Handleiding Uitvoeren gevoeligheidstesten melkmonsters
Voorwoord Het op de juiste manier inzetten van diergeneesmiddelen, waaronder de onderbouwing voor het toepassen van antibiotica, is van groot belang. Als partner in uiergezondheid ondersteunen wij veehouders en dierenartsen met het nemen van melkmonsters, voor bacteriologisch onderzoek en gevoeligheidstesten. Deze handleiding is bedoeld voor dierenartsenpraktijken, die zelf melkmonsters onderzoeken. De handleiding gaat niet in op het uitvoeren van bacteriologisch onderzoek en de kiem identificatie. Het beschrijft de uitvoering van disk diffusie gevoeligheidstesten en de interpretatie ervan. Hopelijk draagt deze handleiding bij aan kwalitatief goede gevoeligheidstesten en plezier in de uitvoering. Met vriendelijke groet, Monique Driesse Van links naar rechts: Edzard van Delden, Elzo Kannekens, Arjon Velthoen, Ferry ten Brinke, Wim Hondelink, Mylène Handgraaf, Harmannus Harkema en Monique Driesse 2
Methode en richtlijnen Disk diffusie Tips: Mueller Hinton agar, (paper)disk, confluente groei Richtlijnen 1) EUCAST 2) CLSI Bewaar de paperdisks, inclusief die in dispensers, in afgesloten containers (beschermd tegen licht) met een droogmiddel. Sla de voorraad disks op bij -20 C, tenzij anders aangegeven door de leverancier. Als dit niet mogelijk is, sla de disks dan op beneden 8 C. Bewaar de werkvoorraad disks beneden 8 C. Om condensvorming te voorkomen, laat de disks op kamertemperatuur komen voor het openen van de containers. Gooi disks na het verstrijken van de expiratie datum weg via de juiste afvalroute. 3
Instructie Volgens EUCAST/ CLSI methode Bereiding van het inoculum Neem minimaal 3-5 identieke kolonies van de (bloed) agar plaat met een steriele entnaald of swab en suspendeer in 4-5 ml 0.9% NaCl. De dichtheid van de kolonie suspensie (inoculum) moet gelijk zijn aan 0,5 McFarland. Het wordt aanbevolen om een density meter te gebruiken voor de juiste dichtheid van het inoculum. Als alternatief kan een 0,5 McFarland standaard gebruikt worden voor visuele standaardisering. Schud de standaard goed voor gebruik en bekijk het inoculum en de standaard tegen een witte achtergrond met horizontale zwarte lijnen. Aanpassing van de dichtheid kan door meer bacteriën toe te voegen of door meer zoutoplossing toe te voegen. Het aanbrengen van het inoculum Gebruik het inoculum bij voorkeur binnen 15 minuten na bereiding. Dit inoculum met een steriele swab op een Mueller Hinton (MH) agar enten. Druk de swab tegen de zijkant van de buis, om overtollige vloeistof te verwijderen. Dit is belangrijk om overbeënting te voorkomen, met name bij Enterobacteriaceae. Bestrijk de gehele MH plaat en herhaal deze procedure 2 x, roteer de plaat elke keer 60, om een gelijkmatige verdeling te krijgen. Het aanbrengen van de disks Breng de disks aan binnen 15 minuten na het aanbrengen van het inoculum (anders gaan de bacteriën al groeien voordat de disks zijn opgebracht, waardoor de remmingszones kunnen afwijken). Voor Streptococcen adviseert EUCAST MH-F agar (Mueller Hinton agar met 5% paardenbloed en 20 mg/l beta-nad) en CLSI adviseert hiervoor MH agar met 5% schapenbloed. Breakpoints van betreffende bronnen zijn tot stand gekomen en gestandaardiseerd met betreffende platen. De paper disks op de beënte MH leggen en licht aandrukken. Geadviseerd wordt om niet meer dan 6 disks op een (standaard) plaat van 90 mm te gebruiken (anders kunnen de zones niet goed gemeten worden). 4
Incubatie van de platen Beoordeling van de platen De plaat omdraaien en binnen 15 minuten na het aanbrengen van de disks in een stoof zetten. Het stapelen van platen kan de verspreiding van warmte in een stoof beïnvloeden. Incubeer de platen gedurende 16-20 uur op 35 ± 2 C, voor het aflezen van de gevoeligheid. Voor staphylococcen en enterococcen de plaat na 24 uur beoordelen (CLSI). Zet indien mogelijk Enterobacteriaceae en staphylococcen bij gewone lucht in de stoof en streptococccen bij 4-6% CO 2 in de stoof (CO 2 verrijkt). Beoordeel de groei op de platen. Een juist inoculum resulteert in een confluente, gelijkmatige groei met ronde inhibitie zones. Als individuele kolonies zichtbaar zijn is het inoculum te licht en moet de test opnieuw ingezet worden. Opmeten van zones en interpretatie De diameter van de remmingszones (inclusief de diameter van de disk) opmeten in mm. De zones vertalen naar gevoelig, intermediair of resistent (ongevoelig), volgens de criteria. 5
Criteria en interpretatie Resistent Gevoelig Criteria voor disk diffusie (melkmonsters) Gram positief panel - Staphylococcen en streptococcen Intermediair Voorstel (preliminaire) criteria Disk antibioticum en lading Amoxicilline + clavulaanzuur 20 + 10 µg (Benzyl)penicilline 1 unit Cefalexine + kanamycine 15 + 30 µg Cefoxitin 30 µg (Mec-A screen) Clindamycine 2 µg (lincomycine) Erythromycine 15 µg (tylosine) Kanamycine 30 µg Nafcilline + penicilline + streptomycine 35 µg Neomycine 10 µg (framycetine) Oxacilline 1 µg (cloxacilline) Penicilline + framycetine 10 i.u. + 100 µg Pirlimycine 2 µg Trimethoprim + sulfamethoxazole 1.25 + 23.75 µg Criteria volgens Clsi Eucast Fabr. Eucast Eucast Eucast Clsi Fabr. Voorst. Clsi Fabrikant Clsi Eucast Kiemen Staph Staph Strep Staph + Sau Cns Staph Strep Staph + Staph + Staph + Sau Sau Staph Staph Strep Staph + Staph Strep Strep Strep Strep Strep Strep 16 22 14 16 18 21 16 13 16 13 16 10 9 14 16 16 9 12 13 17 23 15 17 19 22 17 14 17 14 17 11 10 15 17 17 10 13 14 Remmingszone 18 24 16 18 20 23 18 15 18 15 18 12 11 16 18 18 11 14 15 19 25 17 19 21 24 19 16 19 16 19 13 12 17 19 19 12 15 16 20 26* 18 20 22 25 20 17 20 17 20 14 13 18 20 20 13 16 17 21 27 19 21 23 26 21 18 21 18 21 15 14 19 21 21 14 17 18 22 28 20 22 24 27 22 19 22 19 22 16 15 20 22 22 15 18 19 Voor toelichting, zie pagina 8
Resistent Gevoelig Criteria voor disk diffusie (melkmonsters) Gram negatief panel - Enterobacteriaceae Intermediair Voorstel (preliminaire) criteria Disk antibioticum en lading Amoxicilline + clavulaanzuur 20 + 10 µg Ampicilline 10 µg Cefalexine 30 µg Cefalexine + kanamycine 15 + 30 µg Cefoxatime 5 µg (ESBL/AmpC) Kanamycine 30 µg Nafcilline + penicilline + streptomycine 35 µg Neomycine 10 µg (framycetine) Penicilline + framycetine 10 i.u. + 100 µg Trimethoprim + sulfamethoxazole 1.25 + 23.75 µg Criteria volgens Specifieke kiemen Remmingszone Eucast Eucast Eucast Fabrikant Eucast Clsi Fabrikant Voorstel Fabrikant Eucast E. coli E. coli 13 10 10 16 16 13 16 8 13 11 14 11 11 17 17 14 17 9 14 12 15 12 12 18 18 15 18 10 15 13 16 13 13 19 19 16 19 11 16 14 17 14 14 20 20 17 20 12 17 15 18 15 15 21 21 18 21 13 18 16 19 16 16 22 22 19 22 14 19 17 Voor toelichting, zie pagina 8
Toelichting op beide tabellen * Remmingszone beoordelen tegen het licht gehouden (doorvallend licht): 26 met scherpe rand -> resistent tegen penicilline, amox/ampicilline. 26 met vage, wazige rand -> penicilline gevoelig. Criteria zijn remmingszones in mm. Remmingszones aangegeven in groen of groter aanmerken als gevoelig. Remmingszones aangegeven in oranje aanmerken als intermediair. Remmingszones aangegeven in rood of kleiner aanmerken als resistent. Note: Criteria kunnen veranderen, zie EUCAST website of meest recente CLSI document. 8
Specifieke instructies De aanwezigheid van stoffen met antagonistische werking in het medium (agar) kan resulteren in vage groei tot aan de disk bij sulfonamide en trimethoprim zones. Geadviseerd wordt om deze groei te negeren en af te lezen op 80% groei inhibitie. Bij het testen van Enterobacteriaceae en ampicilline, wordt geadviseerd om groei die eruitziet als een dunne laag, die een binnenste zone vormt, te negeren. Bij hemolytische streptococcen op MH-F medium, lees de inhibitie van groei af en niet de inhibitie van hemolyse. Voor het testen op induceerbare lincosamide (lees clindamycine) resistentie is het nodig dat een erythromycine disk naast de clindamycine disk wordt geplaatst (D-test). Bij een onderlinge afstand van 26 mm kan de inductie nog steeds goed worden aangetoond. De aanwezigheid van induceerbare lincosamide resistentie is te herkennen als een deuk in de remmingszone van de clindamycine (aan de kant van de erythromycine disk). De kiem wordt dan afgeven als resistent tegen alle lincosamides (clindamycine, lincomycine en pirlimycine). Om induceerbare resistentie te kunnen vinden, wordt geadviseerd om te testen met clindamycine en erythromycine, dit kan niet met pirlimycine. Sommige typen van lincosamide resistentie worden geïnduceerd door de aanwezigheid van een macrolide (zoals erythromycine). 9
Kwaliteitscontroles Kwaliteitscontroles Voor het beoordelen van de routine uitvoering van de disk diffusie methode en de interpretatie van de resultaten, wordt geadviseerd om wekelijks kwaliteitscontroles uit te voeren met controle stammen. Gebruik de controle stammen ATCC 29213 Staphylococcus aureus, ATCC 25922 Escherichia coli en ATCC 49619 Streptococcus pneumoniae (volgens CLSI, EUCAST of fabrikant). Referenties CLSI Approved Standard third Edition M31-A3. CVI criteria disk diffusie 26-4-2013. Fiebelkorn 2003 Practical disk diffusion method for detection of inducible clindamycin resistance in Staphylococcus aureus and coagulase-negative staphylococci. EUCAST Disk Diffusion Method for Antimicrobial Susceptibility Testing - Version 3.0 (April 2013). EUCAST Reading Guide EUCAST disk diffusion method for antimicrobial susceptibility testing Version 3.0 April 2013. EUCAST breakpoint table v 3.1 2013-02-11. Pillar 2009 Evaluating the in vitro susceptibility of bovine mastitis pathogens to a combination of kanamycin and cefalexin: recommendations for a disk diffusion test. Pillar 2013 Development of a disk diffusion test for evaluating susceptibility of mastitis field isolates to Ubrostar. Silley 2012 Susceptibility of coagulase-negative staphylococci to a kanamycin and cefalexin combination. 10
Dankwoord Deze handleiding is mede tot stand gekomen dankzij de goede suggesties en adviezen van Marielle Melchior. Deze handleiding 2013 is onderdeel van UbroCare en is aangeboden door: Boehringer Ingelheim Partner in uiergezondheid Voor meer informatie kunt u contact opnemen met: Boehringer Ingelheim bv Postbus 8037, 1802 KA Alkmaar vetmedica.nl@boehringer-ingelheim.com Telefoon: +31 (0)72 566 24 11 Fax: +31 (0)72 564 32 13 11