Identificatie en karakterisatie van MIC Harmien Verstraete Vanda Branco AVECOM NV - Bioproducts & Apps 3/11/2016 1
AVECOM 1) Onderzoeksprojecten zowel tailor-made onderzoek voor industriële partners als subsidieprojecten Zuivering en valorisatie van proceswater, bodem- en grondwatersanering, corrosie Industrieweg 122P B-9032 Wondelgem www.avecom.be 2) Ontwikkeling en verkoop van BIOPRODUCTS & APPS Anaeroob korrelslib, micronutriënten voor afvalwaterzuiveringsinstallaties, bacteriële inocula voor afbraak grondwaterpolluenten, => Focus op bacteriële TEAMS (microbiomen) 2
Microbieel geïnduceerde corrosie (MIC) Complex fenomeen waarbij micro-organismen direct en/of indirect een bijdrage leveren aan de aantasting van het metaal Verschillende bacteriële processen kunnen corrosie bevorderen: Ijzeroxiderende bacteriën (Fe 2+ Fe 3+ ): ijzerhydroxides, -oxiden (roest) en andere neerslag Sulfaatreducerende bacteriën: produceren S 2- (Fe 2+ FeS), verbruiken H 2 Zuurproducerende bacteriën: H 2 S, organische zuren, CO 2 Methanogene micro-organismen: verbruiken H 2. 3
Detectie en kwantificatie van MIC inzicht in het probleem is noodzakelijk om preventieve en/of remediërende maatregelen te selecteren metingen laten ook toe remediërende maatregelen te evalueren. Combinatie van bacteriële analyses, fysicochemische analyses en inzicht verwerven in het proces/de situatie Fysicochemische analyses: Corrosieproducten Omringend milieu ph, Fe, sulfaat, chloride, organische zuren, Bacteriële analyses: Aanwezigheid, verspreiding en groei van micro-organismen achterhalen 4
Onderzoek van de bacteriële gemeenschap Uitplatingen: conventionele bacteriële tellingen => meer dan 99% van de momenteel gekende bacteriële species kan niet groeien op artificiële media in een laboratorium DNA-gebaseerde analyses: volledige microbiële gemeenschap wordt geanalyseerd! Staal (corrosieproduct, water, bodem, ) DNAextractie Moleculaire analyses (qpcr, NGS, ) 5
Moleculaire analyses MI Europe Samenwerking tussen Avecom en Microbial Insights teneinde de service voor Europese klanten te optimaliseren Snelle en kwalitatief hoogstaande analyses Vertaling naar de praktijk Toepassingsdomeinen: Corrosie Bodem- en grondwatersanering Waterzuivering Hygiene (pathogenen opsporen) Biofilmvorming En meer! 6
Moleculaire analyses Mogelijkheden voor MIC: Quantitative polymerase chain reaction (qpcr) Quant-Array Denaturerende gradient gelelektroforese (DGGE) Next generation sequencing (NGS) 7
Quantitative polymerase chain reaction (qpcr) Quant-Array Denaturerende gradiënt gelektroforese (DGGE) Next generation sequencing (NGS) 8
Quantitative polymerase chain reaction (qpcr) Kwantificatie van specifieke micro-organismen, groepen van micro-organismen of functionele genen Techniek: amplificatie van specifieke genen zodat deze middels fluorescentie meetbaar zijn. => kopieermachine met teller 9
Quantitative polymerase chain reaction (qpcr) Targets in kader van MIC Target Totaal bacteriën Totaal Archaea Sulfaatreducerende bacteriën (SRB) Methanogene microorganismen Zuurproducerende bacteriën - acetogenen Betekenis Algemene evaluatie van de bacteriële groei in het systeem. Archaea vormen een andere algemene groep van ééncellige micro-organismen die kunnen betrokken zijn bij MIC. Vaak betrokken bij putcorrosie. Een functioneel gen dat gelinkt is met sulfaatreductie wordt gekwantificeerd. Kunnen rechtstreeks MIC bevorderen of onrechtstreeks door stimuleren van de groei van andere micro-organismen (bv. SRB of acetogenen) Acetogene bacteriën zijn strict anaeroben die acetaat produceren via de omzetting van CO 2, CO of formiaat. Acetogenese werd reeds aangetoond in hoge druk gasleidingen. 10
Quantitative polymerase chain reaction (qpcr) Targets in kader van MIC Target Ijzeroxiderende bacteriën Mangaanoxiderende bacteriën Archaeoglobus En meer! Betekenis Vaak betrokken in de afzetting van ijzeroxides en de vorming van tubercules. Kunnen net als ijzeroxiderende bacteriën verantwoordelijk zijn voor de afzetting van metaaloxides. Kwantificatie van een specifiek gen van hyperthermofiele, sulfaatreducerende Archaea die MIC kunnen veroorzaken bij hoge temperaturen. 11
Quantitative polymerase chain reaction (qpcr) Te analyseren targets worden bepaald door interpretatie van het probleem en analyse van omgevingsparameters Voordelen: Accuraat Specifiek Snel Gevoelig (lage detectielimieten 0,1 tot 1 cellen per ml) 12
Quantitative polymerase chain reaction (qpcr) Quant-Array Denaturerende gradiënt gelektroforese (DGGE) Next generation sequencing (NGS) 13
Quant-Array MIC Simultane kwantificatie van een brede range aan microorganismen die betrokken kunnen zijn bij MIC Steunt op de qpcr techniek 14
Quantitative polymerase chain reaction (qpcr) Quant-Array Denaturerende gradiënt gelelektroforese (DGGE) Next generation sequencing (NGS) 15
Pearson correlation [0.0%-100.0%] bactn bactn Denaturerende gradiënt gelelektrophorese (DGGE) Genereert een genetisch profiel of vingerafdruk van een microbiële gemeenschap Mogelijkheden: Opvolging van microbiële gemeenschappen in de tijd Vergelijking van de microbiële gemeenschap in stalen van verschillende locaties/behandelingen Onderzoek van de respons van een microbiële gemeenschap op wijzigingen in processen/omgevingsparameters Identificatie van dominante micro-organismen in een microbiële gemeenschap 16-50 0 50 100. 10N. 10O. 38N. 38O. 7N. 7O. 25N. 25O. 36N. 36O. 37N. 37O. 19N. 19O. 51N. 51O. 54O. 54N. 54.3. 54.1. 54.2. 51.2. 51.1. 51.3
Denaturerende gradiënt gelelektrophorese (DGGE) Techniek: Amplificatie scheiding van 16S rrna genfragmenten op een gel met een denaturerende gradiënt Identificatie van drie bandjes door middel van sequencing Detectie van species die meer dan 1% van de bacteriële gemeenschap uitmaken (hogere detectielimiet dan andere moleculaire analyses) Verschillende types DGGE: Bacteriën Fungi Sulfaatreducerende bacteriën 17
Quantitative polymerase chain reaction (qpcr) Quant-Array Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) Next generation sequencing (NGS) 18
Next generation sequencing (NGS) Identificatie van de verschillende spelers in een microbiële gemeenschap tot op genus-niveau. Zowel de functionele species als de ondersteunende species worden in kaart gebracht. Mogelijkheden Opvolging van microbiële gemeenschappen in de tijd Vergelijking van de microbiële gemeenschap in stalen van verschillende locaties/behandelingen Onderzoek van de respons van een microbiële gemeenschap op wijzigingen in processen/omgevingsparameters Identificatie van de micro-organismen in de volledige microbiële gemeenschap Selectie van targets voor monitoring door middel van Q-PCR 19
Next generation sequencing (NGS) 20
TAKE HOME MESSAGES Corrosie is vaak gelinkt met bacteriële activiteit! Gerichte analyses van fysicochemische condities EN de bacteriële gemeenschap zijn aangewezen om remediërende en preventieve maatregelen te selecteren Bacteriële gemeenschap: DNA-gebaseerde methodes nu ook beschikbaar voor onderzoek van corrosie. => volledige microbiële gemeenschap wordt bekeken. 21
DANK VOOR UW AANDACHT VRAGEN???? Voor meer info: harmien.verstraete@avecom.be www.avecom.be 22