Tentamen Celbiologie DATUM 19-11-2004 TIJD 14 tot 17 uur ZAAL N109 Wentgebouw. Dit tentamen bestaat uit onderdelen: - Onderdeel 1 bestaat uit twee vragen (vraag 1-2) 20 punten - Onderdeel 2 bestaat uit drie vragen (3-5) 30 punten - Onderdeel 3 bestaat uit drie vragen (7-10) 30 punten Beantwoord elk onderdeel op een apart vel. Zet op elk vel papier: - Onderdeelnummer - Naam - Collegenummer Veel succes!
Vraag 1 1A 1B Bij eiwit transmembraan translocatie speelt het translocon Sec61 complex in het endoplasmatisch reticulum membraan een belangrijke rol. Noem de vier eiwit transportprocessen waarbij Sec61 actief is. Teken hoe de volgende rijpe eiwitten in de cel aanwezig zijn, en maak duidelijk waar de N-terminus en de C-terminus zit met betrekking tot het cytosol en het endoplasmatisch reticulum. (I) (II) (III) (IV) N---------(-)MSS(+) ---------------------- C N (MSS)(K) -------------------------------C N (+)MSS1(-)----MSS2--------------- C N----------------------------------------------- C MSS = membraanspanning segment; K = kliefgedeelte; (+) (-) lading einde van de MSS 1C 1D 1E Noem vier redenen om eiwitten te versuikeren. Wat betekent de afkorting UPR? Welk eiwit is nu de "sensor" in het UPR proces? Verklaar je antwoord. Vraag 2 2A 2B 2C 2D 2E Clathrine-gecoate vesicles budden van eukaryotische membraan fragmenten wanneer adaptine, clathrine, en dynamine-gtp worden toegevoegd. Wat verwacht je te zien wanneer de volgende veranderingen aan het experiment worden gedaan. Verklaar je antwoord. 1. Weg laten van adaptine. 2. Weglaten van clathrine. 3. Weglaten van dynamine-gtp. 4. Wanneer bacteriële membraan fragmenten worden gebruikt. Verklaar de zogenoemde SNARE hypothese in het transport van vesicles van het endoplasmatisch reticulum naar het Golgi complex. Wat is het effect van NSF in de SNARE hypothese? Wat is de rol van Rab-GTP in het vesicle transport? Het BiP als ER-luminaal resident eiwit komt in het Golgi complex terecht. Beschrijf hoe het BiP weer in het ER-lumen terecht komt.
Vraag 3 3. Na toevoeging van EGF aan een celkweek blijken de cellen te worden gestimuleerd tot celdeling, a. Beschrijf het effect van EGF op de chromosoomstructuur van genen, die belangrijk zijn voor celdeling, zoals c-fos. b. Hoe zou EGF de c-fos expressie kunnen verhogen? Er zijn een aantal mogelijkheden en beschrijf er drie. Vraag 4 4. a. Teken een stuk DNA en geef daarop aan de plaatsen waar RNA polymerase zou kunnen starten en stoppen, en waar het ribosoom (op het overeenkomende mrna) zou kunnen starten en stoppen. b. Geef de start en stopsignalen van RNA polymerase en het ribosoom. Vraag 5 5. De transcriptiefactor SP3 behoort tot dezelfde familie als SP1. SP1 was de eerste transcriptiefactor die gezuiverd werd met behulp van affiniteitschromatografie. a. Beschrijf hoe deze affiniteitschromatografie voor SP1 werd gedaan. SP3 behoort tot de Zink-vinger familie van transcriptiefactoren. b. Wat wordt hiermee bedoeld? c. Ken je nog andere families? Noem ze. Je hoeft ze niet te beschrijven. d. Teken en beschrijf de initiatie van transcriptie in eukaryoten. e. Welke rol zou SP3 in dit proces kunnen hebben? In oktober van dit jaar werd de nucleotidensequentie van SP3 gepubliceerd. Het volledige gen werd gekloneerd en een plasmide werd gemaakt. Van het plasmide werd mrna gemaakt (in vitro) en het mrna werd tot expressie gebracht in vitro met hulp van radioactieve aminozuren, waardoor de in vitro gemaakte eiwitten met behulp van SDS-PAGE en autoradiografie zichtbaar werden gemaakt.
Als geen mrna aan het systeem werd toegevoegd werden geen eiwitten gemaakt zoals te zien in paneel B, laan 1 gemerkt met -. (Links staat aangegeven waar de positie is van eiwitten met een mol.massa van 97 en 66kDa.) f. Waarom zou deze controle gedaan zijn? Als het onveranderde (wildtype genaamd) mrna, gemerkt WT (zie bovenste schematische voorstelling in paneel A) werd vertaald tot eiwit, werden 4 eiwitten gedetecteerd in laan 2, gemerkt SP3li-1, SP3li-2, SP3si-3, en SP3si-4. g. Leg uit hoe het ribosoom een eukaryotisch mrna herkent. Beschrijf dit in het algemeen, dus niet voor het geval van SP3 mrna. h. Leg uit waarom 4 eiwitten worden gemaakt van SP3 mrna. i. Wat kan je zeggen van de efficiëntie waarmee elk potentieel AUG startcodon wordt herkend, en waar hangt dat van at? Vervolgens werden een aantal mutaties aangebracht in het plasmide (zie paneel A: 1.AUGm, 2.AUGm, 3.AUGm, en 4.AUGm), waarin aangegeven is dat elk van de 4 potentiële startcodons werd gemuteerd. Van de gemuteerde plasmiden werd weer mrna gemaakt en de mutante mrna's werden weer tot expressie gebracht (paneel B). j. Waarom zouden de startcodons niet altijd gemuteerd zijn tot hetzelfde triplet? (Hint: een startcodon kan meer functies hebben!) k. Verklaar de expressiepatronen in paneel B van elk van de vier mutante mrna's, Beschrijf ook hoe het ribosoom zich in elk van de 4 gevallen gedraagt. I. Geef een hypothese waarom in bijvoorbeeld de analyse van mutant 3.AUGm de expressie van het bovenste bandje hoger is dan de expressie van dit bandje in de analyse van mutant 2.AUGm.
m. In het construct genaamd 5.AUGoK (de onderste van paneel A) werd de sequentie rond het eerste AUG veranderd in gccaugg. Waarom zou dat zijn gedaan? n. Kan je de expressie van deze mutant, 5.AUG.oK in laan 7, uitleggen in vergelijking met de expressie van het WT mrna in laan 2? Opm. De 6 constructen in paneel A (van boven naar beneden) zijn getest in laantjes 2 t/m 7 in paneel B.
Vraag 6. Polymerisatie van microtubuli is een ingewikkeld proces waarop verschillende fenomenen tegelijkertijd van invloed zijn. Hierdoor is het moeilijk voorspellingen te doen over het polymerisatiegedrag van microtubuli. Om het polymerisatiegedrag van microtubuli in vitro te bestuderen is een methode ontwikkeld waarbij het mogelijk is de individuele tubulus in de microscoop langer of korter te zien worden. Twee voorbeelden (a en b) van dergelijke observaties zijn te zien in onderstaande figuur. Hierbij is het 'active' end het plus-einde en het 'inactive' end het min-einde. Analyse van de groeisnelheid van twee individuele microtubuli, aangegeven met a en b. (A) Lengte variatie van het plus-einde van de microtubuli a en b. (B) Lengte variatie van het min-einde van de microtubuli a en b. a. Wat is het verschil tussen het min- en het plus-einde van de microtubulus? b. Wat is dynamische instabiliteit en aan welk einde vindt dit plaats? c. Is de polymerisatie aan het + of - einde afhankelijk of onafhankelijk van elkaar? d. Wat gebeurt er met de aanbouw en afbraak van microtubuli als er geïsoleerde centrosomen bij worden gedaan? e. Wat gebeurt er met het polymerisatie gedrag als er zogenaamde Microtubuligeassocieerde-eiwitten, zoals MAP'S en Tau, aan de oplossing worden toegevoegd?
Vraag 7. a. Beschrijf hoe in de celcyclus een cycline-cdk complex wordt geactiveerd? b. Hoe leidt DNA schade tot arrest in g1 fase van de celcyclus? c. Hoe leidt binding van groeifaktoren aan oppervlakte receptoren tot remming van apoptose? Vraag 8. a. Hoe leidt binding van platelet derived growth factor (PDGF) tot activatie van de receptor? b. Een van de enzymen die gestimuleerd worden door PDGF is het phosphatidylinositol 3'- kinase (PI3K). Welk gebied op de receptor en welk gebied in het PI3K zijn verantwoordelijk voor de binding van het PI3K aan de PDGF receptor en wat is de moleculaire aard van deze binding? c. De interactie tussen PI3K en de PDGF receptor wordt nader onderzocht. Dit wordt gedaan onder andere gedaan met behulp van een co-immunoprecipitatie van de PDGF receptor. Beschrijf het principe van deze techniek. Geïsoleerde receptoren worden geïncubeerd met een cel homogenaat waarin PI3K aanwezig is. Hieraan wordt in verschillende incubaties synthetische peptiden van 5 aminozuren toegevoegd, die overeenkomen met verschillende stukjes van het cytoplasmatische deel van de PDGF receptor en die elk een tyrosine bevatten. De peptides bevatten de volgende tyrosines: 684, 708, 719, 731, 739, 743, 746 en 755. De peptides worden zowel in de gefosforyleerde en de niet-gefosforyleerde staat gebruikt. De PDGF receptoren, cel homogenaat en een van de peptides worden steeds geïncubeerd met PDGF. De aan de receptor geassocieerde PI3K activiteit wordt vervolgens bepaald m.b.v. radioactief ATP en autoradiografie. In de figuur 3 worden de resultaten van de verschillende incubaties weergeven. Figuur 3: Effect van de verschillende peptides op de gemeten activiteit van PI3Kinase. Een zwarte cirkel geeft inbouw van 32 P weer.
d. Waarom heeft de toevoeging van de niet gefosforyleerde peptides geen effect op de gemeten PI3K activiteit en het toevoegen van sommige gefosforyleerde peptides wel? e. Welke tyrosine(s) in de PDGF receptor is/zijn verantwoordelijk voor de interactie tussen de receptor en het PI3K? f. Welke reactie wordt door het PI3K gekatalyseerd? En wat is de functie van die reactie.