Chapter IX Samenvatting
Chapter 9 Inleiding Multiple Organ Dysfunction Syndrome (MODS) is een ernstige complicatie bij zwaar gewonde patiënten. MODS gaat gepaard met een hoog sterftecijfer (40 tot 60 %) en is het uiteindelijke gevolg van een voortdurende algehele (systemische) ontsteking, welke Systemic Inflammatory Response Syndrome (SIRS) wordt genoemd. Klinisch wordt SIRS gekarakteriseerd door de combinatie van twee of meer van de volgende symptomen: koorts of hypothermie (verlaagde temperatuur), versnelde hartslag, verhoogde ademhalingsfrequentie of hypocapnie (verlaagd CO 2 gehalte in het bloed) en leukocytose of leukopenie (een tijdelijk toe -of afname van de hoeveelheid witte bloedcellen). SIRS wordt verondersteld de eerste fase te zijn van een systemische respons als reactie op een plaatselijk ontstekingsproces. SIRS wordt in veel gevallen gekenmerkt door het vrijkomen van een overvloed aan ontsteking inducerende stoffen. Door het voortdurend vrijkomen van een overvloed van deze stoffen, kan de normaal gesproken voordelige ontstekingsreactie als gevolg van weefselschade, veranderen in een zelf-vernietigend proces. Dit kan uiteindelijk tot schade aan organen en zelfs tot orgaanfalen leiden. Hoewel er veel gegevens beschikbaar zijn met betrekking tot de aanwezigheid van bepaalde merkers (pro-ontstekingsmediatoren) in het bloed en de relatie tot SIRS en MODS, is de interpretatie van deze gegevens moeilijk. Verhoogde spiegels van het cytokine interleukine 6 (IL6) in het bloed correleren bijvoorbeeld met het risico dat een patiënt loopt om multi-orgaanfalen te ontwikkelen, maar het is nog steeds onbekend welke prikkel tot een overproductie van IL6 leidt. Aangezien de hoogte van cytokine productie gerelateerd lijkt te zijn aan de mate van weefselschade, zou een lokale ontsteking en de productie van cytokines in de weefsels belangrijk kunnen zijn bij het initiëren van systemische ontsteking. Immers, wanneer plaatselijke activering in de beschadigde weefsels te lang aanhoudt, kunnen lokaal geproduceerde ontstekingsmediatoren in het bloed en daarmee in de rest van het lichaam terechtkomen. Hierdoor zou een ongecontroleerde reactie in gang gezet kunnen worden, die in een aantal gevallen uiteindelijk tot multi-orgaanfalen leidt. In dit proefschrift wordt de vroeg lokale ontstekingsreactie als gevolg van weefselschade onderzocht bij trauma patiënten. Als standaard model werd de plaatselijke weefsel activatie als gevolg van een gesloten bovenbeenbreuk gekozen. Niet alleen de lokale ontstekingsreactie in het algemeen, maar vooral de productie van pro-ontstekingscytokines werd onderzocht in weefsels (huid, spier en vetweefsel) rondom de breuk en vergeleken met onbeschadigde weefsels die verder van de breuk waren verwijderd. 128
Samenvatting Om lokaal -in weefsels zoals huid-, cytokines aan te tonen, is het belangrijk om een gevalideerde methode te gebruiken en de basale cytokine niveaus te kennen. De literatuur is niet eenduidend over de aanwezigheid van het cytokine TNFα in normale humane huid. Daarom hebben we in Hoofdstuk 2, tien verschillende antilichamen, gericht tegen humaan TNFα, getest op hun geschiktheid om dit cytokine in weefsel aan te tonen. In de eerste plaats werden de antilichamen getest op immunoreactiviteit op geactiveerde monocyten (cellen waarvan bekend is dat ze TNF aanmaken). Vervolgens werden ze met behulp van Western blot getest op binding aan recombinant TNFα. Tenslotte werden de antilichamen getest op vriescoupes van normale humane huid. TNFα bleek aanwezig te zijn in normale huid, echter de verschillende antilichamen lieten verschillende aankleuringspatronen zien. Hoewel sommige antilichamen in staat bleken TNFα aan te tonen, zijn ze niet per definitie geschikt om TNFα in menselijke huid te bestuderen. De resultaten benadrukken dat voor het ondubbelzinnig interpreteren van gegevens, het belangrijk is dat duidelijk vermeld wordt welk protocol, welk antilichaam en welke concentratie van het antilichaam gebruikt is. Bovendien is het gebruik van de juiste controles essentieel. De lokale ontsteking als gevolg van het doorbreken van de epitheelbarrière, zoals plaatsvindt bij incisie van de huid, is beschreven in Hoofdstuk 3. Bij vaatchirurgische patienten werd bij de aanvang van de operatie (onder aseptische omstandigheden) in de lies op standaardwijze een huid biopsie genomen. Na vaste tijden werd van de wondrand een nieuw biopt genomen om de ontstekingsreactie in de tijd te kunnen volgen. We vonden dat incisie van de huid inderdaad een lokale ontstekingsreactie veroorzaakt. Dit werd aangetoond door een in de tijd snelle toename van het aantal infiltrerende granulocyten, parallel met de expressie van E-selectine op endotheel. Er kan geconcludeerd worden dat in afwezigheid van schadelijke exogene stoffen en onder aseptische omstandigheden, een milde ontstekingsreactie opgewekt wordt in de huid. In Hoofdstuk 4, werd de lokale ontstekingsreactie als gevolg van incisie van de huid vergeleken met een ontstekingsreactie die het gevolg is van een bewezen bacteriële infectie en met een mogelijke ontstekingsreactie in humane huid ten gevolge van een breuk van het bovenbeen. Zoals beschreven in hoofdstuk 3 leidde incisie van de huid tot het infiltreren van granulocyten en E- selectine expressie. In de geï nfecteerde huid werd naast granulocyten een toename in het aantal monocyten/macrofagen en T-cellen waargenomen. Ook werd een verhoogde expressie van E-selectine, VCAM-1, ICAM-1 en proontstekingscytokines geconstateerd. Huidbiopten afkomstig van patienten met een gesloten bovenbeenbreuk toonden geen tekenen van ontsteking. Uit deze 129
Chapter 9 resultaten kan geconcludeerd worden dat verschillende vormen van schade aan de huid bestaan, die verschillende ontstekingspatronen induceren. In Hoofdstuk 5, werd de lokale ontstekingsreactie en met name de cytokine productie als gevolg van stomp letsel, d.w.z. een gesloten breuk van het bovenbeen, in detail bestudeerd. Huid rondom de gesloten bovenbeenbreuk werd vergeleken met huid van dezelfde patiënt op een plaats waar geen letsel aanwezig was. Biopten werden geanalyseerd met behulp van immunohistochemie, electronen microscopie, ELISA en RT-PCR. Huid rondom de breuk, maar ook de huid op afstand vertoonde slechts een geringe activatie, zoals afgeleid uit de aanwezigheid van IL1β en IL6 mrna en E-selectine, TNFα en IL6 eiwit expressie. Electronen miscroscopie liet zien dat er een grote variatie is in de activatietoestand van endotheelcellen. Er werd aangetoond dat humane huid niet direct geactiveerd wordt als gevolg van een breuk van het bovenbeen. Lokale ontsteking in de huid is beperkt en draagt waarschijnlijk niet bij aan de systemische ontstekingsreacties die vaak bij ongevalspatiënten worden gezien. Aangezien we geen duidelijke activatie in huid konden aantonen, werden tekenen van een vroege plaatselijke ontstekingsreactie gezocht in weefsels dichter bij het gebroken bot, d.w.z. spier en vetweefsel. De resultaten zijn beschreven in Hoofdstuk 6. Daarnaast werd naast een lokale ontstekingsreactie ook de mogelijke aanwezigheid van een systemische ontstekingsreactie onderzocht door pro-ontstekingscytokines in het bloed te bepalen van patiënten met een gesloten breuk van het bovenbeen. Stomp letsel induceert de activatie van onderhuids vetweefsel. Dit bleek uit een duidelijke toename van de gemeten IL6 en IL8 niveaus in weefsel vlakbij de breuk in vergelijking met weefsel op afstand. RT- PCR experimenten bevestigen dat de toename van cytokines het resultaat is van daadwerkelijke productie door vetweefsel zelf. In spierweefsel daarentegen was met behulp van immunohistochemie en RT-PCR geen lokale ontsteking of cytokine productie zichtbaar. Op één patiënt na, vertoonden alle patiënten een matige systemische reactie zoals zichtbaar is door de verhoogde systemische IL6 en IL8 spiegels. Mechanische schade als gevolg van een gesloten bovenbeenbreuk induceert alleen cytokine productie in vetweefsel en niet in spierweefsel. Als we deze resultaten doortrekken naar de situatie bij patiënten met ernstige verwondingen, dan kan geconcludeerd worden dat een plaatselijke initiële ontstekingsreactie in vetweefsel een oorzaak kan zijn van de snelle verhoogde systemische IL6 niveaus als gevolg van een ongeval. Hoofdstuk 7 tracht de resultaten van de verschillende studies met betrekking tot vroege lokale ontsteking als gevolg van weefselbeschadiging te integreren. De belangrijkste conclusie is dat stomp letsel geen klassieke ontstekingsreactie in de huid en spier, zoals gekarakteriseerd door infiltrerende 130
Samenvatting granulocyten, veroorzaakt. Echter, stomp letsel zou via het lokaal in werking zetten van een ontstekingsreactie kunnen leiden tot systemische ontsteking. Aangedaan vetweefsel rondom de breuk lijkt hieraan de voornaamste bijdrage te leveren. 131
Chapter 9 132