Het optimaliseren en visualiseren van western blot voor collageen Type I BMTE0740 Karim Abdullah December 2007 Supervisor: Ing. W.L. van de Loo Dr. A. mol Dr. M. de Liefde Stagedocente: Mw. C.A.M Huijbregts Opleiding: ROC Eindhoven MLO Differentiatie: Microbiologie niveau 4 Stagebedrijf: TU/Eindhoven Faculteit: Biomedische technologie Afdeling: Soft tissue engineering Periode: September t/m December 2007 School: ROC Eindhoven LMP
Samenvatting: Het hart is een holle spier die door geregeld samen te trekken bloed door het lichaam pompt. De hartkleppen zorgen ervoor dat het bloed in één richting gaat. Als een klep niet goed werkt, kan men deze vervangen. In de TU is men bezig met de mogelijkheden van het maken van kunstmatige hartkleppen m.b.v. tissue engineering. Er wordt gezocht in welke verhouding welke type collageen bevindt, zodat er zoveel mogelijk een gelijke kunstmatige hartkleppen gemaakt kan worden. Het eiwit collageen zorgt ervoor dat de weefsels flexibel en sterk zijn. Dit eiwit heeft verschillende typen met elk een eigen functie en plaats in het lichaam. Omdat in de hartkleppen collageen type I en III bevinden, wordt collageen type I als positief controle gebruikt bij het optimaliseren van western blotting voor collageen type I. De stage gaat over het optimaliseren van western blotting voor collageen type I. Collageen Type III wordt als negatief controle gebruikt. Western blot bestaat uit twee delen, het eerste deel is het runnen van eiwitten in een SDS-page gel. De tweede deel is het blotten en het aantonen van de eiwitbandjes in de gel m.b.v. antilichamen en chemolumonicentie. Het doel van dit onderzoek is het visualiseren en optimaliseren van het protocol van western blot dat in het lab aanwezig is. Bij het optimaliseren van dit protocol wordt naar de verdunningen van de antilichamen gekeken. De juiste verdunning wordt gebruikt bij het onderzoek naar de verschillende typen collageen. Ook van het apparaat waarmee de foto s gemaakt kunnen worden, Versa Doc (Bio-Rad) moet een handleiding gemaakt worden. Na het testen van verschillende verdunningen van de 1 e en 2 e antilichaam is gebleken dat de optimale verdunning van de 1 e antilichaam 1:1500 is. Bij de 2 e antilichaam is gebleken dat de optimale verdunning 1:12500 is.
Voorwoord: Dit verslag is geschreven in het kader van de stage die als onderdeel is van mijn vierde studiejaar van mijn opleiding aan ROC Eindhoven. Ik wil hierbij de volgende mensen bedanken voor de ondersteuning, uitleg en de samenwerking: Ing. Anita van de Loo, door haar steun en hulp is deze stage voor mij een leerzame en leuke stage geworden. Dr. Anita Mol voor de mogelijkheid om in het lab stage te mogen lopen. Dr. Moniek de Liefde voor haar hulp tijdens mijn stageperiode. Mijn medestagiaire Roel Lalieu voor zijn medewerking en zijn gezelschap tijdens mijn stageperiode. Ook wil ik graag alle collega s bedanken waarmee ik heb samengewerkt.
Afkortingen: µl = microliter ml = milliliter mg = milligram V = volt ma = milliampère RPM = rotations per minute SDS-page SDS = sodium dodecyl sulfate Page = poly acrylamide gel electroforese APS = Ammonium persulfaat HRP = Horse radish peroxidase PVDF = Polyvinylidene fluoride ECM = Extracellulaire matrix
Inhoudsopgave: 1. Inleiding... 1 2. Achtergrond informatie... 2 2.1 Het menselijke hart... 2 2.2 Hartkleppen... 3 2.3 Tissue engineering... 5 2.4 Collageen... 6 3. Onderzoek en methoden... 7 3.1 Onderzoek... 7 3.2 Methoden... 8 3.2.1 Gel-electroforese (SDS-Page)... 8 3.2.2 Western blotting... 9 3.2.3 Ponceau kleuring... 10 4. Resultaten... 11 5. Discussie... 13 6. Conclusie... 14 7. Bronnen... 15 8. Bijlagen... 16 I: Gel-electroforese... 16 II: Schema Gel Percentage... 18 III: Western Blot... 19 IV: Antilichamen, controles en markers... 22 V: Ponceau kleuring... 23 VI: Indeling collageen volgens Bornstein en Traub... 24 VII: Handleiding Versadoc Apparaat... 25
1. Inleiding: Op TU/e faculteit Biomedische technologie houdt men zich met tissue engineering bezig. Deze faculteit onderzoekt de mogelijkheid om getissueengineerde hartkleppen en bloedvaten te maken. Er zijn twee soorten hartkleppen: de mechanische en de biologische. Mechanische kunstkleppen zijn geheel gemaakt van duurzaam metaal of kunststof. Voordeel is dat ze een leven lang meegaan. Helaas hebben ze als groot nadeel dat de patiënt dan altijd bloedverdunners moet blijven slikken. Dit moet om de kans op het coaguleren van bloedplaatjes, veroorzaakt door de kunstklep, tegen te gaan. Biologische kleppen zijn gemaakt van speciaal bewerkt weefsel van dieren, meestal van een varken of rund. Het kan ook een menselijke donorklep zijn van een overledene. De biologische klep heeft als groot voordeel dat je geen bloedverdunners nodig hebt. Nadeel is dat deze klep een beperkte duurzaamheid heeft, vergeleken met een mechanische klep. De patiënt moet ook medicijnen innemen om de afstoting van de nieuwe hartklep tegen te gaan. Biologische kleppen gaan tegenwoordig ongeveer vijftien jaar mee. Biologische kleppen worden verdeeld in drie soorten. Dit zijn menselijke klep (donor), dierlijk klep en getissue-engineerde klep. De TU/e houdt zich met de derde soort (getissue-engineerde klep) bezig. [1] De belangrijkste eigenschap van de hartkleppen is dat ze sterk en duurzaam zijn. Het eiwit collageen is een van de eiwitten die daarvoor verantwoordelijk is. Van dit eiwit zijn er verschillende typen bekend. Het is ook bekend dat in de hartklep en bloedvaten de typen collageen I en III aanwezig zijn. De techniek western blotting wordt gebruikt om te bepalen welke typen collageen aanwezig zijn in de getissue-engineerde hartkleppen. De verhouding tussen de verschillende typen die aanwezig zijn wordt ook met western blotting bepaald. Het protocol dat aanwezig is in het lab is niet helemaal geoptimaliseerd. Daarom moet het nu verder geoptimaliseerd worden. De verdunningen van de antilichamen die gebruikt worden bij het blotten moeten geoptimaliseerd worden. Wanneer het optimaliseren afgrond is, moet ook een protocol gemaakt worden om de blot te visualiseren. 1
2. Achtergrond informatie 2.1 Het menselijke hart Het hart is een holle spier die zich midden achter het borstbeen bevindt. Het zorgt ervoor dat het hele lichaam bloed krijgt door geregeld samen te trekken. Het hart is verdeeld in vier ruimten die gescheiden zijn door kleppen (afbeelding 1). De vier ruimten vormen twee pompen die verantwoordelijk zijn voor de long- en lichaamscirculatie van bloed. De hartspier is sterker dan een normale spier. Dit komt doordat het hart als een pomp werkt. Het heeft ook een ingewikkelde bouw. Afbeelding 1: het menselijke hart. [2] De vier holtes van het hart zijn twee boezems en twee kamers. Deze vier holtes trekken zich samen onder de leiding van de sinusknoop. De sinusknoop is een gespecialiseerd stukje weefsel die elektrische signalen afgeeft aan de vier kamers. Onder invloed van deze signalen trekken de kamers en de boezems afwisselend samen. Door het samentrekken wordt het bloed door het hele lichaam gepompt. De linkerkamer trekt veel krachtiger samen dan de rechterkamer. Zijn spierwand is dan ook dikker. Dat komt doordat deze kamer het bloed pompt door het hele lichaam [3]. 2
2.2 Hartkleppen Tussen de kamers van het hart en ook tussen de kamers en de slagaders zitten verschillende kleppen. Deze kleppen hebben als functie het voorkomen dat het bloed terugstroomt in de kamers. De kleppen bestaan uit de eerste laag van de hartwand, endocard. De geluiden die men hoort vanuit het hart, zijn de veroorzaakt door de kleppen. Er zijn verschillende soorten kleppen in het hart. De eerste soort is de inlatende kleppen, hieronder behoren de triscuspidalisklep en de mitralisklep. De triscuspidalisklep bevindt zich tussen de rechterboezem en rechterkamer. De mitralisklep bevindt zich tussen de linkerboezem en linkerkamer. De tweede soort zijn de uitlatende kleppen, die zijn ook verdeeld tot pulmonalisklep (longslagaderklep) en aortaklep (lichaamsslagaderklep). [1, 4] Zonder deze kleppen verliest het hart zijn pompfunctie. Er zijn verschillende typen aandoeningen bij de hartkleppen; dit zijn: Hartinsufficiëntie, waarbij de kleppen lekken. Stenose, waarbij de hartklep vernauwd is en niet goed opent. Atresie, de hartklep ontbreekt (een aangeboren afwijking). [4] Om deze aandoeningen aan te pakken, heeft men verschillende oplossingen. Er zijn meer soorten kleppen te implanteren, biologische (afbeelding 2) en mechanische (afbeelding 3). De biologische wordt verdeeld in drie soorten, menselijk klep (donor), dierlijk klep en getissue-engineerde klep. Het komt niet vaak voor dat een klep wordt gedoneerd. Als er wel een donor is, dan zal het beter zijn dat men het hele hart transplanteert. Afbeelding 2: getissue-engineerde hartkleppen. [6] De mechanische hartkleppen zijn de oplossing daarvoor. De patiënt hier is niet afhankelijk van donors. Een mechanische klep is een duurzame klep, maar het heeft ook zijn eigen nadelen, namelijk: De mechanische klep kan het hele leven mee gaan, maar het zal niet met het lichaam meegroeien. Dit heeft geen nadeel bij oudere mensen, maar bij kinderen en baby s moet het na enige tijd vervangen worden door een grotere klep. Gezien het inbrengen van een hartklep erg veel risico s met zich mee brengt is dat erg gevaarlijk. 3
De mechanische kleppen maken geluid dat buiten het lichaam te horen is. Dit kan een psychisch probleem veroorzaken bij de patiënt. Aan het oppervlak van de kunststof zal er coagulatie gevormd worden, daardoor moet de patiënt zijn hele leven bloedverdunners innemen om dit tegen te gaan. Afbeelding 3: mechanische hartkleppen. [6] De dierlijke hartkleppen kunnen lang blijven functioneren maar uiteindelijk worden ze door het immuunsysteem geweigerd. Ook hebben ze als nadeel dat ze niet met het lichaam meegroeien. [5] 4
2.3 Tissue engineering Tissue Engineering, ook wel cel- en weefseltechnologie genoemd, is een wetenschap dat verschillende wetenschapsgebieden met elkaar verbindt. Voorbeelden van deze wetenschappen zijn moleculaire, chemische en medische wetenschappen als ook biomechanica en engineering. Het doel van deze wetenschap is het maken van (bio)implantaten om de beschadigde of slechte organen te vervangen of te ondersteunen. Tissue Engineering kan ook gebruikt worden om specifieke cellen, die genetisch aangepast zijn, te implanteren. Deze cellen kunnen bepaalde stoffen afgeven die het lichaam niet meer maakt, bijvoorbeeld insuline bij diabetes. [8] Bij de TU/e onderzoekt men de mogelijkheden om geheel getissue-engineerde hartkleppen, spiertjes en bloedvaten te maken. Hieronder een afbeelding dat het principe van het hele proces aanduidt (afbeelding 4). Er worden cellen van de patiënt genomen, deze cellen worden in grote hoeveelheden opgekweekt. De opgekweekte cellen worden op de drager materiaal gezaaid. Daarna gaan ze groeien tot een weefsel. Als laatste worden deze cellen geïmplanteerd. Afbeelding 4: tissue engineering van een hartklep. [9] 5
2.4 Collageen Het bindweefsel in het menselijke lichaam zorgt ervoor dat ons lichaam stevig blijft. Daarnaast is het verantwoordelijk voor de vormgeving en bescherming van ons lichaam. Tussen de cellen die het weefsel vormen, bevinden zich niet-levende draadachtig vezels die voornamelijk uit collageen bestaan. Collageen vormt 70% van het bindweefsel in het menselijke lichaam. In de hartkleppen bevindt zich collageen type I en III. Collageen zorgt voor de stevigheid van de hartkleppen. De functie van collageen hangt sterk af van de plaats dat het in het lichaam zich bevindt. In bijvoorbeeld de huid, komt een andere soort collageen dan in kraakbeen. Het meeste voorkomende type van collageen in het menselijke lichaam is type I. [11] De aanwezige typen van collageen in het menselijke lichaam zijn: Collageen type I: bot, pezen, ligamenten, huid, fascia, bloedvaten, fibrotisch kraakbeen Collageen type II: hyalien kraakbeen, tussenwervelschijven. Collageen type III: huid, synovia, bloedvaten. Collageen type IV: basale membraan. [11] Afbeelding 5: Collagentriplehelix [10] Collageen is opgebouwd uit drie om elkaar gedraaide polypeptideketens die elk bestaan uit herhalingen van een motief Glycine-X-Y(Afbeelding 5)[10,11]. Hierbij is het aminozuur op de X-positie meestal proline en op de Y-positie meestal hydroxyproline. In bijlage VI is er meer informatie over de indeling en de typen van collageen. 6
3. Onderzoek en methoden 3.1 Onderzoek De western blotting methode dient geoptimaliseerd worden voor verschillende typen collageen. Tijdens de stage periode wordt de western blotting verder geoptimaliseerd voor collageen type I. Door dit onderzoek wil men te weten komen welke type collageen in de ge-tissue engineerde weefsel en in welke verhouding het voorkomt. In het aanwezige protocol is de western blot gedeeltelijk geoptimaliseerd, het protocol moet verder geoptimaliseerd worden. In deze periode zullen de gebruikte verdunningen van de antilichamen in het onderzoek bepaald worden. Deze antilichamen worden bij het visualiseren van de eiwitbandjes in het membraan gebruikt. In de hartkleppen komen er collageen type I en III voor. Voor het opzetten van western blotting voor collageen type I wordt collageen type III als negatieve controle gebruikt worden. Dit om te controleren of de antilichamen specifiek zijn voor collageen type I. Ook collageen type I Rat wordt als negatieve controle gebruikt. De gebruikte controles zijn terug te vinden in bijlage IV. 7
3.2 Methoden 3.2.1 Gel - electroforese (SDS - Page) SDS-Page is een methode om de eiwitten uit elkaar te scheiden. De eiwitten worden hier op basis van hun grootte gescheiden in een gel onder invloed van elektrische spanning (afbeelding 6). De eiwitten moeten voor het onderzoek uitgevouwen worden, dit gebeurt door de monsters te incuberen met Laemmli buffer bij 96 ºC. Deze buffer bevat SDS (sodium dodecyl sulfaat) dat verantwoordelijk is voor het uitvouwen van de eiwitten zodat ze in de gel gescheiden kunnen worden. De bandjes die gescheiden zijn in de gel zijn onzichtbaar op dit moment. Laemmli buffer bevat ook broomfenolblauw (BFB). Dit wordt als indicator gebruikt en geeft aan hoe ver het electroforese proces is. Laemmli buffer bevat ook DDT ( β- mercaptoethanol) om de zwavelbruggen in de eiwitten te verbreken. De monsters, die eiwitten bevatten, worden in de gel gebracht na het uitvouwen daarvan. De kleine eiwitten migreren sneller in de gel dan de grote eiwitten. Door het scheiden van de verschillende eiwitten in de gel, kunnen er na afloop bandjes gezien worden. Deze bandjes zijn kenmerkend voor de verschillende eiwitten. Er worden ook markers bij een elektroforese proces gebruikt. De markers zijn eigenlijk eiwitten met verschillende grootte die ook verschillende bandjes in gel geven. Deze markers worden gebruikt voor het afleiden waar de bandjes met welke formaat zich op de gel bevinden. Er kan gekozen worden tussen gekleurde en ongekleurde marker. De gekleurde marker is te zien met het blote oog op de gel. [5, 16]. De werkwijze en de verschillende gel percentages zijn in bijlage I en II terug te vinden, en bijlage IV voor de gebruikte markers en controle. Afbeelding 6: SDS Page [12] 8
3.2.2 Western blotting Western blotting is een methode die m.b.v. antilichamen een bepaald eiwit kan aantonen. Om dit proces uit te voeren moet eerst de eiwitten vanuit de gel op een membraan gebracht worden (PVDF-membraan). Dit gebeurt door een zogenaamde sandwich van de gel en het membraan te maken. Het gebruikte apparaat voor dit proces lijkt op een normaal electroforese apparaat. De stroom wordt nu recht op de sandwich gezet. Daardoor worden de eiwitten bandjes vanuit de gel naar het membraan getrokken (afbeelding 7). Hierna dient het membraan gekleurd worden d.m.v. ponceau kleuring. Ponceau kleuring wordt in de volgende paragraaf uitgelegd (zie paragraaf 3.2.3). Voor het aantonen van het gezochte eiwit, moet eerst na het afronden van het blotten het verkregen membraan geblokt worden. Deze stap voorkomt dat de toegevoegde antilichamen aan het membraan zelf gebonden zullen worden. Het blokken wordt bereikt door het membraan met een eiwitrijke oplossing te verzadigen, bijvoorbeeld melk. De tweede stap is het toevoegen van 1 e antilichaam. Dit is een antilichaam dat gericht is tegen het gezochte eiwit. Het antilichaam wordt in een dier gekweekt (bijvoorbeeld konijn). Voordat het 2 e antilichaam toegevoegd kan worden, wordt het verkregen membraan gewassen om de overtollige 1 e antilichaam weg te wassen. Het 2 e antilichaam is in een ander dier gekweekt en gericht tegen 1 e antilichaam. Het is gelabeld met HRP (horse radish peroxidase). HRP is een enzym dat door H 2 O 2 wordt geactiveerd en dan het substraat luminol zal omzetten in o.a. licht. Luminol wordt toegevoegd bij het gebruiken van ECL oplossing. Deze oplossing bestaat uit twee componenten, luminol en waterstofperoxide. Door het activeren van het label door deze oplossing ontstaat chimoluminicentie. Dit betekent dat alleen het bandje van het gewenste eiwit licht zal uitstralen. Dit licht is waar te nemen in het donker, waarvan een foto kan gemaakt worden. Afbeelding 7; principe western blot en immuno-blot [14] 9
De factoren die invloed kunnen hebben op het hele proces zijn; Monsterbehandeling; de juiste verdunning en het verhitten daarvan De stroom; dit moet 200 ma zijn De duur van het hele proces; tussen 120 en 130 minuten De temperatuur (koeling); dit gebeurt m.b.v. een ijspak. De ijspak wordt halverwege vervangen [16, 17] Samenstelling van de blotbuffer. Andere vormen van blotten zijn Southern blotting voor DNA, en northern blotting voor RNA [5, 13, 16, 17]. Het western blotting protocol is in bijlage III terug te vinden. 3.2.3 Ponceau kleuring Ponceau kleuring is een kleuringsmethode om te controleren of de eiwitten op het membraan terecht gekomen na het blotten. Het is een aspecifieke kleuring dat alle eiwitten kleurt. Het wordt ook gebruikt om te controleren dat er geen luchtbellen op het membraan ontstaan. Ponceau is een rode synthetische kleurstof (afbeelding 8). Het kan worden afgespoeld met (demi)water. De werkwijze en de benodigdheden zijn in bijlage V terug te vinden. Afbeelding 8: Ponceau kleuring. [15] 10
4. Resultaten 4.1 Eerste antilichaam Bij western blot wordt de verdunning 1:250 als standaard verdunning gebruikt. Dit zou nog verder doorverdund kunnen worden. Volgens de bijsluiter dat bij het antilichaam komt ligt de grens waar het 1 e antilichaam verdund kan worden tussen 1:100 en 1:500 (zie bijlage VIII). Daarom is besloten om de volgende verdunningen te testen; 1:500, 1:1000, 1:1500 en 1:2000. De laatset drie verdunningen zijn getest omdat bij de verdunning 1:500 de belichtingstijd kort was (20 sec) en de bandjes waren duidelijk te zien. Als de bandjes nog zichtbaar zijn bij een belichtingstijd dat gelijk aan of minder dan (60 sec) is, dan kan het antilichaam doorverdund worden. Als er belichtingstijd langer dan (60 sec) nodig is om de bandjes zichtbaar te maken, dan hoeft er niet doorverdund worden. Bij de verdunning 1:250 was bij een belichtingstijd van 15 sec waren de bandjes goed te zien. Daarna is de verdunning 1:500 getest. De belichtingstijd was gelijk aan de belichtingstijd bij de eerste verdunning (15 sec) maar de bandjes waren zichtbaar op het blot. Doordat de bandjes nog goed te zien waren, is besloten om de volgende verdunning te testen, de verdunning 1:1000. Hierbij waren de bandjes nog te zien. De belichtingstijd was iets langer dan bij de vorige verdunningen (20 sec), maar nog minder dan de grens (60 sec). Daarom is besloten om naar de volgende verdunning te gaan. De volgende stap was het testen van de verdunning 1:1500. Bij het gebruiken van deze verdunning waren de bandjes nog te zien bij een belichtingstijd van (30 sec). Omdat deze belichtingstijd binnen de grens ligt, is besloten om door te verdunnen. Als laatste was de verdunning 1:2000 gebruikt. Deze verdunning was te groot. Bij een belichtingstijd van (40 sec) waren de bandjes niet goed te zien. Ook bij een belichting van (60 sec) waren de bandjes niet goed te zien. Daarom is besloten om niet door te gaan verdunnen, en dat was eigenlijk de laatste verdunning van de 1 e antilichaam die getest wordt. Na het uitvoeren van western blotting met verschillende verdunningen was gebleken dat verdunning 1:1500 de optimale verdunning is. Sluitertijd 30 sec bij verdunning 1:1500 11
4.2 Tweede antilichaam De verdunning 1:5000 werd als standaard gebruikt bij western blotting. Dit zou verder doorverdund kunnen worden. In de bijsluiter van dit antilichaam staat dat het doorverdund kan worden tussen 1:1000 en 1:100.000 (zie bijlage VIII). Bij het testen van het antilichaam is gebleken dat alleen tot 1:20.000 verdund kan worden. Bij deze antilichaam is besloten om de volgende verdunningen te testen als begin; 1:10.000, 1:12.500, 1:15.000 en 1:20.000. Als bij verdunning 1:20.000 de bandjes nog goed te zien dan kan er doorverdund worden. Als de bandjes nog zichtbaar zijn bij een belichtingstijd dat gelijk aan of minder dan (60 sec) is, dan kan het antilichaam doorverdund worden. Als er belichtingstijd langer dan (60 sec) nodig is om de bandjes zichtbaar te maken, dan hoeft er niet doorverdund worden. Bij deze verdunningen zijn de volgende belichtingstijden gebruikt (15, 30, 45 en 60 sec). Bij het testen van de verdunning 1:5000 zijn de bandjes nog te zien bij een belichtingstijd van (30 sec). Daarna is verdunning 1:10.000 getest. De bandjes waren nog duidelijk te zien bij een belichtingstijd van (45 sec). Daarom is besloten om de volgende verdunning te gaan testen, verdunning 1:12.500. Bij deze verdunning waren de bandjes ook te zien bij een belichtingstijd van (45 sec). Hierdoor was besloten om de volgende verdunning te gaan testen, verdunning 1:15.000. Bij deze verdunning waren de bandjes moeilijk te zien bij een belichtingstijd van (45sec). Bij een belichtingstijd van (60 sec) waren de bandjes beter te zien dan bij (45 sec). Hierna was de verdunning 1:20.000 als laatste getest. Hierbij zijn dezelfde belichtingstijden gebruikt als bij de andere verdunningen. De bandjes waren helemaal niet te zien ook bij een belichtingstijd van (60 sec). De enige bandjes die te zien waren, waren de bandjes van de magic marker. Na dit resultaat is besloten om te stoppen met het doorverdunnen, omdat het geen nut heeft om door te gaan verdunnen. Bij de verdunning 1:12.500 waren de bandjes duidelijk te zien dan bij verdunning 1:15.000 bij dezelfde belichtingstijden. Uit de resultaten van de western blotting met de verschillende verdunningen is gebleken dat optimale verdunning van de 2 e antilichaam is 1:12.500. Sluitertijd 45 sec bij verdunning 1:10.000. 12
5. Discussie en aanbevelingen Tijdens dit onderzoek is geprobeerd om de western blot methode te optimaliseren voor collageen I. Gedurende het onderzoek zijn veel problemen opgetreden waardoor het experiment opnieuw uitgevoerd moest worden. Een voorbeeld van deze problemen; tijdens dit onderzoek is een ponceau kleuring gebruikt om te controleren of de blotting proces goed vergelopen is. In het begin waren er geen bandjes te zien op het membraan, ook na langere tijd kleuren. Uiteindelijk was gebleken dat de ponceau kleuring die gebruikt is, uitgewerkt was omdat het waarschijnlijk over de datum was. Het heeft als resultaat dat er geen bandjes op het membraan te zien waren. Daarna was er nieuwe fles gekocht als vervanging voor de oude. Na het gebruik van de nieuwe fles waren er wel bandjes zichtbaar op het membraan. Veel factoren van de western blot methode waren al opgezet in het protocol die in het lab aanwezig was. Het protocol was ver uitgewerkt, alleen de verdunningen van de 1 e en de 2 e antilichamen zouden nog bepaald moeten worden. Ook het visualiseren van de western blot voor collageen type I zou nog geoptimaliseerd moeten worden. In het begin van het onderzoek was collageen type I rat als negatieve controle gebruikt. Bij de laatste zes experimenten is collageen type III ernaast als negatieve controle gebruikt. Dit gebeurt om te controleren of de 1 e antilichaam specifiek is voor collageen type I humaan. Het gebruik van collageen type III is besloten na het gesprek met de supervisor. Collageen III moet altijd als negatieve controle gebruikt worden bij het optimaliseren van western blotting voor collageen type I. Dit om te controleren of het 1 e antilichaam specifiek is voor collageen type I. Doordat er niet genoeg tijd was, is alleen western blot voor collageen type I humaan onderzocht. Voor het optimaliseren van western blot methode voor collageen type III humaan, moet hetzelfde proces opnieuw gedaan worden. Uiteindelijk zullen de twee typen collageen op hetzelfde manier bepaald kunnen worden. Voor de komende tijd is aan te raden dat men direct met twee gels tegelijk aan de slag te gaan. Op deze manier is het sneller om western blot te optimaliseren. Ook is het wenselijk dat alles van tevoren gecontroleerd wordt. Een voorbeeld; als de buffers op zijn moeten deze gemaakt worden. Dit moet voor het beginnen met het experiment zodat het proces snel begint en de gels/membranen niet droog gaan worden. 13
6. Conclusie Na het gebruik van verschillende verdunningen van het 1 e antilichaam is gebleken dat de optimale verdunning die gebruikt kan worden bij de western blot methode voor collageen type I humaan verdunning 1:1500 is. Na het gebruik van verschillende verdunningen van het 2 e antilichaam is gebleken dat de optimale verdunning die gebruikt kan worden bij de western blot methode voor collageen type I humaan verdunning 1:12500 is. 14
7. Bronnen 1) http://www.mstwente.nl/thoraxcentrum/hart/problemen_met_de_hartkleppe n.doc/ 2) http://www.yayabla.nl/users/innercircle/uploads/img_113.jpg 3) http://www.natuurinformatie.nl/nnm.dossiers/natuurdatabase.nl/i002083.ht ml 4) http://nl.wikipedia.org/wiki/hartklep 5) R. van Wezel; ROC stage verslag; Juni 2007. 6) http://roy.schrijft.nl/hartkleppen.jpg 7) http://www.lumc.nl/2070/patientenzorg/operaties/foto/replac1.jpg 8) http://www.dpte.nl/site/index.php?id=17 9) http://biomed.brown.edu/courses/bi108/bi108_2007_groups/group12/ho mepage.html 10) http://nl.wikipedia.org/wiki/afbeelding:collagentriplehelix.png 11) http://nl.wikipedia.org/wiki/collageen 12) http://www.imb-jena.de/~rake/bioinformatics_web/gifs/sds_page2.gif 13) http://www.chemieforum.nl/forum/index.php?showtopic=1349&st=0& 14) http://www.chemicon.com/images/ant101/a2wb.gif 15) http://www.western-blot.org/photos/rouge_ponceau_1.jpg 16) Braam, W.G.M.; Electroforese; EPN te Houten; 2000, 4edruk. 17) W.L. van de Loo; Fontys stageverslag; augustus 2004. 15
Gel elektroforese Bijlage I (SDS-Page) Materialen: Glasplaat met opstaande randjes (0,75mm) Afdek glas Mal Kam Houder Bak Power supply Runningbuffer Separating Gel Stacking gel Pipetten 1000 µl / 100 µl / 10 µl Bijbehorende puntjes Leammli buffer Marker Gels: Bijvoorbeeld 8% gel (andere percentages en stacking gels zijn terug te vinden in bijlage II) (onderstaande waarden zijn gebaseerd op 1 gel) Water: 2,3 ml Bisacrylamide: 1,3 ml Let op: Kankerverwekkend! R45 Tris buffer: 1,3 ml APS (ammonium per sulfaat): 0,05 ml SDS: 0,05 ml TEMED: 0,003 ml Let op: Na toevoegen van TEMED zal de gel polymeriseren. Dus direct verwerken! Gebruik bij het maken van een polyacrylamide gel altijd blauwe handschoenen! Leammli buffer: 2x Laemmli Buffer omdat deze met het monster verdund zal worden bij verwerking 125 mm Tris-HCl ph 6,8 20 % (v/v) Glycerol 5% SDS 0.02% Broom phenol Blue 10% 2-mercaptoethanol De Laemmli buffer kan bij -20 o C lang bewaard blijven. 16
Procedure: Bijlage I Neem de 2 glasplaatjes en plaats ze in de mal. Haal deze over de labtafel om zeker te zijn dat beide onderzijden gelijk staan. Plaats de mal in de houder op het rubber sponsje om lekken te voorkomen. Maak zowel de stacking gel als de separating gel (Voeg pas TEMED toe bij gebruik). Pipeteer de separating gel tussen de twee glasplaatjes en laat ongeveer 1,5 cm vrij. Vul deze ruimte af met ethanol. Binnen 30 minuten is de gel gepolymeriseerd en kan de ethanol er afgegoten worden. Pipeteer nu de stacking gel hier boven op en plaats de kam in de gel. Laat deze gel ook polymeriseren. In de tijden dat de gels moeten polymeriseren moeten de monsters verdund en verwerkt worden. De verdunde monsters worden 1:1 vermengd met Leammli buffer en 10 minuten verhit bij 96 o C. Haal de gel die tussen de glasplaatjes zit uit de mal en plaats deze in de houder. Zet de houder in de bak en vul de bak met running buffer. (Indien 1 gel runt, moet de tegenoverliggende houder afgedekt worden met de plastic plaat die hiervoor bestemd is). Was de slotjes uit door de buffer in en uit het slotje te pipetteren. Voeg 5µl van de gewenste marker toe aan het eerste en laatste slotje in de rij. Pipeteer van de verhitte monsters 15µl in elk slotje. Sluit de bak af met het hiervoor bestemde deksel en sluit deze aan op de power supply. (Let hierbij op dat zwart staat voor en rood voor +) Stel in op 90 Volt en start running. Na ongeveer 10 minuten de voltage verhogen naar 120 Volt. Als de blauwe kleur van de Leammli buffer de onderkant van de gel bereikt heeft is het runnen voltooid. Neem glasplaatjes met de gel uit de houder en haal voorzichtig de glasplaatjes van elkaar. Steek de stacking gel weg en steek een klein hoekje af van het begin zodat je weet waar het eerste en laatste eiwit in gepipetteerd is. De gel kan gekleurd worden in bijvoorbeeld zymo staining of coomassi staining. Indien nodig kan de gel gebruikt worden voor western blot. (Let op: Een gel is niet houdbaar!) 17
Tabel 1: Schema Gel percentage Bijlage II Separating gels 6% gel 5ml 10ml 15ml 20ml 25ml 30ml 40ml 50ml H 2 O 2,6 5,3 7,9 10,6 13,2 15,9 21,2 26,5 30% acrylamide 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 8,0 10,0 1,5M Tris ph8,8 1,3 2,5 3,8 5,0 6,3 7,5 10,0 12,5 10% SDS 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5 10% APS 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5 TEMED 0,004 0,008 0,012 0,016 0,02 0,024 0,032 0,04 8% gel 5ml 10ml 15ml 20ml 25ml 30ml 40ml 50ml H 2 O 2,3 4,6 6,9 9,3 11,5 13,9 18,5 23,2 30% acrylamide 1,3 2,7 4,0 5,3 6,7 8,0 10,7 13,3 1,5M Tris ph8,8 1,3 2,5 3,8 5,0 6,3 7,5 10,0 12,5 10% SDS 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5 10% APS 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5 TEMED 0,003 0,006 0,009 0,012 0,015 0,018 0,024 0,03 10% gel 5ml 10ml 15ml 20ml 25ml 30ml 40ml 50ml H 2 O 1,9 4,0 5,9 7,9 9,9 11,9 15,9 19,8 30% acrylamide 1,7 3,3 5,0 6,7 8,3 10,0 13,3 16,7 1,5M Tris ph8,8 1,3 2,5 3,8 5,0 6,3 7,5 10,0 12,5 10% SDS 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5 10% APS 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5 TEMED 0,002 0,004 0,006 0,008 0,01 0,012 0,016 0,02 12% gel 5ml 10ml 15ml 20ml 25ml 30ml 40ml 50ml H 2 O 1,6 3,3 4,9 6,6 8,2 9,9 13,2 16,5 30% acrylamide 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 16,0 20,0 1,5M Tris ph8,8 1,3 2,5 3,8 5,0 6,3 7,5 10,0 12,5 10% SDS 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5 10% APS 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5 TEMED 0,002 0,004 0,006 0,008 0,01 0,012 0,016 0,02 15% gel 5ml 10ml 15ml 20ml 25ml 30ml 40ml 50ml H 2 O 1,1 2,3 3,4 4,6 5,7 6,9 9,2 11,5 30% acrylamide 2,5 5,0 7,5 10,0 12,5 15,0 20,0 25,0 1,5M Tris ph8,8 1,3 2,5 3,8 5,0 6,3 7,5 10,0 12,5 10% SDS 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5 10% APS 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5 TEMED 0,002 0,004 0,006 0,008 0,01 0,012 0,016 0,02 Stacking gels 5% 1ml 2ml 3ml 4ml 5ml 6ml 8ml 10ml H 2 O 0,68 1,4 2,1 2,7 3,4 4,1 5,5 6,8 30% acrylamide 0,17 0,33 0,5 0,67 0,83 1,0 1,3 1,7 1,0M Tris ph6,8 0,13 0,25 0,38 0,5 0,63 0,75 1,0 1,25 10% SDS 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,08 0,1 10% APS 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,08 0,1 TEMED 0,001 0,002 0,003 0,004 0,005 0,006 0,008 0,01 Bron: Sambrook & Russel; Molecular cloning and laboratory manual; 3 e editie 2001 [13] 18
Western Blot Bijlage III Materialen: PVDF membraan Whatman papier Sponsjes Blotmal Schaaltje Blotbak Ijsbak Roervlo Roerder Blotbuffer (Bio-Rad) 100ml 10x blotbuffer 200 ml MeOH 700 ml MilliQ PBS-Tween 0,1% 5 tabletten PBS per Liter water 1000 ml MiLiQ 1 ml Tween Handschoenen 50ml buis Melkpoeder PBS-tween 0,1% Eerste antilichaam (USBiological, C7510-17K) Tweede antilichaam (pierce, 31402) PBS ECL oplossing ;kit met luminol en waterstofperoxide. (Thermo 34075) Oplossingen: Runningbuffer: 100 ml Running buffer 10x Bio-Rad 900 ml Milli Q water Blotbuffer: 100 ml Blotbuffer 10x Bio-Rad 300 ml Methanol 598 ml Milli Q water 2 ml 10%SDS oplossing PBS-Tween: 5 PBS tabletten (Sigma; P4417t00TAB) 1 L Water 1 ml Tween 19
Procedure: Bijlage III Knip de membranen op formaat van de gel (90 mm bij 60 mm), draag hierbij handschoenen om te voorkomen dat er eiwit van je handen op het membraan komt. Week het membraan ongeveer één min. in 100% methanol. Week het membraan daarna in de blotbuffer samen met de sponsjes en whatman papiertjes. Leg de blotmal in een schaaltje met blotbuffer en leg de materialen er in de volgende volgorde in: Zwarte kant van de blotmal (-) Sponsje Whatman papier (aantal is afhankelijk van de dikte van het papier) Gel (verkregen via gel elektroforese) PVDF membraan Whatman papier (aantal is afhankelijk van de dikte van het papier) Sponsje Transparante kant van de blotmal (+) Plaats de blotmal in de blotbak met de zwarte kant aan de zwarte zijde. Zet de ijsbak en een roervlo er in. Zet de roerder rustig aan en blot ± 2 uur bij 200 ma. Na 1 uur blotten op pauze drukken en de ijsbak vervangen voor een nieuwe. Vries de gesmolten ijsbak opnieuw in voor latere blots. Na 125/130 minuten blotten: Spoel het blot met PBS-Tween en bewaar het blot in PBS-Tween. Het membraan kan zo ongeveer één dag bewaard blijven bij 4 o C en onbeperkt bij - 20 o C. Het verkregen membraan bevat nu de eiwitten die in de gel een bandje vormden. Om de eiwitten zichtbaar te maken is een immuno blot mogelijk maar ook een ponceau kleuring. Immuno blot wordt gebruikt bij het aantonen van een specifiek eiwit. Ponceau kleuring is een aspecifieke methode voor alle eiwitten. Deze methoden sluiten elkaar niet uit, maar ze kunnen ook aanvullend gebruikt. Immunoblot: Als onderdeel van western blot. Melkpoeder PBS /PBS-tween (0,1%) Primair antilichaam Secundair antilichaam 50 ml buis Versa Doc (Bio-Rad) Geblot PVDF membraan Rollenbank (gekoeld) 20
Werkwijze: Bijlage III Dag 1: o 3.5% melkpoeder in PBS tween maken. o Leg het membraan wat is verkregen door blotten in een schaaltje en voeg hier 30 ml 3,5% PBS tween melk aan toe. Het melkpoeder oplossen in PBS-Tween 0,1%. Laat het 1 uur incuberen bij kamertemperatuur. o Stop vervolgens het membraan in een 50 ml buis met de bovenkant naar binnen. Maak de juiste verdunning van het eerste antilichaam in 3,5% melkpoeder met PBS-Tween. Leg de buis in de koelkast op de rollenbank, laat overnacht incuberen. Dag 2: o Was de volgende dag het blot door het buisje leeg te gieten en 5 tot 10 ml PBS-Tween toe te voegen. Leg het buisje 5 minuten op de rollenbank (bij kamertemperatuur). Herhaal deze wasstap 3x. o Maak een verdunning van het 2 e antilichaam in 3,5% melkpoeder met PBS-Tween en voeg die aan de buis met het membraan. o Leg de buis gedurende 1 uur op de rollenbank bij kamertemperatuur om het 2 e antilichaam te laten incuberen. o Was daarna het blot weer 3 keer met PBS-Tween en één keer met PBS, elke keer voor 5 minuten en op de rollenbank bij kamertemperatuur incuberen. o Leg het membraan op een overhead sheet en maak de ECL oplossing klaar door 1:1 de 2 componenten (luminol en waterstofperoxide) bij elkaar te voegen. o Druppel de substantie over het membraan en laat ongeveer 2 minuten incuberen. Laat het membraan uitdruppen en leg het op een nieuwe overhead sheet met een andere sheet er boven op zodat het membraan niet uit kan drogen. (Voorkom hierbij luchtbellen die er tussen kunnen komen). o Maak nu een foto met het de Versa Doc (Bio-Rad) van Bio-Rad. Het uitgezonden licht is van de bandjes afkomstig en wordt zo zichtbaar gemaakt. Afbeelding: Voorbeeld van membraan gekleurd met behulp van immunoblot Sluitertijd 60 sec. rechts en links magic mark midden collageen. Eerste 6 bandjes collageen type I humaan in verdunningen, 7 e bandje collageen type I rat, lege plaats is collageen type III humaan. (Geen binding van 1 e antilichaam aan type III) 21
Tabel 2: Gebruikte antilichamen, controles en markers Bijlage IV Controles Collageen type I human Collageen type I rat Collagen type III human Primaire antilichamen Goat antihuman immunopure col. Type I Secundaire antilichamen Rabbit anti goat immunopure IgG HRP labeled Controles All blue marker Magicmark xp Verdunning --------- --------- --------- 1:100 1:500 1:5.000 1:100.000 --------- --------- Fabrikant Sigma Sigma Sigma USBiological Pierce Biotechnology Bio-Rad Invitrogen Formaat (kd) Ca. 130 kd Ca. 130 kd Ca. 130 kd --------- --------- Prod. Nr. C7774 C8897 C4407 C7510-17K 31402 161-0373 LC 5602 Oorsprong Human placenta Rat tail Human placenta Goat Rabbit Recombinante eiwitten Recombinante eiwitten Poly/monoclonal --------- --------- --------- Polyclonal Monoclonal --------- --------- 22
Ponceau kleuring Bijlage V Materialen: Ponceau oplossing. (Sigma Aldrich; P7170-1L) PVDF membraan (al wel geblot) Schaaltje Water Overhead sheet Pincet Tissues Procedure: Giet een bodem ponceau in het schaaltje. Neem het membraan voorzichtig met een schoon pincet van het blotpapiertje af en leg deze in een schaaltje met ponceau oplossing. Zorg dat het membraan goed onder gedompeld is. Laat ongeveer 15 min staan. (evt. op een schudplaat) Giet nu voorzichtig de ponceau oplossing terug in de fles en vul het schaaltje met water uit de kraan. Let op: niet rechtstreeks op het membraan laten spoelen! Spoel enkele seconden met het water en giet het water door de gootsteen. Vul het schaaltje opnieuw met een bodem water (weer niet direct op het membraan gieten). Haal het membraan uit het water en leg het op de overhead sheet. Een gedroogd membraan is onbeperkt te bewaren*. Een gedroogd membraan is echter niet meer te bewerken. Om het membraan te gebruiken voor immunoblot mag het zeker niet drogen. Afbeelding: Voorbeeld membraan kleuring met ponceau kleuring [5] *Mogelijk ontkleuren de membranen door blootstelling aan licht en lucht. Dit is nog niet bekend. 23
Tabel 3: Indeling collageen volgens Bornstein en Traub Bijlage VI Type Notes I This is the most abundant collagen of the human body. It is present in scar tissue, the end product when tissue heals by repair. It is found in tendons, the endomysium of myofibrils and the organic part of bone. II Articular cartilage and Hyaline cartilage, makes up 50% of all cartilage protein III This is the collagen of granulation tissue, and is produced quickly by young fibroblasts before the tougher type I collagen is synthesized. Reticular fiber. Also found in artery walls, intestines and the uterus IV Basal lamina; eye lens. Also serves as part of the filtration system in capillaries and the glomeruli of nephron in the kidney. V most interstitial tissue, assoc. with type I, associated with placenta VI most interstitial tissue, assoc. with type I VII forms anchoring fibrils in dermal epidermal junctions VIII some endothelial cells IX FACIT collagen, cartilage, assoc. with type II and XI fibrils X hypertrophic and mineralizing cartilage XI cartilage 24
Handleiding Versadoc Apparaat Bijlage VII Start het apparaat aan 2X: o Start de camera o Start de Versadoc apparaat Zet de pc aan. Altijd controleren of in het apparaat de korte of de lange lens staat. Voor western blot moet altijd de korte lens gebruikt worden. Start Quantity One op. Selecteer scanner; Versa Doc. Selecteer onder de button Select: Versadoc. Selecteer channel 1 (het staat meestal al op channel 1) Druk op de button Select en kies hieronder blotting en dan Chem Hi Sensitivity. Druk op de button position om de positie van het membraan vast te stellen, (Light off). Draai aan de lens en kijk naar het scherm om een scherp beeld te krijgen. Scherpstellen op het membraan door op de button Focus te drukken. Light off. Stel de sluitertijd om te beginnen in op 10 sec. Druk op de button Acquire om de foto te maken. Zoom op het sterkste bandje door middel van het zoom icoon. Activeer de density tool, dit is te vinden onder View Plot density, daarna kan gekozen worden tussen verschillende opties; bijvoorbeeld density at cursor. De maximale haalbare intensiteit is 4000. De behaalde intensiteit is aangegeven als Average Quantity onder in beeld. Stel dat deze 35.9 is, zal de berekening van de gewenste sluitertijd als volgt zijn: 4000/36= 111 X meer dan wat nu gebruikt is, dus 111*10= 1110 sec. Ander voorbeeld: stel dat de Average Quantity 550 is, dus 4000/550= 7.3X meer dan wat nu gebruikt is, dus 7.3*10= 73 sec sluitertijd. Kies de gewenste sluitertijd en druk op Acquire om de foto vast te stellen. Na het vaststellen van de foto verschijnt de foto in het wit, om het in zwart te krijgen moet het volgende gedaan worden; rechter muisknop transform kiezen onder display kies invert display. Door de pijlen van (high en low) te veranderen kan het contrast veranderd worden. Foto opslaan. Om de foto te kunnen openen op alle PC s, moet het volgende gedaan worden; File Export to TIFF Image Export view excluding overlays. Nu is de foto formaat geschikt voor alle pc s. Einde. 25
Bijsluiter 1e antilichaam Bijlage VIII 26
Bijsluiter 1 e antilichaam Bijlage IX 27