Dried matrix spot in TDM en Toxicologie : nieuwe ontwikkelingen

Dried matrix spot in TDM en Toxicologie : nieuwe ontwikkelingen Dr L Stolk, ziekenhuisapotheker/klinisch farmacoloog/toxicoloog Klinische Farmacie en Toxicologie, Maastricht Universitair Medisch Centrum. lml.stolk@mumc.nl KKGTDAG2013 1

Academisch Ziekenhuis Maastricht az M NVZA24-11- KKGTDAG2013 2008 2

Inhoud Korte inleiding bloed spot methode in TDM Nieuwe ontwikkelingen: Nieuwe bepalingen TDM en Toxicologie Stabiliteit en Flash Heating DBS en de farmaceutische industrie Bloedmonsters ipv plasmamonsters Het hematocriet probleem Alternatieven voor hematocriet gevoelige methoden KKGTDAG2013 3

Historie Dried Blood spot 1961: Dr Robert Guthrie ontwikkelde een screening test voor phenylketonuria (PKU) bij neonaten: een bepaling voor fenylalanine in bloed gedroogd op filtreer papier. Vanaf dat moment is bloed spot methode gebruikelijk geworden voor screening van metabole ziekten bij neonaten. Vooral kwalitatieve analyse 09/06/2015 researchtoxicologyum 4

Bloed spot methode in TDM Het gebruik van de bloed spot methode in TDM is later ontwikkeld na de neonatale methode. Sinds de tachtiger jaren, maar vooral de laatste 10 jaar zijn veel TDM bepalingen gebaseerd op de bloed spot gepubliceerd. 09/06/2015 researchtoxicologyum 5

Andere toepassingen van de bloed spot methode in de literatuur: Genotyperen Wijnen P, Op den Buijsch R, Cheung S, van der Heijden J, Hoogtanders K, Stolk L, van Dieijen-Visser M, Neef C, Drent M, Bekers O. Genotyping with a dried blood spot method: A useful technique for application in pharmacogenetics. Epub 10 oct 2007. Clin Chim Acta 2008;388:189-191 Identificatie of virussen: eg HIV Klinisch chemische bepalingen Toxicologie: drugs of abuse 09/06/2015 researchtoxicologyum 6

09/06/2015 researchtoxicologyum 7

Techniek Hoe werkt de dried blood spot methode? KKGTDAG2013 8

Bloed spot methode (A) Patient prikt zijn vinger met een automatisch lancet. De patient vult een voorgedrukte cirkel (8 mm ø) op monster papier volledig met één bloeddruppel. De bloed spot moet tenminste 3 uur drogen aan de lucht. Het monster wordt per post verzonden naar het laboratorium KKGTDAG2013 9

Bloed spot methode (A) In het laboratorium: -Controle van het monster. - Een ponsje (7.5 mm ø) wordt uitgeponst. -Extractie van het ponsje vindt plaats. -Het extract wordt geanalyseerd KKGTDAG2013 10

Bloed spot alternatieve methode (B) Een vinger prik vindt plaats Patient of trained technician brengt nauwkeurig een bepaald volume bloed op het monster papier met een pipet. In het laboratorium wordt de totale spot in zijn geheel geextraheerd KKGTDAG2013 11

Bloed spot methoden De eerste methode is eenvoudiger, omdat er niet wordt gepipetteerd. Echter op correcte manier bloed bemonsteren en uitponsen van de spot zijn van kritisch belang om het juiste monstervolume te verkrijgen. Met de tweede methode is dit minder kritisch. KKGTDAG2013 12

Bloed spot in beeld KKGTDAG2013 13

Voordelen bloed spot methode -De patient is kan thuis bemonsteren (na geschikte training) -(Verkorte ) AUC gemakkelijker: meerdere monsters gedurende de tijd. -Verzenden per post is mogelijk (biohazard risk verwaarloosbaar) -In droge vorm zijn de meeste geneesmiddelen zeer stabiel. -Klein monster volume: + 30 μl per spot. 09/06/2015 researchtoxicologyum 14

Nadelen bloed spot methode Bemonsteren is niet onder controle (A) Ondanks training blijkt de kwaliteit van de monsters soms toch onvoldoende te zijn. Patienten zijn soms bang voor vingerprik Klein monstervolume betekent dat gevoelige en dus dure analytische technieken nodig zijn. Meestal zijn de methoden beperkt tot één geneesmiddel. Na analyse is er meestal geen monster over. 09/06/2015 researchtoxicologyum 15

Dried blood spot Wat is er nieuw? KKGTDAG2013 16

Alle TDM bepalingen Bijna alle bepalingen die routinematig in TDM worden gedaan met veneus bloed, zijn nu ook beschikbaar als dried blood spot methode. KKGTDAG2013 17

Bloed spot TDM bepalingen Antipsychotics Antiepileptics Antimalarials Antibiotics Antifungals Tuberculostatics Antiretrovirals Immunosuppressives Tyrosinekinase-inhibitors 09/06/2015 researchtoxicologyum 18

Review artikelen - Li W, Tse FL. Dried blood spot sampling in combination with LC-MS/MS for quantitative analysis of small molecules. Biomed Chromatogr. 2010;24(1):49-65 - Peter M. Edelbroek, Jacques van der Heijden, and Leo M. L. Stolk. Dried Blood Spot Methods in Therapeutic Drug Monitoring: Methods, Assays, and Pitfalls. Ther Drug Monit Volume 2009;31(3):327-36 review of 30 papers about TDM based on DBS 09/06/2015 researchtoxicologyum 19

Updates In 2010 and 2012 zijn updates van ons review article: 40 nieuwe artikelen gepubliceerd op de IATDMCT website: www.iatdmct.org scientific committees: new sampling strategies committee 09/06/2015 researchtoxicologyum 20

Toxicologie Also on IATDMCT website Review of assays of toxicological assays based on DBS. 30 references Dried blood spots in toxicology: from the cradle to the grave? Critical Reviews in Toxicology, 2012; 42(3): 230 243 Christophe P. Stove, Ann-Sofie M.E. Ingels, Pieter M.M. De Kesel, and Willy E. Lambert KKGTDAG2013 21

Toxicologische bepalingen Drugs of abuse (XTC, cocaine, opiates, cotinine, fentanyl, tramadol, zolpidem, ethylgucuronide etc) Environmental contaminants (pesticides, polychlorinated biphenyls, cholinesterase inhibitors etc) Biotoxins ( Brevetoxins = giftige algen, ciguatoxin etc) Trace elements (As, Hg, Pb, Tl etc) KKGTDAG2013 22

Pharmaceutische industrie en DBS Voor registratie nieuwe geneesmiddelen is onderzoek met dieren verplicht DBS kan veel geld besparen : -Kleine hoeveelheid monster (bijv voor maken conc tijd curve is maar één dier nodig.) -DBS monsters zijn stabiel (geen dure koeling tijdens transport nodig). KKGTDAG2013 23

Daarom had de farmaceutische behoefte aan ontwikkeling van nieuwe technieken om veel monsters te kunnen afhandelen in korte tijd: Dus automatisering KKGTDAG2013 24

KKGTDAG2013 25

a system for the automated extraction of DBS cards that can be coupled directly to LC-MS systems: Fully automated handling of up to 500 DBS cards.optical DBS card positioning and identification including barcode reading module (OCR) Wash station eliminates carryover.internal standard (IS) application module.easy Integration LC- MS systems KKGTDAG2013 26

Technieken voor directe analyse zijn ontwikkeld Directe Elutie Directe Desorptie KKGTDAG2013 27

KKGTDAG2013 28

Desorption electrospray ionisation DESI is een combinatie van Electrospray and Desorption Ionisation. Ionisatie vindt plaats met een electrisch geladen mist een paar mm bij het monster oppervlakte te brengen en daartussen een spanningsverschil aan te brengen. KKGTDAG2013 29

DESI KKGTDAG2013 30

Stabiliteit en flash heating monsters Gewoonlijk zijn DBS monsters stabiel in droge vorm. Echter vlak na bemonstering, wanneer het monster nog nat is, kan (enzymatische) afbraak plaatsvinden. KKGTDAG2013 31

KKGTDAG2013 32

Hitte stabilisatie Een nieuwe techniek : Kort verhiten op hoge temperatuur: 30 sec 95 ºC. Bij enkele model geneesmiddelen is stabiliteit van deze methode onderzocht. Oseltamivir, cefotaxime and ribavirin konden met succes worden gestabiliseerd. Arthemeter en Dihydroartemisin waren instabiel zelfs bij kort verhitten bij 60 ºC.

Oseltamivir verhit bij 95 C gedurende 30 sec

Bloed of plasma? KKGTDAG2013 35

Dried blood spot monsters zijn in essentie volbloed monsters. Klassieke TDM wordt over het algemeen in plasma of serum gedaan. Referentie waarden worden altijd aangegeven als concentraties in plasma of serum

De niet eiwit gebonden fractie van geneesmiddelen in plasma is de werkzame fractie. Deze is over het algemeen lastig te bepalen. Daarom wordt meestal alleen de totale concentratie in plasma bepaald.

De fundamentele vraag is: Is de totale geneesmiddelconcentratie in DBS ( = volbloed), een geschikte vervanger voor de totale concentratie en de vrije ongebonden concentratie in plasma? Rowland M et al.use of dried blood spots in drug development:pharmacokinetic considerations. Bioanalysis 2010;2:1791-6

-Eiwitbinding Parameters -Binding aan bloedcellen -Hematocriet = Verhouding volume rode bloedcellen/totaal volume van het bloed. (gemiddeld 0,45)

KKGTDAG2013 41

Conclusies Rowland et al Voor geneesmiddelen die weinig variabiliteit vertonen in eiwitbinding en in affiniteit voor de bloedcellen zijn er geen problemen voor gebruik van DBS (volboed) als alternatief voor plasma.

Het probleem van variatie van de Hematocriet KKGTDAG2013 43

Twee Hematocriet problemen 1) Analytisch probleem: De bias in de nauwkeurigheid van de bepaling die wordt veroorzaakt door spreiding van het op papier opgebrachte bloedmonster. 2) Fysiologisch probleem : Invloed op de Bloed plasma ratio. KKGTDAG2013 44

Volume wordt beinvloed door Ht Het uitgangspunt in DBS is dat bij gebruik van een standaard maat pons, alle spots hetzelfde volume opleveren. Echter wanneer het bloed zich radiaal over het papier verspreid, bepaalt de viscositeit van het bloed hoe ver het bloed zich verspreid. De viscositeit wordt bepaald door de hematocriet van het bloedmonster. KKGTDAG2013 45

Oplossingen voor het analytische hematocriet probleem : -In de validatiefase het effect over een range van hematocriet waarden onderzoeken. -Niet uitponsen maar de gehele bloed spot analyseren. Dit betekent wel dat bij monstername nauwkeurig met een pipet moet worden gepipetteerd. -Gebruik van Dried plasma spots KKGTDAG2013 46

2) Fysiologisch probleem Indien Hematocriet bekend is, kan er gecorrigeerd worden met een formule: Cb/Cp = (1-Ht) + Ht x ρ x fu KKGTDAG2013 47

Hoe weten we wat de hematocrit is met alleen een bloed spot? Antwoord: Voorspelling van de hematocriet van dried bloed spots door het meten van kalium in de spot met een routine clinical analyzer. Capiau S, Stove W, Lambert W, Stove C. Analytical Chemistry 2012; 85(1):404-10 KKGTDAG2013 48

Kalium wordt geanalyzeerd in kleine 3 mm ponsjes. Kalium concentraties zijn: Zeer hoog intracellular in rode bloedcellen 140 mmol. In plasma 3.5-5 mmol en deze staat onder sterke fysiologische controle. Dus bij kleine verandering hematocriet: grote verandering kalium concentratie.

Alternatieven voor hematocriet gevoelig monster papier KKGTDAG2013 51

Cellulose vrij monster papier KKGTDAG2013 52

KKGTDAG2013 53

KKGTDAG2013 54

KKGTDAG2013 55

New Hematocrit Independent Dried Blood Spot Card John Mommers 1, Ellen Gorissen 1, Nik de Bont 2, Jun Qui 2,3, and Ynze Mengerink 1 * 1 DSM Resolve, 2 DSM Biomedical, 3 DSM Ahead, *corr adres: PO Box 18, 6160 MD Geleen, The Netherlands (ynze.mengerink@dsm.com) KKGTDAG2013 56

Alternatieve matrices KKGTDAG2013 58

In dit artikel wordt ipv bloed spot een plasma spot onderzocht. De plasma spot wordt verkregen na centrifugeren en opbrengen plasma. De resultaten in vergelijking met klassiek plasma zijn goed. KKGTDAG2013 59

Praktischer oplossing. KKGTDAG2013 60

Yorktest membrane filtration device Het device (ontwikkled voor bepaling homocysteine ) bestaat uit twee membranen. Het bovenste membraan is in staat om bloedcellen af te filtreren, maar het plasma door te laten tot het onderste membraan. Het bovenste membraan kan worden verwijderd, zodat het membraan met de plasma spot overblijft.

Dried Plasma Spot KKGTDAG2013 62

KKGTDAG2013 63

Behalve bloed meer matrices mogelijk. Plasma Urine Saliva etcetera The Dried Blood Spot lijkt te veranderen in The Dried Matrix Spot KKGTDAG2013 64

vragen? KKGTDAG2013 65

KKGTDAG2013 67

Dried plasma spots KKGTDAG2013 68

09/06/2015 researchtoxicologyum 69

DESI The electrospray mist wordt naar het oppervlakte getrokken door een spanningsverschil aan te brengen met het monster. Na ionisatie, verplaatsen de ionen zich naar de atmospheric pressure interface die verbonden is aan de massa spectrometer. KKGTDAG2013 70

Pharmacokinetic considerations about use of dried blood spot sampling Rowland M et al Use of dried blood spots in drug development: pharmacokinetic considerations Bioanalysis 2010;2:1791-6.

Ratio concentratie Bloed/Plasma Ratio van de concentratie bloed/plasma van een geneesmiddel is een middel om af te leiden of plasma eiwit binding of bloed cel affiniteit een belangrijke rol speelt bij DBS.

Wateroplosbare geneesmiddelen Bij wateroplosbare geneesmiddelen, die zich niet verdelen in bloedcellen ligt de Ratio in de buurt van 0.55. Bloed cellen gedragen zich louter als verdunningsmiddel en alleen de Hematocrit en de eiwitbinding zijn van belang. Voorbeeld: tobramycine

Geneesmiddelen met hoge affiniteit voor bloed cellen: R > 2 Sterke binding aan bloedcellen De Hematocriet en binding aan bloedcellen zijn dan van belang Voorbeeld tacrolimus R =10-20