University of Groningen Experimental studies on dietary fibers Sahasrabudhe, Neha Mohan IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below. Document Version Publisher's PDF, also known as Version of record Publication date: 2016 Link to publication in University of Groningen/UMCG research database Citation for published version (APA): Sahasrabudhe, N. M. (2016). Experimental studies on dietary fibers: Pattern recognition receptor interactions [Groningen]: University of Groningen Copyright Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons). Take-down policy If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim. Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum. Download date: 14-10-2017
I Nederlandse samenvatting
Bepaalde ziekten zoals diabetes, cardiovasculaire aandoeningen, en chronische inflammatoire darmziekten komen vaker voor in de westerse wereld. Het ontbreken van belangrijke koolhydraten in het westerse dieet wordt gezien als een mogelijke oorzaak. Het westerse dieet bestaat uit veel bewerkt voedsel, wat minder voedzaam is. Een groter probleem is echter dat dit voedsel minder vezels bevat. Er zijn vele studies die hebben aangetoond dat voedingsvezels een positieve invloed hebben op de gezondheid, zoals het vergroten van het volume van de ontlasting en het bevorderen van een gezonde darmflora. Daarnaast vormen sommige voedingsvezels ook een gel-achtige substantie in de maag, waardoor het hongergevoel afneemt. Het meest bestudeerde effect is de invloed van voedingsvezels op de darmflora. Vezels uit de voeding worden geconsumeerd door bacteriën in de darmen en afgebroken tot immuun-regulerende korte-keten vetzuren. Voedingsvezels kunnen ook de groei stimuleren van bepaalde gezonde bacteriën, terwijl de groei van pathogene bacteriën wordt geremd. Daarnaast kunnen sommige voedingsvezels, zoals bijvoorbeeld inuline, ook direct interacties aangaan met receptoren betrokken bij activatie van het immuunsysteem. Deze receptoren worden pattern recognition receptoren (PRRs) genoemd. Samenvattend kunnen we dus stellen dat voedingsvezels invloed kunnen uitoefenen op het immuunsysteem via de darmflora, maar ook d.m.v. directe interacties met immuunreceptoren. Momenteel is er nog weinig bekent over de directe interacties tussen voedingsvezels en immuunreceptoren. Het immuunsysteem in de darmen is het grootste immuunsyteem van het hele menselijke lichaam. Het bevat ongeveer 70% van het totale aantal immuuncellen. In hoofdstuk 1 hebben we de verschillende mechanismen beschreven die ten grondslag liggen aan het behouden van een gezonde balans tussen de darmflora en het immuunsysteem in de darmen. Een van de factoren die een rol spelen bij de regulatie van het immuunsysteem zijn de PRRs. Toll-like receptoren (TLRs) zijn de meest bestudeerde PRRs en zijn te vinden in darmepitheelcellen en ook in immuuncellen. TLRs herkennen structuren van bacteriën, virussen, en ook bepaalde componenten van het eigen weefsel. Na herkenning van deze structuren door TLRs wordt het aangeboren immuunsysteem geactiveerd. In de darmen van een gezond persoon zorgen TLRs echter voor een reductie van immuunactivatie door het initiëren van regulatoire responsen. Daarnaast komen TLRs verminderd tot expressie in de darmepitheelcellen om immuunactivatie te beperken. Naast TLRs zijn er nog andere PRRs, zoals bijvoorbeeld Dectin-1. Deze receptor kan interacties aangaan met de voedingsvezel β-glucaan. Dectin-1 speelt een rol in verscheidende processen, waaronder antigeen presentatie en regulatie van inflammatie. Sommige structuren worden herkend door een enkele PPR, maar er zijn ook structuren die herkend worden door een combinatie van PRRs. Bijvoorbeeld TLR2 kan een combinatie vormen met TLR1 of TLR6. De combinatie TLR2-TLR1 induceert een inflammatoire respons, Page 176
Nederlandse samenvatting terwijl TLR2-TLR6 een regulatoire respons teweeg brengt. Er zijn ook aanwijzingen dat een combinatie van Dectin-1 en TLR4 het immuunsysteem kan activeren. Of deze combinatie van receptoren ook een rol speelt in de herkenning van β-glucaan is niet bekend. PRRs vormen de frontlinie van afweermechanismen tegen inkomende vreemde moleculen in de darmen. Het valt dus te verwachten dat ook voedingsvezels interacties aangaan met PRRs. Wij hebben de directe immuunmodulerende effecten bestudeerd van voedingsvezels afkomstig van graanproducten, zoals β-glucaan, arabinoxylaan, en pectine. Deze voedingsvezels zijn goedkoop te verkrijgen en kunnen worden toegepast in het voedsel voor zowel dieren als mensen. Het gebruik van voedingsvezels in voer voor dieren is bestudeerd om het immuunsysteem te stimuleren, waardoor er minder antibiotica aan de dieren gegeven zou hoeven worden. Een beter begrip van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de immuunmodulerende effecten van voedingsvezels zal bijdragen aan de ontwikkeling van voedsel voor dier en mens waarmee het immuunsysteem op de gewenste manier beïnvloed kan worden. In hoofdstuk 2 hebben we de immuunmodulerende effecten van β-glucaan geïsoleerd uit haver geanalyseerd. Er is eerder aangetoond dat deze voedingsvezel immuunmodulerende effecten heeft in vivo. Echter had haver β-glucaan weinig effecten op immuuncellen in in vitro experimenten. Zoals hierboven beschreven kunnen voedingsvezels worden afgebroken door darmbacteriën. Daarom hebben we onderzocht of enzymen afkomstig van deze bacteriën de invloed van haver β-glucaan op immuuncellen kan vergroten. In hoofdstuk 2 laten we zien dat het enzym endoglucanase de immuunstimulerende werking van haver β-glucaan verhoogt. Om het onderliggende mechanisme verder te onderzoeken, hebben we de interacties bestudeerd tussen Dectin-1 en haver β-glucaan behandeld met of zonder endoglucanase. Dectin-1 is een receptor specifiek voor de β(1-3) verbindingen van β-glucaan. De activiteit van Dectin-1 kan worden verhoogd door β-glucaan in de vorm van deeltjes en niet door oplosbaar β-glucaan. Om te bevestigen dat endoglucanase de activiteit van β-glucaan verhoogt door de grootte van de deeltjes te veranderen, hebben we de grootte van β-glucaan deeltjes gemeten na behandeling met of zonder endoglucanase. De grootte van de β-glucaan deeltjes was inderdaad kleiner na endoglucanase behandeling. Bovendien had behandeld β-glucaan meer beschikbare β(1-3) verbindingen. We laten dus zien dat de verhoogde immuunstimulatie van β-glucaan na behandeling met het enzym endoglucanase wordt veroorzaakt door een verkleinging van de grootte van de β-glucaan deeltjes en door een verhoogde beschikbaarheid van β(1-3) verbindingen aan het oppervlak van de β-glucaan deeltjes. Deze structurele modificaties kunnen gebruikt worden voor het maken van immuunstimulerende β-glucaan voedingsvezels. I Page 177
Graan bevat vele verschillende voedingsvezels en één van de meest voorkomende voedingsvezels in graan is arabinoxylaan. Van deze voedingsvezel is het ook bekend dat het immuunmodulerende activiteit heeft in vitro. Aangezien arabinoxylaan een chemische structuur heeft die erg lijkt op β-glucaan, was onze hypothese dat arabinoxylaan ook interacties kan aangaan met PRRs. In hoofdstuk 3 laten we zien dat arabinoxylaan Dectin-1 kan activeren. Zoals eerder beschreven, wordt de Dectin-1 receptor verschillend geactiveerd door β-glucaan in oplosbare vorm of in de vorm van deeltjes. Dectin-1 activatie door arabinoxylaan was vergelijkbaar met oplosbaar β-glucaan. Bovendien kon arabinoxylaan de interactie tussen β-glucaan deeltjes en Dectin-1 beïnvloeden in reporter cellijnen en in humane Dendritische cellen. We laten dus zien dat de Dectin-1 receptor meer structuren kan herkennen dan alleen β-glucaan en dat goedkope voedingsvezels zoals arabinoxylaan gebruikt kunnen worden om het immuunsysteem te beïnvloeden. Het feit dat zowel β-glucaan als arabinoxylaan interacties kunnen aangaan met Dectin-1 suggereert dat in vivo beide voedingsvezels concurreren om te binden aan de Dectin-1 receptor. Daarom is het wellicht mogelijk om de invloed op het immuunsysteem te veranderen door de ratio tussen de twee voedingsvezels aan te passen in de voeding. Zoals reeds vermeld wordt de Dectin-1 receptor geactiveerd door β-glucaan deeltjes, maar niet door oplosbaar β-glucaan. In hoofdstuk 4 demonstreren we dat dit verschil wellicht veroorzaakt wordt door een verschil in synergie tussen Dectin-1 en TLR4. Het was al bekend dat een combinatie van Dectin-1 en TLR4 activatie door β-glucaan en de TLR agonist LPS zorgt voor een synergie in cytokineproductie door monocyten. Beide receptoren waren nodig voor een immuunrespons tegen de pathogene schimmel Candida albicans en muizen zonder functioneel TLR4 waren gevoeliger voor infectie met deze schimmel. Het was dus al bekend dat er synergie kan optreden tussen Dectin-1 en TLR4, maar of deze combinatie ook een rol speelt in de herkenning van β-glucaan was nooit onderzocht. Om de synergie tussen Dectin-1 en TLR4 verder te onderzoeken hebben we reporter cellijnen gemaakt die de Dectin-1 varianten Dectin-1A of Dectin-1B tot expressie brengen in combinatie met TLR4. β-glucaan deeltjes konden inderdaad de combinatie van Dectin-1 en TLR4 activeren wat leidde tot een synergie in immuunstimulatie. In experimenten met humane Dendritische cellen gaf het blokkeren van TLR4 juist een hogere immuunstimulatie. Deze resultaten tonen aan dat β-glucaan deeltjes zowel Dectin-1 als TLR4 activeren, waarbij TLR4 stimulatie leidt tot inductie van regulatoire responsen. De Dectin-1 varianten lieten verschillende synergistische responsen zien na stimulatie met oplosbaar β-glucaan. Dectin-1A-TLR4 werd synergistisch geactiveerd door oplosbaar β-glucaan, maar Dectin-1B-TLR4 niet. Het feit dat er geen synergie was tussen Dectin-1B en TLR4 na stimulatie met oplosbaar β-glucaan zou kunnen bijdragen aan de verminderde immuunstimulerende activiteit van oplosbaar β-glucaan in Page 178
Nederlandse samenvatting vergelijking met β-glucaan deeltjes. In dit proefschrift (hoofdstuk 2, 3, en 4) hebben we drie verschillende mechanismen beschreven hoe β-glucanen het immuunsysteem kunnen beïnvloeden. We hebben laten zien dat immuunstimulatie door β-glucaan kan worden verhoogd door afbraak door de darmflora in vivo. Daarnaast kan het immuunmodulerende effect van β-glucaan beïnvloed worden door andere voedingsvezels zoals arabinoxylaan. Het derde mechanisme wat een rol speelt in het immuunmodulerende effecten van β-glucaan is de synergie tussen verschillende PRRs. Dus hoewel het immuunstimulerende effect van β-glucaan goed gedocumenteerd is, kan het uiteindelijke effect op het immuunsysteem afhangen van verschillende mechanismen. Om het verband tussen voedingsvezel structuur en interactie met PRRs verder te onderzoeken, hebben we onze aandacht gericht op citroen pectine. Deze voedingsvezel kan verkregen worden met een verschillende graad van methyl esterificatie hoeveelheden (DM). Daarom is dit molecuul een goed model om te onderzoeken hoe verschillen in de chemische structuur de binding aan PRRs beïnvloeden. Eerst bekeken we of pectine interacties kon aangaan met PRRs en we ontdekten dat pectine de activiteit van TLR2 kon blokkeren. Bovendien was de inhibitie afhankelijk van de DM graad van pectine. We hebben laten zien dat laag DM pectine het beste in staat was om TLR2 te blokkeren. De oorzaak van deze inhibitie was binding van pectine aan TLR2. Laag DM pectine kon het beste binden aan TLR2, waarbij we een negatieve correlatie zagen tussen DM graad en binding aan TLR2. Ook in humane Dendritische cellen was pectine in staat om cytokineproductie na TLR2 stimulatie te blokkeren. Zoals hierboven beschreven kan TLR2 verschillende responsen stimuleren afhankelijk van de combinatie die deze receptor vormt met andere PRRs. In hoofdstuk 5 laten we zien dat pectine pro-inflammatoire TLR2- TLR1 activatie blokkeert, maar niet de regulatoire TLR2-TLR6 stimulatie. Dus pectine kon specifiek de pro-inflammatoire respons blokkeren, terwijl de regulatoire respons niet werd beïnvloed. Om de anti-inflammatoire eigenschappen van laag DM pectine te bevestigen in vivo, gebruikten we een muismodel waarbij inflammatie wordt geïnduceerd door toediening van doxorubicine. Eerder was aangetoond dat in dit model inflammatie minder was in muizen die geen functioneel TLR2 hebben. Pectine zorgde voor een vermindering van de symptomen van inflammatie, zoals infiltratie van neutrofielen in het peritoneum en celdood in de crypten van de darmen. Daarnaast was er een vermindering van pro-inflammatoire cytokines in zowel het peritoneum als in het plasma na toediening van pectine. De meest opvallende observatie was dat de mate van onderdrukking van inflammatie door pectine te vergelijken was met een antistof die TLR2 blokkeert. Dit suggereert dat pectine de inflammatie geïnduceerd door I Page 179
doxorubicine verminderde door inhibitie van TLR2. Voedingsvezels zoals pectine worden gefermenteerd door de darmflora waarbij korte-keten vetzuren geproduceerd worden. Om uit te sluiten dat korte-keten vetzuren verantwoordelijk waren voor het remmen van inflammatie, hebben we de concentratie van deze moleculen gemeten in het cecum. Pectine had geen invloed op de concentratie korte-keten vetzuren, wat suggereert dat het anti-inflammatoire effect van pectine afhankelijk was van blokkade van TLR2 en niet door korte-keten vetzuur productie te beïnvloeden. Deze resultaten tonen aan dat het in principe mogelijk is om de interacties tussen PRRs en voedingsvezels toe te passen in vivo als medicijn om het immuunsysteem te sturen in de gewenste richting. Bovendien tonen we aan dat de immuunmodulerende effecten van voedingsvezels zoals pectine gunstig kunnen zijn voor het behouden van de juiste balans in het immuunsysteem in de darmen. Om te begrijpen waarom laag en hoog DM pectine verschillend binden aan TLR2, hebben we het gedeelte van TLR2 waar pectine aan bindt verder onderzocht. In hoofdstuk 6 hebben we bepaalde aminozuren van TLR2 veranderd die mogelijk betrokken zijn bij de binding aan pectine. Alleen laag DM pectine kon aan TLR2 binden. Een mogelijke verklaring hiervoor is dat laag DM pectine een sterk negatieve lading heeft. Daarom was onze hypothese dat de aminozuren betrokken bij de binding van pectine positief geladen zouden moeten zijn. Verder gingen we ervan uit dat de plek waar pectine bindt dicht bij de plek moet zijn waar TLR2 een combinatie vormt met TLR1, aangezien pectine TLR2-TLR1 activatie remde, maar geen TLR2- TLR6 activatie. We selecteerden de positief geladen aminozuren R315, R316, R321, en K347, die werden vervangen door het ongeladen aminozuur glutamine (Q). R321 en K347 waren geselecteerd vanwege hun betrokkenheid in de interactie tussen TLR2 en TLR1. R315 en R316 waren geselecteerd vanwege hun nabijheid tot de plek waar agonisten van TLR2 normaalgesproken binden. We hebben twee mutanten gemaakt: TLR2 RRQQ (R321 en K347 veranderd in Q) en TLR2 QQQQ (R315, R316, R321, en K347 veranderd in Q). We zagen dat laag DM pectine minder goed aan TLR2 RRQQ kon binden in vergelijking met TLR2 QQQQ. Dit verschil was er niet met hoog DM pectine. Deze resultaten bevestigen dat laag DM pectine bind aan TLR2 d.m.v. elektrostatische krachten. Ook zagen we dat hoog DM pectine beter aan de TLR2 mutanten kon binden dan aan normaal TLR2. Blijkbaar heeft de aanwezigheid van het neutraal geladen aminozuur glutamine een positieve invloed op de binding tussen hoog DM pectine en TLR2. Vergeleken met laag DM pectine is hoog pectine meer gestabiliseerd d.m.v. waterstofverbindingen. Mogelijk kan hoog DM pectine beter aan de TLR2 mutanten binden door waterstofverbindingen aan te gaan met deze mutanten. Dit soort onderzoeken naar de plek waar de interactie tussen voedingsvezels en PRRs plaatsvindt kunnen gebruikt worden om specifiek Page 180
Nederlandse samenvatting voedingsvezels te ontwikkelen met de meest efficiënte immuunmodulerende effecten. In dit proefschrift hebben we nieuwe mechanismen ontdekt waarmee voedingsvezels het immuunsysteem kunnen beïnvloeden door interacties aan te gaan met PRRs. Het begrijpen van deze mechanismen is van belang om te kunnen voorspellen wat de immuunmodulerende effecten zullen zijn in vivo. Daarnaast kan deze kennis gebruikt worden voor de ontwikkeling van voeding voor mens en dier met het doel het immuunsysteem op de gewenste manier te sturen. Voedingsvezels kunnen bijvoorbeeld gebruikt worden om het immuunsysteem te stimuleren waardoor er minder antibiotica gebruikt hoeft te worden in de veeteelt. De immuunmodulerende effecten van voedingsvezels kunnen ook gebruikt worden om ziekten te bestrijden die vaker voorkomen bij mensen uit westerse landen. I Page 181
Page 182