HLA typeren en HLA antistoffen t.b.v. trombocytentransfusies Christien Voorter Transplantatie-Immunologie, Laboratorium Weefseltypering c,.voorter@mumc.nl
2 HLA Humaan Leucocyt Antigeen Eiwitten op oppervlakte van de cel Polymorf (veel verschillende soorten) Rol bij immunologische reacties Afweer tegen lichaamsvreemde stoffen zoals virussen, bacterien
3 HLA systeem * Bloedgroepsysteem op witte bloedcellen, maar ook op vrijwel alle kernhoudende cellen en bloedplaatjes * Veel polymorfer dan rode bloedgroepen: ABO systeem 4 mogelijke combinaties HLA systeem meer dan 1 miljoen combinaties * ABO: natuurlijk aanwezige antistoffen HLA: antistoffen alleen na contact met vreemde HLA antigenen
4 HLA genen Chromosoom 6 DP DQ DR B C A B A B A B A klasse II klasse I
5 HLA klasse I molecuul C15 beta-2- microglobuline A/B/C C6 HLA klasse I moleculen: expressie op alle kernhoudende cellen en trombocyten
6 HLA klasse II molecuul DRA/DQA/DPA C6 DRB/DQB/DPB C6 HLA klasse II moleculen: expressie op B-lymfocyten, macrofagen, dendritische cellen, endotheelcellen en geactiveerde T-cellen
7
8 Structuur HLA molecuul
9 Structuur HLA molecuul
10 viral protein virus HLA class I /viral peptide cytotoxic recognition CD8+ Tcell
11 HLA-A variatie Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa AA Aa Aa Aa Aa Aa Aa A a Aa Aa Aa Aa Aa Aa AA Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa AA Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa
12 HLA polymorfisme herkent verschillende peptides Virale eiwitten Virale peptide HLA-A1 HLA-A2 HLA-A3 HLA-A11 + + + -- Response
13 January 2003 Polymorfisme HLA Aantal allelen per locus A B C DRB DQB1 DPB1 266 511 128 328 53 101 January 2014 A B C DRB DQB1 DPB1 2579 3285 2133 1512 509 248
14 Trombocyten transfusie?? HLA-A, HLA-B
15 Trombocyten transfusie HLA identiek HLA niet acceptabel HLA acceptabel HLA antistoffen?
16 HLA bepalingen tbv trombocytentransfusies HLA typeren: HLA overeenkomst donor en patiënt HLA antistoffen: aan- en afwezigheid specificiteit
17 HLA typering Serologie: bepaalt HLA moleculen op het cel oppervlak DNA typering: bepaalt HLA gen informatie
18 Serologische HLA typering Te typeren individu lymphocytes many different sera anti-hla antibodies
19 CDC: Complement Dependent Cytotoxicity
20 Serologische HLA typering negatieve reactie positieve reactie
21 Moleculaire HLA typering lage resolutie SSP = sequentie specifieke primer amplificatie SSO = sequentie specifieke oligo hybridisatie hoge resolutie SBT = sequence based typing (nucleotide volgorde)
22 PCR-SSP 5 3 3 5 PCR product 5 3 3 5 geen PCR product 3 mismatch + IC M -
23 PCR-SSO (Luminex technology)
24 Assays HLA ANTISTOF BEPALING LUMINEX SINGLE ANTIGENS HLA TYPERING PCR-SSO
25 PCR-SSO (Luminex) DNA bio BEAD 2 probe 2 PE rode laser: identificatie bead (probe) groene laser: detectie DNA binding
26 Sequence based typing
27 Resolutie van HLA typering en naamgeving serologisch DNA lage resolutie DNA intermediair DNA hoge resolutie A24 A*24 A*24 AMJ A*24 CGMH A*24:02:01:02 N molecuul allelgroep allelgroepcluster alleldefinitie
28 Nomenclatuur typering op DNA proteïn geeft verschillen aan in niet-coderend gebied (intron) HLA A * 24 : 02 : 01 : 02 N gen allel groep synonieme substitutie in het coderend gebied geeft verandering in expressie aan L = lage expressie N = nul allel
29 HLA antistoffen Vorming na contact met vreemde HLA antigenen: - zwangerschap - bloedtransfusie - transplantatie Vastgesteld mbv verschillende technieken: - Elisa - CDC - flow cytometrie (Luminex)
30 HLA antistoffen Aanwezigheid: er zijn wel of geen antistoffen aanwezig Elisa Specificiteit: antistoffen herkennen een bepaald antigen, bv A1, B12, DR13 etc %PRA kan worden doorgegeven CDC screening Luminex Single Antigens
31 ELISA
32 Luminex Single Antigen assay recipient blood + serum + Anti-IgG-PE
33 Luminex Single Antigen assay Commercial assays including the use of single antigen beads (Luminex) although the conformation of these molecules may be different than that of membrane bound HLA molecules. HLA-A1 HLA-A2 HLA-A3 HLA-B7
34 Specificity HLA antibodies > 4000
35 Trombocyten transfusie HLA identiek HLA niet acceptabel HLA acceptabel HLA antistoffen?
36 Trombocyten transfusie HLA identiek HLA niet acceptabel A2, 24, 33, 34, 68, 69 HLA acceptabel A1, 3, 11, etc HLA antistoffen A2, 24, 33, 34, 68, 69
37 Transplantatie Immunologie Laboratorium Weefseltypering Niertransplantaties HLA typeren * Ontvangers en evt hun familieleden * Donoren (postmortale en levende) HLA antistofbepalingen Kruisproeven Stamcel transplantaties Autoloog/familie/ongerelateerd (MUD) HLA typeren HLA antistofbepalingen Searchen en bepalen matchingsgraad donoren Chimerismebepaling na transplantatie Adviezen t.a.v. transplantatiemogelijkheden Associaties HLA met ziekte Coeliakie Bechterev (ankylosing spondylitis) HIV-medicatie (abacavir) Etc Trombocytensupport HLA typeren HLA antistofbepalingen Onderzoek
Transplantation Immunology Tissue Typing Laboratory Prof. Dr. Marcel G.J. Tilanus Office - Diana van Bakel Mieke Haemers Audrey van den Berg 38 Molecular Immunology - Dr. Christien Voorter - Lisette Groeneveld Kevin Gerritsen Timo Olieslagers Veerle Crijns Fausto Palusci Maud Limpens Christel Meertens Stefan Molenbroeck Sophie Onclin Veronique Vastmans Kim Beekers Bio-informatics - Dr. Mathijs Groeneweg Cellular immunology - Dr. Lotte Wieten Ilse Houba Fabienne Jeukens Serology - Dr. Joris Vanderlocht - Dr. Jennifer Schellekens - Sandra Piederiet - Coline van Groesen Thomas Habets Marjolijn van Tuijl Els Bielen Jacqueline Frijns Annette Rombach Esther Schaepkens