152 N e d e r la n d s e s a m e n v a t t in g Het menselijke lichaam bestaat naar schatting uit 65.000.000.000.000 cellen, die allemaal een sp ecif ieke taak en/o f f unctie hebben. Co mmunicatie tussen cellen o nderling als mede gro eif acto ren in de lichaamsv lo eisto f f en (bijv o o rbeeld in het blo ed) gene reren signalen die, o nder andere, bep alen w elke taak o f f unctie een cel heef t en o f een cel z ich mag delen. A ls cellen niet reageren o p die signalen o f als de signalen niet go ed v ertaald w o rden kan dit leiden to t o nge co ntro leerde celdeling w at uiteindelijk kan resulteren in kanker. S ignalen die celgro ei stimuleren o f remmen, mo eten v an buiten de cel getransp o rteerd w o rden naar binnen o v er het celmembraan. D at membraan, o o k w el p lasmamembraan geno emd, bestaat uit lip iden (v etten) en eiw itten, en v o rmt een barriè re die de inho ud v an de cel scheidt v an het ex terne milieu. In het celmembraan bev inden z ich recep to ren die signalen uit hun o mgev ing o p v angen en dit v ia een cascade v an signaalmo leculen in de cel do o rgev en naar, o nder andere, de celkern w aar sp ecif ieke genen o p het D N A aan o f uit w o rden geschakeld. D it kan leiden to t een resp o ns, bijv o o rbeeld celdeling. E en v eel v o o rko mende manier v an signaalo v erdracht is het mo dif iceren v an signaalmo leculen met een o f meer f o sf aatgro ep en, w at f o sf o ry lering w o rdt geno emd. Z o w el eiw itten (p ro teinen) als lip iden kunnen gef o sf o ry leerd w o rden do o r sp ecif ieke enz y men, kinases geno emd. In dit p ro ef schrif t is o nderz o ek gedaan naar diacy lgly cero l kinase (D G K ) dat een f o sf aatgro ep ko p p elt aan het lip ide diacy lgly cero l (D A G ) w aarbij f o sf atidez uur (P A ) o ntstaat. D G K is een enz y matische schakel in een signaalo v erdracht cascade dat begint met de recep to r- gemedieerde activ ering v an een enz y m (f o sf o lip ase C) dat een lip ide in de celmembraan (f o sf atidy lino sito l- bisf o sf aat, P IP 2) klief t w aar - bij D A G gev o rmd w o rdt. E en v o o rbeeld v an een signaal o v erdracht cascade w aarin D G K een ro l sp eelt is geïllustreerd in F iguur 1. D A G is een signaalmo lecuul dat
153 Fig 1. Positie van DGK in een signaal overdracht cascade. meerdere eiwitten kan activeren, waaronder protein kinase C (PKC), en speelt een rol in celdeling, differentiatie (celspecialisatie) en celmorfologie. O ok het DGK product, PA, kan meerdere eiwitten activeren, maar het is niet bekend in welke processen in het lichaam het een rol speelt. In gist is aangetoond dat PA een rol speelt bij het reguleren van specifieke genen. DGK regelt dus de hoeveelheid van twee verschillende signaalmoleculen, DAG en PA. Het belang van een goede regulatie van DAG en PA wordt benadrukt door het grote aantal verschillende subtypen (isovormen) van DGK; bij de mens zijn dat er tien. Dit onderzoek is gefocuseerd op twee DGK isovormen: DGK (theta) en DGK (zeta). Een overzicht van de literatuur over DGK en DGK is beschreven in Hoofdstuk 1.
154 In Hoofdstuk 2 is bestudeerd welke domeinen binnen het DGK molecuul belangrijk zijn voor het efficië nt fosforyleren van DAG. DGK is opgebouwd uit een aantal domeinen, waaronder drie cysteine-rijke domeinen waarvan wordt gedacht dat het DAG bindt en een domein dat verantwoordelijk is voor de enzymatische (kinase) acti viteit. Het derde cysteine-rijke domain van DGK is verlengd met 15 aminozuren (bouwstenen van eiwitten), wat geconserveerd is (d.w.z. een vergelijkbare structuur heeft) in alle DGKs. Geconserveerde aminozuren binnen deze verlenging bleken essentieel te zijn voor DGK activiteit. M ogelijk speelt de verlenging van het cyteine-rijke domein een rol bij het presenteren van DAG aan het kinase domein. Daarnaast is gebleken dat het verwijderen van zelfs een klein gedeelte van DGK de DGK activiteit al drastisch verlaagt. Het grote effect op de activiteit duidt er op dat het complete eiwit nodig is voor de correcte vouwing van DGK of dat alle domeinen nodig zijn voor interacties met andere eiwitten die DGK activiteit kunnen regelen. Het werk dat is beschreven in de overige hoofdstukken van dit proefschrift is een gevolg van onze ontdekking dat het DGK isotype bleek te binden aan het R etino blastoma eiwit (pr B ). Hoofdstuk 3 is een in leiding over pr B en de pr B - gerelateerde eiwitten p107 en p13 0. pr B is een tumor-suppressor eiwit en is een belangrijke schakel die celdeling onderdrukt. In tumoren is pr B of een ander signaalmolecuul in de pr B signalering cascade gemuteerd, waardoor de celdeling niet meer geremd wordt. Naast het reguleren van celdeling is pr B betrokken bij celdifferentiatie. In Hoofdstuk 4 wordt beschreven dat DGK aan zowel pr B, p107 als p13 0 kan binden. Deze binding verhoogt de activiteit van DGK. Daarnaast toonden we aan dat DGK een rol speelt in pr B -signalering. B estraling van cellen (en tumoren) leidt tot DNA schade welke hersteld moet worden voordat de celdeling kan starten. De daartoe benodigde blokkering van de celcyclus is afhankelijk van pr B. Dit werd duidelijk omdat cellen die afkomstig waren van muizen waaruit het pr B gen verwijderd is, zogenaamde pr B -deficië nte cellen, na bestraling niet stopten zich te delen. Overexpressie (verhoogd produ ceren) van actief DGK in pr B -deficië nte cellen daarentegen, herstelt de blokkering van de celdeling na bestraling. DGK activiteit is daarbij essentieel, aangezien cellen waarin een enzymatisch-inactief DGK tot overexpressie is gebracht wel door blijven delen na bestraling. DGK overexpressie heeft geen effect op de blokkering van de celcyclus na bestraling in pr B -positieve cellen. Een mogelijke verklaring hiervoor is dat in pr B -deficië nte cellen een verhoogde hoeveelheid R as (een klein schakel-eiwit) aanwezig is waarvan bekend is dat het celdeling stimuleert. DGK kan R as signalering remmen doordat het DAG wegneemt, en daarmee voorkomt dat DAG een R as activator (R as-gr P) kan activeren. Over expressie van DGK in pr B -deficië nte cellen zou R as signalering kunnen onderdrukken waardoor de celdeling niet gestimuleerd wordt en de cellen na bestraling wel stoppen met delen. Net als DGK heeft DGK een katalytisch domein en twee cysteine-rijke domeinen. Daarnaast bevat DGK een M AR CKS domein, dat homoloog is aan (sterk lijkt op) een gedeelte van het myristoylated alanine-rich C-kinase substrate (M AR CKS) eiwit. Het M AR CKS domein van DGK wordt gefosforyleerd door PKC, wat de acti-
155 viteit van DGK reduceert. prb bindt aan het MARCKS domein van DGK en daarom is in Hoofdstuk 5 bestudeerd of PKC de binding tussen prb en DGK regelt. PKC remt inderdaad de binding tussen DGK en prb door de MARCKS domein van DGK te fosforyleren. Ook van PKC bestaan diverse isovormen, waarvan met name PKC de binding tussen prb en DGK bleek te remmen. Door de binding tussen prb en DGK te verbreken stimuleert PKC zijn eigen activatie. prb binding aan DGK stimuleert namelijk DGK activiteit waardoor DAG omgezet wordt in PA en PKC niet geactiveerd wordt. Door de interactie te remmen wordt DAG niet weggenomen en kunnen PKC en andere DAG-bindende eiwitten geactiveerd worden. W at de functie van deze regulering is in de cel is niet bekend, maar van PKC is bekend dat het een rol speelt in de regulatie van celdeling en differentiatie, dus mogelijk speelt dit mechanisme daar een rol in. Om de fysiologische functie van de interactie tussen prb en DGK te bepalen is onderzocht of DGK celdeling of spier -cel-differentiatie reguleert; processen waarin prb een rol speelt. In Hoofdstuk 6 is aangetoond dat overexpressie van DGK in verschillende cellijnen geen invloed heeft op de celcyclus. Ook onder condities waarbij prb de celcyclus blokkeert heeft overexpressie van DGK geen additionele effecten. Daarnaast is de celcyclus van DGK -deficiënte cellen (afkomstig van muizen waaruit het DGK gen verwijderd is) vergelijkbaar met controlecellen. DGK overexpressie of de afwezigheid van DGK heeft dus geen effect op de celdeling. Aangezien prb betrokken is bij spiercel-differentiatie, is in Hoofdstuk 7 onderzocht of DGK een rol speelt in dit proces. Overexpressie van DGK stimuleert spiercel differentiatie en de productie van spiercel-specifieke eiwitten. Aangezien een inactieve mutant van DGK geen effect heeft op spiercel-differentiatie, is het verminderen van DAG of het produceren van PA waarschijnlijk belangrijk voor differentiatie. Gen-expressie studies door middel van microarrays hebben aangetoond dat DGK voornamelijk genen stimuleert die worden geactiveerd door de spiercel-specifieke transcriptiefactor MyoD, wat suggereert dat DGK mogelijk MyoD activiteit stimuleert. Promoter studies met verschillende pro moters die bindingsplaatsen voor MyoD bevatten, waaronder de myogenin- en muscle creatine kinase promoter, bevestigden dat DGK MyoDgereguleerde promoters stimuleert. Daarnaast bleken DGK -deficiënte cellen niet te kunnen differentiëren tot spiercellen en de daarbij behorende specifieke eiwitten te produceren, wat aantoont dat DGK essentieel is voor spiercel-differentiatie. Nederlandse samenvatting In dit proefschrift is versterkt bewijs gevonden dat DGK activiteit, en daarmee de hoeveelheden DAG en PA, goed gereguleerd dienen te worden. T en eerste, het complete DGK eiwit is nodig voor de volledige activiteit van DGK, wat suggereert dat subtiele veranderingen van het eiwit al voldoende zijn voor regulatie van DGK activiteit. T en tweede, DGK activiteit wordt gereguleerd door prb, p107 en p130. T en derde, het enzym PKC remt de activering van DGK door prb.
156 Daarnaast is aangetoond dat DGK betrokken is bij twee fysiologische processen: (1) overexpressie van DGK in prb-deficiënte cellen herstelt de blokkering van de celdeling na bestraling en (2) DGK stimuleert spiercel-differentiatie. Het feit dat we alleen een effect van DGK op de celdeling hebben gevonden in bestraalde prb-deficiënte cellen, suggereert dat DGK alleen een effect heeft op de celdeling onder zeer specifieke condities. Onze hypothese is dat in prb-deficiënte cellen de balans tussen DAG en PA verstoord is en dat cellen daardoor kunnen blijven delen na bestraling. Overexpressie van DGK herstelt deze balans, waardoor cellen in staat zijn het blokkeringmechanisme van de celdeling in gang te zetten. In controle-cellen is de DAG-PA balans goed gereguleerd, waardoor overexpressie van DGK geen extra bijdrage levert aan de DAG-PA balans, zodat hiervan geen effecten op celdeling worden gevonden. Bij spiercel-differentiatie is mogelijk ook een veran dering in de DAG-PA balans nodig, wat in cellen met verhoogde DGK expressie eerder wordt bereikt, waardoor deze cellen sneller differentiëren. Het is bekend dat DAG de spiercel-differentiatie remt door de activering van Ras (via Ras-GRP) en door activering van PKC dat expressie van spiercel-specifieke genen remt. PA, daar entegen, stimuleert spiercel-differentiatie via het signaal eiwit mtor, maar hoe dit precies gereguleerd wordt is niet bekend. Om het mechanisme te achterhalen hoe DGK bovengenoemde fysiologische processen reguleert en of DAG-PA balansen daarmee te maken hebben, zou in toekomstige experimenten DAG en PA hoeveel heden gemeten kunnen worden. Daarnaast zou onderzocht kunnen worden welke DAG- en PA-bindende eiwitten een rol spelen bij deze fysiologische processen. Een gerichte studie naar het functioneren van spiercellen in DGK -deficiënte muizen kan inzicht verschaffen wat de precieze rol van DGK in spiercel-differentiatie is. Om de rol van DGK in prb signalering uit te zoeken zou het interessant zijn om prb mutanten te genereren die niet aan DGK, maar wel aan andere prb-bindende eiwitten kunnen binden. Deze mutanten zouden ingezet kunnen worden in celcyclus- en spierceldifferen tiatie experimenten. Een zeer interessante richting voor vervolgonderzoek is om na te gaan of DGK regulatie verstoord is in tumoren met een niet-functionerende prb-signaleringsroute. In dit proefschrift is indirect bewijs gevonden dat DGK betrokken zou kunnen zijn bij een verstoorde regulatie van de celcyclus in cellen waarin prb signalering geremd is, aangezien DGK over expressie een blokkering van de cel cyclus in bestraalde prb-deficiënte cellen kan herstellen. Het zou zeer interessant zijn te onderzoeken of DGK ook een positief effect heeft op een blokkering van de cel cyclus in bestraalde tumoren waarin prb signalering niet functioneel is. Er is dus genoeg werk voor de toekomst om de rol van DGK in prb-signalering verder te onderzoeken en hopelijk leidt dit tot verder inzicht hoe kanker behandeld zou kunnen worden.