University of Groningen Attenuating fibrosis Mia, Md Masum IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below. Document Version Publisher's PDF, also known as Version of record Publication date: 2016 Link to publication in University of Groningen/UMCG research database Citation for published version (APA): Mia, M. M. (2016). Attenuating fibrosis: Modulation of myofibroblast formation and extracellular matrix synthesis [Groningen]: Rijksuniversiteit Groningen Copyright Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons). Take-down policy If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim. Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum. Download date: 09-01-2018
Fibrose, oftewel verlittekening van weefsels, is een proces dat tot uitval van belangrijke organen kan leiden, met de dood tot gevolg. In feite ligt het aantal sterfgevallen veroorzaakt door fibrose hoger dan bij kanker of hart- en vaatziekten. Hoewel dat nu langzamerhand erkend wordt, is er nog steeds geen enkel medicijn tegen fibrose. Dat is duidelijk zichtbaar bij brandwonden: hoewel het beschadigde weefsel gemakkelijk toegankelijk is voor het toedienen van medicijnen, is er nog steeds geen remedie gevonden om littekenvrij te genezen. Het belangrijkste kenmerk van fibrose is de pathologische opstapeling van collageen, dat blijft liggen omdat het heel moeilijk afbreekbaar is. Collageen wordt door de cel uitgescheiden, wordt neergelegd in een soort matje, en wordt daarom een extracellulair matrix eiwit genoemd. De cellen die fibrose voorzaken zijn de myofibroblasten: zij produceren veel collageen, minder collageen-afbrekende enzymen, en meer remmers tegen deze collageen-afbrekende enzymen. De netto balans is: meer aanmaak van collageen, en minder afbraak. Daarnaast is het collageen dat geproduceerd wordt door myofibroblasten ook nog eens kwalitatief anders: zij bevat meer cross-links van het type dat ervoor zorgt dat collageen nog moeilijker afbreekbaar is dan normaal het geval is. Deze crosslinks, pyridinolines genaamd, zijn een extra complicerende factor en ontstaan als de lysine zoals aanwezig in de telopeptiden van collageen wordt omgezet naar hydroxylysine. Het enzym dat hiervoor verantwoordelijk is, lysyl hydroxylase 2, wordt gecodeerd door het gen genaamd PLOD2. Myofibroblasten zijn van fibroblasten makkelijk te onderscheiden vanwege de aanwezigheid van een cytoskelet, dat o.a. bestaat uit de componenten αsma en SM22α. Activatie van fibroblasten met transforming growth factor beta1 (TGFβ1) resulteert in de formatie van myofibroblasten; hetzelfde proces treedt in het lichaam op bij fibrose. We kunnen het proces van fibrose dan ook voor een deel nabootsen in het laboratorium door middel van celkweken zonder dat er proefdieren aan te pas komen. Dit gegeven is gebruikt om een aantal stoffen te testen op hun potentie om fibrose tegen te gaan, dat wil zeggen de vorming van myofibroblasten remt dan wel een verlaging teweeg brengt van de synthese van collageen en/of de synthese van lysyl hydroxylase 2. Allereerst is gekeken naar het effect van interleukin-1β (IL1β). Dit cytokine bleek in staat om de vorming van myofibroblasten, zoals bewerkstelligd door TGFβ1, te remmen, alsmede de depositie van collageen. Verder remde het de expressie van lysyl oxidase (een enzym betrokken bij de cross-linking van collageen), en bleek het in staat om de productie van collageen-afbrekende enzymen aanzienlijk te verhogen. Ook bleek het mogelijk om fibroblasten die reeds aan het differentiëren waren naar myofibroblasten, terug te drukken naar fibroblasten. Daarnaast zijn een tweetal laag-moleculaire stoffen onderzocht waarvan bekend is dat ze een remmende invloed hebben op ontsteking in het algemeen, maar niet of nauwelijks zijn getest op fibroblasten. Het zijn CAPE en ACHP. Beide stoffen bleken in staat om de activatie van fibroblasten naar myofibroblasten door TGFβ1 volledig te blokkeren, inclusief de
daarbij behorende productie van collageen type I. Verder bleken beide stoffen de reeds aanwezige myofibroblasten voor een deel weer om te kunnen zetten naar fibroblasten. Stamcellen staan bekend om hun positieve eigenschappen ten aanzien van het genezen van wonden. Omdat aan therapie met levende stamcellen nogal wat haken en ogen kleven, is gekeken of de stoffen die stamcellen uitscheiden (paracriene factoren) een gunstige invloed hebben in een fibrotisch milieu. De paracriene factoren worden uitgescheiden in het kweekmedium waarin de stamcellen zitten, en wordt geconditioneerd medium geoemd. Er werd in onze proeven gebruik gemaakt van geconditioneerd medium van zowel foetale stamcellen (verkregen uit vruchtwater) als van adulte stamcellen (verkregen uit vetweefsel van volwassenen). Deze vergelijking is vooral interessant, omdat een foetus littekenvrij geneest, een eigenschap dat na de geboorte echter al snel verdwijnt. Paracriene factoren van foetale stamcellen bleken een zeer sterk anti-fibrotisch effect te hebben: de vorming van myofibroblasten werd volledig geremd, en ook de depositie van de extracellulaire matrix eiwitten collageen type I en tenascine C werd volledig geremd. Geconditioneerd medium van adulte stamcellen bleek deze eigenschappen in veel mindere mate te hebben. Echter, reeds aanwezige myofibroblasten konden zowel door geconditioneerd medium van foetale en adulte stamcellen worden teruggedrukt naar fibroblasten. Hoewel paracriene factoren van stamcellen bepaalde fibrotische processen kunnen remmen, lijken foetale stamcellen veruit superieur te zijn ten opzichte van adulte stamcellen. Bij de vorming van myofibroblasten en bij de synthese van collageen zijn verschillende netwerken betrokken die op elkaar inwerken. Welke paracriene factoren zijn betrokken bij het remmen van myofibroblasten? Eén van de factoren die foetale stamcellen uitscheiden, maar niet tot nauwelijks door adulte stamcellen, is basic fibroblast growth factor (bfgf = FGF2). Door het toevoegen van antilichamen die een neutraliserende werking hebben op bfgf bleek het geconditioneerd medium van foetale stamcellen grotendeels haar eigenschap om myofibroblast vorming te remmen te verliezen. De remming van collageen produktie bleef echter onverminderd van kracht. Hoe foetale stamcellen de collageen productie remt is dus nog onbekend. Ook hebben we onderzocht hoe IL1β en CAPE de differentiatie van fibroblasten naar myofibroblasten remt. Het is bekend dat de transcriptiefactor GLI1 een belangrijke rol speelt bij de vorming van myofibroblasten. Zowel IL1β en CAPE bleken de expressie van GLI1 te onderdrukken. De expressie van GLI1 staat onder controle van GLI2. Voor de expressie van GLI2 is de aanwezigheid van SMAD3 in de celkern noodzakelijk. De aanwezigheid van CAPE zorgt er inderdaad voor dat SMAD3 verlaagd tot expressie komt, en minder naar de celkern migreert. Hoewel de expressie van GLI2 en SMAD3 voor IL1β niet onderzocht is, lijkt het aannemelijk dat ook hier eenzelfde mechanisme een rol speelt. Voor ACHP kan mogelijk hetzelfde gezegd worden: we hebben aangetoond dat ACHP, evenals CAPE, de expressie van SMAD3 remt, alsmede de migratie van SMAD3 naar de celkern. In onze studies met IL1β, ACHP and CAPE hebben we huidfibroblasten met longfibroblasten vergeleken. We hebben geconstateerd dat TGFβ1 over het algemeen dezelfde profibrotische reactie teweeg brengt. Echter, beide fibroblast typen reageren in 171
verschillende opzichten nogal anders in de aanwezigheid van IL1β, ACHP of CAPE. Zo kan het dus zijn, dat een remmer dat werkt voor huidfibroblasten, een tegenovergestelde werking heeft voor longfibroblasten. Deze heterogeniteit in fibroblast typen dient in ogenschouw te worden genomen in vervolgstudies. Ook dient aandacht te worden geschonken aan de juiste kweekcondities. Het geconditioneerd medium van stamcellen liet een afname zien in de synthese van collageen in humane fibroblasten. Deze bevinding was in tegenspraak met een tiental eerder gepubliceerde studies van andere onderzoeksgroepen, dat het tegenovergestelde liet zien. In geen van deze studies was echter Vitamine C aan het kweekmedium toegevoegd. Vitamine C is noodzakelijk om collageen te kunnen maken; de mens kan geen Vitamine C maken en dient dus als supplement aan het kweekmedium te worden toegevoegd. Geen van de resultaten van de eerder gepubliceerde studies zijn daarom te vertrouwen. Het is vreemd dat zoiets basaals niemand is opgevallen. Onze studies laten verder zien, dat er grote verschillen kunnen zijn tussen wat we zien op genexpressie niveau (mrna waarden) en daadwerkelijke eiwitsynthese. Zo zagen we soms een verhoging van de genexpressie van collageen, terwijl er uiteindelijk toch geen collageen eiwit werd aangemaakt. Omdat het kenmerk van fibrose een opstapeling is van het eiwit collageen, dient altijd de synthese van het eiwit zelf te worden onderzocht om juiste conclusies te kunnen trekken omtrent de werkzaamheid van remmers. Om tot een volwaardig collageen molecuul te komen, dienen verschillende enzymen op het molecuul te kunnen inwerken. Als een van deze enzymen ontbreekt, kan het zijn dat er geen collageen wordt geproduceerd. Bij onze studies hebben we systematisch de expressie van PLOD2 onderzocht. In alle situaties waarin geen collageen werd gevonden (aanwezigheid van IL1β, ACHP, CAPE, of geconditioneerd medium van foetale stamcellen) bleek de expressie van PLOD2 sterk verhoogd te zijn. Waarom dit zo is weten we niet; de afwezigheid van collageen kan in ieder geval niet toegeschreven worden aan een afwezigheid van lysyl hydroxylase 2, want dit enzym was in ruime mate aanwezig. Tenslotte hebben we onderzocht of er een verschil is in de pro-fibrotische reactie van fibroblasten als ze blootgesteld worden aan TGFβ1 of TGFβ3. Van TGFβ3 wordt aangenomen, dat ze een remmende werking heeft op fibrose in vivo. Echter, fibroblasten die in vitro aan TGFβ3 worden blootgesteld hebben een vergelijkbare pro-fibrotische reactie als TGFβ1. Dit is zowel het geval bij neonatale fibroblasten als bij adulte fibroblasten. Het is duidelijk dat de context waarin fibroblasten zich bevinden ook een belangrijke rol speelt hoe ze zich gedragen tegenover bepaalde stimuli. We concluderen dat er nog een lange weg te gaan is voor we een medicijn in handen hebben dat werkzaam is onder alle condities en in alle orgaansystemen. Met onze studies zijn weer een aantal stapjes in de goede richting gezet. 172
173