T-bet differentiatie van CD8 + T cellen. Hiernaast zorgen T-bet en Eomes bij de muis ook voor expressie en productie van IFN-γ, dit zowel in αβ CD4 + en CD8 + Tcellen, als in γδ T cellen. Maar in tegenstelling tot T-bet expressie, verhoogt expressie van Eomes naarmate cellen meer memory-like worden. Bij ontwikkeling van NK cellen vervullen ze een gelijkaardige maar toch niet volledig dezelfde functie. Bij afwezigheid van echter zowel T-bet en Eomes is ontwikkeling van NK cellen ernstig aangetast. Bij muis NK cellen is Eomes vooral van belang bij overgang naar het DX5 + stadium, met acquisitie van Ly49 receptoren, ter maturatie van NK cellen. Opmerkelijk is dat bij wegvallen van Eomes na verkrijgen van het Ly49-repertoire, deze laatste blijft functioneren. Hieruit valt af te leiden dat Eomes noodzakelijk is voor het verkrijgen en aanhouden van mature NK cellen, terwijl T-bet vooral zorgt voor de meest finale stadia van maturatie. Expressie van muis Eomes wordt geïnduceerd in beenmerg en milt, maar in de lever is er geen inductie van Eomes expressie geconstateerd (134, 135). Als Eomes expressie bij de mens onderzocht wordt, stelt men vast dat deze grotendeels op dezelfde cellen voorkomt als T-bet, met uitzondering van B cellen, waar geen Eomes aanwezig is, en bij NK cellen vertonen CD56 dim NK cellen minder expressie van Eomes dan CD56 bright NK cellen, die langzaam hun Eomes expressie verliezen. Zoals vastgesteld is bij de muis (zie hierboven), wordt ook hier T-bet en Eomes expressie gezien bij de αβ CD4 + en CD8 + T cellen, en een groot deel van de γδ T cellen, waar ze ook met IFN-γ productie gelinkt worden (134). - Blimp1 Blimp 1 staat ook gekend als Prdm1 (of PRDI-BF1), en deze TF heeft bij de muis een rol in zowel B, T als NK cellen (136, 137). Bij plasmacellen en CD8 + T cellen is Blimp1 van belang voor terminale differentiatie, en bij deficiëntie van Blimp1 worden functieloze antilichaamsecreterende cellen en kortlevende CD8 + T cellen teruggevonden. Verder is in CD8 + cytotoxische T cellen Blimp1 verantwoordelijk voor optimale expressie van cytotoxische moleculen en regulatie van chemokine receptoren, maar overbodig voor productie van cytokines. Ook bij algemene muis T cel homeostase is Blimp1 van belang, want bij afwezigheid wordt een accumulatie van geactiveerde T cellen met immunopathologie gezien. 38

44 Verder wordt voor Blimp1 ook een rol gesuggereerd bij inhibitie van Th1 differentiatie via blokkade van de T-bet en IFN-γ genen. Terwijl Blimp1 expressie bij muis T en B cellen gereguleerd wordt door 2 TFs (IRF4 en Bcl6), is deze expressie bij NK cellen afhankelijk van T-bet. Bij muis NK cellen wordt expressie van Blimp1 al gevonden vanaf immature stadia (in tegenstelling met B en T lymfocyten), door inductie via IL-15, en behouden doorheen de ontwikkeling. Blimp1 expressie is het hoogst in de meest mature stadia, zowel bij de mens als muis, en kan verder verhoogd worden door IL-12, IL-18 en IL-21, die op zichzelf NK cel maturatie induceren. Verder speelt Blimp1 bij de muis een cruciale rol voor perifere maturatie en homeostatische weefseldistributie van NK cellen in non-lymfoïde organen (long, lever), alsook voor restrictie van proliferatie. Voor cytokine productie en cytotoxiciteit is Blimp1 overbodig, maar voor expressie van granzyme B is deze wel genoodzaakt (136). Bij de mens wordt Blimp1, waarvan het Prdm1 gen op crhomosoom 6q21 ligt, ook teruggevonden op NK cellen, maar er bestaan 3 isovormen tegenover het ene muis homoloog. Blimp1 wordt bij mensen geïnduceerd door cytokines en is aanwezig op CD16 + NK cellen in het perifere bloed, zoals ook bij de muis vastgesteld is. Een ander verschil met muis Blimp1 is dat deze bij de mens geen constitutieve expressie vertoont doorheen de ontwikkeling van een NK cel. Hiernaast werd voor humaan Blimp1 ook een rol weggelegd voor vermindering van cytokineproductie van IFN-γ en TNF-α. Deze inhibitie van IFN-γ komt in sommige gevallen overeen met resultaten van muis Blimp1 studies, maar verschilt bij andere resultaten, afhankelijk van welke celtypes, en al dan niet bij infectie, wat een celtype- en species specificiteit voor regulatie van IFN-γ door Blimp1 suggereert. Ook bij de mens werd invloed van Blimp1 op B lymfocyten vastgesteld, namelijk voor terminale differentiatie, inductie van Ig-secretie, exit uit de celcyclus en repressie van EBF. Bij T cellen is Blimp1 expressie gezien op CD4 en CD8 cellijnen, en verantwoordelijk voor behoud van homeostase (136, 137). - C/EBPγ De CCAAT/enhancer binding proteïnes (C/EBP) behoren tot een familie van leucine zipper TFs. Er zijn tot nu toe 6 verschillende leden ontdekt, elk met eenzelfde COOH-terminaal domein, die een basisregio bevatten nodig voor DNA binding en een leucine zipper motief voor dimerisatie. In tegenstelling tot de meeste leden van deze familie die vaak slechts in specifieke weefsels of na bepaalde inductie voorkomen, is C/EBPγ overal en continu aanwezig. Hierbovenop bezit C/EBPγ geen transcriptie-activerend domein, en functioneert dus als dominant negatieve vorm bij interactie met andere TFs. Wel is beschreven dat het in sommige gevallen de DNA bindingscapaciteit van andere TFs verhoogt. C/EBPγ kan worden 39

45 beschouwd als regulator van TFs met een leucine zipper motief. Bij deficiëntie van muis C/EBPγ wordt een hoge mortaliteitsgraad gezien binnen de eerste 48u na geboorte, duidend op de noodzaak van C/EBPγ voor neonatale overleving. Op vlak van NK cellen is IFN-γ productie en cytotoxische activiteit gestoord. Opmerkelijk is wel dat NK cel ontwikkeling volledig normaal blijft, wat C/EBPγ een rol geeft in de late maturatie van NK cellen. In de ontwikkeling van T en B cellen speelt C/EBPγ geen rol (138). De rol van C/EBPγ op humane NK cellen is nog niet onderzocht. - MITF Microftalmie transcriptie factor (MITF) behoort tot de basis-hlh leucine zipper regulatoren bevindt zich op het mi-locus bij de muis. Bij mutatie wordt een abnormaal MITF geproduceerd, waarna dit aangeduid wordt als het mi-mitf. Deze mutant is defectief in DNA-binding, nucleaire lokalisatie en transactivatie van sommige genen. Het aantal NK cellen is ongewijzigd bij deze mi-mitf mutant, wat suggestief is voor een behouden NK ontwikkeling. Wel is er een afwijking te vinden bij expressie van perforine door NK cellen, alsook productie van IFN-γ, waardoor NK cellen niet in staat zijn target cellen te doden. Deze deficiënte IFN-γ productie kan verklaard worden doordat mi-mitf een gedaalde expressie van IL12Rβ2 en IL18Rα tot gevolg heeft, die na activatie door IL12 en IL18 de productie van IFN-γ induceren. Expressie van granzyme B daarentegen bleek wel normaal te zijn bij deze mi-mitf mutatie. Opmerkelijk is ook dat deze mutatie enkel NK cellen aantast, te zien aan het feit dat CTLs geen afwijkende granzyme B noch perforine expressie vertonen (139, 140). Bij de mens zijn er nog geen onderzoeken naar de invloed van MITF of mi-mitf op humane NK cellen teruggevonden. 4. Discussie Uit de resultaten kan vastgesteld worden dat er vele TFs nodig zijn voor ontwikkeling van HSCs tot finaal gematureerde NK cellen. Deze TFs kunnen op 1 bepaald stadium, één aspect van een stadium, of meerdere achtereenvolgende stadia inwerken. Dan zijn er ook nog TFs nodig voor de effector functies van NK cellen, die in deze review bij de ontwikkeling verwerkt zijn. Opvallend is dat er tussen onderlinge studies veel verschillen bestaan in de resultaten over de noodzakelijke TFs voor NK differentiatie. 40

46 Bij muis HSCs stellen Morrison et al. vast dat ontwikkeling van lange termijn zelfvernieuwende HSCs tot niet-zelfvernieuwende HSCs gepaard gaat met upregulatie van Mac-1 en CD4 en behoud van Thy-1.1 low expressie (83). Hierbij is het Mac-1 low CD4 low fenotype dit van de MPPs. De studie van Christensen et al. onderzoekt deze stadia via Flk-2 expressie, waarbij deze upgereguleerd, en Thy-1.1 tegelijk downgereguleerd wordt naarmate HSCs evolueren (86). De uiteindelijke MPP in de studie van Christensen et al. blijkt zich ook nog in een verder stadium te bevinden dan de MPP uit de studie van Morrison et al., of een andere pathway volgt. Dit moet verder onderzocht worden. Ook vermelden deze studies niet of expressie van Flk-2 of Mac-1 en CD4 op de HSCs van Morrison et al. of Christensen et al. respectievelijk is teruggevonden, wat ook verder onderzoek vraagt (83, 86). Als we deze muis HSCs vergelijken met humane HSCs zien we bij deze laatste ook een verlaging van Thy-1.1 (CD90) expressie, wat de resultaten van Christensen et al. staaft. De studie van Majeti et al. stelt echter ook dat CD90 - CD45RA - cellen op basis van hun multipotente eigenschappen, incomplete zelfvernieuwing en plaats downstream van CD90 + CD45RA - cellen, geschikte kandidaat humane MPPs vormen, en voorlopig nog niet geweten is welke plaats CD90 - CD45RA + cellen innemen in de hematopoëtische hiërarchie. Kan het zijn dat CD90 - CD45RA - cellen korte termijn zelfvernieuwende HSCs zijn en CD90 - CD45RA + cellen kandidaat MPPs, als we spiegelen met de eigenschappen van muis HSCs (84)? Bij TFs van HSCs zijn al vele studies uitgevoerd op Scl en Lyl1 bij muizen, maar over mens Lyl1 is slechts weinig geweten, het zijn vooral studies naar Scl bij mens HSCs die tot nu toe uitgevoerd zijn. Lyl1 is wel al ontdekt, maar er kan slechts gespeculeerd worden over gelijkaardige of andere functies. GATA-2 daarentegen is zowel bij mens als muis teruggevonden, maar tegengestelde resultaten worden vastgesteld. Tsai et al. beschrijven dat bij afwezigheid van muis GATA-2 een daling van het aantal MPPs optreedt dat op een rol bij proliferatie en overleving van vroege HSCs wijst (90). Aan de andere kant stelt de studie van Tipping et al. dat zowel bij mens als muis een verhoging van GATA-2 expressie leidt tot een verhoogd aantal HSCs en vroege progenitorcellen in de rustfase van de cyclus (91). Verder onderzoek is nodig naar de exacte mechanismen en effecten van GATA-2. Wat opgemerkt dient te worden, is dat bij CLPs en CMPs er nog een alternatieve route gevonden is met LMPPs, die aanleiding kunnen geven tot CLPs en GMPs, maar niet tot MEPs (97). Hierbij kan de vraag gesteld worden of dit een toevallige vondst is, of het huidig model van CMP en CLP inderdaad moet aangepast worden, en wat er met de vondst van uitzonderingen die toch nog megakaryocytair en erythrocytair potentieel bezitten, gedaan 41

47 moet worden. Daarbij dient ook verder onderzoek over deze cellen bij de mens uitgevoerd te worden. Bij humane CLPs zijn er verschillen tussen de twee studiepopulaties in hun expressie van merkers. Bij de CD34 + Lin - CD10 + populatie uit het beenmerg wordt bijna steeds ook CD38 tot expressie gebracht, terwijl dit bij de CD34 + CD38 - CD7 + populatie in het navelstrengbloed niet het geval is. Hier is geen verklaring voor gegeven. Daarnaast zijn er ook cellen in het navelstrengbloed gevonden die ook CD10 tot expressie brengen en niet tot de lymfoïde lijn beperkt zijn. Dit wordt verklaard doordat ze vanuit andere locaties afkomstig zijn. Kan deze redenering dan ook gebruikt worden voor de verschillen in CD38 expressie te verklaren (87, 95)? Bij mens NKPs stellen Miller et al. (95) dat CD7 een merker is vanaf dit stadium, terwijl Hao et al. (106) het stadium vanaf humane CLPs al kenmerkte door expressie van CD7. Dit doet de geloofwaardigheid dat CD7 pas vanaf het NKP stadium geëxpresseerd wordt volgens het artikel van Miller et al. dalen, aangezien deze reeds is aangetoond in een eerder stadium. Dit kan te wijten zijn aan het feit dat de studie van Miller et al. in 1994 plaatsvond en deze van Hao et al. in 2001, en kennis over de verschillende stadia en hun merkers lager was, of Miller et al. beschikten nog niet over dezelfde technologie als Hao et al. voor hun onderzoek om het vroegste stadium op te sporen. Ook gebeurt de overgang tussen de stadia bij Miller et al. rechtstreeks van HSC naar pro-nk cel, zonder het CLP stadium te vermelden (95, 106). De muis Ets-1 TF kent veel functies binnen de ontwikkeling van NK cellen, zo is muis Ets-1 verantwoordelijk voor expressie van bepaalde receptoren, regulatie van expressie van Id2 en T-bet, ontwikkeling van NK cellen en het instellen van een drempelwaarde voor cytokineactiviteit. Maar het mechanisme achter dit alles, of op welk stadium/welke stadia Ets-1 precies ingrijpt is niet goed gekend, en vraagt naar meer onderzoek. Ook de invloed van Ets-1 op menselijke NK cellen is amper onderzocht, enkel studies over Ets-1 in verband met T en B cellen zijn teruggevonden. Ook het mechanisme achter de Bcl11b TF in het NKP stadium is niet gekend, net als de invloed van deze TF bij humane NK cellen. Verder stellen Grund et al. dat Ets-1 een zeer belangrijke rol speelt in ontwikkeling van humane NK cellen, en dat deze TF reeds bij vroege NKPs merkbaar is. Het artikel handelt over Ets-1 en NK cel ontwikkeling bij de mens, terwijl deze laatst genoemde gegevens echter uit artikels gehaald zijn die zich baseren op muis NK cellen (112). Dit mag niet zomaar geëxtrapoleerd worden naar de mens en aangenomen worden dat dit exact dezelfde resultaten geeft. 42

48 In het stadium waar ink cellen ontstaan kan vastgesteld worden dat deze verder ontwikkelen naarmate deze meer expressie vertonen van bepaalde oppervlaktemerkers en receptoren. Zo gaat verwerving van CD94 op NK cellen gepaard met de capaciteit tot productie van IFN-γ. Nu stelt de vraag zich of het verwerven van andere receptoren of merkers, zoals acquisitie van CD16 of KIR, ook gepaard gaan met het, vanaf dan, uitoefenen van bepaalde functies of eigenschappen (119). Bij EBP4 is onderzoek naar de humane EBP4 TF aangewezen, aangezien dit een belangrijke TF is mede door zijn invloed op GATA-3 en Id2, en expressie op meerdere stadia vanaf de overgang van NKP naar ink. Als laatste TFs opgesomd bij ink cellen zijn Runx proteïnen. Het opvallendste is dat de Runx proteïnen bij de muis expressie van CD122, het Ly49 repertoire, Mac-1 en CD43 positief reguleren, terwijl bij de mens KIR expressie geïnhibeerd door de Runx proteïnen (AML). Wel heeft Runx3 bij zowel muis als mens de belangrijkste functie van de 3 Runx proteïnen in NK ontwikkeling, maar de manier waarop ze NK ontwikkeling beïnvloeden zou volgens deze resultaten compleet tegengesteld zijn. Meer duidelijkheid hierover in een duidelijke vergelijkende studie is gewenst (122, 123). Wat ook nog vermeld kan worden is dat de studie van Ohno et al. stelt dat het vooral Runx3 is die de belangrijkste van de Runx proteïnen is voor NK cel ontwikkeling. Maar verder in de studie, wanneer de invloed op expressie van merkers zoals CD122, Ly49 repertoire et cetera uitgewerkt wordt, spreken ze enkel over Runx in het algemeen als TF. Als eerst Runx3 als belangrijkste aangeduid wordt, kan dan aangenomen worden dat de invloed op expressie ook grotendeels door Runx3 vervuld wordt (122)? Bij humane mnk cellen worden twee groepen vastgesteld, één met een CD56 bright en de ander met een CD56 dim fenotype. Expressie van CD56 gebeurt geleidelijk aan gedurende de ontwikkeling van NK cellen, maar op het finaal stadium zijn er dan toch 2 groepen. Is het mogelijk dat er toch een klein verschil in maturiteit is? Er bestaan al enkele studies, zoals deze van Freud et al., die de hypothese stelt dat CD56 dim NK cellen met het meer cytotoxische effect het meest mature stadium is, na CD56 bright NK cellen (119). De studie van Knox et al. beschouwt dit zelfs niet meer als hypothese maar als waarheid, ook met CD56 dim NK cellen als het laatste stadium (134). En hoe kan het verschil verklaard worden tussen de twee eindgroepen bij mens mnk cellen en slechts 1 finale eindgroep bij muis mnk cellen? Zou het kunnen dat muis mnk cellen misschien ook beschikken over een tot nu toe ongedefinieerd tweede eindstadium? Dit lijkt weinig waarschijnlijk, aangezien het grootste deel van NK cel studies gebeurt op muizen, en onduidelijkheden zich bijna altijd binnen mens NK cellen bevinden. 43

49 Bij TFs die verantwoordelijk zijn voor overgang tot mature NK cellen bestaan er ook nog enkele onduidelijkheden. Zo is het vaak dat bij er de muis TFs veel informatie beschikbaar is, maar bij de mens slechts enkele tot geen artikels bestaan over hun effect op NK cel ontwikkeling. Het is geconstateerd dat bij GATA-3, MEF, IRF-2 en IRF-1, C/EBPγ en MITF nog veel studies moeten uitgevoerd worden op menselijke NK cellen. Verder is het moeilijk om een specifiek stadium toe te kennen aan GATA-3 en Id2 die, zoals vermeld, inwerken op verschillende stadia en al tot expressie komen vanaf HSCs of het CLP naar NKP stadium respectievelijk, en zo gedurende de gehele ontwikkeling een, al dan niet altijd even belangrijke, invloed uitoefenen (125, 126). Bij T-bet worden 3 hypothesen aangehaald voor het verklaren van de verhoogde perifere apoptose bij afwezigheid van T-bet. Hier zou meer duidelijkheid in mogen komen om de precieze mechanismen van NK cel migratie naar perifeer en homeostase aldaar volledig op te klaren, met de rol van T-bet hierin verwerkt. Belangrijk hierbij is om ook de precieze functies van Eomes in NK cel ontwikkeling en maturatie te onderzoeken en wat de verschillen, gelijkenissen en relaties met T-bet zijn (133). Ten slotte dient vermeld te worden dat bij MITF alle resultaten informatie geven over wat gezien wordt bij de mi-mitf mutant, maar nergens een conclusie of afleiding gemaakt wordt naar wat de echte rol van de normale MITF TF op NK cellen inhoudt. Nu is de enige wetenschap wat de gevolgen zijn bij deze mutant. Indien er een grote kans bestaat dat dit gewoon de tegenstelde effecten van mi-mitf zijn, kan dit erbij gezet worden als vermoeden of een te onderzoeken hypothese. Verder onderzoek naar de echte functie, alsook zoals eerder vermeld werking van MITF op mens NK cellen is aangewezen (139, 140). Globaal kan samengevat worden dat veel meer TFs de NK cel ontwikkeling beïnvloeden, de ene al meer dan de ander, dan op voorhand gedacht. Ook TFs die bijvoorbeeld zorgen voor B cel, T cel of zelfs myeloïde cellijn ontwikkeling, kunnen in een vroeg stadium nodig zijn voor HSCs en later CLPs te helpen overleven en verder differentiëren. Pas vanaf het NKP stadium zijn het uitsluitend TFs die specifiek voor NK differentiatie een rol spelen. Vaak worden bij TFs de functies en mechanismen ervan voor het grootste deel of enkel bij de muis uitgewerkt en aangenomen dat dit bij mensen hetzelfde zal zijn. In vele gevallen hebben TFs bij mens en muis een gelijkaardig effect en soms zelf exact hetzelfde. Hier en daar echter bestaan toch enkele verschillen tussen muis en mens TFs en NK cellen, waar nauwlettend aandacht moet aan geschonken worden om dit niet over het hoofd te zien. Verdere studies zijn dan ook genoodzaakt om deze verschillen duidelijk weer te geven. Ook dienen studies uitgevoerd te worden naar de effecten van deze TFs op de verschillende ILCs. Aangezien deze nieuwe 44

50 indeling enkele nieuwe celpopulaties aan het licht heeft gebracht die nauw verwant zijn met NK cellen, is de vraag of deze populaties niet door dezelfde TFs gereguleerd worden, en of die TFs hetzelfde effect hebben. Doordat NK cellen, zoals vermeld in de inleiding, nu ook vaak gebruikt worden als therapie tegen kanker, is uitgebreidere kennis over NK cellen, en dan vooral bij de mens, voor bijvoorbeeld het manipuleren, genereren of verkrijgen van de best passende NK cellen voor therapie, van extreem grote waarde. 5. Referenties 1. Medzhitov R, Janeway CA, Jr. Innate immune recognition and control of adaptive immune responses. Seminars in immunology. 1998;10(5): McLellan AD, Starling GC, Williams LA, Hock BD, Hart DN. Activation of human peripheral blood dendritic cells induces the CD86 co-stimulatory molecule. European journal of immunology. 1995;25(7): Valle A, Zuber CE, Defrance T, Djossou O, De Rie M, Banchereau J. Activation of human B lymphocytes through CD40 and interleukin 4. European journal of immunology. 1989;19(8): June CH, Bluestone JA, Nadler LM, Thompson CB. The B7 and CD28 receptor families. Immunology today. 1994;15(7): Hwang YY, McKenzie AN. Innate lymphoid cells in immunity and disease. Advances in experimental medicine and biology. 2013;785: Lanier LL. NK cell recognition. Annual review of immunology. 2005;23: Campbell KS, Hasegawa J. Natural killer cell biology: an update and future directions. The Journal of allergy and clinical immunology. 2013;132(3): Screpanti V, Wallin RP, Ljunggren HG, Grandien A. A central role for death receptor-mediated apoptosis in the rejection of tumors by NK cells. Journal of immunology. 2001;167(4): Takeda K, Cretney E, Hayakawa Y, Ota T, Akiba H, Ogasawara K, et al. TRAIL identifies immature natural killer cells in newborn mice and adult mouse liver. Blood. 2005;105(5): Cooper MA. Human natural killer cells: a unique innate immunoregulatory role for the CD56bright subset. Blood. 2001;97(10): Fauriat C, Long EO, Ljunggren HG, Bryceson YT. Regulation of human NK-cell cytokine and chemokine production by target cell recognition. Blood. 2010;115(11): Vivier E, Raulet DH, Moretta A, Caligiuri MA, Zitvogel L, Lanier LL, et al. Innate or adaptive immunity? The example of natural killer cells. Science. 2011;331(6013): Carbone E, Terrazzano G, Ruggiero G, Zanzi D, Ottaiano A, Manzo C, et al. Recognition of autologous dendritic cells by human NK cells. European journal of immunology. 1999;29(12): Stebbins CC, Watzl C, Billadeau DD, Leibson PJ, Burshtyn DN, Long EO. Vav1 dephosphorylation by the tyrosine phosphatase SHP-1 as a mechanism for inhibition of cellular cytotoxicity. Molecular and cellular biology. 2003;23(17): Yusa S, Campbell KS. Src homology region 2-containing protein tyrosine phosphatase-2 (SHP-2) can play a direct role in the inhibitory function of killer cell Ig-like receptors in human NK cells. Journal of immunology. 2003;170(9): Olcese L, Cambiaggi A, Semenzato G, Bottino C, Moretta A, Vivier E. Human killer cell activatory receptors for MHC class I molecules are included in a multimeric complex expressed by natural killer cells. Journal of immunology. 1997;158(11): Lanier LL, Corliss BC, Wu J, Leong C, Phillips JH. Immunoreceptor DAP12 bearing a tyrosine-based activation motif is involved in activating NK cells. Nature. 1998;391(6668): Hanke T, Takizawa H, McMahon CW, Busch DH, Pamer EG, Miller JD, et al. Direct assessment of MHC class I binding by seven Ly49 inhibitory NK cell receptors. Immunity. 1999;11(1): Smith KM, Wu J, Bakker AB, Phillips JH, Lanier LL. Ly-49D and Ly-49H associate with mouse DAP12 and form activating receptors. Journal of immunology. 1998;161(1): Uhrberg M, Valiante NM, Shum BP, Shilling HG, Lienert-Weidenbach K, Corliss B, et al. Human diversity in killer cell inhibitory receptor genes. Immunity. 1997;7(6): Faure M, Long EO. KIR2DL4 (CD158d), an NK cell-activating receptor with inhibitory potential. Journal of immunology. 2002;168(12):

51 22. Vance RE, Kraft JR, Altman JD, Jensen PE, Raulet DH. Mouse CD94/NKG2A is a natural killer cell receptor for the nonclassical major histocompatibility complex (MHC) class I molecule Qa-1(b). The Journal of experimental medicine. 1998;188(10): Vales-Gomez M, Reyburn HT, Erskine RA, Lopez-Botet M, Strominger JL. Kinetics and peptide dependency of the binding of the inhibitory NK receptor CD94/NKG2-A and the activating receptor CD94/NKG2-C to HLA-E. The EMBO journal. 1999;18(15): Cosman D, Fanger N, Borges L, Kubin M, Chin W, Peterson L, et al. A novel immunoglobulin superfamily receptor for cellular and viral MHC class I molecules. Immunity. 1997;7(2): Kubagawa H, Chen CC, Ho LH, Shimada TS, Gartland L, Mashburn C, et al. Biochemical nature and cellular distribution of the paired immunoglobulin-like receptors, PIR-A and PIR-B. The Journal of experimental medicine. 1999;189(2): Ito M, Maruyama T, Saito N, Koganei S, Yamamoto K, Matsumoto N. Killer cell lectin-like receptor G1 binds three members of the classical cadherin family to inhibit NK cell cytotoxicity. The Journal of experimental medicine. 2006;203(2): Lanier LL, Yu G, Phillips JH. Analysis of Fc gamma RIII (CD16) membrane expression and association with CD3 zeta and Fc epsilon RI-gamma by site-directed mutation. Journal of immunology. 1991;146(5): Diefenbach A, Hsia JK, Hsiung MY, Raulet DH. A novel ligand for the NKG2D receptor activates NK cells and macrophages and induces tumor immunity. European journal of immunology. 2003;33(2): Gilfillan S, Ho EL, Cella M, Yokoyama WM, Colonna M. NKG2D recruits two distinct adapters to trigger NK cell activation and costimulation. Nature immunology. 2002;3(12): Wu J, Song Y, Bakker AB, Bauer S, Spies T, Lanier LL, et al. An activating immunoreceptor complex formed by NKG2D and DAP10. Science. 1999;285(5428): Mathew SO, Rao KK, Kim JR, Bambard ND, Mathew PA. Functional role of human NK cell receptor 2B4 (CD244) isoforms. European journal of immunology. 2009;39(6): Schatzle JD, Sheu S, Stepp SE, Mathew PA, Bennett M, Kumar V. Characterization of inhibitory and stimulatory forms of the murine natural killer cell receptor 2B4. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1999;96(7): Pegram HJ, Andrews DM, Smyth MJ, Darcy PK, Kershaw MH. Activating and inhibitory receptors of natural killer cells. Immunology and cell biology. 2011;89(2): Pende D, Parolini S, Pessino A, Sivori S, Augugliaro R, Morelli L, et al. Identification and molecular characterization of NKp30, a novel triggering receptor involved in natural cytotoxicity mediated by human natural killer cells. The Journal of experimental medicine. 1999;190(10): Tahara-Hanaoka S, Shibuya K, Onoda Y, Zhang H, Yamazaki S, Miyamoto A, et al. Functional characterization of DNAM-1 (CD226) interaction with its ligands PVR (CD155) and nectin-2 (PRR- 2/CD112). International immunology. 2004;16(4): Carlyle JR, Martin A, Mehra A, Attisano L, Tsui FW, Zuniga-Pflucker JC. Mouse NKR-P1B, a novel NK1.1 antigen with inhibitory function. Journal of immunology. 1999;162(10): Lanier LL, Chang C, Phillips JH. Human NKR-P1A. A disulfide-linked homodimer of the C-type lectin superfamily expressed by a subset of NK and T lymphocytes. Journal of immunology. 1994;153(6): Shiratori I, Ogasawara K, Saito T, Lanier LL, Arase H. Activation of natural killer cells and dendritic cells upon recognition of a novel CD99-like ligand by paired immunoglobulin-like type 2 receptor. The Journal of experimental medicine. 2004;199(4): Anfossi N, Andre P, Guia S, Falk CS, Roetynck S, Stewart CA, et al. Human NK cell education by inhibitory receptors for MHC class I. Immunity. 2006;25(2): Yokoyama WM. Inhibitory receptors signal activation. Immunity. 2008;29(4): Fernandez NC, Treiner E, Vance RE, Jamieson AM, Lemieux S, Raulet DH. A subset of natural killer cells achieves self-tolerance without expressing inhibitory receptors specific for self-mhc molecules. Blood. 2005;105(11): Hoglund P, Brodin P. Current perspectives of natural killer cell education by MHC class I molecules. Nature reviews Immunology. 2010;10(10): Chalifour A, Scarpellino L, Back J, Brodin P, Devevre E, Gros F, et al. A Role for cis Interaction between the Inhibitory Ly49A receptor and MHC class I for natural killer cell education. Immunity. 2009;30(3): Brodin P, Lakshmikanth T, Johansson S, Karre K, Hoglund P. The strength of inhibitory input during education quantitatively tunes the functional responsiveness of individual natural killer cells. Blood. 2009;113(11): Orr MT, Murphy WJ, Lanier LL. 'Unlicensed' natural killer cells dominate the response to cytomegalovirus infection. Nature immunology. 2010;11(4):

52 46. Chaix J, Tessmer MS, Hoebe K, Fuseri N, Ryffel B, Dalod M, et al. Cutting edge: Priming of NK cells by IL-18. Journal of immunology. 2008;181(3): Fehniger TA, Shah MH, Turner MJ, VanDeusen JB, Whitman SP, Cooper MA, et al. Differential cytokine and chemokine gene expression by human NK cells following activation with IL-18 or IL-15 in combination with IL-12: implications for the innate immune response. Journal of immunology. 1999;162(8): Hughes T, Becknell B, Freud AG, McClory S, Briercheck E, Yu J, et al. Interleukin-1beta selectively expands and sustains interleukin-22+ immature human natural killer cells in secondary lymphoid tissue. Immunity. 2010;32(6): De Maria A, Bozzano F, Cantoni C, Moretta L. Revisiting human natural killer cell subset function revealed cytolytic CD56(dim)CD16+ NK cells as rapid producers of abundant IFN-gamma on activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2011;108(2): Kim S, Iizuka K, Kang HS, Dokun A, French AR, Greco S, et al. In vivo developmental stages in murine natural killer cell maturation. Nature immunology. 2002;3(6): Sun JC, Beilke JN, Lanier LL. Adaptive immune features of natural killer cells. Nature. 2009;457(7229): O'Leary JG, Goodarzi M, Drayton DL, von Andrian UH. T cell- and B cell-independent adaptive immunity mediated by natural killer cells. Nature immunology. 2006;7(5): Ruggeri L, Capanni M, Urbani E, Perruccio K, Shlomchik WD, Tosti A, et al. Effectiveness of donor natural killer cell alloreactivity in mismatched hematopoietic transplants. Science. 2002;295(5562): Sola C, Andre P, Lemmers C, Fuseri N, Bonnafous C, Blery M, et al. Genetic and antibody-mediated reprogramming of natural killer cell missing-self recognition in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2009;106(31): Ruggeri L, Mancusi A, Burchielli E, Capanni M, Carotti A, Aloisi T, et al. NK cell alloreactivity and allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. Blood cells, molecules & diseases. 2008;40(1): Seidel UJ, Schlegel P, Lang P. Natural killer cell mediated antibody-dependent cellular cytotoxicity in tumor immunotherapy with therapeutic antibodies. Frontiers in immunology. 2013;4: Imai C, Iwamoto S, Campana D. Genetic modification of primary natural killer cells overcomes inhibitory signals and induces specific killing of leukemic cells. Blood. 2005;106(1): Zhu D, Corral LG, Fleming YW, Stein B. Immunomodulatory drugs Revlimid (lenalidomide) and CC-4047 induce apoptosis of both hematological and solid tumor cells through NK cell activation. Cancer immunology, immunotherapy : CII. 2008;57(12): Shi J, Tricot GJ, Garg TK, Malaviarachchi PA, Szmania SM, Kellum RE, et al. Bortezomib down-regulates the cell-surface expression of HLA class I and enhances natural killer cell-mediated lysis of myeloma. Blood. 2008;111(3): Spits H, Artis D, Colonna M, Diefenbach A, Di Santo JP, Eberl G, et al. Innate lymphoid cells--a proposal for uniform nomenclature. Nature reviews Immunology. 2013;13(2): Bernink JH, Peters CP, Munneke M, te Velde AA, Meijer SL, Weijer K, et al. Human type 1 innate lymphoid cells accumulate in inflamed mucosal tissues. Nature immunology. 2013;14(3): Vonarbourg C, Mortha A, Bui VL, Hernandez PP, Kiss EA, Hoyler T, et al. Regulated expression of nuclear receptor RORgammat confers distinct functional fates to NK cell receptor-expressing RORgammat(+) innate lymphocytes. Immunity. 2010;33(5): Halim TY, MacLaren A, Romanish MT, Gold MJ, McNagny KM, Takei F. Retinoic-acid-receptor-related orphan nuclear receptor alpha is required for natural helper cell development and allergic inflammation. Immunity. 2012;37(3): Hoyler T, Klose CS, Souabni A, Turqueti-Neves A, Pfeifer D, Rawlins EL, et al. The transcription factor GATA-3 controls cell fate and maintenance of type 2 innate lymphoid cells. Immunity. 2012;37(4): Moro K, Yamada T, Tanabe M, Takeuchi T, Ikawa T, Kawamoto H, et al. Innate production of T(H)2 cytokines by adipose tissue-associated c-kit(+)sca-1(+) lymphoid cells. Nature. 2010;463(7280): Price AE, Liang HE, Sullivan BM, Reinhardt RL, Eisley CJ, Erle DJ, et al. Systemically dispersed innate IL-13-expressing cells in type 2 immunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2010;107(25): Neill DR, Wong SH, Bellosi A, Flynn RJ, Daly M, Langford TK, et al. Nuocytes represent a new innate effector leukocyte that mediates type-2 immunity. Nature. 2010;464(7293): Mjosberg JM, Trifari S, Crellin NK, Peters CP, van Drunen CM, Piet B, et al. Human IL-25- and IL-33- responsive type 2 innate lymphoid cells are defined by expression of CRTH2 and CD161. Nature immunology. 2011;12(11): Cupedo T, Crellin NK, Papazian N, Rombouts EJ, Weijer K, Grogan JL, et al. Human fetal lymphoid tissueinducer cells are interleukin 17-producing precursors to RORC+ CD127+ natural killer-like cells. Nature immunology. 2009;10(1):

53 70. Mebius RE, Rennert P, Weissman IL. Developing lymph nodes collect CD4+CD3- LTbeta+ cells that can differentiate to APC, NK cells, and follicular cells but not T or B cells. Immunity. 1997;7(4): Bouskra D, Brezillon C, Berard M, Werts C, Varona R, Boneca IG, et al. Lymphoid tissue genesis induced by commensals through NOD1 regulates intestinal homeostasis. Nature. 2008;456(7221): Scandella E, Bolinger B, Lattmann E, Miller S, Favre S, Littman DR, et al. Restoration of lymphoid organ integrity through the interaction of lymphoid tissue-inducer cells with stroma of the T cell zone. Nature immunology. 2008;9(6): Kim MY, McConnell FM, Gaspal FM, White A, Glanville SH, Bekiaris V, et al. Function of CD4+CD3- cells in relation to B- and T-zone stroma in spleen. Blood. 2007;109(4): Cella M, Fuchs A, Vermi W, Facchetti F, Otero K, Lennerz JK, et al. A human natural killer cell subset provides an innate source of IL-22 for mucosal immunity. Nature. 2009;457(7230): Satoh-Takayama N, Dumoutier L, Lesjean-Pottier S, Ribeiro VS, Mandelboim O, Renauld JC, et al. The natural cytotoxicity receptor NKp46 is dispensable for IL-22-mediated innate intestinal immune defense against Citrobacter rodentium. Journal of immunology. 2009;183(10): Sawa S, Lochner M, Satoh-Takayama N, Dulauroy S, Berard M, Kleinschek M, et al. RORgammat+ innate lymphoid cells regulate intestinal homeostasis by integrating negative signals from the symbiotic microbiota. Nature immunology. 2011;12(4): Takahashi K, Hirose K, Kawashima S, Niwa Y, Wakashin H, Iwata A, et al. IL-22 attenuates IL-25 production by lung epithelial cells and inhibits antigen-induced eosinophilic airway inflammation. The Journal of allergy and clinical immunology. 2011;128(5): e Zenewicz LA, Yancopoulos GD, Valenzuela DM, Murphy AJ, Stevens S, Flavell RA. Innate and adaptive interleukin-22 protects mice from inflammatory bowel disease. Immunity. 2008;29(6): Eisenring M, vom Berg J, Kristiansen G, Saller E, Becher B. IL-12 initiates tumor rejection via lymphoid tissue-inducer cells bearing the natural cytotoxicity receptor NKp46. Nature immunology. 2010;11(11): Buonocore S, Ahern PP, Uhlig HH, Ivanov, II, Littman DR, Maloy KJ, et al. Innate lymphoid cells drive interleukin-23-dependent innate intestinal pathology. Nature. 2010;464(7293): Shields JD, Kourtis IC, Tomei AA, Roberts JM, Swartz MA. Induction of lymphoidlike stroma and immune escape by tumors that express the chemokine CCL21. Science. 2010;328(5979): Latchman DS. Transcription factors: an overview. The international journal of biochemistry & cell biology. 1997;29(12): Morrison SJ, Wandycz AM, Hemmati HD, Wright DE, Weissman IL. Identification of a lineage of multipotent hematopoietic progenitors. Development. 1997;124(10): Majeti R, Park CY, Weissman IL. Identification of a hierarchy of multipotent hematopoietic progenitors in human cord blood. Cell stem cell. 2007;1(6): Osawa M, Hanada K, Hamada H, Nakauchi H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 1996;273(5272): Christensen JL, Weissman IL. Flk-2 is a marker in hematopoietic stem cell differentiation: a simple method to isolate long-term stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2001;98(25): Galy A, Travis M, Cen D, Chen B. Human T, B, natural killer, and dendritic cells arise from a common bone marrow progenitor cell subset. Immunity. 1995;3(4): Souroullas GP, Salmon JM, Sablitzky F, Curtis DJ, Goodell MA. Adult hematopoietic stem and progenitor cells require either Lyl1 or Scl for survival. Cell stem cell. 2009;4(2): Zhang Y, Payne KJ, Zhu Y, Price MA, Parrish YK, Zielinska E, et al. SCL expression at critical points in human hematopoietic lineage commitment. Stem cells. 2005;23(6): Tsai FY, Orkin SH. Transcription factor GATA-2 is required for proliferation/survival of early hematopoietic cells and mast cell formation, but not for erythroid and myeloid terminal differentiation. Blood. 1997;89(10): Tipping AJ, Pina C, Castor A, Hong D, Rodrigues NP, Lazzari L, et al. High GATA-2 expression inhibits human hematopoietic stem and progenitor cell function by effects on cell cycle. Blood. 2009;113(12): Wilson NK, Foster SD, Wang X, Knezevic K, Schutte J, Kaimakis P, et al. Combinatorial transcriptional control in blood stem/progenitor cells: genome-wide analysis of ten major transcriptional regulators. Cell stem cell. 2010;7(4): Beck D, Thoms JA, Perera D, Schutte J, Unnikrishnan A, Knezevic K, et al. Genome-wide analysis of transcriptional regulators in human HSPCs reveals a densely interconnected network of coding and noncoding genes. Blood. 2013;122(14):e Kondo M, Weissman IL, Akashi K. Identification of clonogenic common lymphoid progenitors in mouse bone marrow. Cell. 1997;91(5):

54 95. Hao QL, Zhu J, Price MA, Payne KJ, Barsky LW, Crooks GM. Identification of a novel, human multilymphoid progenitor in cord blood. Blood. 2001;97(12): Akashi K, Traver D, Miyamoto T, Weissman IL. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 2000;404(6774): Adolfsson J, Mansson R, Buza-Vidas N, Hultquist A, Liuba K, Jensen CT, et al. Identification of Flt3+ lympho-myeloid stem cells lacking erythro-megakaryocytic potential a revised road map for adult blood lineage commitment. Cell. 2005;121(2): Arinobu Y, Mizuno S, Chong Y, Shigematsu H, Iino T, Iwasaki H, et al. Reciprocal activation of GATA-1 and PU.1 marks initial specification of hematopoietic stem cells into myeloerythroid and myelolymphoid lineages. Cell stem cell. 2007;1(4): Zhang P, Behre G, Pan J, Iwama A, Wara-Aswapati N, Radomska HS, et al. Negative cross-talk between hematopoietic regulators: GATA proteins repress PU.1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1999;96(15): Morgan B, Sun L, Avitahl N, Andrikopoulos K, Ikeda T, Gonzales E, et al. Aiolos, a lymphoid restricted transcription factor that interacts with Ikaros to regulate lymphocyte differentiation. The EMBO journal. 1997;16(8): Molnar A, Wu P, Largespada DA, Vortkamp A, Scherer S, Copeland NG, et al. The Ikaros gene encodes a family of lymphocyte-restricted zinc finger DNA binding proteins, highly conserved in human and mouse. Journal of immunology. 1996;156(2): Hosokawa Y, Maeda Y, Takahashi E, Suzuki M, Seto M. Human aiolos, an ikaros-related zinc finger DNA binding protein: cdna cloning, tissue expression pattern, and chromosomal mapping. Genomics. 1999;61(3): Rosmaraki EE, Douagi I, Roth C, Colucci F, Cumano A, Di Santo JP. Identification of committed NK cell progenitors in adult murine bone marrow. European journal of immunology. 2001;31(6): Fathman JW, Bhattacharya D, Inlay MA, Seita J, Karsunky H, Weissman IL. Identification of the earliest natural killer cell-committed progenitor in murine bone marrow. Blood. 2011;118(20): Nozad Charoudeh H, Tang Y, Cheng M, Cilio CM, Jacobsen SE, Sitnicka E. Identification of an NK/T cellrestricted progenitor in adult bone marrow contributing to bone marrow- and thymic-dependent NK cells. Blood. 2010;116(2): Miller JS, Alley KA, McGlave P. Differentiation of natural killer (NK) cells from human primitive marrow progenitors in a stroma-based long-term culture system: identification of a CD34+7+ NK progenitor. Blood. 1994;83(9): Schotte R, Dontje W, Nagasawa M, Yasuda Y, Bakker AQ, Spits H, et al. Synergy between IL-15 and Id2 promotes the expansion of human NK progenitor cells, which can be counteracted by the E protein HEB required to drive T cell development. Journal of immunology. 2010;184(12): Yu H, Fehniger TA, Fuchshuber P, Thiel KS, Vivier E, Carson WE, et al. Flt3 ligand promotes the generation of a distinct CD34(+) human natural killer cell progenitor that responds to interleukin-15. Blood. 1998;92(10): Freud AG, Becknell B, Roychowdhury S, Mao HC, Ferketich AK, Nuovo GJ, et al. A human CD34(+) subset resides in lymph nodes and differentiates into CD56bright natural killer cells. Immunity. 2005;22(3): Barton K, Muthusamy N, Fischer C, Ting CN, Walunas TL, Lanier LL, et al. The Ets-1 transcription factor is required for the development of natural killer cells in mice. Immunity. 1998;9(4): Ramirez K, Chandler KJ, Spaulding C, Zandi S, Sigvardsson M, Graves BJ, et al. Gene deregulation and chronic activation in natural killer cells deficient in the transcription factor ETS1. Immunity. 2012;36(6): Grund EM, Spyropoulos DD, Watson DK, Muise-Helmericks RC. Interleukins 2 and 15 regulate Ets1 expression via ERK1/2 and MNK1 in human natural killer cells. The Journal of biological chemistry. 2005;280(6): Aliahmad P, de la Torre B, Kaye J. Shared dependence on the DNA-binding factor TOX for the development of lymphoid tissue-inducer cell and NK cell lineages. Nature immunology. 2010;11(10): Yun S, Lee SH, Yoon SR, Kim MS, Piao ZH, Myung PK, et al. TOX regulates the differentiation of human natural killer cells from hematopoietic stem cells in vitro. Immunology letters. 2011;136(1): Li P, Burke S, Wang J, Chen X, Ortiz M, Lee SC, et al. Reprogramming of T cells to natural killer-like cells upon Bcl11b deletion. Science. 2010;329(5987): Haddad R, Guardiola P, Izac B, Thibault C, Radich J, Delezoide AL, et al. Molecular characterization of early human T/NK and B-lymphoid progenitor cells in umbilical cord blood. Blood. 2004;104(13):

55 117. Radtke F, Ferrero I, Wilson A, Lees R, Aguet M, MacDonald HR. Notch1 deficiency dissociates the intrathymic development of dendritic cells and T cells. The Journal of experimental medicine. 2000;191(7): Souabni A, Cobaleda C, Schebesta M, Busslinger M. Pax5 promotes B lymphopoiesis and blocks T cell development by repressing Notch1. Immunity. 2002;17(6): Freud AG, Yokohama A, Becknell B, Lee MT, Mao HC, Ferketich AK, et al. Evidence for discrete stages of human natural killer cell differentiation in vivo. The Journal of experimental medicine. 2006;203(4): Gascoyne DM, Long E, Veiga-Fernandes H, de Boer J, Williams O, Seddon B, et al. The basic leucine zipper transcription factor E4BP4 is essential for natural killer cell development. Nature immunology. 2009;10(10): Vacca P, Vitale C, Montaldo E, Conte R, Cantoni C, Fulcheri E, et al. CD34+ hematopoietic precursors are present in human decidua and differentiate into natural killer cells upon interaction with stromal cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2011;108(6): Ohno S, Sato T, Kohu K, Takeda K, Okumura K, Satake M, et al. Runx proteins are involved in regulation of CD122, Ly49 family and IFN-gamma expression during NK cell differentiation. International immunology. 2008;20(1): Trompeter HI, Gomez-Lozano N, Santourlidis S, Eisermann B, Wernet P, Vilches C, et al. Three structurally and functionally divergent kinds of promoters regulate expression of clonally distributed killer cell Ig-like receptors (KIR), of KIR2DL4, and of KIR3DL3. Journal of immunology. 2005;174(7): Vosshenrich CA, Garcia-Ojeda ME, Samson-Villeger SI, Pasqualetto V, Enault L, Richard-Le Goff O, et al. A thymic pathway of mouse natural killer cell development characterized by expression of GATA-3 and CD127. Nature immunology. 2006;7(11): Samson SI, Richard O, Tavian M, Ranson T, Vosshenrich CA, Colucci F, et al. GATA-3 promotes maturation, IFN-gamma production, and liver-specific homing of NK cells. Immunity. 2003;19(5): Boos MD, Yokota Y, Eberl G, Kee BL. Mature natural killer cell and lymphoid tissue-inducing cell development requires Id2-mediated suppression of E protein activity. The Journal of experimental medicine. 2007;204(5): Lacorazza HD, Miyazaki Y, Di Cristofano A, Deblasio A, Hedvat C, Zhang J, et al. The ETS protein MEF plays a critical role in perforin gene expression and the development of natural killer and NK-T cells. Immunity. 2002;17(4): Hedvat CV, Yao J, Sokolic RA, Nimer SD. Myeloid ELF1-like factor is a potent activator of interleukin-8 expression in hematopoietic cells. The Journal of biological chemistry. 2004;279(8): Kai H, Hisatsune A, Chihara T, Uto A, Kokusho A, Miyata T, et al. Myeloid ELF-1-like factor up-regulates lysozyme transcription in epithelial cells. The Journal of biological chemistry. 1999;274(29): Taki S, Nakajima S, Ichikawa E, Saito T, Hida S. IFN regulatory factor-2 deficiency revealed a novel checkpoint critical for the generation of peripheral NK cells. Journal of immunology. 2005;174(10): Ogasawara K, Hida S, Azimi N, Tagaya Y, Sato T, Yokochi-Fukuda T, et al. Requirement for IRF-1 in the microenvironment supporting development of natural killer cells. Nature. 1998;391(6668): Harada H, Takahashi E, Itoh S, Harada K, Hori TA, Taniguchi T. Structure and regulation of the human interferon regulatory factor 1 (IRF-1) and IRF-2 genes: implications for a gene network in the interferon system. Molecular and cellular biology. 1994;14(2): Townsend MJ, Weinmann AS, Matsuda JL, Salomon R, Farnham PJ, Biron CA, et al. T-bet regulates the terminal maturation and homeostasis of NK and Valpha14i NKT cells. Immunity. 2004;20(4): Knox JJ, Cosma GL, Betts MR, McLane LM. Characterization of T-bet and eomes in peripheral human immune cells. Frontiers in immunology. 2014;5: Gordon SM, Chaix J, Rupp LJ, Wu J, Madera S, Sun JC, et al. The transcription factors T-bet and Eomes control key checkpoints of natural killer cell maturation. Immunity. 2012;36(1): Kallies A, Carotta S, Huntington ND, Bernard NJ, Tarlinton DM, Smyth MJ, et al. A role for Blimp1 in the transcriptional network controlling natural killer cell maturation. Blood. 2011;117(6): Smith MA, Maurin M, Cho HI, Becknell B, Freud AG, Yu J, et al. PRDM1/Blimp-1 controls effector cytokine production in human NK cells. Journal of immunology. 2010;185(10): Kaisho T, Tsutsui H, Tanaka T, Tsujimura T, Takeda K, Kawai T, et al. Impairment of natural killer cytotoxic activity and interferon gamma production in CCAAT/enhancer binding protein gamma-deficient mice. The Journal of experimental medicine. 1999;190(11): Ito A, Kataoka TR, Kim DK, Koma Y, Lee YM, Kitamura Y. Inhibitory effect on natural killer activity of microphthalmia transcription factor encoded by the mutant mi allele of mice. Blood. 2001;97(7): Kataoka TR, Komazawa N, Oboki K, Morii E, Nakano T. Reduced expression of IL-12 receptor beta2 and IL-18 receptor alpha genes in natural killer cells and macrophages derived from B6-mi/mi mice. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 2005;85(1):

56 6. Bijlagen 6.1 Bijlage 1 Tabel: NK cel receptoren (33) A

57 6.2 Bijlage 2 B

58 6.3 Bijlage 3 C

59 6.4 Afkortingenlijst - ADCC: antibody dependent cellular cytotoxicity - APC: antigeen presenterende cellen - bhlh: basic helix-loop-helix - CARs: chimere antigeen receptoren - CBFβ: common beta subunit - CD40L: CD40 ligand - C/EBP: CCAAT/enhancer binding proteïnes - CLPs: common lymphoid progenitor cellen - CMP: common myeloid progenitors - DC: dendritische cellen - DNAM-1: DNAX accessory molecule 1 - EBF: early B cell factor - ELP: vroege (early) lymfoïde precursoren - IBD: inflammatoire darmziekte - ink: immature NK cel - ITNK: geïnduceerde T-tot-NK cel - Eomes: eomesodermin - Fc: constante regio - FcγR: Fcγ receptor-ii/iii - GMPs: granulocyt/macrofaag lineage-restricted progenitors - HLA: Humaan leukocyten antigeen - HSCs: hematopoëtische stamcellen - HSCT: hematopoëtische stamceltransplantatie - H60: histocompatibility 60 - IBD: inflammatoire darmziekte - Id2: inhibitor van DNA binding 2 - IFN: interferon - IgH: immunoglobuline zware ketens - I H 2: aangeboren type 2 helper cellen bij de muis - ILCs: innate lymphoid cells - ILFs: geïsoleerde lymfoïde follikels - IL2Rβ: IL-2 receptor - IL-7Rα: de receptor α keten voor interleukine-7 (CD127) - ITAMs: immunoreceptor tyrosine-based activation motif - ITIM: immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif - KIR: Killer cell immunoglobulin-like Receptoren - KLRG1: Killer cell lectin-like receptor G1 - LILRs: Leukocyte immunoglobulin-like receptors - Lin: Lineage - LMPP: lymphoid-primed multipotente progenitor - LSK/KTLS: Thy-1.1 low, Sca-1 +, Lin -/low, c-kit + als celoppervlaktemerkers D

60 - LTi: lymphoid-tissue inducer cellen - LT-α: lymfotoxine-α - MEF: Myeloid Elf-1-like factor - MEPs: megakaryocyt/erythrocyt lineage-restricted progenitors - MHC-I: Major Histocompatibility Complex klasse I - MITF: Microphtalmia transcriptie factor - mnk: mature NK cel - MPPs: multipotente progenitorcellen - MULT1: murine ULBP-like transcript 1 - NK cel: natural killer cel - NKP: NK cel progenitor - NKT: Natural killer T lymfocyten - NRCs: Natural cytotoxicity receptors - PAMPs: pathogen-associated molecular patterns - PILR: paired Ig-like receptor - PRR: pattern recognizing receptoren - PVR: polio virus receptor - Rae1: retinoic acid early transcript-1 - RAG: recombination activating gene - RORγt: retinoic acid receptor-related orphan receptor γt - Sca-1: stem cell antigen 1 - Scl: stem cell leukemia (gen) - SH2-domein: Src homology domain 2 - SHIP: SH2-containing inositol polyphosphate 5-phosphatase - SHP1/2: SH2-containing protein-tyrosine phosphatase 1/2 - SRIRs: self-recognizing inhibitory receptors - Tbx21: T-bet - TCR: T cel receptor - TdT: terminal deoxynucleotidyl transferase - TFs: Transcriptiefactoren - Th: Thelper cel - TNFα: tumor necrosis factor-α - TOX: Thymocyte selection-associated HMG box factor - TRAIL: TNF-related apoptosis-inducing ligand - TSLP: thymus stromaal lymfopoëtine - ULBP: UL-16-binding proteins E

61 Vertrouwelijkheid en overdracht van recht F