pagina : 1 van 18 Datum van ingang: 23-06-2008 Wijzigingen die zijn aangebracht: Nr. versienr. (oud) pag.nr./puntnr. 1 5.11 5 / 10 Verwante verbindingen en gehalte HPLC methode vervangen door UPLC methode. Nieuwe SAM VRCANNA (versie 2.1) opgesteld bij Farmalyse n.a.v. UPLC-validatie in opdracht van BMC. Nieuwe SAM bij Farmalyse ingegaan op 20 februari 2007 versienr. (nieuw) 6.0 2 6.0 Wijzigingen aangebracht in voorbeeld analyse certificaten. Kleine aanpassingen aangebracht bij verwante verbindingen en gehalte en in de voorbeeld analyse certificaten. 6.1 Veiligheidsaanwijzingen: Echtblauwzout B is mogelijk carcinogeen en mutageen! Houderslijst: Origineel: Handboek werkinstructies Kwaliteitsfunctionaris Kopie 1: Handboek werkinstructies Laboratorium
pagina : 2 van 18 Datum van ingang: 23-06-2008 Doel en toepassingsgebied Het voorgeschreven onderzoek dient ter vrijgiftecontrole van Cannabis Flos (Hennepbloemen); variëteiten Bedrocan, Bedrobinol en Bediol. Allen volgens voorschrift van de leverancier (versie 6.1). De te onderzoeken parameters zijn: 1. Uiterlijk 2. Vreemd materiaal 3. Fijnheid 4. Identificatie A: microscopische eigenschappen 5. Identificatie B: DLC 6. Microbiologische contaminatie (door Bactimm) 7. Pesticiden (door TNO voeding) 8. Zware metalen (door Aemas) 9. Gewichtsverlies door drogen 10. Verwante verbindingen en gehalte Voorbereiding Ongemalen monster: Direct na ontvangst en openen verpakking wordt van het ongemalen materiaal 10 gram opgestuurd naar Bactimm voor bepaling van microbiologische contaminatie. Overig materiaal wordt gekeurd op de volgende kenmerken: uiterlijk, vreemd materiaal, fijnheid en microscopische eigenschappen (# 1-4). Gemalen monster: Er wordt ca 20 gram vermalen tot ca. 5 mm, meng het gemalen monster vervolgens goed door. Zes gram van het gemalen materiaal wordt in de diepvries opgeslagen t.b.v. keuring op pesticiden. Het overige gemalen materiaal wordt gebruikt voor alle overige testen (# 5-10). Afkortingen 9- THC = 9- tetrahydrocannabinol 8- THC = 8- tetrahydrocannabinol THCA = Tetrahydrocannabinol zuur CBD = Cannabidiol CBDA = Cannabidiol zuur CBG = Cannabigerol CBN = Cannabinol
pagina : 3 van 18 Datum van ingang: 23-06-2008 Onderzoeksmethoden 1. Uiterlijk Bedrocan en Bedrobinol: Vuilgroene trosvormige, kleverige bloeiwijzen van 1.5 tot 3 cm lengte en met een karakteristieke geur. Bediol: Ca. 5 mm bruingroen granulaat van de kleverige bloeiwijze met een karakteristieke geur. 2. Vreemd materiaal Het materiaal is vrij van losse stengeldelen (> 1,5 cm) en van insecten en ander ongedierte. 3. Fijnheid Bedrobinol en Bedrocan: Bij macroscopische inspectie van het ongemalen materiaal is geen blad waarneembaar dat meer dan 20% van de lengte van de bloeiwijze uitsteekt. Stengels zijn weggeknipt tot direct onder de onderste bloemen van de bloeiwijze. Bediol: Fijn gegranuleerde bloemen zonder losse stengeldelen groter dan 1,0-1,5 cm. 4. Identificatie A: Microscopische eigenschappen a. Reagentia Chloralhydraatoplossing: oplossing van 80 gram chloralhydraat in 20 ml water. b. Werkwijze Bereid een chloralhydraat preparaat door enkele druppels chloralhydraatoplossing aan een spatelpunt plantmateriaal toe te voegen en kort op een kleine vlam te koken. Onder de microscoop zijn vooral klierharen waarneembaar. 5. Identificatie B: DLC 5.1 Reagentia petroleumether (40-60) ether R echtblauwzout B (gestabiliseerd met zinkchloride) (mogelijk carcinogeen en mutageen) ethanol R methanol R Δ 9 - THC referentiesubstantie THCA referentiesubstantie CBD referentiesubstantie CBDA referentiesubstantie
pagina : 4 van 18 Datum van ingang: 23-06-2008 5.2 Werkwijze DLC-plaat: Silicagel F 254 (Merck art.nr. 5715) Loopmiddel: petroleum ether, ether (40:10 V / V ) Loopafstand: 10 cm Spraymiddel: Oplossing van 1 g / l echtblauwzout B in een mengsel van 50% ethanol in water. Monsteroplossing a: Gebruik monsteroplossing 1a (zie paragraaf 10) van de test op verwante verbindingen en gehalte. Monsteroplossing b: Gebruik monsteroplossing 2a (zie paragraaf 10) van de test op verwante verbindingen en gehalte. Standaardoplossing a: Gebruik de bestaande Δ 9 - THC referentiesubstantie van 0.1 mg / ml in ethanol. Standaardoplossing b: Gebruik de bestaande THCA referentiesubstantie van 0.1 mg / ml in ethanol. In geval van keuring van Bediol nog toevoegen: Standaardoplossing c: Gebruik de bestaande CBD referentiesubstantie van 0.1 mg / ml in ethanol. Standaardoplossing d: Gebruik de bestaande CBDA referentiesubstantie van 0.1 mg / ml in ethanol. Breng 5 µl van alle monsteroplossingen en alle standaardoplossingen op de plaat als een band van max. 5 mm breed. Plaats de plaat in de bak met loopmiddel en laat ca. 10 cm lopen. Droog de plaat aan de lucht, besproei met het spraymiddel. Beoordeel in zichtbaar licht. Monsteroplossing A Bedrocan of Bedrobinol: De hoofdvlek in monsteroplossing a is een roodoranje vlek (THCA) met een RF- waarde gelijk aan die van referentieoplossing b (THCA). In het chromatogram van monsteroplossing a kan een roodviolette zone overeenkomstig met Δ 9 - THC aanwezig zijn. Bediol: Behalve bovenstaande vlekken wordt ook een vlek waargenomen overeenkomend met die van referentieoplossing d (CBDA).
pagina : 5 van 18 Datum van ingang: 23-06-2008 Monsteroplossing B Bedrocan of Bedrobinol: De hoofdvlek in monsteroplossing b is een roodviolette vlek (Δ 9 - THC) met een RF- waarde gelijk aan die van referentieoplossing a (Δ 9 - THC). In het chromatogram van monsteroplossing b kan een roodoranje zone overeenkomstig met THCA aanwezig zijn en een oranje zone overeenkomstig met CBD. Bediol: Behalve bovenstaande vlekken wordt er ook een hoofdvlek waargenomen overeenkomend met die van referentieoplossing c (CBD). Top van de plaat rode zone (CBDA) oranje zone (CBD) rood-violette zone (Δ 9 - THC) rood-oranje zone (THCA) rode zone (CBDA) rood-oranje zone (THCA) oranje zone (CBD) rood-violette zone (Δ 9 - THC) standaardoplossingen monsteroplossing a monsteroplossing b 6. Microbiologische contaminatie Wordt uitgevoerd door Bactimm. Van het materiaal dat geen kiemreducerende behandeling heeft ondergaan wordt bepaald: - aerobe bacteriën - aerobe gisten en schimmels - enterobacteriae en gramnegatieven - Pseudomonas aeruginosa - Staphylococcus aereus 7. Pesticiden Wordt uitgevoerd door TNO voeding. Er worden altijd 5 batches tegelijk verstuurd. Sla direct na ontvangst van het monster 6 gram van het gemalen materiaal op in de diepvries, om later per 5 monsters naar TNO voeding te versturen. Het materiaal wordt getest op de aanwezigheid van residuen van pesticiden volgens de methode die beschreven staat in het TNO validatie rapport met als referentie ASC- 2004/0941rev1-mol. Pyrethrinen is niet aantoonbaar met deze methode. De bepaling van azinfosmethyl vindt plaats door middel van een andere methode.
pagina : 6 van 18 Datum van ingang: 23-06-2008 8. Zware metalen Wordt uitgevoerd op 5 gram gemalen materiaal door Aemas. Lood : max. 20.0 ppm (ICP-OES) Cadmium: max. 0.5 ppm (ICP-OES) Kwik: max. 0.5 ppm (d.m.v. combustion atomic absorption) 9. Gewichtsverlies na drogen Niet meer dan 10.0% bepaald op 0.500 gram van het gemalen monstermateriaal en verwarmd gedurende 24 uur bij 40 C boven fosforpentoxide onder vacuüm. Zie de EP monografie "Loss on drying" (2.3.32) methode C.
pagina : 7 van 18 Datum van ingang: 23-06-2008 10. Verwante verbindingen en gehalte 10.1 Reagentia Ethanol R Acetonitril HPLC Formic Acid MiliQ water 10.2 Apparatuur en hulpmiddelen Waters Acquity Ultra Performance LC Pump: Serialnumber: J05UPB 162M Autosampler: Serialnumber: J05UPS 062M Photodiode Array Detector: Serialnumber: J05UPD 449M Software: Empower 2 UPLC-kolom: Aquity C18 1.7 μm, 2.1 x 150 mm, (Waters) Kolomtemperatuur: 30 ºC Traycooler: 8 o C Mobiele fase: 0.1 % Formic acid in Acetonitril (MF A) 0.1 % Formic acid in MiliQ water (MF B) Oplosmiddel / Needle wash: Meng 70 volumes MF A met 30 volumes MF B. Gradient: t (min.) MF A (%) MF B (%) 0 70 30 6.00 70 30 10.50 100 0 10.70 100 0 11.00 70 30 12.50 70 30 Flow: 0.3 ml / min. Injectievolume: 10 µl Detectie: 228 nm Runtijd: 12.5 min.
pagina : 8 van 18 Datum van ingang: 23-06-2008 10.3 Werkwijze monsteroplossing 1 (vers materiaal): Weeg 1000 mg van het gemalen monster af in een Falcon buis en schud (ca. 300 rpm) gedurende 15 minuten met 40 ml ethanol R en centrifugeer. Breng de heldere bovenlaag in een 100 ml maatkolf. Herhaal dit 2 maal met 25 ml ethanol R en vul de maatkolf aan met ethanol R. Filtreer de monsteroplossing over een 0.45 µm filter. Pipetteer 1 ml hiervan in een maatkolf van 10 ml en vul aan met oplosmiddel (monsteroplossing 1a m1 en 1a m2). Verdun monsteroplossing 1a nogmaals 10 keer met oplosmiddel (monsteroplossing 1b m1 en 1b m2 ). monsteroplossing 2 (gedecarboxyleerd materiaal): Decarboxylatieproces in eigendom van Farmalyse. Standaardmix: Er zijn 2 soorten standaard mixen; voor de variëteit Bedrocan en Bedrobinol is één mix en de tweede mix is bestemd voor de variëteit Bediol. Mix 1 Bedrocan / Bedrobinol bestaat uit: 15.0% THC, 15.0% THCa, 1.0% CBD, 1.0% CBDA en 1.0% Delta 8 THC. Mix 2 Bediol bestaat uit: 7.0% THC, 7.0% THCa, 7.0% CBD, 7.0% CBDA en 1.0 % Delta 8 THC. Hieruit worden 2 doorverdunningen gemaakt (1 op 10; 1 op 100). Dit om de actieve bestanddelen en de verwante verbindingen in hun juiste concentratie bereik te krijgen. Verdun mix 1 of 2 (behorende bij het monster) volgens onderstaand schema met oplosmiddel. Std mix 1 of 2 (1/10): Pipetteer 100 µl van de mix en verdun met 900 µl oplosmiddel. Std mix 1 of 2 (1/100): Verdun Std mix 1 of 2 (1/10) nogmaals 10 keer met oplosmiddel. Standaardoplossing THC:
pagina : 9 van 18 Datum van ingang: 23-06-2008 Verdun de standaard THC oplossing met een concentratie van 0.93 mg / ml tot een concentratie van 0.01 mg / ml. Pipetteer daartoe 53.8 µl van de standaard THC oplossing (0.93 mg / ml ) in een maatkolf van 5 ml en vul aan met oplosmiddel. LLOQ standaard THC: Verdun de standaard oplossing THC met een concentratie van 0.01 mg / ml tot een concentratie van 0.0005 mg / ml. Pipetteer daartoe 250 µl van de standaard oplossing THC in een maatkolf van 5 ml en vul aan met oplosmiddel. Referentie extract: Elke variëteit heeft zijn eigen referentie extract. Dit met als doel het profiel te schetsen van wat verwacht wordt in de monsteroplossing. Bereid een 5 maal verdunning uit het referentie extract: pipetteer daartoe 50 µl van het referentie extract (behorende bij het monster) in een vial met insert en verdun met 200 µl oplosmiddel. System suitability test: Stel een sequence op aan de hand van het voorbeeld in figuur 1. Injecteer zes maal 10 µl van standaardmix (1/100) behorende bij het monster. De relatieve standaardafwijking van de piekoppervlakken van THC is niet groter dan 2.0%. Injecteer vervolgens de mix 1/10 (behorende bij het monster). Beoordeel de resolutie tussen de pieken THC en delta 8-THC. Deze mag niet minder bedragen dan 1.2. Vergelijk de piek oppervlakken van alle componenten in beide mixen met de piekoppervlakken uit voorgaande analyses. Dit om de houdbaarheid van beide mixen te trenden. De piekoppervlakken van beide mixen worden bijgehouden in een database. Injecteer de THC standaardoplossing twee maal. Vergelijk het piekoppervlak van THC met die uit de standaardmix (1/100). Deze moeten lineair met elkaar zijn. Vervolgens wordt de LLOQ standaard THC één maal geïnjecteerd. Dit om de laagst te meten concentratie te controleren. Injecteer vervolgens 10 µl van het bijbehorende referentie extract. Het verkregen profiel moet overeenkomend zijn met
pagina : 10 van 18 Datum van ingang: 23-06-2008 monsteroplossing 1a. Figuur 1: Opbouw standaard sequence Gehaltebepaling THC en CBD Injecteer 10 µl van alle monsteroplossingen. Aan de hand van de standaardmixen worden de actieve bestanddelen berekend. Std mix 1 (1/10): Hiermee worden de volgende cannabinoiden berekend: CBD/CBDa/Delta 8 THC Std mix 1 (1/100): Hiermee worden de volgende cannabinoiden berekend: THC/THCa Std mix 2 (1/10): Hiermee worden de volgende cannabinoiden berekend: Delta 8 THC Std mix 2 (1/100): Hiermee worden de volgende cannabinoiden berekend: CBD/CBDa/THC/THCa Bepaal uit monsteroplossing 1b het totaal gehalte THC op de gedroogde stof volgens onderstaande voorbeeld berekeningen. Doe hetzelfde voor monsteroplossing 2b. Am THC (%) = 100 x 2b x Vm x Conc. std As x Wm x Vf THC total equivalalents (%) = %THCa x 0.877 + %THC Onzuiverheden Bepaal aan de hand van het gemiddelde piekoppervlak van THC uit de standaard mix en de responsfactoren t.o.v. THC de verwante verbindingen CBN en CBNa volgens onderstaande voorbeeld berekening. Doe hetzelfde voor monsteroplossing 2a. Zie voor de responsfactoren tabel 1. Am2a x Vm x Conc.std CBN (%) = 100 x x Vf RFm x As x Wm
pagina : 11 van 18 Datum van ingang: 23-06-2008 CBN total equivalalents (%) = %CBNa x 0.877 + %CBN Waarin: Am: Area monster (mau * min) Vm: Volume monster (ml) Conc.std: Concentratie van de te berekenen component RFm: Respons factor monster (zie tabel 1) As: Area standard (mau * min) Wm: Inweeg monster (mg) Vf: Verdunningsfactor (10 of 100) Wanneer de concentraties lager zijn dan de LLOQ (0.0005 mg / ml ), dan wordt dit als volgt gerapporteerd: < 0.05% Tabel 1: Responsfacturen UPLC. Respons Factor UPLC CBDA 1,60 CBGA 1,58 CBG 0,93 CBD 1,03 CBN 1,93 THC 1,00 delta-8-thc 0,70 CBNA 1,08 CBC 1,80 THCA 1,60 CBCA 0,84 Een voorbeeld rekensheet is te vinden in de map: X:\Data\Farmalyse\Laboratorium\Berekeningen\UPLC\Berekening Cannabis UPLC leeg 11. Literatuur: Monografie BMC/Farmalyse ter vrijgiftecontrole van Cannabis Flos (Hennepbloemen); variëteiten Bedrocan, Bedrobinol en Bediol; versie 6.1. 12. Validatie: Validatie gehaltebepaling m.b.v. UPLC uitgevoerd door Farmalyse: report UPLC-0512-1. Pesticiden: Validatie uitgevoerd door TNO voeding met als referentie ASC-2004/0941rev1-
pagina : 12 van 18 Datum van ingang: 23-06-2008 mol. Bijlagen: Bijlage 1: Voorbeeld chromatogrammen Bijlage 2: Moeder analyse certificaat Bedrocan Bijlage 3: Moeder analyse certificaat Bedrobinol Bijlage 4: Moeder analyse certificaat Bediol
pagina : 13 van 18 Datum van ingang: 23-06-2008 Bijlage 1 Chromatogram Std mix 1 (1/100) CB DA - 4.446 CBD - 5.207 Delta 9-9.238 Delta 8-9.376 THCA - 10.382 Chromatogram Std mix 2 (1/100) CBDA - 4.442 CBD - 5.205 Delta 9-9.241 Delta 8-9.374 THCA - 10.383
pagina : 14 van 18 Datum van ingang: 23-06-2008 Chromatogram Std mix 1 (1/10) CBDA - 4.442 CBGA - 4.799 CBD - 5.200 5.756 7.726 7.861 CBN - 8.152 8.675 Delta 9-9.216 Delta 8-9. 370 CBNA - 9.490 10.001 CBC - 10.193 10.567 CBCA - 10.835 THCA - 10.351 Chromatogram Std mix 2 (1/10) CBDA - 4.427 CBGA - 4.795 CBD - 5.190 5.743 7.718 7.857 CBN - 8.151 Delta 9-9.230 Delta 8-9.375 CBNA - 9.490 10.002 CBC - 10.201 THCA - 10.576 CBCA - 10.850 10.370
pagina : 15 van 18 Datum van ingang: 23-06-2008 Chromatogram referentie extract Bedrocan 1a CBDA - 4.452 4.643 CBGA - 4.796 CBG - 4.918 6.123 6.284 7.135 7.862 CBN - 8.084 Delta 9-9.235 Delta 8-9.347 CBNA - 9.490 9.828 CBC - 10.194 CBCA - 10.833 THCA - 10.343 Chromatogram referentie extract Bedrobinol 1a CB DA - 4.461 4.648 CBGA - 4.798 CBD - 5.330 6.158 6.292 7.865 CBN - 8.082 Delta 9-9.235 Delta 8-9.344 CBNA - 9.486 9.837 CBC - 10.196 CBCA - 10.835 THCA - 10.370 Chromatogram referentie extract Bediol 1a CBDA - 4.425 THCA - 10.368 CBGA - 4.799 CBD - 5.195 6.124 6.287 7.213 7.866 CBN - 8.081 8.782 Delta 9-9.236 Delta 8-9.347 CBNA - 9.489 9.990 CBC - 10.189 CBCA - 10.831
pagina : 16 van 18 Datum van ingang: 23-06-2008 Bijlage 2: Analyse certificaat Cannabis Flos (Hemp flowers) variety: Bedrocan Product: Cannabis Flos (Hemp flowers) variety: Bedrocan Batch/charge: Code of analysis: VWS xxx/yyy According to: Monograph BMC/Farmalyse Version 6.1 / SAM VRCANNA 2.2 Date of analysis: Specification Results Appearance brown green clustered flowers of 1,5 to 3 cm with a characteristic smell Identity test A microscopy; mainly gland hairs visible test B TLC Foreign material Fineness stalks, insects and other vermin are absent no leaves shooting out more then 20% of the length of the flowers stalks are cut away directly under the bottom flowers of the inflorescence Microbiological purity. Aerobic bacteria cfu/g Aerobic fungi cfu/g Total aerobic bacteria and fungi cfu/g Enterobacteriaceae en gramnegatives bacteria cfu/g Pseudomonas aeruginosa absent Staphylococcus aureus absent Loss on drying 10.0% % Assay (UPLC, after decarbox): Fingerprint similar Dronabinol (THC, total eq.) Approx. 18% % Cannabidiol (CBD, total eq.) <1.0% % Related substances (UPLC, after decarbox) Cannabinol (CBN, total eq.) <1.0% % QC Check QA Check By: Initial: Date:
pagina : 17 van 18 Datum van ingang: 23-06-2008 Bijlage 3: Analyse certificaat Cannabis Flos (Hemp flowers) variety: Bedrobinol Product: Cannabis Flos (Hemp flowers) variety: Bedrobinol Batch/charge: Code of analysis: VWS xxx/yyy According to: Monograph BMC/Farmalyse Version 6.1 / SAM VRCANNA 2.2 Date of analysis: Appearance Specification brown green clustered flowers of 1,5 to 3 cm with a characteristic smell Results Identity test A microscopy; mainly gland hairs visible test B TLC Foreign material Fineness stalks, insects and other vermin are absent no leaves shooting out more then 20% of the length of the flowers stalks are cut away directly under the bottom flowers of the inflorescence Microbiological purity. Aerobic bacteria cfu/g Aerobic fungi cfu/g Total aerobic bacteria and fungi 10 2 cfu/g cfu/g Enterobacteriaceae en gramneg. bact <10 cfu/g cfu/g Pseudomonas aeruginosa absent Staphylococcus aureus absent Loss on drying 10.0% % Fingerprint similar Assay (UPLC, after decarbox): Fingerprint similar Dronabinol (THC, total eq.) Approx. 11% % Cannabidiol (CBD, total eq.) <1.0% % Related substances (UPLC, after decarbox) Cannabinol (CBN, total eq.) <1.0% % QC Check QA Check By: Initial: Date:
pagina : 18 van 18 Datum van ingang: 23-06-2008 Bijlage 4: Analyse certificaat Cannabis Flos (Hemp flowers) variety: Bediol granulated Product: Cannabis Flos (Hemp flowers) variety: Bediol granulated Batch/charge: Code of analysis: VWS xxx/yyy According to: Monograph BMC/Farmalyse Version 6.1 / SAM VRCANNA 2.2 Date of analysis: Specification Results Appearance brown green granulate of the flowers (about 5 mm) with a characteristic smell Identity test A microscopy; mainly gland hairs visible test B TLC Foreign material Fineness stalks, insects and other vermin are absent Fine granulated flowers without stalks longer than 1.0-1.5 cm Microbiological purity. Aerobic bacteria cfu/g Aerobic fungi cfu/g Total aerobic bacteria and fungi 10 2 cfu/g cfu/g Enterobacteriaceae en gramneg. bact <10 cfu/g cfu/g Pseudomonas aeruginosa absent Staphylococcus aureus absent Loss on drying 10.0% % Fingerprint similar Assay (UPLC, after decarbox): Fingerprint similar Dronabinol (THC, total eq.) Approx. 5% % Cannabidiol (CBD, total eq.) Approx. 6% % Related substances (UPLC, after decarbox) Cannabinol (CBN, total eq.) <1.0% % QC Check QA Check By: Initial: Date: