Docentenhandleiding vaccinatie Hepatitis B practicum, 2015 1
Kopiëren van (delen van) deze handleiding is alleen toegestaan voor gebruik in de klas. Docentenhandleiding vaccinatie Hepatitis B practicum, 2015 2
Introductie De leerlingen gaan een practicum doen dat met het immuunsysteem van de mens te maken heeft. Door middel van het uitvoeren van een ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) wordt de ontwikkeling van specifieke antistoffen na vaccinatie tegen het Hepatitis B virus bekeken. Daarbij wordt gekeken naar de primaire en secundaire immuunrespons, door het aantonen of de vaccinatie succesvol is geweest. De ELISA bestaat uit een aantal stappen: Stap 1: Een aantal putjes (vaak welletjes genoemd) van een microtiterplaat (96 putjes: 8 rijen van 12 putjes) wordt geïncubeerd met eiwitten van het Hepatitis B virus. De eiwitten hechten zich spontaan aan het plastic. Stap 2: Bindingsplaatsen op het plastic waar nog geen (virus)eiwitten aan gebonden zijn, worden geblokkeerd met een overmaat van een irrelevant eiwit (meestal wordt hiervoor boviene (=runder) serum albumine, BSA, gebruikt). Hiermee wordt voorkomen dat de antilichamen uit de sera (stap 3) rechtstreeks aan het plastic plakken. Stap 3: Vervolgens incubeert men de putjes met een verdunning van de te onderzoeken sera en wast men de plaat na incubatie grondig met een wasbuffer. Stap 4: Daarna wordt geïncubeerd met konijnenantistoffen gericht tegen menselijke immunoglobulinen (antistoffen). Deze konijnenantistoffen zijn gekoppeld aan een enzym (een peroxidase). Meestal wordt hier het Horseradish Peroxidase (HRP) voor gebruikt. Stap 5: Na opnieuw wassen, wordt het indirect (via humane antistoffen tegen de viruseiwitten en konijn-anti-humaan-immunoglobulinen) aan de plaat gebonden peroxidase aangetoond door een substraat voor dit enzym toe te voegen. Het substraat is vrijwel kleurloos, maar wordt door het peroxidase in een blauw gekleurd reactieproduct omgezet. De hoeveelheid blauwkleuring is evenredig met de hoeveelheid peroxidase, dus met de hoeveelheid gebonden anti-immunoglobuline en dus met de hoeveelheid humane antistoffen tegen het Hepatitis B virus. LET OP: Het practicum dat de leerlingen zullen doen is geen echte ELISA. Alle handelingen zijn vergelijkbaar met een echte ELISA, maar om de experimenten zo succesvol mogelijk te laten verlopen zijn deze met andere stoffen. De geleverde microtiterplaten zijn gecoat met verschillende concentraties kippenantilichaam (IgY). De sera van zogenaamd gevaccineerde individuen is in alle gevallen Rabbit-anti-IgY- HRP (50% in glycerol) in PBS/0.05%tween20. Het anti-igm-hrp en anti-igg-hrp is beide PBS, waarna vervolgens na incuberen de kleuring (TMB reagent) aan wordt toegevoegd. Omdat alle welletjes al gecoat zijn met een verschillende hoeveelheid IgY, zal het experiment na toevoeging van Rabbit-anti-IgY en het TMB reagent verschillende kleurintensiteiten per well geven. Docentenhandleiding vaccinatie Hepatitis B practicum, 2015 3
Inhoud van de kit 15 gecoate ELISA platen Tween20 (5 ml) Rabbit-anti-IgY-HRP TMB reagent Materialenlijst Voorbereiden voor de leerlingen (per tweetal): Set met sera : 12 epjes met 150 μl Rabbit-anti-IgY-HRP (1:1000) in PBS/0.05%tween20. Rekenvoorbeeld: 0.150 x 12 epjes x 25 platen = 45 ml. Maak 50 ml totaal. Voeg de 50 μl Rabbit-anti-IgY-HRP toe aan 50 ml PBS/0.05%tween20. Epje Anti-IgM-HRP : 1.5 ml PBS Epje Anit-IgG-HRP ; 1.5 ml PBS Reageerbuis TMB reagent: per tweetal is 24 wells x 100 μl TMB reagent nodig = 2.4 ml. Wasbuffer: 15 bekerglazen van 1 liter. PBS = fosfaatbuffer + 0.9% natriumchloride Rekenvoorbeeld: 10x PBS/tween20 : nodig 15 platen x 0.5 L = 7.5 L. Voor 10 liter PBS: 5 ml tween20 toevoegen aan 10 liter PBS (=PBS/0.05%tween20) 15 x 50 μl fixed-volume pipetten of 20-200 μl micropipetten. Rekjes: 15x eppendorf rekjes, 15x 50mL rekjes. Elke werkplek biedt materialen voor twee leerlingen: Item Omschrijving Aantal Micro-reageerbuisjes (epjes) 1 t/m 12 Sera van 0 t/m 11 weken na 12 vaccinatie Microtiterplaat (96-wells); gecoat; geblocked Epje Anti-IgM-HRP Anti-IgM-HRP 1 Epje Anti-IgG-HRP Anti-IgG-HRP 1 Reageerbuis TMB reagent Kleurreagens 50 μl fixed-volume pipetten of 20-200 μl 1 micropipetten Gele puntjes 1 Wasbuffer in bekerglas PBS / 0.05% Tween-20 1 Plastic wegwerppipetten 2 Keukenpapier Mocht u geen pipetten ter beschikking hebben op uw school, zijn pipetten (o.a.) verkrijgbaar via onderstaande websites. Fixed volume pipetten zijn voordeliger dan variabel volume maar uiteraard minder flexibel. Daarbij zijn de fixed volume pipetten alleen verkrijgbaar in 50 μl, wat inhoudt dat de leerlingen 2x 50 μl moeten pipetteren in een well voor 100 μl. Docentenhandleiding vaccinatie Hepatitis B practicum, 2015 4
Variabel volume: VWR International B.V. : https://nl.vwr.com/store/ Finnpipette F3 20-200 μl Artikelnummer: 613-1464 Richtprijs: 153,38,- per stuk Fixed volume: BIO-RAD: http://www.bio-rad.com/en-us/product/fixed-volume-micropipets 50 μl Fixed-Volume Micropipets Artikelnummer: 166-0515EDU Richtprijs (educatie): 23,- per stuk Docentenhandleiding vaccinatie Hepatitis B practicum, 2015 5
Antwoordmodel Vaccinatie practicum vragen 1) Wat wordt in dit experiment als negatieve controle gebruikt? Het serum afgenomen vlak voor de 1 e immunisatie (monster 1, week 0) 2) Maak een schets van de verwachte IgM- en de IgG-respons bij deze vaccinatie. Wanneer verwacht je de pieken in het serum voor IgM en voor IgG? 3.5 3 Kleuring (OD) 2.5 2 1.5 1 IgG IgM 0.5 0 0 2 4 6 8 10 12 Weken na 1e Immunisatie 3) Wat wil men immunologisch gezien bereiken met vaccinatie? Het opwekken van (lang levende) antigeen specifieke B (en T) geheugencellen, zodat het immuunsysteem na contact met het pathogeen snel een sterke specifieke antistof (en T cel) respons kan ontwikkelen die het pathogeen onschadelijk maakt voor deze zich te sterk heeft kunnen vermenigvuldigen. Extra info: Daarnaast kunnen de opgewekte antistoffen ook direct bescherming bieden tegen infectie, als deze infectie niet te lang na de vaccinatie plaatsvindt. De antistoffen verdwijnen wel veel eerder (maanden tot een (paar) jaar) dan de geheugencellen die levenslang aanwezig blijven. 4) Beschrijf het verschil tussen de IgM en de IgG respons na de eerste immunisatie (van week 0 t/m week 6) en geef hier een verklaring voor. IgM respons piekt 2 weken na (eerste) immunisatie en IgG piekt 3 weken na de eerste immunisatie. Verklaring: IgG is afhankelijk van helper T cellen voordat IgM naar IgG kan switchen. De antigeen specifieke T cellen moeten zich ook eerst gaan delen voor ze de B cellen van IgM naar IgG kunnen laten switchen. Dit kost tijd. Docentenhandleiding vaccinatie Hepatitis B practicum, 2015 6
5) Beschrijf het verschil tussen de IgM en de IgG respons na de tweede immunisatie (van week 6 t/m week 11) in vergelijking met deze responsen na de eerste immunisatie en geef hier een verklaring voor de gevonden verschillen. De IgM respons na de tweede immunisatie is veel kleiner dan de IgG respons (na de tweede immunisatie). De IgM respons na de tweede immunisatie is vergelijkbaar met de IgM respons na de eerste immunisatie. De IgG respons is na de tweede immunisatie veel sterker dan na de eerste immunisatie. De veel sterkere respons van IgG is het resultaat van de aanwezigheid van geheugencellen die blijkbaar (resultaten van je ELISA) vooral antistoffen van het IgG type maken. Extra info: De uitgebreide verklaring is, dat B cellen die voor de eerste keer gestimuleerd worden aanvankelijk IgM maken en wat later switchen naar IgG productie. De geheugencellen die uit dit eerste contact voortkomen zullen daardoor vooral IgG maken. Omdat er door de B cel deling na het eerste contact veel meer specifieke geheugencellen zijn dan voor het eerste contact, is de IgG reactie ook veel sterker dan na de eerste immunisatie. Het IgM dat na de tweede immunisatie gevormd wordt ontstaat weer vooral uit B cellen die voor de eerste keer met dit antigeen in contact komen. 6) De ELISA is eerder in Wageningen uitgevoerd waarna de kleuring (=OD405-waarde) gemeten is. Van de onderstaande grafieken geeft 1 grafiek deze kleuring precies weer. a. Welke lijn (X of Y) in de bovenstaande grafieken geeft de IgG respons weer en welke de IgM respons? Gebruik hiervoor de resultaten van je eigen experiment en licht je antwoord toe. Lijn X = IgG, lijn Y = IgM Toelichting: IgM geeft in ELISA na de eerste en tweede immunisatie twee vergelijkbare pieken (dit komt overeen met lijn Y), IgG geeft na de tweede immunisatie een veel hogere piek dan na de eerste immunisatie (dit komt overeen met lijn X). b. Welke van de bovenstaande grafieken (A, B, C of D) geeft het best het resultaat van jullie ELISA weer? Beargumenteer je antwoord. Grafiek B. Toelichting: De IgG piek na de eerste immunisatie ligt op week 3 en de IgM piek een week eerder (op week 2). Dit is alleen het geval voor grafiek B en D. Op week 7 en 8 (dat is 1 en 2 weken na de tweede immunisatie) is de IgG kleuring van jullie eigen ELISA veel sterker dan de IgM kleuring. Dit is alleen het geval voor grafiek B. 8. Worden bij een vaccinatie antistoffen ingespoten of antigenen? Van vaccinatie is sprake wanneer een vaccin van verzwakte of gedode ziekteverwekkers (of onderdelen/componenten) wordt ingebracht (dus antigen) om het lichaam aan te zetten tot actieve immunisatie. Docentenhandleiding vaccinatie Hepatitis B practicum, 2015 7
Extra info: Hierbij worden antigeen-specifieke geheugencellen gevormd. Inspuiten van specifieke antistoffen kan helpen, tijdens een infectie of vrij kort voorafgaand aan een infectie, maar zal geen geheugencellen induceren. 9. Wat wordt bedoeld met een primaire immuunrespons, wat met een secundaire? De primaire immuunrespons ontstaat na een eerste contact met een antigen (bijvoorbeeld het Gele koorts virus). Deze respons leidt tot antistofvorming (vooral IgM) en het ontstaan van een geheugenrespons met een beetje IgG. De secundaire immuunrespons ontstaat na een hernieuwde blootstelling aan hetzelfde antigeen en leidt tot een snellere en sterkere antistofrespons met vooral veel meer IgG (in plaats van IgM) antistoffen. Extra info: De antistoffen zijn een gevolg van de specifieke geheugenrespons die gepaard gaat met antigen-specifieke B-cellen. 10. Waarom denk je dat het immuunsysteem zoveel verschillende B cellen maakt die allemaal hun eigen unieke (antigeen specifieke) B cel receptor hebben? Zodat het immuunsysteem allerhande antigenen/ziekteverwekkers kan herkennen. Het immuunsysteem weet van te voren niet welke van de vele miljoenen micro-organismen het lichaam ooit binnendringt en moet dus tegen bijna elk antigeen een afweerreactie kunnen starten. 11. Het Human Immunodeficiency Virus (HIV) dat AIDS veroorzaakt kan heel snel muteren (veranderen). Binnen een geïnfecteerd individu ontstaan daardoor voortdurend nieuwe virusvarianten. Wat betekent dit voor de afweer tegen dit virus? Licht je antwoord toe. Het afweersysteem kan antistoffen tegen het virus maken die aan het virus kunnen binden en het onschadelijk kunnen maken (door de binding van de antistoffen kan het virus bijvoorbeeld niet meer aan een lichaamscel hechten en die ook niet meer infecteren). Als de virussen door mutaties voortdurend veranderen, zullen er virusvarianten kunnen ontstaan die niet meer door de antistoffen (en/of T cellen) aangepakt kunnen worden. Deze virussen hebben op dat moment een (evolutionair) voordeel en kunnen zich ongeremd gaan vermenigvuldigen totdat zich weer antistoffen tegen deze nieuwe virusvariant gevormd hebben. Ondertussen kunnen echter alweer nieuwe varianten ontstaan zijn, enzovoort. Docentenhandleiding vaccinatie Hepatitis B practicum, 2015 8