Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen. Academiejaar

Transcriptie

1 Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen Academiejaar Optimalisatie van een HRM RT-qPCR test voor detectie en genotypering van Hepatitis E virus Jolien Vandewalle Promotor: Prof. dr. ir. I. Sampers Tutor: Dr. A. Stals Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van Master in de bio-ingenieurswetenschappen: Biochemie

2

3 Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen Academiejaar Optimalisatie van een HRM RT-qPCR test voor detectie en genotypering van Hepatitis E virus Jolien Vandewalle Promotor: Prof. dr. ir. I. Sampers Tutor: Dr. A. Stals Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van Master in de bio-ingenieurswetenschappen: Biochemie

4 Auteursrecht De auteur en de promotor geven de toelating om deze masterproef voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze masterproef. 6 Juni 2014 Jolien Vandewalle Sampers Prof. Dr. Ir. Imca

5 Voorwoord Om mijn studies Master of Science in de industriële wetenschappen optie biochemie te voltooien dien ik een stage te lopen van 4 maand. Aangezien mijn interesse uitgaat naar de moleculaire biologie/virologie was ik onmiddellijk enthousiast over het thesisonderwerp dat handelde rond Hepatitis E. In een zeer korte tijd heb ik me moeten verdiepen in de moleculaire detectietechniek High Resolution Melting RT-qPCR. Ik heb dan ook op een korte tijd veel bijgeleerd over deze extreem gevoelige techniek. Uiterste concentratie en precisie zijn noodzakelijk om deze techniek onder de knie te krijgen. Dit alles gebeurde gedeeltelijk in het laboratorium levensmiddelenmicrobiologie en conservering (LFMFP) van de universiteit Gent, bij Professor dr. Mieke Uyttendaele maar ook grotendeels in het ILVO eenheid Technologie en Voeding te Melle. Graag zou ik een aantal personen willen bedanken die mij in vele opzichten hebben geholpen om deze masterproef met succes te beëindigen. Dr. Ambroos Stals, mijn stagementor, die mij de techniek van RT-qPCR en HRM RTqPCR zo efficiënt mogelijk aanleerde om dit dan zo snel mogelijk zelfstandig te kunnen uitvoeren. Ook begeleidde Ambroos me waar nodig, zodat ik de techniek zo precies mogelijk kon uitvoeren. Naast het praktisch werk heeft Ambroos vele suggesties en opmerkingen bijgebracht aan de thesis. Met vragen en problemen kon ik ook steeds bij hem terecht. Prof. dr. ir. I. Sampers, mijn promotor, die mij dit thesisonderwerp aanbood. Haar suggesties en kritische opmerkingen hebben deze thesis tot een hoger niveau gebracht. Hierbij wil ik ook alle medewerkers van UGent faculteit Bio-ingenieurs, die me tijdens mijn masterproef hebben geholpen, bedanken. Jolien Vandewalle Masterproef II

6 Abstract Hepatitis E is a viral liver infection caused by the Hepatitis E virus (HEV), an RNA virus. The viral culture method based on cell lines is extremely time consuming and therefore not suitable for routine detection of HEV in foods. The detection of HEV is most commonly performed by molecular techniques, such as the "reverse transcriptase polymerase chain reaction" (RT-PCR). HEV consists of four different genotypes with a significant difference in appearance and manner of transfer between genotypes 1 and 2 and genotypes 3 and 4. The main purpose of this thesis involved the development of a high resolution melting (HRM) RT-qPCR assay for simultaneous detection and genotyping of HEV. The latter was performed by modifying an existing RT-qPCR assay for HEV detection into an HRM format. Results showed that detection of low levels of HEV control plasmid DNA and genotyping could be performed by combining a degenerate forward primer and the HRM Meltdoctor TM Mastermix (Life Technologies). Although the majority of detection and genotyping tests were performed on purified plasmid DNA samples and on clinical samples (faecal material), preliminary results suggest that the described method could also work on food samples such as pig liver. Abstract Hepatitis E is een virale leverontsteking veroorzaakt door het Hepatitis E virus (HEV), een RNA virus. De viruskweek aan de hand van diverse cellijnen is zeer tijdrovend en hierdoor niet bruikbaar voor routinedetectie van HEV in levensmiddelen. Voor detectie van HEV wordt daarom geopteerd voor moleculaire technieken zoals de reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR). Het HEV bestaat uit vier verschillende genotypen waarbij er een belangrijk verschil is in voorkomen en manier van overdracht tussen genotypen 1 en 2 en genotypen 3 en 4. Het doel van deze masterthesis omvat de optimalisatie van een high resolution melting (HRM) RT-qPCR voor de simultane detectie en genotypering van HEV. Dit werd uitgevoerd door het aanpassen van een reeds bestaande RT-qPCR paper voor HEV detectie in een HRM formaat De resultaten tonen aan dat detectie en genotypering van lage concentraties HEV controle plasmiden kan worden uitgevoerd door het combineren van een gedegenereerde forward primer en de MeltdoctorTM HRM Mastermix (Life Technologies). Alhoewel de meerderheid van de detectie- en genotyperingstesten werden uitgevoerd op opgezuiverde plasmide DNA stalen en op klinische stalen (fecaal materiaal), suggereren voorlopige resultaten dat de beschreven methode ook zou kunnen werken op monsters van levensmiddelen, zoals varkenslever. Jolien Vandewalle Masterproef III

7 Inhoudsopgave 1. Literatuurstudie Virussen Voedselgebonden virussen Norovirus (NoV) Hepatitis A virus Hepatitis E virus Opbouw HEV partikel Genoom HEV Transmissie Ziekteverloop Verschillende fylogenetische genotypen Detectie HEV Cultivatie Detectiestrategie RNA virussen Virusextractie RNA opzuivering Moleculaire detectie Moleculaire detectie HEV Reverse transcriptase qpcr (RT -qpcr) Reverse Transcriptie (RT) Polymerase Chain Reaction (PCR) Reverse transciptase qpcr (RT qpcr) HRM RT-qPCR Principe Intercalerende kleurstoffen Toepassingen Voordelen en nadelen Materiaal en methode Positieve controleplasmiden Transformatie en upscaling van de controleplasmiden in DH5α E. coli cellen Plasmide extractie Kwantificatie van phev gt 1/2, 3, 4 plasmiden Gelelektroforese...31 Jolien Vandewalle Masterproef IV

8 2.6 Aanmaak phev plasmide standaardreeks voor gt 1/2, 3, Reverse Transcriptie Reverse Transcriptase qpcr (RT-qPCR) volgens Martin-Latil et al., High Resolution Melting Reverse transcriptase qpcr (HRM RT- qpcr) Resultaten en discussie Onderzoeksstrategie Kwantificatie van phev gt 1/2, 3, 4 plasmiden Analyse zuiverheid van de plasmiden RT-qPCR volgens Martin-Latil et al. (2012) HRM RT-qPCR Contaminatie in functie van de tijd Analyse smeltprofiel met smeltcurven en smeltpieken Besluit Conclusie...62 Jolien Vandewalle Masterproef V

9 Lijst van symbolen en afkortingen ALT cdna CM CPC Cq DNA dntp s dsdna EDTA esdna Fdeg FP FRET GuSCN HAV Hel HEV HRM HRMCA IgG IgM LAMP LFMFP LB LOD MeT mrna NaCl NaOH NASBA NTC OG OLR Ori PCP RdRp Alanine-aminotransferase copie DNA Contaminatiemerker Cysteïne Protease Capaïne Quantification cycle Deoxyribonucleic acid Deoxynucleosidetrifosfaten Dubbelstrengig DNA Ethylene diamine tetraacetic acid Enkelstrengig DNA Gedegenereerde Forward Primer Forward Primer Fluorescence Resonance Energie Transfer Guanidinium(iso)thiocyanaat Hepatitis A Virus RNA Helicase Hepatitis E Virus High Resolution Melting High-Resolution Melting Curve Analysis Immunoglobuline G Immunoglobuline M Loop-mediated isothermal amplification Laboratory of Food Microbiology and Food Preservation Luria Broth Limit of Detection Methyltransferase messenger RNA Natriumchloride Natriumhydroxide Nucleic Acid Sequence-Based Amplification Negative Template Control Onvertaald gebied Open Lees Ramen Origin of replication Papain-like cysteine protease RNA dependent RNA polymerase Jolien Vandewalle Masterproef VI

10 RNA ROV RP RT-PCR RT-qPCR RubV TAE buffer Tm UNG VLP Ribonucleic acid Rotavirus Reverse Primer Reverse-Transcription Polymerase Chain Reaction Real-time Reverse-Transcription Polymerase Chain Reaction Rubella Virus Tris acetate EDTA buffer Melting temperature Uracil N-Glycosylase Virus Like Particle Jolien Vandewalle Masterproef VII

11 Lijst van figuren Figuur 1.1: Algemene structuur van een viruspartikel (Stals, 2011) Figuur 1.2: Elektronenmicroscoop beeld NoV partikels (Stals, 2012) Figuur 1.3: Elektronenmicroscoop beeld HAV partikels (Stals, 2012) Figuur 1.4: Structuur van Hepatitis E virus-like particle (VLP) Figuur 1.5: Beschreven assays op het HEV genoom (Eindwerk S. Bonte, ) Figuur 1.6: Geconserveerd regio Figuur 1.7: Het OLF1 proteïne (Ahmad et al., 2011) Figuur 1.8: Verloop acute HEV infectie Figuur 1.9: HEV detectiestrategie in levensmiddelen en klinische monsters Figuur 1.10: Sequentie specifieke primer Figuur 1.11: Oligo-dT primer Figuur 1.12: Random primer Figuur 1.13: Proces Polymerase Chain Reaction (PCR) Figuur 1.14: Werking 5 nuclease method Figuur 1.15: Principe binding SybrGreen op dubbelstrengig DNA (Stals, 2011) Figuur 1.16: Theoretische amplificatiecurve (Biorad, 2013) Figuur 1.17: Smeltcurve met de fluorescentie in de y-as en de temperatuur in de x-as Figuur 1.18: Smeltpieken (eerste afgeleide van de smeltcurve) Figuur 2.1: Sequentie overzicht van de inserts van alle gebruikte plasmiden. Figuur 3.1: De onderzoeksstrategie Figuur 3.2: Elektroforese van de plasmidenstocks met als grootte 2087 bp zonder contaminatiemerker en 2096 bp met contaminatiemerker Figuur 3.3: Standaardcurve phev gt 1/2 Fdeg (n=2) Figuur 3.4: Standaardcuve phev gt 3 Fdeg (n=2) Figuur 3.5: Standaardcurve phev gt 4 +CM (n=4) Figuur 3.6: Aantal positieve NTC op de HRM qpcr plaat in functie van de tijd Figuur 3.7: Analyse verkeerde smeltpiek (links primerdimeerpiek en rechts ampliconpiek) Figuur 3.8: detailweergave smeltpieken phev gt 1/2, 3, 4 bij gebruik MeltdoctorTM mastermix Jolien Vandewalle Masterproef VIII

12 Figuur 3.9: detailweergave smeltpieken phev gt 1/2, 3, 4 bij gebruik Type-it HRM mastermix Lijst van tabellen Tabel 1.1: Karakteristieken van de vier verschillende genotypen van HEV Tabel 2.1: Gebruikte buffers bij plasmide-extractie Tabel 2.2: Kwantificatie van de verschillende gebruikte HEV plasmiden Tabel 2.3: Reagentia mastermix Tabel 2.4: RT-qPCR cyclus well plaat met plasmideconcentraties en negatieve controles Tabel 2.5: RT-qPCR cyclus Tabel 2.6: Reagentia HRM Mastermix Tabel 2.7: HRM RT- qpcr cyclus Tabel 3.1: Kwantificatie van de verschillende gebruikte HEV plasmiden Tabel 3.2: PCR-parameters RT-qPCR van gt 1/2, 3, 4 Tabel 3.3: PCR-parameters HRM RT-qPCR van gt 1/2, 3, 4 Tabel 3.4: Percentage detectie 10 0 pc/µl bij RT-qPCR (links) en HRM RT-qPCR (rechts) Tabel 3.5: overzicht smeltpieken temperaturen van de verschillende plasmiden bekomen bij gebruik van 2 verschillende HRM qpcr mastermixen en de SybrSelect mastermix voor conventionele qpcr Tabel 3.6: overzicht temperatuurverschillen tussen smeltpieken van de verschillende plasmiden bekomen bij gebruik van 2 verschillende HRM qpcr mastermixen EN DE SybrSelect mastermix voor conventionele qpcr Tabel 3.7: Tm-waarden plasmiden phevgt1/2, phevgt3 en phevgt4 (HRM RTqPCR) Tabel 3.8 Tm-waarden cdna stalen opgezuiverd uit varkensfeces en uit in vitro gekweekt HEV (HRM RT-qPCR) Tabel 3.9: Tm-waarden plasmiden phevgt1/2, phevgt3 en phevgt4 (HRM RTqPCR) Tabel 3.10: Tm-waarden cdna stalen opgezuiverd uit varkenslever (HRM RT-qPCR) Tabel 3.11: Overzicht van de smeltpiek temperaturen van de verschillende plasmiden, geobserveerd op 27/11/2013 en op 11/12/2013 Jolien Vandewalle Masterproef IX

13 Tabel 3.12: overzicht van de temperatuurverschillen tussen smeltpieken verschillende plasmiden, geobserveerd op 27/11/2013 en op 11/12/2013 van de Jolien Vandewalle Masterproef X

14 Inleiding Hepatitis E is een virale leverontsteking die wordt veroorzaakt door het Hepatitis E virus (HEV), een RNA virus. De viruskweek gebeurt met behulp van diverse cellijnen zoals de PLC/PRF/5 menselijke hepatocarcinoma cellijn of de A549 menselijke epitheel cellijn, maar het duurt langer dan vier weken tot een cellijn confluent is gegroeid en vervolgens nog eens langer dan zes weken tot het virus zich vermenigvuldigt. Gezien deze methode dus zeer tijdrovend is, is ze niet bruikbaar voor routinedetectie van HEV in levensmiddelen zoals varkenslever en andere risicovolle levensmiddelen. Om deze reden wordt voor detectie van HEV meestal geopteerd voor moleculaire technieken zoals de reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) (Martin-Latil et al., 2012). RT-PCR is een techniek die kan aangewend worden voor detectie van RNA sequenties door amplificatie ervan (Dorak, 2007). Het Hepatitis E virus genus bestaat uit 4 verschillende genotypen waarbij er een belangrijk verschil is in voorkomen en manier van overdracht tussen genotypen 1 en 2 en genotypen 3 en 4 (Scobie & Dalton, 2013). Het doel van deze masterthesis is de optimalisatie van een high resolution melting real-time RT-PCR (HRM RT-qPCR) test om de vier verschillende genotypen van Hepatitis E virus (HEV) simultaan te detecteren en te onderscheiden van elkaar. Conventionele RT-qPCR is een techniek die toelaat om RNA niet enkel te detecteren, maar ook te kwantificeren (Dorak, 2007). In deze thesis wordt gebruikt gemaakt van SybrGreen, een molecule die dubbelstrengig DNA bindt en daarbij fluoresceert. SybrGreen is een niet-specifieke molecule en bindt alle dubbelstrengig DNA (zoals bijvoorbeeld ook primer dimeren) wat aanleiding kan geven tot vals-positieve resultaten. Om dit te voorkomen wordt de temperatuur na de finale amplificatiestap langzaam verhoogd tot 95 C en wordt de smeltcurvecyclus gestart. Via de smeltcurve-analyse kunnen aspecifieke bindingen zoals primer dimeren onderscheiden worden van de beoogde amplicons op basis van lengte en anderzijds op basis van hun samenstelling. Dit laatste is belangrijk voor de optimalisatie van de HRM RT-qPCR. Een vorig onderzoek toonde aan dat het verschil in sequentie van de qpcr amplicons van HEV genotypen 1, 2, 3 en 4 zich bevindt in slechts 3 baseparen. Waar HEV genotypen 1, 2 en 4 een cytosine bezitten, bezit genotype 3 een adenosine. Waar HEV genotypen 1 en 2 twee adenosines bezitten, bezitten genotypen 3 en 4 twee cytosines. Genotypen 1 en 2 bevatten op die specifieke plaatsen in de sequentie drie adenosines terwijl genotype 3 slechts één adenosine bezit en twee cytosines en genotype 4 drie cytosines bezit (Eindwerk S. Bonte, ). Aangezien adenosine en thymine verbonden zijn via twee waterstofbruggen en guanine en cytosine via drie waterstofbruggen zal een hogere smelttemperatuur nodig zijn bij deze laatste. Op deze manier kunnen de vier verschillende genotypen op basis van hun samenstelling worden onderscheiden. HRM wordt gezien als een verfijnde, snelle en nauwkeurige verbetering van de conventionele RT-qPCR smeltcurve-analyse. Deze post PCR analysemethode is zo gevoelig dat het de detectie van één enkel baseverschil in de nucleotidesequenties mogelijk maakt. Het verschil met een gewone RT-qPCR analyse ligt ter hoogte van het aantal metingen per C. Bij een standaard dissociatiecurve wordt de temperatuur meestal in stappen van 0,20 C of meer verhoogd, terwijl bij HRM RT-qPCR de temperatuur bij de dissociatiecurve in veel kleinere stappen van 0,05 C of minder wordt verhoogd (Wittwer,

15 2009; Reed et al., 2007). HRM maakt gebruik van verzadigende kleurstoffen en niet van de niet- -verzadigende kleurstof SybrGreen, aangezien deze bij hoge concentraties de PCR reactie inhibeert (Wittwer et al., 2003). Het belangrijkste doel van deze masterthesis omvat de optimalisatie van een HRM RTqPCR test voor simultane detectie en genotypering van HEV. In eerste instantie werd deze optimalisatie uitgevoerd met behulp van plasmiden phevgt1/2, phevgt3 en phevgt4, die de targetsequenties van Hepatitis E genotypen 1/2, 3 en 4 bevatten. Vervolgens werd het functioneren van de HRM RT-qPCR test geanalyseerd op HEV RNA opgezuiverd uit fecaal materiaal en uit levensmiddelen. Dit alles gebeurde aan het laboratorium levensmiddelenmicrobiologie en conservering (LFMFP) van de universiteit Gent, bij Professor dr. Mieke Uyttendaele. Jolien Vandewalle Masterproef

16 1. Literatuurstudie 1.1 Virussen Een virus is een zeer klein obligatoir intracellulair micro-organisme met een diameter van 20 tot 400 nanometer. Het is dus volledig afhankelijk van het metabolisme van de gastheer voor reproductie. Virussen kunnen een brede waaier aan organismen infecteren, zoals bacteriën, planten, dieren en mensen. Ze kunnen in deze gastheren een grote verscheidenheid aan symptomen en ziektes veroorzaken en bezitten eveneens een grote diversiteit aan morfologie en genetische inhoud. Virusoverdracht kan op verschillende manieren plaatsvinden zoals aërosolvorming bij hoesten of niezen, contact met geïnfecteerd bloed en contact met dieren (Koopmans & Duizer, 2004). Figuur 1.1 toont de algemene structuur van een viruspartikel. Een viruspartikel bezit drie belangrijke structuren: het genomisch materiaal, het (proteïne) capside en de (lipide) envelop. Het genomisch materiaal bevat de coderende informatie voor het virus. Een eerste indeling gebeurt naar de aard van het nucleïnezuur, RNA of DNA. Het genoom kan vervolgens enkelstrengig of dubbelstrengig zijn. Het genoom kan bovendien lineair, gesegmenteerd of circulair zijn. Bij enkelstrengige RNA virussen bestaat een strikt onderscheid tussen virussen waarbij dit RNA direct als messenger RNA (mrna) kan fungeren als het virus de cel binnendringt (positief georiënteerd RNA) en de virussen waarbij dit RNA eerst nog moet worden omgezet naar de complementaire streng (negatief georiënteerd RNA) (Hoepelman, 2011). Rond het genoom zitten virale eiwitten, deze vormen een mantel rond de nucleïnezuren. Deze mantel die het capside wordt genoemd, vervult twee belangrijke functies. Enerzijds zorgt het voor de bescherming van het genomisch materiaal en anderzijds is het belangrijk voor de herkenning van de gastheercellen en de vasthechting hierop. Bij de structuur van capsiden zijn er twee hoofdgroepen: de capsiden op basis van een regelmatig twintigvlak (icosaëder) en de capsiden op basis van een helixstructuur rond het nucleïnezuur. De eenheden waaruit een capside bestaat noemt men capsomeren. Het nucleïnezuur bestaand uit RNA of DNA vormt samen met het capside het nucleocapside (Hoepelman, 2011). Het capside is op zijn beurt weer omgeven door matrixeiwitten. De matrix is geassocieerd met de envelop van virussen. De envelop bestaat uit een dubbele fosfolipidenmembraan en is afkomstig van de gastheercel. Op de envelop kunnen er eventueel nog spikes aanwezig zijn, die viraal gecodeerd zijn. De lipide envelop is niet bij alle virussen aanwezig, maar indien ze aanwezig is, zorgt ze voor de herkenning van en het binnendringen in de gastheercel. Figuur 1.1: Algemene structuur van een viruspartikel (Stals, 2011) Jolien Vandewalle Masterproef

17 1.2 Voedselgebonden virussen Voedselgebonden virussen zijn per definitie virussen infectieus voor de mens die de cellen in het gastro-intestinaal stelsel gaan infecteren. Ze verspreiden zich door de consumptie van gecontamineerde levensmiddelen. Voor de meeste voedselgebonden virussen wordt geschat dat een kleine hoeveelheid viruspartikels (minder dan 100 partikels) voldoende is om een individu te infecteren. Daarentegen is er in meeste gevallen een hoge concentratie aan viruspartikels (tot partikels/g) aanwezig in feces en braaksel bij geïnfecteerde personen. De belangrijkste voedselgebonden virussen kunnen worden ingedeeld in drie groepen (Koopman & Duizer, 2004): Virussen die gastro-enteritis veroorzaken Enterisch overdraagbare Hepatitisvirussen Virussen die zich vermenigvuldigen in het maag-darmstelsel, maar een andere ziekte veroorzaken na migratie naar andere organen, zoals het centraal zenuwstelsel Door de afwezigheid van een virale envelop zijn meeste voedselgebonden virussen sterk resistent in de omgeving. Ze zijn veelal resistent tegen hitte, droogte, licht, lage en hoge ph en zure omstandigheden. Door deze sterke resistentie kunnen ze tot meerdere weken overleven in de omgeving en op levensmiddelen zonder gastheer (Stals et al., 2012). De transmissieroute bij voedselgebonden virussen is de feco-orale route. De belangrijkste voedselgebonden virussen zijn het Norovirus (NoV), die gastro-enteritis veroorzaakt en Hepatitis A virus (HAV), die Hepatitis veroorzaakt. Daarnaast zijn er nog een aantal belangrijke uitbraken geweest van voedselgebonden virussen zoals Rotavirus groep B en C en occasionele uitbraken van Hepatitis E (HEV) (Koopman & Duizer, 2004) Norovirus (NoV) Norovirus is een virus met een enkelstrengig positief geörienteerd RNA genoom van 7,7kb (figuur 1.2). De lage infectieuze dosis wordt geschat op 18 tot 100 viruspartikels en de incubatieperiode bedraagt 12 tot 48 uur (Hall, 2012). Een hoge concentratie (10 5 tot virusparitkels/g) aan viruspartikels wordt tijdens en na de manifestering van de symptomen uitgescheiden in feces en braaksel (Hall, 2012; Teunis et al., 2008). De feco-orale route is de belangrijkste transmissieroute van het Norovirus. Ten eerste is er de voedselgerelateerde overdracht door het eten van gecontamineerd voedsel, zoals schelp- en schaaldieren, die besmet zijn door het leven in fecesgecontamineerd water. Ten tweede is er de water gerelateerde transmissieroute door het inslikken van feces-besmet water tijdens het zwemmen of het spoelen van eten met feces-besmet water. Als laatste is er de persoon tot persoon transmissie door het contact met besmet braaksel of besmette ontlasting. Dit wordt veroorzaakt door onvoldoende hygiëne na een toiletbezoek waardoor besmettelijke deeltjes op de handen achterblijven en zich zo verspreiden. De symptomen van een Norovirus infectie zijn braken en diarree. Deze symptomen manifesteren zich tussen 15 en 48 uur nadat iemand het virus binnenkrijgt. Het braken is vaak heftig en kan heel plotseling optreden. Verder zijn hoofdpijn, buikpijn, maagkrampen, spierpijn en milde Jolien Vandewalle Masterproef

18 koorts de meest voorkomende klinische symptomen. De verschijnselen gaan in de meeste gevallen vanzelf over na 1 tot 4 dagen. Bij kinderen en mensen met een verzwakt afweersysteem kunnen de klachten langer duren. Het genus Norovirus behoort tot de familie van de Caliciviridae en kan worden ingedeeld in 6 genogroepen (GI, GII, GIII, GIV, GV en GVI). De genogroepen binnen het Norovirus genus vertonen een grote diversiteit aan genotypen en subgroepen. Enkel genogroepen GI, GII en GIV zijn infectieus voor de mens en genogroepen GIII en GV en GVI zijn uitsluitend geïdentificeerd in dieren en zijn niet zoönotisch. De grote diversiteit is te wijten aan ophoping van puntmutaties en recombinatie tussen verwante virussen (Glass et al., 2009). De stijgende aandacht voor dit virus is te wijten aan de rol van het virus in acute gastro-enteritis uitbraken over de hele wereld (Hardy, 2005). Norovirus is de belangrijkste veroorzaker van gastro-enteritis voornamelijk in kinderen en volwassenen. Het virus heeft een zeer lage infectieve dosis, is stabiel in de omgeving en resistent tegen desinfectie (Koopman & Duizer, 2004) Hepatitis A virus Hepatitis A virus is een virus met een enkelstrengig positief geörienteerd RNA genoom van 7,5 kb (figuur 1.3). De infectieve dosis wordt geschat tussen de 10 en 100 viruspartikels met een incubatieperiode van 2 tot 6 weken (Martin & Lemon, 2006). Door deze lange incubatieperiode is het moeilijk om de bron van infectie te achterhalen. Een grote concentratie aan viruspartikels wordt tijdens de ziekte uitgescheiden in feces, tot 10 9 viruspartikels/g (Martin & Lemon, 2006). Hepatitis A virus heeft een viertal manieren van overdracht. Ten eerste is er de fecoorale overdracht door het eten van gecontamineerd voedsel of het drinken van besmet water. Ten tweede is er de seksuele overdracht door seksueel oraal contact. Ten derde kan er besmetting optreden door contact met bloed of bloedproducten door het uitvoeren van bloedtransfusies. En als laatste de overdracht van Hepatitis A van moeder op kind, wat eerder een zeldzame vorm van overdracht is (Martin & Lemon, 2006). Hepatitis A virus is endemisch in de ontwikkelingslanden met een gebrekkige hygiëne. In de ontwikkelde landen kan er sporadisch een besmetting met Hepatitis A virus voorkomen voornamelijk door de consumptie van besmet rauwe schaaldieren. De ziekte gaat gepaard met symptomen zoals koorts, hoofdpijn, misselijkheid, buikpijn en een gebrek aan eetlust. Deze symptomen verminderen wanneer de geelzucht ontstaat, deze houdt een paar weken aan. De ziekte evolueert bijna altijd naar volledige genezing en kinderen onder de 8 jaar doorlopen de infectie meestal asymptomatisch (Lu et al., 2013). In sommige gevallen kan een Hepatits A infectie leiden tot een chronische leverontsteking die kan leiden tot een levertransplantatie. HAV behoort tot het genus van de hepatovirussen en wordt ondergebracht in de familie van de Picornaviridae. In tegenstelling tot NoV is de diversiteit in Heptatitis A virus beperkt, er zijn slecht 7 genotypen (GI, GII, GIII, GIV, GV, GVI, GVII) en slecht 1 serotype. Hierbij zijn genotypen GI, GII, GIII en GVII infectieus voor de mens en GIV, GV en GVI infectieus voor primaten en deze laatste zijn niet zoönotisch (Martin & Lemon, 2006). Jolien Vandewalle Masterproef

19 Figuur 1.2: Elektronenmicroscoop beeld NoV partikels (Stals, 2012) Figuur 1.3: Elektronenmicroscoop beeld HAV partikels (CDC, 2013) 1.3 Hepatitis E virus Hepatitis E is een virale leverontsteking die wordt veroorzaakt door het Hepatitis E virus (HEV). In 1980 waren er individuen met geelzucht die seronegatief waren voor acute Hepatitis A en B. Vanaf toen kwamen er vermoedens voor het bestaan van een andere ongeïdentificeerde vorm van Hepatitis. De bevestiging kwam er in 1983 wanneer via immuno-elektronen-microscopie een klein virusachtig partikel werd gevonden in fecale monsters van individuen met geelzucht die seronegatief waren voor Hepatitis A en B (Pelosi & Clarke, 2008) Opbouw HEV partikel Het HEV partikel bezit twee belangrijke structuren, enerzijds het genomisch materiaal dat bestaat uit een enkelstrengig positief georiënteerd RNA molecule en anderzijds het capside. Het HEV partikel bezit geen envelop waardoor het capside volledig verantwoordelijk is voor de herkenning van de gastheercel en de aanhechting erop. Bij Hepatitis E virus heeft het capside een icosahedrale vorm, dit betekent dat het capside bestaat uit een regelmatig twintigvlak (Pelosi &Clarke, 2008). Deze vorm is de meest voorkomende structuur om virale proteïnen te assembleren tot een stabiel capside (Hoepelman, 2012). Figuur 1.4 toont de 3,5 Å structuur van Hepatitis E virus like particle (VLP). HEV VLP toont een icosahedrale symmetrie met een uitwendige diameter van 270 Å. Elk capside proteïne bevat drie lineaire domeinen die verschillende structurele elementen vormen. Het eerste domein is het S-domein die de interne scaffold structuur van het capside vormt (blauw). Het tweede domein is het M-domein (geel) en het laatste domein is het P-domein (rood). Elk domein heeft een potentiële polysacharide bindingsplaats die functioneert in cel-receptor bindingen. Een polysacharidebinding aan het P-domein op het capside protëine kan leiden tot demontage van het capside en het binnendringen van het polysacharide in de cel (Guu et al., 2009). Jolien Vandewalle Masterproef

20 Figuur 1.4: Structuur van Hepatitis E virus-like particle (VLP) (Yamashita et al., 2009) Genoom HEV Figuur 1.5 geeft het genoom weer van Hepatitis E virus. Het HEV genoom bestaat uit een lineair, enkelstrengig, positief georiënteerd RNA molecule met een lengte van 7,2 kb. Het bevat een 5 -methylguanine cap en een 3 poly A staart. Het bestaat uit drie overlappende Open Lees Ramen (OLR s), namelijk OLR1, OLR2 en OLR3, die coderen voor virale proteïnen. Op het einde van OLR1 bevindt zich een 58 nucleotide lange regio die sterk geconserveerd is. Deze regio tussen het einde van OLR1 en de start van OLR2 en OLR3 bevat een hoge concentratie aan start- en stopcodons die belangrijk zijn voor de regulatie van de HEV RNA replicatie en de genotypering van HEV. Dit gebied is sterk geconserveerd in de vier verschillende genotypen (Ahmad et al., 2011). De 5 -methylguanine cap en de 3 poly A staart zijn twee posttranscriptionele modificaties. Dit zijn enzym gekatalyseerde veranderingen aan het mrna die zorgen voor de stabilisatie van het mrna waardoor afbraak door exonucleasen onmogelijk wordt. De capstructuur speelt ook een belangrijke rol bij het transport van het RNA door de kernporiën naar het cytoplasma. Daarnaast bevat het genoom nog een kort 5 en 3 onvertaald gebied (OG s). Tijdens de translatie leest het ribosoom het mrna af van het 5 eind tot het 3 eind. Wanneer de ribosomen een startcodon herkennen, start de translatie en worden aminozuren aan het protëine geassembleerd. Dit gebeurt tot het ribosoom een stopcodon tegenkomt. Figuur 1.5 toont ook een overzicht van verschillende beschreven assays voor de qpcr detectie van HEV. Deze assays verschillen sterk in gebruikte regio s in de 3 OLR s van het HEV genoom. In een vorig onderzoek werd de conserveringsgraad van de verschillende genomische regio s bekeken en vergeleken met elkaar als mogelijke target voor de qpcr en HRM RT-qPCR detectie en genotypering van HEV. Hieruit bleek dat regio B, het geconserveerd gebied op het einde van OLR1, de hoogste conserveringsgraad had van de verschillende genomische regio s, namelijk 98,1% in vergelijking met regio s A, C en D die een percentage bekwamen van respectievelijk 84,4%; 85,5% en 89,7%. Regio B is dus ideaal als target voor de qpcr en HRM RT-qPCR detectie en genotypering van HEV (S. Bonte, 2013). Jolien Vandewalle Masterproef

21 Figuur 1.5: Beschreven assays op het HEV genoom (Eindwerk S. Bonte, ) Figuur 1.6 toont de geconserveerde regio B in de vier verschillende genotypen. In dit geconserveerd gebied zijn er verschillen van 3 baseparen waar te nemen tussen de verschillende genotypen. Waar HEV genotypen 1, 2 en 4 een cytosine bezitten, bezit genotype 3 een adenosine. Waar HEV genotypen 1 en 2 twee adenosinen bezitten, bezitten genotypen 3 en 4 twee cytosines. Genotypen 1 en 2 bevatten op die specifieke plaatsen in de sequentie drie adenosinen terwijl genotype 3 slechts één adenosine bezit en twee cytosinen en genotype 4 drie cytosinen bezit. De twee voorwaarden die moeten voldaan zijn voor HRM RT-qPCR genotypering, nl. een sterk geconserveerde regio en toch een onderscheid tussen de verschillende genotypen onderling, zijn voldaan (S. Bonte, 2013). Figuur 1.6: Geconserveerd regio B in de vier verschillende genotypen via Jalview (Eindwerk S. Bonte, ) Het OLR1 gebied codeert voor een polyproteïne bestaande uit 1693 aminozuren die niet-structurele eiwitten omvat. Deze niet-structurele regio s zijn beginnend bij het N- terminale domein: methyltransferase (MeT), cysteïne protease papaïne (CPC), RNA helicase (Hel) en RNA afhankelijk RNA polymerase (RdRp) (Ahmad et al., 2011). Daarnaast zijn er nog drie andere ongekarakteriseerde regio s ontdekt in het OLR1 gebied namelijk de Y, V, X regio s die ook voorkomen in andere dier- en plant RNA virussen zoals het Rubella virus en sommige coronavirussen (Figuur 1.7) (Ahmad et al., 2011). Het Y domein bevindt zich 200 aminozuren stroomafwaarts van het methyltransferase domein en bevat een sequentie die een hoge alignering kent met de structurele eiwitten van het Rubellavirus (RubV). Het X domein, een geconserveerd domein, toont significante homologie met gelijkaardige domeinen in Rubellavirus, alfavirussen en sommige coronavirussen. In HEV en RubV is er een Jolien Vandewalle Masterproef

22 proline-rijk gebied aanwezig dat een flexibel scharnier vormt tussen het X domein en de stroomopwaarts domeinen (Ahmad et al., 2011). Figuur 1.7: Het OLF1 proteïne (Ahmad et al., 2011) Naast het OLR1 proteïne bestaat het HEV genoom nog uit het OLR2 en OLR3 proteïne die hieronder kort besproken worden. Het OLR2 gebied codeert voor het virale capside eiwit bestaande uit 660 aminozuren waar het viraal RNA in verpakt zit (Ahmad et al., 2011). Het OLR3 proteïne functioneert als een viraal associatie eiwit bestaande uit 114 aminozuren en zorgt ervoor dat de gastheercel gevoelig wordt voor infectie (Graff et al.,2006). Jolien Vandewalle Masterproef

23 1.3.3 Transmissie De transmissie van HEV gebeurt via verschillende transmissieroutes. Er zijn vier verschillende transmissieroutes beschreven, maar besmetting van mens op mens komt niet voor (Scobie & Dalton, 2013). Genotypen 1 en 2 van HEV verspreiden zich voornamelijk via gecontamineerd water, waarbij vooral onhygiënische omstandigheden een grote rol spelen (Scobie & Dalton, 2013). Dit verklaart waarom deze genotypen voornamelijk in ontwikkelingslanden voorkomen (Scobie & Dalton, 2013). Uit nieuwe ontwikkelingen blijkt dat genotype 3 ook via water wordt verspreid, meer bepaald via afvalwater afkomstig van varkensboerderijen en slachthuizen (Crossan et al., 2012; Said et al., 2009). De verspreiding van HEV via consumptie van schaaldieren is gerelateerd aan de aanwezigheid van HEV in water indien schelpdieren gekweekt en geoogst worden in HEV gecontamineerd (zee)water. Recent werd aangetoond dat HEV genotypen 3 en 4 zoönotisch kunnen worden overgedragen. Voornamelijk varkens en wilde zwijnen blijken de primaire gastheer, maar recente studies tonen aan dat HEV ook meer en meer voorkomt in andere diersoorten, zoals ratten en konijnen (Scobie en Dalton, 2013). Zo werd in een studie in Frankrijk HEV RNA teruggevonden bij 23% van de gekweekte konijnen (Izopet et al., 2012). HEV genotypen 3 en 4 kunnen overgedragen worden door consumptie van niet verhit of onvoldoende verhit varkensvlees (Scobie & Dalton, 2013) Een derde mogelijke transmissieroute is via bloedtransfusies. In Duitsland en Zweden werden studies gevonden die de transmissie van HEV genotype 3 via bloedtransfusies van HEV geïnfecteerde donors aantoont (Baylis et al., 2012). Een studie in Londen toonde aan dat 11% van de donors HEV immunoglobuline G (IgG) reactief zijn en 0,7% immunoglobuline M (IgM) reactief zijn (Ljaz et al., 2011). Een laatste mogelijke transmissieroute is de verticale transmissie, zijnde de overdracht van HEV van moeder op kind tijdens de zwangerschap. Van deze transmissieroute is weinig gekend. In een studie werden acht zwangere vrouwen, die in de derde periode van de zwangerschap werden geïnfecteerd met HEV, onderzocht. Er werd bij vijf baby s, door middel van PCR van geboortebloedstalen, Hepatitis E vastgesteld (Khuroo et al., 1995). In een andere studie in India werden 93 zwangere vrouwen getest op HEV. In totaal waren 28 (30 %) van deze vrouwen HEV RNA-positief. Hiervan ontwikkelden twaalf vrouwen een acute leveraandoening en twee vrouwen hadden een miskraam. De 26 baby s testten allemaal HEV RNApositief en ontwikkelden een acute infectie (Kumar et al. 2001). Jolien Vandewalle Masterproef

24 1.3.4 Ziekteverloop Na inname van een infectieuze dosis HEV, die geschat wordt tussen de 10 en 100 viruspartikels, volgt een incubatieperiode van 2 tot 6 weken. Dit is de tijd die verstrijkt tussen de infectie en de eerste symptomen. Na de incubatieperiode is er een periode van 1 tot 10 dagen waarin de ziekte zich manifesteert. In deze periode kunnen symptomen zoals koorts, misselijkheid, buikpijn en overgeven ontstaan. In een tweede fase die 15 tot 40 dagen duurt, kunnen ernstiger symptomen ontstaan zoals verminderde eetlust, geelzucht, leveraantasting (Kamar et al., 2012; Pelosi & Clarke, 2008). Figuur 1.8 geeft de immuunreactie op HEV partikels weer die een basispatroon volgt. In het lichaam van mensen geïnfecteerd met HEV worden antilichamen geproduceerd die reageren tegen de HEV antigenen. Eerst wordt immunoglobuline M (IgM) geproduceerd die 2 tot 3 maanden aanwezig in het lichaam blijven. Vervolgens ontstaat immunoglobuline G (IgG) die jaren aanwezig kan blijven in het lichaam (Kamar et al., 2012; Pelosi & Clarke, 2008). IgM anti-hev is een merker voor de aanwezigheid van een acute infectie terwijl IgG anti-hev duidt op een eerdere blootstelling aan HEV. ALT staat voor Alanine-aminotransferase, dit is een enzym dat van nature voorkomt in de lever maar een verhoogde concentratie kent bij leverbeschadiging (Hoofnagle et al. 2012). Het ziektebeeld dat gepaard gaat met een HEV infectie is klinisch sterk gelijkaardig aan een infectie met HAV. Onderscheid kan enkel gemaakt worden via serologisch onderzoek. HEV infectie met klinische symptomen komt het meest voor bij volwassen van 15 tot 40 jaar. Kinderen onder de 8 jaar doorlopen de ziekte vaak asymptomatisch (Lu et al., 2013). Figuur 1.8: Verloop acute HEV infectie met in de x-as het aantal weken na blootstelling aan het antigen en in de y-as de concentratie aan antilichamen in het serum Met virus in stool wordt bedoeld dat reeds 3 weken na blootstelling een hoge concentratie aan viruspartikels wordt uitgescheiden, voor het manifesteren van de symptomen. Symptomen ontstaan 5 weken na blootstelling en blijven aanwezig tot 8 weken na blootstelling Jolien Vandewalle Masterproef

25 1.3.5 Verschillende fylogenetische genotypen Tabel 1.1 toont dat HEV uit 4 fylogenetische genotypen bestaat die sterk verschillen in voorkomen en manier van overdracht. Genotypen 1 en 2 komen voornamelijk voor in gebieden met een tekort aan basishygiëne zoals ontwikkelingslanden in Azië en Afrika. De overdracht van genotypen 1 en 2 gebeurt fecaal-oraal via gecontamineerde watervoorraden. Deze twee genotypen van HEV zijn enkel infectieus voor de mens. De mortaliteit bedraagt minder dan 1 %, een uitzondering hierop is de mortaliteit bij zwangere vrouwen waar deze 25% bedraagt. Bij genotype 1 is er ook een stijgende mortaliteit bij patiënten met een chronische leverziekte. Genotypen 3 en 4 komen voornamelijk in de Westerse wereld voor, zoals Amerika, Europa en Oceanië (Scobie & Dalton, 2013). De manier van overdracht is te wijten aan de consumptie van niet gekookt of onvoldoende gekookt, geïnfecteerd vlees zoals varkensvlees. HEV blijft vitaal na een proces van verhitting bij 56 C voor 60 minuten (Emerson et al., 2010). Er is een verhittingsproces nodig van 20 minuten bij 71 C om het virus te inactiveren. Genotypen 3 en 4 zijn infectieus voor de mens maar ook voor verschillende dierensoorten met het varken als primaire gastheer, dit betekent dat genotypen 3 en 4 zoönotisch zijn (Scobie & Dalton, 2013). Tabel 1.1: Karakteristieken van de vier verschillende genotypen van HEV (Scobie & Dalton, 2013) HEV Voorkomen Gastheren Overdracht Gevoeligen genotypen 1 2 Azië en Afrika Afrika en Centraal Amerika Menselijk lichaam Gecontamineerde watervoorraden Jongvolwassenen Zwangere vrouwen Mensen met chronische leverziekte 3 Amerika, Europa en Oceanië 4 Azië Menselijk lichaam en dieren (varkens) Gecontamineerd en onvoldoende gekookte levensmiddelen Mannen van middelbare leeftijd en ouderen Jolien Vandewalle Masterproef

26 1.4 Detectie HEV Cultivatie De in vitro cultivatie van virussen op de klassieke manier, met behulp van een voedingsbodem, is onmogelijk aangezien virussen obligaat intracellulaire organismen zijn en dus een gastheercel nodig hebben om zich te vermenigvuldigen. Het HEV virus kan dus wel worden opgegroeid met behulp van tweedimensionale celculturen zoals replicatie in de menselijke hepatocarcinoma cellijn PLC/PRF/5. Bij toepassing van tweedimensionale celculturen wordt een cellijn op een gecoat oppervlak opgegroeid tot een monolaag. Wanneer de cellijn confluent is gegroeid, wordt hierop het virus gebracht die de cellen infecteert en zich vermenigvuldigt. Het duurt langer dan vier weken tot een cellijn confluent is gegroeid en vervolgens nog eens langer dan zes weken tot het virus zich vermenigvuldigt. Deze methode is bijgevolg zeer tijdrovend, en dus is ze niet bruikbaar voor routine-detectie van HEV in risicovolle levensmiddelen zoals varkenslever. Een tweede reden om cultivatie te vermijden, is de onvoldoende efficiëntie van cultivatie om lage aantallen van HEV te kweken. Om deze twee redenen wordt geopteerd voor moleculaire methodes, zoals reverse transcriptase qpcr (RT -qpcr) (Martin-Latil, 2012) Detectiestrategie RNA virussen Figuur 1.9 toont aan dat de HEV detectiestrategie uit drie belangrijke opeenvolgende stappen bestaat met moleculaire genotypering als een mogelijke vierde stap. Er bestaat een essentieel verschil tussen detectie van HEV partikels in klinische monsters, zoals feces, en in levensmiddelenmonsters. De detectie in klinische monsters die tot partikels/g kunnen bevatten, is eenvoudiger dan de detectie in levensmiddelenmonsters die slecht 10 2 tot 10 4 partikels/g kunnen bevatten (Stals., 2011). Daarnaast kunnen levensmiddelen ook inhibitoren bevatten wat de detectie nog moeilijker maakt. Biomoleculen zoals eiwitten, vetten en koolhydraten kunnen als mogelijke inhibitoren optreden. Figuur 1.9: HEV detectiestrategie in levensmiddelen en klinische monsters (Stals et al., 2012b) Jolien Vandewalle Masterproef

27 Virusextractie Als eerste stap worden de cellen die het RNA bevatten gelyseerd. Dit kan op verschillende manieren plaatsvinden. Een eerste methode is het gebruik van het enzym lysozyme die de peptidoglycaanlaag van de cellen afbreekt. Een tweede methode is sonicatie waarbij ultrasone trillingen worden uitgezonden waardoor de cellen openbarsten en het virus vrijkomt. Een laatste methode is het bevriezen van de cellen in vloeibare stikstof waardoor de cellen worden beschadigd en openbarsten (Yong Wang et al., 2012). Tijdens deze stap komen er nucleasen vrij die het RNA beschadigen en afbreken. Er moet dus reagentia worden toegevoegd zodat het RNA intact blijft. Mogelijke reagentia zijn 2-mercaptoethanol of dithiothreitol zodat de vrijgekomen nucleasen direct worden geïnactiveerd (Yong Wang et al., 2012). Een andere methode is het toevoegen van guanidinium(iso)thiocyanaat (GuSCN), dit zorgt enerzijds voor het lyseren van de cellen en anderzijds voor de inactivatie van RNAsen zodat het RNA dat vrijkomt stabiel blijft RNA opzuivering Na de virusextractiestap dient het RNA opgezuiverd te worden uit het capside. Aangezien nucleïnezuren een grote affiniteit hebben voor glas en silica, is de RNA opzuivering dan ook gebaseerd op dit principe (Stals et al., 2012). Het gebruik van glas of silica om RNA op te zuiveren uit het viraal capside is één van de meest gebruikte methodes. Bij deze stap wordt guanidinium(iso)thiocyanaat (GuSCN) toegevoegd. Dit zorgt er enerzijds voor dat de affiniteit van RNA voor glas of silica stijgt waardoor een beter RNA opzuivering plaatsvindt, anderzijds inhibeert GuSCN nucleasen zodat het RNA stabiel blijft (Boom et al., 1990) Moleculaire detectie Aangezien voedselgebonden virussen een zeer lage infectieuze dosis hebben, geschat op virale partikels, is het belangrijk om over een gevoelige detectiemethode te beschikken zodat ook de kleinste aantallen gedetecteerd kunnen worden. Om deze redenen wordt geopteerd voor moleculaire methodes (Stals et al., 2012) (Martin-Latil, 2012). Zo wordt er een onderscheid gemaakt tussen de amplificatiemethoden (zoals reverse transcriptase PCR (RT-PCR)) en de niet-amplificatiemethoden (zoals merking met proben). Het grote nadeel van deze laatste methode is dat er een hoge concentratie aan RNA noodzakelijk is om een duidelijk signaal te verkrijgen. Aangezien monsters uit levensmiddelen, zoals varkenslever vaak een lage concentratie aan viruspartikels bezitten namelijk viruspartikels/g, is deze methode niet optimaal. Voor klinische monsters is het gebruik van proben geen probleem omdat deze een hoge concentratie aan viruspartikels bezitten namelijk viruspartikels/g. De meest toegepaste kwantitatieve nucleïnezuur amplificatietesten zijn reverse transcriptase PCR (RT- PCR) in combinatie met real-time (RT-qPCR), Nucleic Acid Sequence-Based Amplification (NASBA) (Compton et al., 1991) en Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) (Mori & NotomiI, 2009). Jolien Vandewalle Masterproef

28 1.5 Moleculaire detectie HEV Reverse transcriptase qpcr (RT -qpcr) Reverse Transcriptie (RT) Aangezien het HEV genoom een enkelstrengig positief georiënteerde RNA-streng is, dient het RNA omgezet te worden naar kopie DNA (cdna) via het enzym reverse transcriptase. Van deze enkelstrengige cdna-streng wordt een complementaire cdna-streng aangemaakt zodat in het PCR proces met dubbelstrengig DNA gestart kan worden. Voor de synthese van cdna is een enkelstrengige DNA primer noodzakelijk. Drie vaak gebruikte primers zijn: random primer, oligo-dt primer en een sequentie specifieke primer. Sequentie specifieke primers, bieden de grootste specificiteit en consistentie van de primeropties voor reverse transcriptie (figuur 1.10). Zij hebben echter niet de flexibiliteit van oligo-dt en random primer, hetgeen betekent dat voor elke targetsequentie een nieuwe cdna-synthesereactie moet worden uitgevoerd. Hierdoor worden sequentie specifieke primers minder optimaal. Bepaalde studies toonden aan dat sequentie specifieke primers voor een hogere cdna opbrengst zorgden in vergelijking met random hexameren (Jothikumar et al., 2005b). Eénstaps RT-qPCR reacties maken altijd gebruik van een sequentie specifieke primer voor een eerste streng cdna, terwijl tweestaps RT-qPCR reacties gebruik maken van andere primeropties (Jothikumar et al., 2005b) Figuur 1.10: Sequentie specifieke primer (Life Technologies, 2013) Oligo-dT primers zijn de favoriete keuze voor de twee-staps synthese van cdna reacties vanwege hun specificiteit voor mrna, ze binden namelijk aan poly A staart aan het 3 uiteinde van het mrna (figuur 1.11). Echter, omdat ze altijd de reverse transcriptiereactie starten aan het 3' -uiteinde van het transcript, kan de aanwezigheid van complexe secundaire structuren leiden tot onvolledige cdna synthese. Vervolgens kan het gebruik van oligo-dt primers bij gesegmenteerde RNA sequenties problematisch zijn. Meerdere types van oligo-dt primers zijn beschikbaar. Het kiezen van de beste oligo-dt primer hangt gedeeltelijk af van de temperatuur waarin de reverse transcriptie wordt uitgevoerd. Thermostabiele reverse transcriptase enzymen werken beter met langere primers aangezien deze bij hoge temperaturen een betere aanhechting hebben dan de kortere primers. Jolien Vandewalle Masterproef

29 Figuur 1.11: Oligo-dT primer (Life Technologie, 2013) Random hexameren (6-nucleotide bevattende sequentie) zijn zeer geschikt voor de synthese van grote hoeveelheden van cdna (figuur 1.12). Ze zijn ook geschikt voor niet-gepolyadenyleerd RNA, zoals bacterieel RNA, omdat ze zich vasthechten in de targetsequentie. Gedegradeerde transcripten en de aanwezigheid van een secundaire structuur in RNA vormen geen groot probleem voor het gebruik van random primers in vergelijking met sequentie specifieke primers en oligo-dt primers. Ondanks dat het gebruik van hexameren kan leiden tot een gereduceerde lineariteit van het amplicon, tonen bepaalde studies aan dat het gebruik resulteert in een hogere cdna opbrengst in vergelijking met oligo-dt en sequentiespecifieke primers (Lekanne Deprez et al., 2002; Zhang & Byrne, 1999). De combinatie van random hexameren en oligo-dt primers kan soms de kwaliteit verhogen indien ze worden gebruikt in dezelfde eerste streng cdna synthesereactie. Random hexameren worden enkel gebruikt in tweestaps qrt-pcr reacties (Lekanne Deprez et al., 2002; Zhang & Byrne, 1999). Figuur 1.12: Random hexameren (Life Technologie, 2013) Een belangrijk onderscheid wordt gemaakt tussen éénstaps en tweestaps RT - qpcr. Bij een éénstaps RT-qPCR wordt de reverse transcriptie in combinatie met de PCR amplificatie uitgevoerd. Dit gebeurt het best met een sequentie specifieke primer in eenzelfde reactievat. Het grootste voordeel van deze methode is de verminderde reactietijd en het grootste nadeel van een éénstaps RT-qPCR voor de genotypering is dat er geen apart cdna wordt aangemaakt, waardoor steeds opnieuw een RT stap moet uitgevoerd worden. Bij een tweestaps RT-qPCR worden beide stappen afzonderlijk uitgevoerd. Het grote nadeel is de grotere kans op contaminatie wanneer het reactievat een tweede keer wordt geopend (Battaglia et al., 1998; Bustin, 2002). Beide methoden zijn gelijkwaardig in efficiëntie en sensitiviteit. Jolien Vandewalle Masterproef

30 Polymerase Chain Reaction (PCR) Het doel van een PCR is om op een snelle en effectieve manier specifieke DNAfragmenten te amplificeren, beginnend met het template DNA-fragment. Het template DNA-fragment dient als basis voor de start van de PCR cyclus. Het PCR proces omvat drie belangrijke stappen. Ten eerste de denaturatie van het DNA, ten tweede de primer binding op het DNA en ten derde de extensie vanuit de primers van 5 naar 3 kant. Voordat een PCR kan worden uitgevoerd voor detectie van een specifieke DNA sequentie, moeten eerst de flankerende sequenties van het te amplificeren fragment gekend zijn. Hierna kunnen oligonucleotideprimers geconstrueerd worden die complementair zijn aan deze flankerende sequenties. Er wordt een forward primer en een reverse primer gemaakt die binden op het te amplificeren DNA-fragment via baseparing. Om een PCR reactie te voltooien, zijn er verschillende reactieproducten nodig, namelijk: enkelstrengig template DNA, forward en reverse primer, DNA polymerase, deoxynucleosidetrifosfaten (dntp s), MgCl 2 en een buffer. Figuur 1.13 geeft de drie verschillende stappen in de PCR cyclus weer. De eerste stap in het PCR proces is de denaturatie van het template DNA zodat dit enkelstrengig wordt (stap 1 figuur 1.13). Denaturatie wordt geïnitieerd door een temperatuur van 95 C. Deze stap is essentieel aangezien in een volgende stap primers op dit enkelstrengig DNA moeten hybridiseren. De tweede stap in het PCR proces is de primerhechting waarbij de forward en reverse primer binden aan de complementaire sequentie van het template DNA (stap 2 figuur 1.13). Dit gebeurt meestal bij een temperatuur tussen 55 C en 72 C. De hechtingstemperatuur wordt berekend aan de hand van de smeltcurve. De optimale hechtingstemperatuur bevindt zich 5 C lager dan de smelttemperatuur. De smelttemperatuur wordt berekend via de formule van Wallace, waarbij de hoeveelheid guaninen en cytosinen een belangrijke rol spelen. De formule van Wallace wordt hieronder weergegeven. Tm= 4 C x (GC) + 2 C x (AT) De laatste stap is de primerextensie, hierbij zal het DNA polymerase vanaf het 3 uiteinde van de primer het DNA verlengen. Dit gebeurt door de insertie van complementaire dntp s (stap 3 figuur 1.13). Het meest gebruikte DNA polymerase is het Taq polymerase aangezien dit hitteresistent is. Na deze drie stappen start de cyclus telkens opnieuw zodat het DNA-fragment exponentieel wordt geamplificeerd. De cyclus wordt 20 tot 50 maal herhaald en na iedere cyclus worden 2 n aantal dubbele fragmenten gevormd met n = aantal cycli. Jolien Vandewalle Masterproef

31 Figuur 1.13: Proces Polymerase Chain Reaction (PCR) Reverse transciptase qpcr (RT qpcr) Principe Polymerase Chain Reaction heeft zijn plaats in de biochemische/ biomedische wereld verzekerd. Uit deze PCR techniek zijn vele andere technieken ontstaan. Een recente ontwikkeling is de kwantitatieve PCR methode (qpcr) of de real-time PCR methode waarvan de populariteit blijft stijgen. qpcr heeft zich ontwikkeld als de meest gevoelige en specifieke kwantitatieve PCR methode (Dorak, 2007). Deze methode is gebaseerd op de conventionele principes van PCR met als bijkomend voordeel dat de reactie in real-time te volgen is. Deze techniek maakt zowel de detectie als de kwantificatie van nucleïnezuren mogelijk. Real-time PCR is het continu verzamelen van fluorescent signaal na de extentiestap van elke cyclus in de PCR reactie. Bij de detectie van RNA door qpcr wordt de qpcr reactie voorafgegaan door een Reverse Transcriptase (RT) stap. Zoals in werd besproken wordt in deze stap het RNA omgezet in cdna. Men spreekt dus van Reverse Transcriptase qpcr of RT-qPCR (Dorak, 2007). Enkele voordelen van deze techniek zijn: lage detectielimiet zodat lage concentraties aan virale partikels ook worden gedetecteerd (Dorak, 2007); snelle, accurate, betrouwbare methode (Pfaffl, 2001); kwantificatie van het geamplificeerd DNA (Dorak, 2007 ; Pfaffl, 2001); minder voorbereidend werk dan cultivatie. Jolien Vandewalle Masterproef

32 Sequentie specifieke chemie Een grote variatie in sequentie specifieke real-time PCR chemie methoden zijn beschikbaar. De drie meest gebruikte methoden in de sequentie specifieke chemie zijn de 5 nuclease methode, de hybridisatieprobe en de moleculaire beacon methode. Figuur 1.14 geeft de 5 nuclease methode weer. Hierbij wordt gebruik gemaakt van twee primers en één duaal gelabelde hydrolyse probe. De probe bestaat uit een covalent gebonden fluorofoor aan het 5' uiteinde van de probe en een quencher aan het 3' uiteinde. De quencher onderdrukt de fluorescentie geëmitteerd door de fluorofoor via FRET transfer (Fluorescence Resonance Energie Transfer). Zolang de fluorofoor en de quencher zich dicht bij elkaar bevinden, zal de quencher de fluorescente signalen van de fluorofoor onderdrukken (figuur 1.14 B). Na de hechting van de primers en hydrolyse probe, wordt de probe door de 5'-3' nuclease activiteit van Taq polymerase gedegradeerd (figuur 1.14 C). Hierdoor zal de quencher en de fluorofoor gescheiden worden van elkaar, hierdoor zal het fluorescent signaal uitgezonden door de fluorofoor niet meer onderdrukt worden en ontstaat er een sterk fluorescent signaal (figuur 1.14 D). Zo ontstaat er elke cyclus van de amplificatie een stijging van het fluoresent signaal (Holland et al., 1991). De intensiteit van het fluorescente signaal is recht evenredig met de DNA concentratie. Studies gebaseerd op deze techniek zijn voor verschillende voedselgebonden virussen ontwikkeld, zoals AdV, HAV, HEV, NoV (Butot et al., 2010; He and Jiang, 2005; Jothikumar et al., 2005a; Jothikumar et al., 2006; Park et al., 2008; Petitjean et al., 2006). Hybridisatie probes en de moleculaire beacon methode zijn twee alternatieve technieken die behoren tot de sequentie specifieke real-time PCR chemie. Het voordeel van het gebruik van hybridisatie probes is de mogelijkheid tot zeer specifieke primer binding aangezien de hybridisatie van twee proben en twee primers vereist is. Dit is dan ook weer nadelig voor de detectie van verschillende genotypen van een virus. Om deze reden is deze methode meer gebruikt voor specifieke detectie van virale pathogenen zoals Hepatitis B virus in klinische stalen. Jolien Vandewalle Masterproef

33 Figuur 1.14: Werking 5' nuclease methode Niet-sequentie specifieke chemie Om tot een fluorescent signaal te komen kan een intercalerende kleurstof worden gebruikt zoals SybrGreen. Een intercalerende kleurstof is een chemische verbinding die dubbelstrengig DNA bindt. Deze kleurstof is niet specifiek en bindt hierdoor met elk dubbelstrengig DNA-molecule. Achtergrondfluorescentie door vrij SybrGreen of SybrGreen die bindt met enkelstrengig DNA is verwaarloosbaar klein, eenmaal SybrGreen gebonden is aan dubbelstrengig DNA zal het fluorescent signaal sterk toenemen tot 2000 maal de achtergrondfluorescentie (Dorak, 2007). Hieronder wordt het principe van de binding van SybrGreen op dubbelstrengig DNA als onderdeel van qpcr reactie voorgesteld. Initieel wordt het DNA gedenatureerd en worden SybrGreen en de forward en reverse primer toegevoegd (figuur 1.15 A). Vervolgens gebeurt de primerhechting waarbij de forward en reverse primer binden met complementair sequentie DNA (Figuur 1.15 B). Daarna gebeurt de primerverlenging waardoor dubbelstrengig DNA vanaf de 3 kant via DNA polymerase wordt verlengd (figuur 1.15 C). Tenslotte is het volledig DNA dubbelstrengig en bindt SybrGreen overal waardoor een sterk fluorescent signaal ontstaat (figuur 1.15 D). Jolien Vandewalle Masterproef

34 Figuur 1.15: Principe binding SybrGreen op dubbelstrengig DNA (Stals,2011) Amplificatiecurve Figuur 1.16 geeft een amplificatiecurve weer die gedurende de real-time PCR reactie wordt verkregen. Dit wordt bekomen door het aantal PCR cycli uit te zetten in functie van de gemeten fluorescentie na elke cycli, die proportioneel is met de hoeveelheid geamplificeerd DNA. De amplificatiecurve vertoont twee fasen, de exponentiële fase gevolgd door de plateau fase. Tijdens de exponentiële fase wordt het DNA elke cyclus verdubbeld, aangezien de reactiecomponenten zoals DNA polymerase, dntp s, MgCl 2 en andere limiterend zijn, zal de reactiesnelheid verminderen en de amplificatiecurve overgaan in de plateau fase. Tijdens de eerste cycli van de PCR reactie wordt er nog geen fluorescent signaal gedetecteerd aangezien dit signaal zich nog op het achtergrondniveau bevindt. De achtergrondfluorescentie is het duidelijkst waar te nemen tijdens de initiële cycli van de PCR. Tijdens deze vroege PCR cycli wordt het achtergrondsignaal gebruikt om de baseline fluorescentie vast te leggen. Het doel van deze data analyse is het bepalen wanneer de target amplificatie voldoende boven het achtergrondsignaal uitkomt. De threshold is een getal die aan elke run wordt toegekend. Het is een statistisch significant punt dat zich boven de berekende baseline bevindt. Wanneer voldoende geamplificeerd DNA ontstaat, wordt het fluorescent signaal detecteerbaar. Het cyclusnummer op dit moment wordt de quantification cycle (C q ) genoemd. De C q waarde is het cyclusnummer dat overeenkomt met het snijpunt tussen het fluorescent signaal en de threshold line. De C q wordt hoofdzakelijk bepaald door de hoeveelheid template DNA bij de start van de amplificatie reactie. Indien een grote starthoeveelheid template DNA aanwezig is, zullen er slechts Jolien Vandewalle Masterproef

35 enkele amplificatiecycli noodzakelijk zijn om een fluorescent signaal te bekomen. Deze reactie zal een lage of vroege C q waarde hebben. Indien een kleine starthoeveelheid template DNA aanwezig is, zullen er meer amplificatiecycli nodig zijn om een fluorescent signaal te bekomen boven het achtergrondsignaal. Deze reactie zal een hoge of late C q waarde hebben. Figuur 1.16: Theoretische amplificatiecurve (Biorad, 2013) Standaardcurve Door de bekomen C q waarden uit de amplificatiecurve uit te plotten ten opzichte van de logaritme van de bijhorende concentraties wordt een standaardcurve opgesteld. De lage C q waarden bevatten de hoogste concentraties aan template DNA, de hoge C q waarden bevatten de laagste concentraties aan template DNA. Op deze manier wordt een lineair dalende curve bekomen waaruit de PCR parameters van de realtime PCR reactie kunnen worden gehaald. Via deze standaardcurve kunnen bekomen C q waarden worden gelinkt aan de bijhorende startconcentratie van het target DNA. Naast het gebruik van plasmiden met daarin de primer binding sites kunnen nog andere zaken worden gebruikt voor de aanmaak van de standaardcurven zoals genomisch DNA en run-off RNA. Het is aanbevolen om langere DNA moleculen te gebruiken om standaardcurven te genereren in RT -qpcr experimenten aangezien de kans op aërosolvorming en verdamping kleiner is waardoor mogelijke contaminatie wordt gereduceerd (Stals, 2011). Om deze reden is het beter om plasmide DNA en genomisch DNA te verkiezen boven run-off RNA. Run-off RNA kan op elk moment worden aangemaakt maar door zijn kleine nucleotidesequentie is run-off RNA het meest gevoelig voor contaminatie, wat leidt tot vals positieve resultaten (Stals, 2011). Jolien Vandewalle Masterproef

36 Smeltcurve De smelttemperatuur (Tm) van dubbelstrengig DNA is de temperatuur waar 50% van het DNA nog enkelstrengig is. De smelttemperatuur is hoofdzakelijk afhankelijk van de lengte van de DNA sequentie en de samenstelling van de DNA sequentie, meer bepaald de concentratie aan GC-baseparen. Op een bepaald moment, wanneer het DNA wordt verhit, zal er een plotse afname zijn in fluorescentie (figuur 1.17). Op dit moment is de smelttemperatuur bereikt waarbij de helft van het dubbelstrengig DNA, enkelstrengig wordt en hierdoor de binding met SybrGreen verliest. Via de eerste afgeleide van de smeltcurve kan de smeltpiek worden bekomen (figuur 1.18). Ideaal is wanneer er één piek te zien is bij één bepaalde temperatuur. Meerdere pieken, meestal op een lagere temperatuur, kunnen indicatie geven dat er primer dimeren zijn ontstaan. SybrGreen bindt mogelijks ook primer dimeren, wat aanleiding kan geven tot vals-positieve resultaten. Om dit te voorkomen wordt de temperatuur na de amplificatie (50 cycli) langzaam verhoogd tot 95 C waarbij primer dimeren denatureren. Via de smeltcurve-analyse kunnen aspecifieke bindingen zoals primer dimeren op basis van lengte worden onderscheiden van de amplicons. Primer dimeren zijn veel kleiner dan het amplicon en hebben hierdoor een lagere smelttemperatuur. Figuur 1.17: Smeltcurve met de fluorescentie in de y-as en de temperatuur in de x-as Figuur 1.18: Smeltpieken (eerste afgeleide van de smeltcurve) Jolien Vandewalle Masterproef

37 1.5.2 HRM RT-qPCR Principe High-Resolution Melting Curve Analysis (HRMCA), of kortweg HRM, werd in 2002 geïntroduceerd als een krachtige en eenvoudige techniek voor mutatiescanning en genotypering (Wittwer, 2009; Reed et al., 2007). HRM wordt gezien als een verfijnde, snelle en nauwkeurige verbetering van de conventionele RT-qPCR smeltcurve-analyse. Deze post PCR analyse-methode wordt gebruikt om de kleinste variaties in de nucleotidesequenties te identificeren. De methode is gebaseerd op de detectie van minimale verschillen in de PCR smeltcurve (dissociatiecurve). HRM is zo gevoelig dat het de detectie van één enkel baseverschil in de nucleotidesequenties kan detecteren (Reed et al., 2007). De HRM RT-qPCR maakt gebruik van instrumenten die voor een meer nauwkeurige temperatuurverhoging zorgen en een meer nauwkeurige dataverzameling toelaten (Stals, 2011). Het verschil met een gewone RT-qPCR analyse is het aantal metingen per C. Bij de gewone dissociatiecurve wordt de temperatuur meestal in stappen van 0,20 C of meer verhoogd, terwijl bij HRM RT-qPCR de temperatuur bij de dissociatiecurve in veel kleinere stappen van 0,05 C of minder wordt verhoogd. Dit laat een meer gedetailleerde analyse van het smeltgedrag toe. Deze methode is veel gevoeliger voor de detectie van kleine verschillen in de nucleotidesequentie en is dus ook, naast detectie, geschikt voor toepassing zoals opsporen van genmutaties, virustypering, etc. De methode is gebaseerd op het gebruik van verzadigde fluorescente kleurstoffen met verbeterde dubbelstrengig DNA bindingseigenschappen zoals LC Green, LC Green Plus, ResoLight en EvaGreen (Gundry et al., 2003; Wittwer et al., 2003). De eerste stap van de HRM methode is de conventionele qpcr amplificatie van de targetsequentie. Dit door gebruik te maken van standaard qpcr technieken, in aanwezigheid van een fluorescente intercalerende kleurstof (Wittwer, 2009; Reed et al., 2009). Verzadigde kleurstoffen genieten de voorkeur boven niet-verzadigde kleurstoffen, omdat deze laatste, in hoge concentraties PCR-inhibitie veroorzaken. De verzadigde kleurstof labelt het amplicon over de volledige lengte, zodat alle smeltdomeinen worden gedetecteerd. Na voltooiing van de PCR stap wordt het amplicon geleidelijk gedenatureerd door temperatuurstijging in kleine stappen van 0,05 C of minder (Reed et al., 2007; Wittwer et al., 2003). Wanneer de smelttemperatuur (Tm) wordt bereikt, denatureert het dsdna en worden enkelstrengen gevormd. Tijdens dit proces van temperatuurstijging wordt de fluorescentie gemeten. Op deze manier worden van de amplicons smeltcurves gegenereerd die de fluorescentie intensiteit weergeven in functie van de smelttemperatuur (Wittwer, 2009; De leeneer et al., 2008). Zo wordt een karakteristiek smeltprofiel bekomen. De fluorescente kleurstof fluoresceert sterk bij lage temperaturen wanneer het gebonden is aan dsdna. De fluorescentie neemt af bij hogere temperaturen wanneer ssdna wordt gevormd (Reed et al., 2007). Het smeltprofiel en de smelttemperatuur van een amplicon zijn o.a. afhankelijk van de GC- inhoud, lengte, sequentie en heterozygositeit (Reed et al., 2007). Jolien Vandewalle Masterproef

38 Sequentieveranderingen worden onderscheiden op basis van vorm of positie van de smeltcurve (Witwerr et al., 2003) Intercalerende kleurstoffen Er zijn verschillende types van dsdna intercalerende kleurstoffen die verschillende eigenschappen hebben. De eisen van de kleurstoffen voor HRM verschillen van de kleurstoffen die worden gebruikt voor standaard qpcr. De kleurstof bij HRM moet gedetailleerde informatie geven over het smeltgedrag van de geamplificeerde targetsequentie. Hieronder worden de drie belangrijkste klassen van dsdna bindende kleurstoffen weergegeven die momenteel beschikbaar zijn. Niet-verzadigde kleurstoffen SybrGreen I is de meest voorkomende niet-verzadigde dsdna intercalerende kleurstof. Deze kleurstof is algemeen ongeschikt voor de toepassing van HRM. Bij hoge concentraties aan SybrGreen I stabiliseert het DNA en remt het de DNA polymerase. Om betrouwbare informatie te bekomen, moet dus een lage concentratie aan SybrGreen I gebruikt worden. Bij lagere concentraties aan SybrGreen I is deze kleurstof in staat om te verspringen van de gedenatureerde gebieden van esdna naar de gebieden van dsdna. Aangezien de HRM methode wordt gebruikt om nucleotidesequenties, die verschillen in één base, te onderscheiden op basis van fluorescent signaal, resulteert het gebruik van SybrGreen I in een verkeerde interpretatie van het fluorescent signaal. Om deze beperking van niet-verzadigde kleurstoffen te omzeilen worden verzadigde kleurstoffen ontwikkeld. Verzadigde kleurstoffen Een nieuwe klasse van dsdna intercalerende kleurstoffen die de DNA polymerasen niet remmen zijn recentelijk ontwikkeld. Hogere concentraties van deze kleurstoffen kunnen worden toegevoegd dan bij niet-verzadigende kleurstoffen, dit zorgt voor een nog sterkere binding op de targetsequentie. De verzadigde kleurstoffen kunnen niet verspringen van de gedenatureerde esdna gebieden naar de dsdna gebieden aangezien het dsdna al is verzadigd. Een meer nauwkeurige analyse van het smeltgedrag van de targetsequentie is mogelijk. Mogelijke verzadigde kleurstoffen die voor HRM analyse kunnen worden gebruikt zijn LC Green en LC Green Plus (Kapabiosystems, 2013). Release on demand kleurstoffen De "release-on-demand" kleurstoffen, waarvan EvaGreen een voorbeeld is, kunnen worden toegevoegd aan niet-verzadigde concentraties. Dit komt door de nieuwe werkwijze van fluorescentie emissie. Wanneer de kleurstof vrij in oplossing is, wordt het fluorescente signaal gedoofd door een quenching factor. Na binding van de kleurstof aan dubbelstrengig DNA wordt de quenching factor vrijgegeven zodat de kleurstof een sterk fluorescent signaal afgeeft. Dit laat het gebruik van niet-verzadigde concentraties van de kleurstof toe, zonder PCR-remming, terwijl de Jolien Vandewalle Masterproef

39 unieke intercalerende kleurstof een zeer gevoelige HRM-analyse levert (Kapabiosystems, 2013) Toepassingen HRM wordt gebruikt als pre-screening methode voorafgaand aan sequenering van afwijkende fragmenten. Sequenering van volledige genen is immers tijdrovend en arbeidsintensief (De leeneer et al., 2008). HRM is een snelle en sterke techniek die de detectie van mutaties, polymorfismen en epigenetische verschillen in dubbelstrengige DNA stalen toelaat. De HRM methode werd reeds succesvol toegepast bij het Norovirus om de verschillende NoV genotypen te onderscheiden na amplificatie met NoV primers (tajiri-utagawa et al., 2009). Op heden is de combinatie van real-time PCR en HRM commercieel beschikbaar (Herrmann et al., 2006) (Herrmann et al., 2007) Voordelen en nadelen Het grote voordeel van HRM is het onderscheidend vermogen tot op één basepaar. Een ander voordeel zijn de minimale post PCR vereisten (De Leeneer et al., 2008). Er is geen staalverwerking, toevoeging van reagentia of scheiding meer vereist na PCR (Reed et al., 2007). Hierdoor wordt het een minder arbeidsintensieve methode met een hoge kosteneffectiviteit. Andere voordelen van HRM zijn de hoge sensitiviteit en accuraatheid van de techniek. Daarnaast is HRM een snelle, eenvoudige, gebruiksvriendelijke methode (Reed et al., 2007; Witwerr, 2009; De leeneer et al., 2008). Naast deze voordelen zijn er ook een aantal nadelen aan de HRM technologie verbonden. HRM laat slechts screening toe van kleine fragmenten tot 500 bp (Witwerr, 2009; Reed et al., 2007). Indien langere amplicons worden gebruikt, kan een maximale sensitiviteit niet worden gegarandeerd (Witweer et al., 2009). Verdere nadelen zijn de strenge PCR- optimalisatie vereisten voor HRM. Ook analyse van DNA-stalen van verschillende DNA-extractie methoden kan problematisch zijn (Reed et al., 2007). Jolien Vandewalle Masterproef

40 2. Materiaal en methode 2.1 Positieve controleplasmiden Figuur 2.1 geef de 6 positieve controleplasmiden weer die werden gebruikt. Plasmiden phevgt1/2+cm, phevgt3+cm en phevgt4+cm werden gebruikt als positieve controle voor de SybrGreen RT-qPCR-detectie van HEV. Plasmiden phevgt1/2, phevgt3 en phevgt4 werden gebruikt als positieve controle voor de high resolution melting qpcr detectie en genotypering van HEV. De plasmiden zijn voorzien van een ampicilline resistentiemerker en een origin of replication (ori). Daarnaast bevatten ze ook een insert waarvan de sequentie verschilt per plasmide. Plasmiden phevgt1/2+cm, phevgt3+cm en phevgt4+cm bevatten respectievelijk de genomische doelwitsequenties van HEV gt1 en gt2, gt3 en gt4, vergezelt van een contaminatiemerker sequentie. Plasmiden phevgt1/2, phevgt3 en phevgt4 bevatten respectievelijk de genomische doelwitsequenties van HEV gt1 en gt2, gt3 en gt4 zonder contaminatiemerker sequentie. Aangezien de (HRM) RT-qPCR sequentie voor HEV genotypen 1 en 2 de doelwitsequenties identiek zijn, wordt voor deze genotypen telkens 1 controleplasmide gebruikt. Bovendien dient te worden opgemerkt dat werd besloten om te werken met de phev plasmides zonder contaminatemerker sequentie bij de HRM RTqPCR methode, aangezien bij detectie en genotypering van hepatitis E virus in natuurlijk gecontamineerde stalen, geen contaminatiemerker sequentie aanwezig is. Op deze manier wordt een correctere smelttemperatuur bekomen bij de analyse van het smeltprofiel. phev gt1/2 CCTCGTGCCGGCGGTGGTTTCTGGGGTGACAGGGTTGATTCTCAGCCCTTCGCAATCCCCTATATTCATCC AACCAACCCCTTCG CCGCCGCGC phev gt3 CCTCGTGCCGGCGGTGGTTTCTGGGGTGACAGGGTTGATTCTCAGCCCTTCGCCCTCCCCTATATTCAT CCAACCAACCCCTTCGCCGCCGCGC phev gt4 CCTCGTGCCGGCGGTGGTTTCTGGGGTGACCGGGTTGATTCTCAGCCCTTCGCCCTCCCCTATATTCAT CCAACCAACCCCTTCGCCGCCGCGC phev gt1/2 + CM CCTCGTGCCGGCGGTGGTTTCTGGGGTGACAGGGTTGATTCTCAGCCCTTCGCAATCCGGATCCCCTATA TTCATCCAACCAACC CCTTCGCCGCCGCGC phev gt3 + CM CCTCGTGCCGGCGGTGGTTTCTGGGGTGACAGGGTTGATTCTCAGCCCTTCGCCCTCCGGATCCCCTAT ATTCATCCAACCAACCCCTTCGCCGCCGCGC phev gt4 + CM CCTCGTGCCGGCGGTGGTTTCTGGGGTGACCGGGTTGATTCTCAGCCCTTCGCCCTCCGGATCCCCTAT ATTCATCCAACCAACCCCTTCGCCGCCGCGC Figuur 2.1: Sequentie overzicht van de inserts van alle gebruikte plasmiden De met rood aangeduide sequentie is de contaminatiemerker (CM) die werd ingebouwd. De groen aangeduide basenparen zijn de verschillen tussen genotypen die HRM-analyse in dit gebied mogelijk maken Jolien Vandewalle Masterproef

41 2.2 Transformatie en upscaling van de controleplasmiden in DH5α E. coli cellen Principe Transformatie is de opname van plasmiden door competente bacteriële cellen (E. coli DH5α stam) met als doel het plasmide in grote aantallen aan te maken. Door de cellen te onderwerpen aan een hitteshock ontstaan er poriën in het celmembraan waardoor het plasmide de cel kan binnendringen. Door de cellen daarna terug op ijs te plaatsen, sluit het membraan zich opnieuw. Hierna wordt een herstelmedium toegevoegd aan de cellen om ze te herstellen na de hitteshock. De cellen worden ten slotte uitgeplaat op een Luria Broth (LB) agarbodem waar een bepaald antibioticum aanwezig is, in ons geval ampicilline. Zodoende overleven enkel de cellen die het plasmide hebben opgenomen aangezien het plasmide een antibioticaresistentiegen bezit. Door de met de plasmiden getransformeerde E. coli stammen op te kweken in vloeibaar medium, kunnen er grote hoeveelheden geproduceerd worden van het plasmide. Dit maakt het mogelijk om de plasmiden (langdurig) te stockeren bij een temperatuur van -80 C voor eventueel verder onderzoek Materiaal - pmos Blue Blunt-Ended PCR Cloning Kit (GE Healthcare; Diegem, België) - DH5α E. coli competente cellen (-80 C) - Plasmide DNA van de verschillende genotypen - Centrifuge - Schudincubator 37 C - Warmwater bad 42 C - Ijs - Luria Broth base vloeibaar medium met antibioticum (Invitrogen; Merelbeke, België; 1.5 % w/v) o 25 g LB medium/l o 50 µg/ml ampicilline (1000x) - Luria Broth base agar voedingsbodem met antibioticum (Invitrogen; Merelbeke, België; 1.5 % w/v) o 25 g LB medium/l o 1,5 % agar o 50 µg/ml ampicilline (1000x) Methode Transformatie van de plasmiden werd uitgevoerd volgens de instructies van de pmos Blue Blunt-Ended PCR Cloning Kit. Als eerste werd de Luria Broth base agar voedingsbodem gesteriliseerd gedurende 15 minuten bij 121 C. Vervolgens werd het medium afgekoeld in een warmwaterbad van 60 C en daaraan werd 50 µg/ml ampicilline (1000 x) toegevoegd. Het medium werd uitgegoten in petri-platen en afgekoeld in de laminaire flowkast. Vervolgens werd de transformatie van de Jolien Vandewalle Masterproef

42 plasmiden in de competente E. coli cellen uitgevoerd. Zes microcentrifuge tubes werden gekoeld op ijs en daarin werd 20 µl van de competente E. coli cellen gebracht. Vervolgens werden de plasmidestocks kort gecentrifugeerd en 1 µl van elk plasmide werd overgebracht in 20 µl E. coli aliquots. De transformatie van de plasmiden werd uitgevoerd met behulp van een hitteshock: na een 30 minuten durende incubatie op ijs van een mix van een plasmide en competente E. coli cellen, werd de mix gedurende 40 seconden in een warmwaterbad van 42 C geplaatst. Deze hitteshock zorgde voor een verhoogde permeabiliteit van het membraan van de E. coli cellen. Daarna werd de mix twee minuten op ijs geplaatst zodat het celmembraan zich weer kan sluiten en het plasmide opgenomen blijft. Na deze hitteshock werd aan de mix 80 µl herstelmedium zonder antibiotica toegevoegd en dit werd schuddend geïncubeerd gedurende 1 uur bij 37 C. De mix werd vervolgens uitgeplaat op Luria broth base agar dat voorzien is van 50µg/ml ampicilline (1000x) en overnacht geïncubeerd bij een temperatuur van 37 C. De gegroeide kolonies zijn kolonies van getransformeerde E. coli en bevatten dus het plasmide. Upscaling van de plasmiden gebeurde door de getransformeerde kolonies over te enten naar een vloeibaar Luria broth base medium, waaraan opnieuw 50µg/ml antibioticum ampicilline (1000x) werd toegevoegd. De geïnoculeerde vloeibare media werden vervolgens bij 37 C overnacht schuddend geïncubeerd. 2.3 Plasmide extractie Principe Na de laatste incubatie worden de geproduceerde plasmides geëxtraheerd uit de vloeibare E. coli cultuur met behulp van de Plasmid Midi Kit (Qiagen; Hilden, Duitsland) volgens de instructies van de fabrikant. In deze stap wordt het DNA uit de E. coli cellen geïsoleerd Materiaal - Plasmid Midi Kit (Qiagen; Hilden, Duitsland) Tabel 1.1: Gebruikte buffers bij plasmide-extractie Buffer Bestanddelen Buffer P1 (Resuspensiebuffer) Tris-Cl 50 mmol/l, ph 8,0; EDTA 10 mmol/l; RNase A 100 µg/ml Buffer P2 (Lysisbuffer) NaOH 200 mmol/l, 1% SDS Buffer P3 (Neutralisatiebuffer) Kaliumacetaat 3,0 mol/l, ph 5,5 Buffer QBT (Equilibreerbuffer) NaCl 750 mmol/l; MOPS 50 mmol/l, ph 7,0; 15% isopropanol; 0,15% Triton X-100 Jolien Vandewalle Masterproef

43 Buffer QC (Wasbuffer) Buffer QF (Elutiebuffer) NaCl 1,0 mol/l; MOPS 50 mmol/l, ph 7,0; 15% isopropanol NaCl 1,25 mol/l; Tris 50 mmol/l, Tris.Cl, ph 8,5; 15% isopropanol - Tafelcentrifuge - Midi spinkolom - Iso-propanol (100 %) - Ethanol 70 % - RNAse vrij water Methode Na de laatste incubatie werden de plasmides geëxtraheerd uit de vloeibare E. coli cultuur met behulp van de Plasmid Midi Kit volgens de instructies van de fabrikant. Eerst werd het medium gecentrifugeerd bij 6000 g gedurende 15 min bij 4 C om de getransformeerde en opgekweekte E. coli cultuur te concentreren. Na verwijdering van het supernatans werd 4 ml buffer P1 toegevoegd. Buffer P1 of de resuspensiebuffer zorgt ervoor dat de pellet bestaande uit bacteriën beter oplost waardoor buffer P2, de lysisbuffer, de cellen beter kan bereiken. Van buffer P2 werd ook 4 ml toegevoegd en dit laat men 5 minuten inwerken op kamertemperatuur. Hierna werd ook 4 ml gekoelde neutralisatiebuffer P3 toegevoegd, die ervoor zorgt dat de lysereactie gestopt werd en dat het bacterieel DNA neerslaat. Door een centrifugatie bij g gedurende 30 min bij 4 C werd het bacterieel DNA neergeslagen, terwijl het plasmide in oplossing blijft. Er volgde een tweede centrifugatie bij g gedurende 15 min bij 4 C om de zuiverheid te verhogen door het neerslaan van enig overgebleven genomisch DNA. Vervolgens werd een Midi spinkolom geëquilibreerd met 4 ml QTB-buffer, waarna het supernatans uit de voorgaande stap op de kolom gebracht werd. De kolom werd tweemaal gewassen met 10 ml QC-buffer en het plasmide werd tenslotte geëlueerd met 5 ml QF-buffer. Het DNA werd geprecipiteerd door 3,5 ml iso-propanol (0.7 volumes) toe te voegen aan het eluaat en daarna te centrifugeren bij g gedurende 30 min bij 4 C. Tenslotte werd het DNA gewassen met 5 ml ethanol 70 % op kamertemperatuur. Er werd opnieuw gecentrifugeerd bij g gedurende 10 min bij 4 C. Na het afgieten van het supernatans laat men de overblijvende ethanol verdampen. De pellets, die de plasmiden bevatten, werden opgelost in 800 µl Tris-EDTA buffer (ph 7.0). Jolien Vandewalle Masterproef

44 2.4 Kwantificatie van phev gt 1/2, 3, 4 plasmiden De kwantificatie van de phev plasmiden gebeurde door de concentratie te meten bij 260 nm met behulp van de Nanodrop ND-1000 UV vis-spectrofotometer (Nanodrop Technologies; Wilmington, DE, USA). Door het aantal baseparen te vermenigvuldigen met de gemiddelde massa van een basepaar (330 Da) en dit vervolgens te delen door het getal van Avogadro werd de massa van 1 plasmide bekomen. Het toestel geeft een waarde in ng/µl en door het gemiddelde van de drie concentratiemetingen in ng/µl te delen door de massa van 1 plasmide werd het aantal plasmidekopieën per µl bekomen (tabel 2.2). Tabel 2.2: Kwantificatie van de verschillende gebruikte HEV plasmiden Genotypen Behaalde concentratie (plasmidekopieën/µl) Genotype 1/2 + CM 2,66x Genotype 3 + CM 9,33x 10 9 Genotype 4 + CM 7,644x Genotype 1/2 1,60x Genotype 3 6,80x Genotype 4 5,764x Gelelektroforese Principe Agarose gelelektroforese is een methode om DNA te scheiden volgens grootte. DNA is negatief geladen en wordt geladen tussen een negatieve pool (anode) en onderaan een positieve pool (kathode). Het negatieve DNA wordt door de positieve pool aangetrokken. Hoe kleiner het DNA, hoe minder weerstand het DNA ondervindt van het gel, dus hoe sneller het DNA door de positieve pool wordt aangetrokken. Hoe groter het DNA, hoe meer weerstand het DNA ondervindt van het gel, dus hoe trager het DNA wordt aangetrokken door de positieve pool. Op deze manier wordt het DNA gescheiden volgens grootte. Door een moleculaire ladder mee te laden, kan de grootte van het DNA worden afgelezen. Er kunnen verschillende percentages aan agarosegels worden gebruikt. Een 1 % gel is algemeen geschikt om grote DNA- fragmenten te scheiden van 3 tot 10kb, hoewel dit uiteraard afhankelijk is van het agarosetype. Hoe groter het gelpercentage, hoe kleiner de fragmenten zijn die kunnen worden gescheiden. Ethidiumbromide bindt DNA en kan via bestraling met UV licht worden gevisualiseerd. Hoe groter het DNA, hoe meer ethidiumbromide bindt, hoe dikker de band bij bestraling met UV licht. Hoe kleiner en hoe minder het DNA, hoe minder ethidiumbromide bindt, hoe dunner de band Materiaal - Seakam LE agarose (Lonza; Verviers, België) - 0,5 % TAE buffer - Elektroforese toestel (Mupid-ex horizontal electrophoresis system, ABC scientific) Jolien Vandewalle Masterproef

45 - Merker: 1kb DNA ladder (Invitrogen) - Ethidiumbromide (0.2 % v/v) Methode Er werd 1g SeaKam LE agarose afgewogen en 60 ml 0,5 %TAE buffer toegevoegd. TAE buffer zorgt voor het behouden van de stabiliteit van het DNA. Het geheel werd kort verhit in de microgolf tot een heldere oplossing verschijnt. Dit werd 15 minuten afgekoeld en in de opstelling met kammetjes gegoten. De luchtbellen werden verwijderd zodat deze niet in het gel aanwezig blijven. Het gel stolt in 10 minuten. Daarna werd het gel in de elektroforesetoestel geplaatst zodat het onderloopt met TAE buffer. Het DNA werd geladen met loading dye in de slotjes van het gel. Het toestel werd aangesloten op het spanningsveld. Het negatieve DNA migreert naar de positieve pool of de kathode. Het gel werd 1 uur gelopen bij 140 Volt. Nadien werd het gel in ethidiumbromide geplaatst voor 15 minuten, hierdoor wordt het gel gekleurd en worden de banden bij bestraling met UV licht gevisualiseerd. Hierna volgt de analyse van het bekomen bandenpatroon. 2.6 Aanmaak phev plasmide standaardreeks voor gt 1/2, 3, 4 Voor de verschillende phev genotypen werd van de plasmideopslagstock, in tabel 2.2, een verdunningsreeks aangemaakt tot 2x10 7 pc/µl, de werkstock, vertrekkend vanuit een opslagstock van 2x10 10 pc/µl. Vervolgens werd voor de drie verschillende phev genotypen een tienvoudige plasmidestandaardreeks aangemaakt van 2x10 7 pc/µl tot 2x10 0 pc/µl. Dit werd bekomen door telkens 10 µl van de vorige verdunning toe te voegen aan 90 µl nuclease vrij water. Deze verdunningsreeksen werden steeds uitgevoerd in Lobind microcentrifuge tubes (Eppendorf). Tijdens het maken van deze verdunningsreeks was het zeer belangrijk om na elke verdunning de plasmiden te homogeniseren zodat de plasmides homogeen werden verdeeld in de microcentrifuge tubes. Deze standaardreeksen van de plasmides met de sequenties voor detectie van Hepatitis E genotypen 1/2, 3, 4 werden op ijs bewaard. Jolien Vandewalle Masterproef

46 2.7 Reverse Transcriptie Principe Aangezien het HEV genoom een enkelstrengig positief georiënteerde RNA-streng is, dient het RNA omgezet te worden naar kopie DNA (cdna) m.b.v. het enzym reverse transcriptase. Van deze enkelstrengige cdna-streng wordt een complementaire cdna-streng aangemaakt zodat in het PCR proces met dubbelstrengig DNA gestart kan worden. Dit principe werd in paragraaf reeds uitgebreid besproken Materiaal - Mastermix 1 (MMX1; Volumes 1 reactie) o 7,5 µl Nuclease vrij water o 1,0 µl Willekeurige Hexameren (Applied Biosystems) - Mastermix 2 (MMX2; Volumes 1 reactie) o 4,0 µl MgCl2 (25mM) (Applied Biosystems) o 2,0 µl 10x PCR buffer II (Applied Biosystems) o 1,0 µl dntp (20mM) (Applied Biosystems) o 1,0 µl Rnase inhibitor (Applied Biosystems) o 0,5 µl Multiscribe RT (Applied Biosystems) - GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems) Methode Er werd een pre-reactiemengsel bestaande uit 3 µl HEV RNA en 8,5 µl MMX1 aangemaakt in de pre PCR ruimte. Dit werd tot 95 C gedurende 2 min verwarmd en vervolgens op ijs gekoeld gedurende 2 min. Dit zorgde ervoor dat de aanwezigheid van secundaire structuren in het RNA werd geminimaliseerd. Dit eerste prereactiemengsel werd vervolgens gemengd met een tweede pre-reactiemengsel van 8,5 µl MMX2 tot een uiteindelijke volume van 20 µl werd verkregen. De reverse transcriptie werd uitgevoerd in een GeneAmp PCR System 9700 met het volgende temperatuurprofiel : 22 C gedurende 10 min, 42 C gedurende 15 min, 99 C gedurende 5 minuten en 5 C gedurende 5 minuten en afgekoeld tot 4 C. Alle cdna stalen werden opgeslagen bij -20 C. PCR programma: 95 C 2min Ijs 2min 22 C 10 min 42 C 15 min 99 C 5 min 5 C 5 min 4 C oneindig MMX1 + RNA MMX1 + MMX2 + RNA Jolien Vandewalle Masterproef

47 2.8 Reverse Transcriptase qpcr (RT-qPCR) volgens Martin-Latil et al. (2012) Principe RT-qPCR is gebaseerd op de principes van conventionele PCR met als bijkomend voordeel dat de reactie in real-time te volgen is. Via de software van het SDS7300 Real-Time PCR Systeem worden verschillende curves verkregen, namelijk de amplificatiecurve, de standaardcurve en de smeltcurve. Deze principes werden in paragraaf reeds besproken Materiaal - Standaardreeks plasmides phev gt 1/2, 3, 4 (+CM) o 2 x 10 7 pc/µl phev gt 1/2, 3, 4 (+ CM) o Nuclease vrij water o Lobind microcentrifuge tubes (Eppendorf) - Mastermix o 1 x SYBR Select MasterMix (Life technologies) o 600 nm Forward primer (IDT-DNA; Leuven, België) HEV-5260-F deg: 5 CRGTGGTTTCTGGGGTGAC 3 Positie: o 600 nm Reverse primer (IDT-DNA; Leuven, België) HEV-5330-R: 5 AGGGGTTGGTTGGATGAATATAG 3 Positie: o ng Template o Nuclease vrij water o 2 ml tubes - Real-Time PCR o 96-well plaat o Automatische pipet o Sequence detection system 7300 Real-Time PCR Systeem (Life technologies) o SDS7300 software (Life Technologies) Methode In de pre PCR ruimte werd de mastermix aangemaakt. In een microcentrifuge tube werd telkens 600 nm forward primer en 600 nm reverse primer toegevoegd. Dit werd zowel uitgevoerd met de standaard forward primer als met de gedegenereerde forward primer. Aan dit geheel werd vervolgens 1xSybr Select master mix toegevoegd. Dit werd vervolgens aangelengd met water tot een totaal volume van 20 µl werd bekomen. De mastermix bevat MgCl 2, reactiebuffers, DNA-polymerase, dntp s (waaronder dutp) en UNG. De mastermix werd na toevoegen van de Sybr Select master mix gehomogeniseerd. Tabel 2.3 geeft de verschillende reagentia weer die in de mastermix moeten aanwezig zijn. Vervolgens werd 20 µl van deze Jolien Vandewalle Masterproef

48 mastermix verdeeld in een 96 well plaat, met behulp van een automatische pipet. Kolommen 1 tot 9 en rijen A tot F werden gevuld met 20 µl mastermix. Tabel 2.3: Reagentia mastermix Reagentia Concentratie Concentratie µl voor 1 stock finaal reactie Sybr Select master mix 2 x 1 x 12,5 µl FP (Forward Primer 20 µm 600 nm 0,75 µl RP (Reverse Primer 20 µm 600 nm 0,75 µl Water 6 µl Totaal volume 20 µl Na aanmaak van de mastermix in de pre PCR ruimte werd de qpcr reactieplaat opgevuld in de post PCR ruimte. In deze reactieplaten werden steeds de tienvoudige verdunningsreeksen gepipetteerd, startend bij 10 5 plasmide kopieën en eindigend bij 10 0 plasmide kopieën. Bovendien werd steeds een minimum van 12 negatieve controles (no template controles) meegenomen PCR cyclus Tabel 2.4: RT-qPCR cyclus Martin Latil et al., 2012 UNG 2 min. 50 C Activatie 10 min. 95 C Amplificatie cyclus (50 cycli) Dissociatiecurve 10 sec. 95 C Continue 1 min. 60 C temperatuurtoename 1 min. 65 C tot 95 C Tabel 2.4 geeft een overzicht weer van het gebruikte temperatuurprofiel (naar Martin-Latil et al., 2012). Tijdens de UNG-stap is het enzym uracyl N-glycosylase werkzaam. Het vernietigt alle eventuele achtergebleven dutp-bevattende DNArestanten van een vorige PCR run, en verhindert in theorie dus carry-over contaminatie. Tijdens de activatiestap wordt dit enzym geïnactiveerd waardoor het geamplificeerd DNA niet wordt afgebroken. Tijdens die activatie stap gebeurt ook de hitte-activatie van het DNA polymerase. Tijdens de denaturatie wordt het template DNA enkelstrengig. Denaturatie wordt geïnitieerd door een temperatuur van 95 C. Deze stap is essentieel aangezien in een volgende stap primers op dit enkelstrengig DNA moeten hybridiseren. Tijdens de hechting gebeurt de aanhechting van de primers waarbij de forward en reverse primer binden aan de complementaire sequentie van het template DNA. Dit gebeurt meestal bij een temperatuur tussen 55 C en 72 C. De volgende stap is de primerextensie, hierbij zal het DNA polymerase vanaf het 3 uiteinde van de primer het DNA verlengen. Dit gebeurt door de insertie van complementaire dntp s. Het ontstane DNA wordt dan gedenatureerd zodat nieuwe primers kunnen binden die op hun beurt dan weer worden geamplificeerd. Deze cyclus (denaturatie, hechting en extensie) wordt 50 maal doorlopen. In de essays beschreven door Martin-Latil et al., 2012 gebeurt de Jolien Vandewalle Masterproef

49 fluorescentie datacollectie tijdens de extensiestap. Na de eigenlijke PCR wordt nog een dissociatiestap uitgevoerd om het smeltgedrag te analyseren en de smeltcurven en smeltpieken te verkrijgen. Op deze manier kunnen primerdimeren worden opgespoord. Hierbij wordt de temperatuur, in stappen van 0,2 C, verhoogd tot ongeveer 95 C waardoor de primerdimeren eerder zullen denatureren dan het target DNA omwille van hun lagere smelttemperatuur. De SYBR Green moleculen kunnen niet langer intercaleren met het dubbelstrengig amplicon met een daling in fluorescentie als gevolg. De fluorescentie wordt gemeten en geanalyseerd met de SDS7300 software en op deze manier worden de smeltcurven en smeltpieken bekomen PCR parameters Uit de standaardcurve kunnen verschillende parameters worden bepaald. Als eerste parameter wordt de determinatiecoëfficiënt of de R² waarde berekend, dit geeft de lineariteit weer van de standaardcurve. Voor de R² waarde wordt een minimum van beoogd. De volgende parameters zijn de helling van de standaardcurve en PCR-efficiëntie, deze zijn aan elkaar gekoppeld. Elke 3,3 cycli gebeurt er in theorie een verdubbeling van het aanwezig DNA. Als de helling van de standaardcurve gelijk is aan 3,3 dan bedraagt de PCR-efficiëntie 100%. Ideaal is wanneer de PCR efficiëntie zich tussen de 90% en 110% bevindt, deze waarden komen overeen met een helling die zich bevindt tussen -3,0 en -3,6. De PCR efficiëntie wordt berekend a.d.h.v. de Cq-waarden van de standaardcurves met de formule E= (10( 1/helling) 1) 100. De laatste parameter is het y-intercept, dit is het snijpunt met de y-as en geeft de theoretische c q waarde van één kopie weer. De intercept is de theoretische limiet voor de detectie van de laagst aanwezige concentratie die tot een significante amplificatie leidt. Jolien Vandewalle Masterproef

50 2.9 High Resolution Melting Reverse transcriptase qpcr (HRM RT- qpcr) Principe HRM wordt gezien als een verfijnde, snelle en nauwkeurige verbetering van de conventionele RT-qPCR smeltcurve-analyse. De methode is gebaseerd op de detectie van minimale temperatuurverschillen in de PCR smeltcurve (dissociatiecurve). HRM is zo gevoelig dat het de detectie van één enkel baseverschil in de nucleotidesequenties kan detecteren (Reed et al., 2007). Het verschil met een gewone RT-qPCR analyse is het aantal metingen per C. Bij de gewone dissociatiecurve wordt de temperatuur meestal in stappen van 0,20 C of meer verhoogd, terwijl bij HRM RT-qPCR de temperatuur bij de dissociatiecurve in veel kleinere stappen van 0,05 C of minder wordt verhoogd. Dit laat een meer gedetailleerde analyse van het smeltgedrag toe. Dit werd in reeds uitgebreid besproken Materiaal - phev gt 1/2, 3, 4 plasmides o Tienvoudige phevgt 1/2, 3, 4 plasmide verdunningsreeks - Mastermix o 1 x Meltdoctor TM HRM Mastermix (Life technologies) o 1 x Type-it HRM Mastermix (Qiagen) o 600 nm Forward primer (IDT-DNA; Leuven, België) HEV-5260-F: 5 CGGTGGTTTCTGGGGTGAC 3 Positie: o 600 nm Forward primer (IDT-DNA; Leuven, België) HEV-5260-F deg: 5 CRGTGGTTTCTGGGGTGAC 3 Positie: o 600 nm Reverse primer(idt-dna; Leuven, België) HEV-5330-R: 5 AGGGGTTGGTTGGATGAATATAG 3 Positie: o ng Template o Nuclease vrij water o 2 ml tubes - Real-Time PCR o Lightcycler LC480II (Roche Diagnostics; Almere; Nederland) Methode In de pre PCR ruimte werd de mastermix aangemaakt. In een microcentrifuge tube werd telkens 600 nm (gedegenereerde) forward primer en 600nM reverse primer toegevoegd. Aan dit geheel werd vervolgens Meltdoctor TM HRM Mastermix (Life technologies) of Type-it HRM Mastermix (Qiagen) toegevoegd. Het totaal volume van de mastermix bedroeg steeds 20 µl. Vervolgens werd 20 µl van deze mastermix verdeeld in een 96 well plaat met behulp van een automatische pipet. Jolien Vandewalle Masterproef

51 In de post PCR ruimte werd aan de qpcr plaat voor de negatieve controle (no template control) 5 µl nuclease vrij water toegevoegd aan de mastermix. Voor de positieve controles werd telkens 5 µl controle plasmide toegevoegd. De qpcr plaat werd vervolgens afgedekt en in het PCR toestel geplaatst. Tabel 2.5 geeft de HRM RT-qPCR cyclus weer die werd uitgevoerd HRM RT-qPCR cyclus Tabel 2.5: HRM RT-qPCR cyclus UNG 2 min. 50 C Activatie 10 min. 95 C Amplificatiecyclus (50 cycli) 15 sec. 95 C 1 min. 60 C 1 min. 65 C Koeling 1 min. 40 C HRM dissociatiecurve Continue temperatuurtoename tot 95 C Tabel 2.5 geeft een overzicht weer van het gebruikte temperatuurprofiel. De UNGstap, activatie-stap en de amplificatiecyclus gebeuren op dezelfde manier als beschreven in paragraaf De amplificatiecyclus (denaturatie, hechting en extensie) wordt ook hier 50 maal doorlopen, waarbij de fluorescentie datacollectie ook tijdens de extensiestap plaatsvindt. Na de eigenlijke PCR volgt een koelingsstap voor 1 minuut bij 40 C. Daarna vindt de HRM dissociatiestap plaats om het smeltgedrag te analyseren en de smeltcurven en smeltpieken te verkrijgen. Op deze manier kunnen primerdimeren worden opgespoord. De temperatuur wordt in stappen van 0,05 C verhoogd tot ongeveer 95 C waardoor de primerdimeren eerder zullen denatureren dan het target DNA omwille van hun lagere smelttemperatuur. De fluorescente moleculen kunnen niet langer intercaleren met het dubbelstrengig amplicon met een daling in fluorescentie als gevolg. De fluorescentie wordt gemeten en geanalyseerd met de LC480II qpcr systeemsoftware en op deze manier worden de smeltcurven en smeltpieken bekomen. Jolien Vandewalle Masterproef

52 3 Resultaten en discussie 3.1 Onderzoeksstrategie Figuur 3.1 vat de onderzoeksstrategie samen van deze thesis. Transformatie, upscaling en plasmide extractie 6 phev plasmides: phev gt1/2, phev gt3, phev gt4, phev gt 1/2 + CM, phev gt3 + CM, phev gt4 + CM - Kwantificatie phev plasmides - Analyse van de zuiverheid phev plasmides RT-qPCR voor detectie van HEV volgens Martin-Latil et al. (2012) - Analyse PCR-parameters - Analyse smeltprofielen - Vergelijking verschillende forward primers HRM RT-qPCR voor detectie en genotypering van HEV gebaseerd op studie van Martin-Latil et al. (2012) op 3 phev plasmides: phev gt1/2, phev gt3, phev gt4 - Analyse PCR-parameters - Analyse smeltprofiel - Vergelijking verschillende mastermixen - Vergelijking verschillende forward primers HRM RT-qPCR op HEV cdna stalen opgezuiverd uit varkensfeces - Analyse Cq waarde - Analyse smeltprofiel HRM RT-qPCR op HEV cdna stalen opgezuiverd uit varkenslever - Analyse Tm waarde - Analyse smeltprofiel Figuur 3.1: Onderzoeksstrategie Jolien Vandewalle Masterproef

53 3.2 Kwantificatie van phev gt 1/2, 3, 4 plasmiden Bij kwantificatie van de 6 phev plasmides (phevgt1/2, phevgt3, phevgt4, phevgt1/2+cm, phevgt3+cm en phevgt4+cm) werd vastgesteld dat de concentratie van de plasmides in alle gevallen minstens 9.33 x 10 9 plasmide kopieën per µl bedroeg (tabel 3.1). Tabel 3.1: Kwantificatie van de verschillende HEV plasmiden Genotypen Concentratie (plasmidekopieën/µl) Genotype 1/2 + CM 2,66x Genotype 3 + CM 9,33x 10 9 Genotype 4 + CM 7,644x Genotype 1/2 1,60x Genotype 3 6,80x Genotype 4 5,764x Analyse zuiverheid van de plasmiden Bij de plasmide opzuivering na de upscaling van de plasmiden bestaat de mogelijkheid dat, naast het plasmide DNA, er ook ander (bacterieel) DNA geïsoleerd kan worden. Daarom is het belangrijk om de zuiverheid van het plasmide te controleren. In eerste instantie kan dit worden gecontroleerd tijdens de spectrofotometrische concentratiebepaling van de plasmiden. Als er één duidelijk afgescheiden piek bij 260 nm verschijnt en geen pieken bij 230 en/of 280 nm dan mag men er van uit gaan dat het monster voornamelijk DNA bevat. Hier kan uiteraard geen onderscheid worden gemaakt tussen de plasmiden en eventuele contaminanten, zoals bijvoorbeeld bacterieel DNA. In tweede instantie wordt een agarose gelelektroforese uitgevoerd om zeker te zijn dat het plasmide DNA aanwezig is. Als basepaarladder wordt de DNA molecular marker x (Invitrogen) gebruikt. Plasmide DNA kan in drie vormen voorkomen, namelijk supercoiled DNA, open circulaire DNA en lineair DNA. De supercoiled vorm is de kleinste vorm en ondervindt dus het minst wrijving met de agarosematrix. Dit zorgt ervoor dat het supercoiled DNA het snelst migreert, dit is de onderste dikke band die je ziet op figuur 3.2. Ethidiumbromide bindt gemakkelijk aan supercoiled DNA vandaar de fel opgelichte dikke onderste band. Lineair DNA ondervindt meer wrijving met de agarosematrix dan het supercoiled DNA en migreert daardoor minder snel. In figuur 3.2 komen geen lineaire vormen voor van het plasmide DNA aangezien er niet geknipt werd met restrictie-enzymen. De open circulaire vorm van het DNA ondervindt de meeste wrijving met de agarosematrix en migreert het traagst, dit kan de bovenste dikkere band zijn in figuur 3.2. De verwachte band bevindt zich rond de 2087 bp zonder contaminatiemerker en 2096 bp met contaminatiemerker. Door de dikke fel opgelichte supercoiled band zijn de verwachte circulaire plasmidebanden niet zichtbaar. Jolien Vandewalle Masterproef

54 Open circulair DNA Supercoiled DNA 3054 bp 2036 bp 1636 bp 1018 bp Figuur 3.2: Elektroforese van de plasmidenstocks met als grootte 2087 bp zonder contaminatiemerker en 2096 bp met contaminatiemerker 3.4 RT-qPCR volgens Martin-Latil et al. (2012) Vooraleer het onderzoek naar de toepassing van een HRM RT-qPCR assay te starten, werd geopteerd om de qpcr assay zoals beschreven door Martin-Latil et al., 2012 te implementeren in het laboratorium. In eerste plaats werd, met het oog op PCR contaminatie, gewerkt met de phev gt 1/2 + CM, phev gt3 + CM en phev gt4 + CM plasmides die zoals eerder besproken een contaminatiemerker bevatten. In deze eerste fase werd de qpcr assay zoals beschreven door Martin-Latil et al. (2012) zo getrouw mogelijk nagebootst. Vervolgens werd in een 2 de fase dezelfde qpcr uitgevoerd op de phev gt 1/2 + CM, phev gt3 + CM en phev gt4 + CM plasmides én op de phev gt 1/2, phev gt3 en phev gt4 plasmides die zoals eerder besproken geen contaminatiemerker bevatten. Gedurende deze 2 de fase werden bovendien 2 verschillende forward primers vergeleken. Bij een in silico analyse van meer dan 130 HEV genomen werd in een vorige studie namelijk waargenomen dat op de bindingsplaats van de forward primer (genaamd HEV-5260-F ) zoals beschreven door Martin-Latil et al. (2012) er meer dan 20 % van de genomische sequenties een mismatch vertoonde (Eindwerk Steve Bonte, 2013). Zodoende werd in deze vorige studie een gedegenereerde forward primer (genaamd HEV-5260-F deg ) ontwikkeld. Deze primer werd getest naast de oorspronkelijk HEV-5260-F forward primer. Jolien Vandewalle Masterproef