On the mechanism of prokaryotic glutamate transporter homologues Groeneveld, Maarten

Transcriptie

1 University of Groningen On the mechanism of prokaryotic glutamate transporter homologues Groeneveld, Maarten IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below. Document Version Publisher's PDF, also known as Version of record Publication date: 2010 Link to publication in University of Groningen/UMCG research database Citation for published version (APA): Groeneveld, M. (2010). On the mechanism of prokaryotic glutamate transporter homologues Groningen: s.n. Copyright Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons). Take-down policy If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim. Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum. Download date:

2 Nederlandsesamenvattingvoorgeïnteresseerdenbuitendit vakgebied 107

3 Korteinleiding Alle leven om ons heen is opgebouwd uit een of meerdere cellen. De kleinste levensvormen zoals bacteriën bestaan slechts uit een enkele cel, terwijl de gemiddelde mens(behorendetotdeeukaryoten)opgebouwdisuitruwweg65.000miljardcellen.elke cel wordt omgeven door een vettig membraan, dat er voor zorgt dat de binnen en buitenkant van de cel van elkaar gescheiden blijven. Dit membraan is semipermeabel; watereninvetoplosbaredeeltjeskunnenvrijelijkhetmembraanpasseren,maargeladen en grote deeltjes kunnen dit niet. Hierdoor kunnen belangrijke bouwstoffen niet zondermeer de cel binnenkomen, terwijl moleculen die de cel juist kwijt wil niet zomaar naarbuitenkunnen.omhiermeeomtegaanisereengrotegroepverschillendeeiwitten in deze membraan te vinden, die als sluizen tussen de binnen en buitenkant van de cel fungeren,enselectiefmoleculennaarbinnenhalenofnaarbuitendrijven(figuur1). Figuur 1: Transport van deeltjes door membraaneiwitten. Deeltjes die vetoplosbaar zijn kunnen zonder problemendemembraanpasseren.groteengeladendeeltjeskunnenditniet.transporteiwittenzorgenervoor datdezedeeltjestochdemembraankunnenpasseren. Hetbelangvanglutamaattransporters In onze hersenen is de communicatie tussen hersencellen van cruciaal belang voor ons eigen functioneren. Voor deze communicatie zijn verschillende signaalmoleculen beschikbaar,waarvanglutamaateenvandebelangrijksteis.ophetmomentdatglutamaat wordt vrijgegeven aan het uiteinde van een signalerende cel (presynaptische cel) in de ruimte tussen cellen (synaps), wordt dit opgemerkt door receptoreiwitten op de ontvangende cel (postsynaptische cel), met als resultaat dat het signaal wordt doorgegeven.hetisechternoodzakelijkdatnadoorgiftevandeboodschaphetsignaalook weerbeëindigdwordt.ophetmomentdatglutamaatnietsnelgenoegverwijderdwordt uit de synaps kan dit leiden tot schade aan de hersencellen, met verschillende 108

4 aandoeningen als gevolg. De cellen rond de synaps beschikken over specifieke transporteiwitten,glutamaattransporters,dieervoorzorgendatglutamaatuitdesynaps gehaaldwordt,endatdaarmeehetsignaalbeëindigdwordt.omdatglutamaattransporters mogelijk betrokken zijn bij verschillende neurologische aandoeningen, is onderzoek naar hetfunctionerenvandezeeiwittenvangrootbelang. Deze glutamaattransporters zijn niet alleen aanwezig in mensen en andere eukaryote organismen, maar ook simpele levensvormen zoals bacteriën en archaea (samen prokaryotengenoemd)hebbenhuneigenvariantenvandezeeiwitten.indezeeencellige organismen worden glutamaattransporters niet gebruikt in signaaloverdracht zoals dat in menselijke hersenen het geval is, maar zorgen ze ervoor dat glutamaat en andere belangrijke bouwstoffen uit de leefomgeving worden opgenomen. Naast glutamaattransporters zijn er in bacteriën eiwitten aanwezig die sterk lijken op glutamaattransporters(homologen),maardiebijvoorbeeldaspartaat,serine,threonineen verschillende moleculen uit de citroenzuurcyclus kunnen opnemen. Alhoewel glutamaattransporters in bacteriën een andere functie hebben dan dat ze in mensen hebben, is de opbouw van de verschillende eiwitten vergelijkbaar, en zitten op de belangrijke punten in de eiwitten dezelfde aminozuren ingebouwd. Bacteriële cellen zijn echtervelemalengemakkelijkertehanterenineenbiochemischlabdanmenselijkecellen. Ook zijn er verschillende technieken ontwikkeld om in bacteriën eiwitten in grote hoeveelheden te produceren, deze daarna uit de bacteriën te zuiveren en in een kunstmatigmembraansysteem(liposoom)terugteplaatsenentekarakteriseren.daarom worden bacteriële eiwitten vaak als modelsystemen gebruikt om de werking van menselijkeeiwittenteverklaren. Figuur 2: Bovenaanzicht van de aspartaattransporter Glt Ph van Pyrococcus horikoshii. Te zien zijn de verschillendekopieëninzwart,donker enlichtgrijs.plaatjeaangepastnaaryernooletal(referentie121). 109

5 Devissenkom Recentelijkisdekristalstructuurvaneenglutamaattransportervariantopgehelderd.Deze aspartaattransporter uit het thermofiele organisme Pyrococcus horikoshii vormt een vissenkomindecelmembraan,waarbijdekomisopgebouwduitdriekopieënvanheteiwit (trimeer) (zie figuur 2). Elke kopie heeft zijn eigen bindingsplaats voor een aspartaatmolecuul,erkunnendustegelijkertijddrieaspartaatmoleculenperkombinden. Eendergelijkekristalstructuurisopzicheennogalstatischgegeven.Daaromwashetnade publicatievandezestructuurooknietdirectduidelijkwaaromdezeeiwittenalseenkomin demembraanaanwezigzijn,enwaaromdezeeiwittentrimerenvormen.devormvande trimeer zou eventueel gunstig kunnen zijn tijdens transport, maar het was ook niet uitgeslotendatdedriekopieënsamenwerkentijdenstransport.ommeerinzichtinderol vandezeopvallendevormtekrijgenisinhoofdstuk2onderzoekbeschrevenwaarinopde plaatsen waar de kopieën dicht bij elkaar in de buurt komen(de interface), deze via een covalentebindingaanelkaarvastgezetzijn.dezebindingisergsterk,enzorgtervoordat de interface tussen de kopieën star is. Mochten de kopieën onderling van vorm moeten veranderen tijdens transport, en daardoor met elkaar communiceren, dan zal het vastzetten van de interface er voor zorgen dat transport slechter of helemaal niet meer verloopt.mochtendekopieënlosvanelkaarwerken,danzalhetvastzettengeeninvloed hebben. Uit hoofdstuk 2 is duidelijk gebleken dat het vastzetten van de interface geen invloedheeftoptransport.waaromheeftditeiwitdanzo nopvallendevorm?doordathet kommetje voor 50% de membraan insteekt, is de afstand die het molecuul door de membraanmoetafleggeneenstukkleinergeworden.ditkaneventueelgunstigzijntijdens transport. Daarom lijkt het er op dat de vorm die het eiwit heeft aangenomen een voordeelopleverttijdenstransport,maardatdedriekopieënverdernietsamenwerken. Deglutamaattransporterfamilie:hoeenwat Omdat glutamaattransporters een belangrijke rol in de hersenen hebben, heeft het onderzoekzichdelaatstedecenniasterkgerichtopglutamaattransporters,ennietopde overige familieleden die andere moleculen transporteren. Toch is onderzoek naar deze andere transporters belangrijk, omdat dit verdere informatie kan verschaffen over het mechanismevantransport,enoverhoehetkandatheteneeiwitglutamaattransporteert, terwijl het andere eiwit, wat er sterk op lijkt, een ander molecuul transporteert. Daarom zijn in de hoofdstukken 3 en 5 experimenten beschreven waarin belangrijke eigenschappen van 2 bacteriële glutamaattransporters, en 2 glutamaattransporter familieleden zijn omschreven. Elk eiwit blijkt maar een zeer beperkt aantal moleculen te herkennen.erisgekekennaarhoesneldezemoleculenwordengetransporteerd,ennaar hoesterkdetransportersdemoleculenkunnenbinden. 110

6 Glutamaattransporters zijn zogenaamde secundaire transporters. Dit houdt in dat de energiedieligtinhetverschilinconcentratieaandebinnen enbuitenkantvandecelvan bijvoorbeeld natrium ionen of protonen gebruikt wordt tijdens transport. Bacteriële glutamaattransporters gebruiken het concentratieverschil van protonen als energiebron. Per glutamaatmolecuul gaat een vast aantal protonen mee naar binnen. Met een groot verschil in de protonenconcentratie (buiten meer dan binnen) kan meer glutamaat getransporteerd worden dan met een klein verschil. Menselijke transporters maken gebruikvaneenverschilinconcentratievanzowelnatriumenkaliumionenenprotonen. Er is in hoofdstuk 3 en 5 gekeken naar welke ionen er gebruikt worden door de verschillende bacteriële eiwitten, en wat de invloed is van de grootte van het concentratieverschilaandebinnen enbuitenkantvaneenliposoom. Tweeofdrienatriumionen? Menselijketransportersgebruikendusonderanderenatriumionenomhettransportvan glutamaattedrijven.uitonderzoekisgeblekendatdezeeiwittenperglutamaatmolecuul tegelijkertijd drie natrium ionen naar binnen transporteren. Dit betekent dus ook dat er drieplaatseninheteiwitmoetenzijnwaarnatriumkanbinden.indekristalstructuurvan deaspartaattransportervanpyrococcushorikoshiikondentotdusverremaartweeplaatsen wordenaangewezenwaareennatriumionkanbinden,terwijlindeopbouwdezeeiwitten tochzoveelopelkaarlijken.devraagwasdusofhetpyrococcuseiwitmaartweenatrium ionen per aspartaat gebruikt, of dat er, net als in menselijke eiwitten, toch drie worden gebruikt.inhoofdstuk4zijnexperimentenbeschrevenwaarmeehetaantalnatriumionen isbepaalddatperaspartaatgetransporteerdwordt.eerstisvoordezeproevenheteiwit van Pyrococcus in grote hoeveelheden geproduceerd, gezuiverd, en teruggezet in een kunstmatigeliposoom.daarnaisgekekenhoeveelaspartaatenhoeveelnatriumernaeen bepaaldetijdindeliposoomterechtgekomenis(figuur3).hierbijisgebruikgemaaktvan radioactief aspartaat en radioactief natrium, wat door de radioactiviteit gemakkelijk te metenis.deratiovandetweemetingengeeftaanhoeveelnatriumionenerperaspartaat gebruiktworden.uitdemetingenisduidelijkgeblekendaterperaspartaatmolecuuldrie natriumionenmeegetransporteerdworden.daarinlijktheteiwitvanpyrococcusdussterk op menselijke eiwitten. Wel betekent het dat er ergens in de kristalstructuur nog een derdepositiemoetzittenwaareennatriumionkanbinden. 111

7 Figuur3:TransportvanaspartaatennatriumdoordeaspartaattransportervanPyrococcushorikoshii.Nadathet eiwitingrotehoeveelhedengeproduceerdis,wordthetgezuiverd,enteruggezetineenkunstmatigmembraan (liposoom).dooraandebuitenkantvandemembraaneengrotehoeveelheidnatriumionentehebben(na),en aandebinnenkantweinignatriumionen,wordtereengradientgecreëerddiehettransportvanaspartaat(asp) kandrijven.doornatriumenaspartaattegebruikenwatradioactiefis,kandehoeveelheidnatriumenaspartaat aandebinnenkantvandeliposoomgemetenworden. Eengroeneiwitalsmaatvoorkwaliteit Membraaneiwittenzijn,zelfsvoordedoorgewinterdebiochemicus,relatieflastigommee tewerken.verschillendeproblemenstekendekopopophetmomentdatwetenschappers dezeeiwitteningrotehoeveelheidwillenproduceren.demachineriedieervoorzorgtdat de eiwitten op een goede manier in de membraan terecht komen, raakt snel overbelast. Ook door hun specifieke eigenschappen, membraaneiwitten moeten stabiel zijn in het vettige membraan van de cel en zijn daarom sterk hydrofoob (watervrezend), zorgen ervoordatoverproductievanmembraaneiwittenvaakfoutgaat.ditleidtdantotverkeerd gevouwen, niet functionele eiwitten, die ofwel aggregeren (samenklonteren) of worden afgebrokendoordecel. Omnategaanwatertijdensoverproductiemeteenmembraaneiwitgebeurt,staaterin hoofdstuk 6 een algemene methode omschreven waarmee bepaald kan worden of eiwit goedgevouwenenfunctioneelis,ofmisvouwenennietfunctioneel.daarbijwordtgebruik gemaakt van het groen fluorescente eiwit GFP (green fluorescent protein). GFP is, mits goedgeproduceerd,nietalleenzeerstabiel,maarooknogeensfelgroen.eerderonderzoek hadalaangetoonddatwanneergfpgekoppeldzitaaneentweedeeiwit,enditfusie eiwit wordt geproduceerd, GFP een indicator is voor de kwaliteit van het eiwit waaraan het gekoppeld is. Op het moment dat GFP groen fluorescent is, is het gekoppelde eiwit ook goedgevouwen.ophetmomentdatgfpnietgroen fluorescentis,ishetandereeiwitook niet functioneel. In hoofdstuk 6 wordt gedemonstreerd dat goed gevouwen eiwit 112

8 gekoppeldaangfpgescheidenkanwordenvanverkeerdgevouweneiwitmetbehulpvan eeneiwitanalysegel.opdezemanierkanbepaaldwordenhoeefficientdeeiwitproductie is. Met verschillende ingrepen (langzamere productie, andere groei temperatuur, ander groeimediumetc.)kandeproductiedusdanigbeïnvloedwordendatermeergoedgevormd eiwit wordt aangemaakt. Met de simpele methode beschreven in hoofdstuk 6 kan een grootaantalconditiesgetestwordentotdatereenoptimaleconditiegevondenisvoorhet specifiekeeiwitwaarindeonderzoekergeïnteresseerdis. Samenvattend staan in dit proefschrift verschillende experimenten omschreven waarin belangrijke karaktereigenschappen van prokaryote glutamaattransporters en glutamaattransporterhomologenzijnonderzocht.ondankshetfeitdatertochduidelijke verschillen zijn aan te wijzen tussen bacteriële en archaeale eiwitten aan de ene, en eukaryoteeiwittenaandeanderekant,isuitditproefschriftgeblekendateenpaarvande belangrijkste eigenschappen overeenkomen. De uitdaging is nu om aan de hand van de driedimensionale kristalstructuur uit te leggen hoe de verschillen tussen de eiwitten veroorzaaktworden. 113

9 114