Experimentele therapie bij duchenne-spierdystrofie

STAND VAN ZAKEN Experimentele therapie bij duchenne-spierdystrofie Janneke C. van den Bergen, Chiara S.M. Straathof, Annemieke Aartsma-Rus, Ieke B. Ginjaar en Jan J.G.M. Verschuuren Duchenne-spierdystrofie is een X-chromosomaal gebonden spieraandoening. Door het ontbreken van het eiwit dystrofine is de stabiliteit van het spiermembraan verminderd. Dit leidt tot progressieve spierzwakte vanaf de kinderleeftijd. Het ziektebeloop kan men vertragen met corticosteroïden, maar de ziekte is verder nog niet te behandelen. Mogelijke therapieën waarnaar onderzoek wordt gedaan betreffen zowel mutatiespecifieke medicijnen, bijvoorbeeld de antisense -oligonucleotiden ( exon skippen ), als therapieën die mogelijk ook bij andere spierziekten gebruikt kunnen worden. Daarbij kan men denken aan inhibitie van spierdegeneratie en stimulatie van spierherstel. Dit artikel geeft een overzicht van de therapeutische ontwikkelingen rondom duchenne-spierdystrofie. KLINISCHE PRAKTIJK De therapeutische mogelijkheden op het gebied van duchenne-spierdystrofie, een erfelijke spierziekte, maken een ongekend snelle ontwikkeling door. Wereldwijd zijn op dit moment meer dan 30 verschillende vormen van therapie in ontwikkeling, waarbij voor 11 de fase van klinische trials is bereikt (tabel). De betreffende onderzoeken richten zich op het herstellen van het primaire gendefect, de aanmaak van dystrofine, en het beperken van de gevolgen hiervan, door bijvoorbeeld het remmen van spierschade en het bevorderen van spierherstel. Veel van deze behandelstrategieën zijn mogelijk ook toepasbaar bij andere spieraandoeningen. Dit hangt af van het werkingsmechanisme van het toegepaste medicament. Op deze wijze kunnen de ontwikkelingen op het gebied van deze invaliderende, progressieve spierziekte een voorbeeld zijn voor andere neuromusculaire ziekten. Momenteel zijn dan ook over de hele wereld onderzoekers op zoek naar een behandeling voor duchenne-spierdystrofie. In dit artikel geven we een overzicht van de ontwikkelingen. DUCHENNE-SPIERDYSTROFIE Leids Universitair Medisch Centrum, Leiden. Afd. Neurologie: drs. J.C. van den Bergen, arts in opleiding tot neuroloog; drs. C.S.M. Straathof en dr. J.J.G.M. Verschuuren, neurologen. Afd. Humane en Klinische Genetica: dr. A. Aartsma-Rus en dr. I.B. Ginjaar, moleculair genetici. Contactpersoon: drs. J.C. van den Bergen (j.c.van_den_bergen@lumc.nl). Duchenne-spierdystrofie is een erfelijke spierziekte, waar in Nederland ongeveer 500 jongens en mannen aan lijden. De ziekte openbaart zich meestal op de peuterleeftijd met zwakte van de bovenbeenspieren, waardoor problemen ontstaan met opstaan en lopen en waardoor patiënten frequent vallen. Door progressie van de spierzwakte komen de jongens tussen hun 9e en 12e jaar in een rolstoel terecht. In de tienerjaren ontwikkelt zich vaak een scoliose, die soms een operatieve correctie noodzakelijk maakt. In de adolescentie ontstaat een gedilateerde cardiomyopathie en toenemende zwakte van de ademhalingsspieren. De toepassing van thuisbeademing NED TIJDSCHR GENEESKD. 2009;153:B298 1

KLINISCHE PRAKTIJK TABEL Overzicht van de experimentele therapieën voor duchennespierdystrofie die zich in een klinische onderzoeksfase bevinden therapie beloop fase I fase II herstellen dystrofine-expressie exon-skipping 2 -O-methylgemodificeerd ribose gestart morfolino-oligomeren gestart read-through PTC124 gestart gentamicine gentherapie raav-vector gestart biologische nanopartikels opregulatie utrofine SMT C1100 gepland remmen spierafbraak proteaseremming salbutamol stabilisatie mestcellen oxatomide proteolyseremming glutamine, creatine bevorderen spierherstel stamceltransplantatie autologe CD133+-stamcellen mesangioblasten gepland TGF-β-inhibitie losartan gepland MYO-029 overige antioxidanten idebenon co-enzym Q10 inhibitie fibrosering pentoxifylline = nog niet gepland; raav = recombinant adenogeassocieerd virus; TGF-β = transformerende groeifactor β. vanaf de jaren negentig van de vorige eeuw heeft de levensverwachting van duchenne-patiënten verhoogd van 15-20 naar 25-30 jaar. De spierzwakte bij duchenne-spierdystrofie wordt veroorzaakt door het ontbreken van dystrofine. Dit eiwit heeft een stabiliserende invloed op het spiermembraan, door het cytoskelet met de extracellulaire matrix te verbinden. Wanneer dystrofine afwezig is, verliest het spiermembraan de stabiliteit die het nodig heeft bij spiercontractie. Dit leidt tot schade aan het membraan en via diverse processen uiteindelijk tot spierverval. Het ontbreken van dystrofine is het gevolg van een defect in het dystrofinegen, gelegen op het X-chromosoom. Vele verschillende mutaties in dit gen kunnen leiden tot duchenne-spierdystrofie. Dit betreft zowel grote deleties en duplicaties als puntmutaties. Bij een grote deletie of duplicatie zijn één of meerdere exonen, die de coderende informatie van het gen bevatten, betrokken. Een puntmutatie is een afwijking van slechts één of enkele nucleotiden binnen één exon. Diagnostisch onderzoek naar de verschillende genetische defecten bij duchenne-patiënten vindt in Nederland plaats in het Leids Universitair Medisch Centrum. HERSTEL DYSTROFINE-EXPRESSIE De ultieme behandeling van duchenne-spierdystrofie is erop gericht het dystrofine-eiwit tot expressie te brengen in de spiervezels. Gezien het grote aantal verschillende mutaties zal zo n causaal gerichte therapie om maatwerk vragen. EXON-SKIPPING : HERSTEL VAN HET LEESRAAM Recentelijk besteedden de media veel aandacht aan een mogelijke doorbraak in de behandeling van duchennespierdystrofie. Aanleiding was de publicatie van de onderzoeksresultaten van de in Nederland uitgevoerde exon-skipping -trial. Met exon-skipping probeert men de verstoring van het leesraam van het dystrofinegen te herstellen (figuur 1a). Een deletie of duplicatie leidt vaak tot een aantasting van dit leesraam. Zoals bekend coderen in het RNA steeds groepjes van 3 nucleotiden voor één aminozuur. Door de deletie of duplicatie verschuiven nucleotiden en zal meestal een onzincode ontstaan. Hierdoor wordt de productie van het eiwit vroegtijdig beëindigd en wordt dus geen functioneel dystrofine gevormd. Het is mogelijk om één specifiek exon in het RNA over te slaan of te skippen tijdens het RNA-splicingsproces. Dat gebeurt met een antisense -oligonucleotide, een klein stukje gemodificeerd RNA dat specifiek aan een exon van het RNA kan binden. Door het skippen van het gemuteerde exon treedt herstel van het leesraam op, waardoor een verkort, maar wel functioneel dystrofineeiwit gemaakt kan worden. De verwachting is dat dit zal leiden tot een klinisch minder ernstig ziektebeloop, zoals men ziet bij becker-spierdystrofie. Bij deze spieraandoening is er ook een mutatie in het dystrofinegen, maar zodanig dat het leesraam niet verstoord wordt. Deze patiënten hebben dus een afwijkend, maar gedeeltelijk functioneel dystrofine. De klinische verschijnselen van becker-spierdystrofie beslaan een spectrum dat varieert van alleen een verhoogde serumcreatinekinasewaarde of spierkrampen tot meer ernstige vormen met progressieve spierzwakte. De levensver- 2 NED TIJDSCHR GENEESKD. 2009;153:B298

A A B B KLINISCHE PRAKTIJK C C a FIGUUR (a) Het principe van exon-skipping A is de normale situatie. De RNA-code wordt in eenheden van 3 nucleotiden ( letters ) gelezen en vertaald in aminozuren, waardoor een goed leesbare zin ontstaat. Er vormt zich normaal dystrofine. B is een situatie bij duchenne-spierdystrofie. Door een deletie verschuift het leesraam, waardoor onzinwoorden ontstaan en de zin niet meer te lezen is. De productie van dystrofine wordt afgebroken omdat er een onleesbare code is ontstaan. C laat zien wat exon-skipping-therapie doet. Door met antisense - oligonucleotiden (AON) een onderdeel van de code te skippen (in het voorbeeld de letters A en F, in de cel een gemuteerd exon), ontstaat weer een leesbare zin, waarin echter een woord ontbreekt. De aminozuurketen van dystrofine wordt verkort, maar het geproduceerde dystrofine is wel voor een deel functioneel. b (b) Het principe van read-through. A is de normale situatie. De RNA-code wordt in eenheden van 3 nucleotiden ( letters ) gelezen en vertaald in aminozuren, waardoor een goed leesbare zin ontstaat. Er vormt zich normaal dystrofine. B is een situatie bij duchenne-spierdystrofie. Door een puntmutatie is een nucleotide veranderd (hier letter B>R). De nieuwe code (hier: ROB) wordt herkend als stopsignaal. De productie van dystrofine wordt vroegtijdig afgebroken. C laat zien wat read-through-therapie doet. De stof PTC124 zorgt ervoor dat het stopsignaal genegeerd en gecorrigeerd wordt en de zin weer volledige leesbaar wordt. Er wordt normaal dystrofine geproduceerd. wachting van mensen met een vorm van becker-spierdystrofie is beter dan van mensen met duchenne-spierdystrofie. READ-THROUGH : STOPCODONS NEGEREN Wereldwijd loopt in 37 centra een fase IIb-trial met PTC124, tegenwoordig ataluren genoemd. Deze chemische stof zorgt dat vroegtijdige stopsignalen, veroorzaakt door puntmutaties in het dystrofinegen, genegeerd worden. Door het negeren van het stopsignaal op messenger - RNA(mRNA)-niveau wordt de productie niet onderbroken en kan zich een volledig dystrofine-eiwit vormen (zie figuur 1b). Deze therapievorm werd ontdekt toen de eigenschappen van de aminoglycosiden werden ontrafeld, waaronder gentamicine, die de eiwitproductie in bacteriën kunnen verstoren. Aminoglycosiden hebben een soortgelijk effect op humane cellen, waarin zij oneigenlijke stopsignalen onderdrukken door interactie met ribosomen. In tegenstelling tot behandeling met gentamicine liet de fase I-studie van PTC124 geen nefro- of ototoxiciteit zien. Stopcodons negeren door middel van PTC124 is ook toepasbaar bij andere erfelijke, ook niet-neuromusculaire aandoeningen waarbij sprake is van een vroegtijdig stopcodon. Een bekend voorbeeld is cystische fibrose. GENTHERAPIE Exon-skipping en read-through zijn technieken die aangrijpen op het RNA, maar het gemuteerde gen ongemoeid laten. Het zijn dus geen van beide vormen van gentherapie. Gentherapie probeert daadwerkelijk het onderliggende genetische defect definitief te repareren, een functioneel dystrofinegen in de spiervezels te brengen en daardoor de eiwitaanmaak te herstellen. Het grootste probleem van dergelijke therapieën is om het nieuwe gen ín de cellen van het weefsel van keuze te krijgen. De meest toegepaste methode om dit te bereiken maakt gebruik van een virale vector. Voor het transporteren van genen naar de spier is het NED TIJDSCHR GENEESKD. 2009;153:B298 3

KLINISCHE PRAKTIJK adenogeassocieerde virus (AAV) de geschiktste vector. Doordat het dystrofinegen zeer groot is, is het inbouwen in een virale vector echter moeizaam; de vectoren kunnen niet de gehele coderende sequentie bevatten. Daarom wordt momenteel gekeken naar de mogelijkheden van een minidystrofinegen, dat slechts een deel van het coderende materiaal van het gen bevat (www.clinicaltrials. gov, zoek op mini dystrophin ). De expressie van dit kleinere gen zal, net als bij exon-skipping, leiden tot een gedeeltelijk herstel van de spierfunctie en dus tot een becker-fenotype. Er wordt ook onderzoek gedaan naar eiwitten of synthetische, virusachtige biological nano particles, die het product adequaat zouden kunnen afleveren bij de spiervezels (www.askbio.com/bnp.html). UTROFINE Naast therapieën gericht op de expressie van dystrofine in het spiermembraan, zijn er methoden die proberen de functie van het dystrofine door een ander eiwit te laten overnemen. Een goede kandidaat hiervoor is utrofine. Dit membraaneiwit komt normaal met name in de neuromusculaire overgang tot expressie en de structuur lijkt op die van dystrofine. Onderzoek bij de zogeheten mdxmuis, een diermodel voor duchenne-spierdystrofie, liet zien dat utrofine de stabiliserende functie van dystrofine in het spiermembraan kan overnemen. Door overexpressie van het eiwit kon de progressie van de spierzwakte worden vertraagd. REMMEN VAN SPIERAFBRAAK De afwezigheid van dystrofine heeft een verminderde stabiliteit van het spiermembraan bij contractie tot gevolg. Hierdoor raakt het membraan beschadigd, wat via diverse processen uiteindelijk leidt tot spierafbraak. Door beïnvloeding van deze processen tracht men de spierschade te beperken. ONTSTEKINGSREMMING Ontstekingsremming is waarschijnlijk de basis voor het remmende effect van corticosteroïden op duchennespierdystrofie. Er zijn medicijnen in ontwikkeling die wellicht een meer gerichte inhibitie geven van de ontstekingsreactie bij duchenne-spierdystrofie, door bijvoorbeeld CD4- en CD8-gemedieerde T-cellen selectief te remmen of mestcellen te stabiliseren. Mogelijk hebben deze medicijnen ook een gunstiger bijwerkingenprofiel dan corticosteroïden. BEVORDEREN VAN SPIERHERSTEL Tot slot is ook de stimulatie van spierregeneratie een therapeutische mogelijkheid bij duchenne-spierdystrofie. Dit kan onder andere door het inhiberen van transformerende groeifactor(tgf)-β, dat spierregeneratie remt en daardoor een negatief effect heeft op de spiermassa. Maar ook insulineachtige groeifactor(igf)-1, trichostatine A en stikstofmonoxide (NO) lijken een positief effect te hebben op het herstel van spiervezels. Daarnaast wordt onderzoek gedaan naar stamceltransplantatie. Stamceltransplantatie is erop gericht de voorraad satellietcellen aan te vullen om zo de schade aan spiervezels te herstellen. De continue cyclus van schade en herstelpogingen put de voorraad satellietcellen uit, waardoor na verloop van tijd de regeneratie van spiervezels stagneert en vervetting en fibrosering van de spieren de overhand krijgen. Momenteel wordt onderzoek gedaan naar celgroepen die als satellietcel in de spiervezels kunnen dienen. Obstakels bij deze behandeling zijn het verkrijgen van een systemische toedieningsweg en de mogelijke immunologische reactie tegen de stamcellen. De hoopgevendste stamceltherapie van dit moment maakt gebruik van mesangioblasten. Deze cellen, afkomstig uit de vaatwand, lijken in staat te zijn de vaatwand te passeren en te differentiëren tot spiercellen. Een onderzoek waarbij dystrofische honden intra-arterieel allogene mesangioblasten toegediend kregen, leidde tot expressie van dystrofine in de spiervezels, een normaal morfologisch beeld van de spiervezels en een toename van de contractiekracht. Het klinisch resultaat was dat de honden hun mobiliteit behielden. Een Italiaanse klinische trial met mesangioblasten staat gepland. REMMING VAN EIWITAFBRAAK Door de beschadiging van het spiermembraan lekken calciumionen de spiervezel in. Deze zorgen voor spierafbraak onder andere door het proteolytische eiwit calpaïne te activeren. Met diverse medicijnen tracht men de activatie van calpaïne en andere proteasen te voorkomen en daarmee de spierafbraak te remmen. OVERIGE VORMEN VAN THERAPIE In diverse centra wordt onderzoek gedaan naar therapeutische mogelijkheden die hierboven niet aan bod zijn UITLEG RNA- splicing : door transcriptie van DNA ontstaat pre-messenger - RNA (pre-mrna). Dit bevat exonen, waarvan het RNA codeert voor aminozuren, en intronen die dat niet doen. In het splicingsproces worden de intronen uit het pre-mrna geknipt en de exonen aan elkaar verbonden tot het uiteindelijke mrna. 4 NED TIJDSCHR GENEESKD. 2009;153:B298

LEERPUNTEN Duchenne-spierdystrofie is een X-chromosomaal gebonden spieraandoening, waarbij het gen voor dystrofine, een spiereiwit, is gemuteerd. Er zijn verschillende therapieën in ontwikkeling, die gericht zijn op het herstellen van de dystrofine-expressie, remming van de spierafbraak of bevordering van spierherstel. De dystrofine-expressie in spiervezels kan onder meer hersteld worden door exon-skipping en door stoffen die zorgen dat het aflezen van het messenger-rna niet voortijdig stopt ( readthrough ). Naar deze twee technieken is klinisch fase II-onderzoek gestart. gekomen. Hierbij gaat het bijvoorbeeld om medicijnen die de energieproducerende functie van mitochondriën in de spiercel verbeteren, cardiale therapieën met L-arginine voor coronaire vaatverwijding en stimulatie van antioxidantia voor de remming van spierschade. Alle therapiemogelijkheden in een klinische fase zijn te vinden in de tabel. Nederland is te vinden op www.lumc.nl/duchenne en op de website van de patiëntenverenigingen www.vsn.nl en www.duchenne.nl. CONCLUSIE Er zijn momenteel veelbelovende ontwikkelingen op het gebied van de behandeling van duchenne-spierdystrofie, waarin Nederland een actieve rol speelt. De behandelingen grijpen in op diverse processen die betrokken zijn bij de aandoening, van vervanging van het gemuteerde gen tot stimuleren van spierherstel. Een aantal van deze behandelstrategieën is in de toekomst mogelijk ook breder toepasbaar, bij andere erfelijke of neuromusculaire ziekten. Wetenschappelijke ontwikkelingen bij duchennespierdystrofie vervullen hierin een voortrekkersrol. Belangenconflict: geen gemeld. Financiële ondersteuning: de auteurs participeren in Translational Research in Europe Assessment and Treatment of Neuromuscular Diseases (TREAT-NMD), een network of excellence dat gefinancierd wordt door de Europese Unie (Zesde Kaderprogramma, projectnummer 036825). KLINISCHE PRAKTIJK ONDERZOEK EN ZORG IN NEDERLAND Nederland levert een actieve bijdrage aan het onderzoek naar duchenne-spierdystrofie, onder andere door het All Against Duchenne in the Netherlands(ALADIN)- consortium. Informatie over de huidige zorg en het huidige onderzoek naar de ziekte van Duchenne in Aanvaard op 29 oktober 2008 Citeer als: Ned Tijdschr Geneeskd. 2009;153:B298 > Meer op www.ntvg.nl/klinischepraktijk LITERATUUR 1 Den Dunnen JT, de Visser VM, Bakker E. Van gen naar ziekte; het dystrofinegen, betrokken bij Duchenne- en Becker-spierdystrofie. Ned Tijdschr Geneeskd. 2002;146:364-7. 2 Aartsma-Rus A, van Deutekom JC, Fokkema IF, van Ommen GJ, den Dunnen JT. Entries in the Leiden Duchenne muscular dystrophy mutation database: an overview of mutation types and paradoxical cases that confirm the reading-frame rule. Muscle Nerve. 2006;34:135-44. 3 Van Deutekom JC, Janson AA, Ginjaar IB, Frankhuizen WS, Aartsma-Rus A, Bremmer-Bout M, et al. Local dystrophin restoration with antisense oligonucleotide PRO051. N Engl J Med. 2007;357:2677-86. 4 Aartsma-Rus A, Bremmer-Bout M, Janson AA, den Dunnen JT, van Ommen GJ, van Deutekom JC. Targeted exon skipping as a potential gene correction therapy for Duchenne muscular dystrophy. Neuromuscul Disord. 2002;12(Suppl 1):S71-7. 5 Aartsma-Rus A, Janson AA, van Ommen GJ, van Deutekom JC. Antisense-induced exon skipping for duplications in Duchenne muscular dystrophy. BMC Med Genet. 2007;8:43. 6 Welch EM, Barton ER, Zhuo J, Tomizawa Y, Friesen WJ, Trifillis P, et al. PTC124 targets genetic disorders caused by nonsense mutations. Nature. 2007;447:87-91. 7 Barton-Davis ER, Cordier L, Shoturma DI, Leland SE, Sweeney HL. Aminoglycoside antibiotics restore dystrophin function to skeletal muscles of mdx mice. J Clin Invest. 1999;104:375-81. 8 Wagner KR, Hamed S, Hadley DW, Gropman AL, Burstein AH, Escolar DM, et al. Gentamicin treatment of Duchenne and Becker muscular dystrophy due to nonsense mutations. Ann Neurol. 2001;49:706-11. 9 Hirawat S, Welch EM, Elfring GL, Northcutt VJ, Paushkin S, Hwang S, et al. Safety, tolerability, and pharmacokinetics of PTC124, a nonaminoglycoside nonsense mutation suppressor, following single- and multiple-dose administration to healthy male and female adult volunteers. J Clin Pharmacol. 2007;47:430-44. 10 Du M, Liu X, Welch EM, Hirawat S, Peltz SW, Bedwell DM. PTC124 is an orally bioavailable compound that promotes suppression of the human CFTR-G542X nonsense allele in a CF mouse model. Proc Natl Acad Sci USA. 2008;105:2064-9. 11 Wang B, Li J, Xiao X. Adeno-associated virus vector carrying human minidystrophin genes effectively ameliorates muscular dystrophy in mdx mouse model. Proc Natl Acad Sci USA. 2000;97:13714-9. 12 Deconinck N, Tinsley J, de Backer F, Fisher R, Kahn D, Phelps S, et al. Expression of truncated utrophin leads to major functional improvements in dystrophin-deficient muscles of mice. Nat Med. 1997;3:1216-21. NED TIJDSCHR GENEESKD. 2009;153:B298 5

KLINISCHE PRAKTIJK 13 Tinsley J, Deconinck N, Fisher R, Kahn D, Phelps S, Gillis JM, et al. Expression of full-length utrophin prevents muscular dystrophy in mdx mice. Nat Med. 1998;4:1441-4. 14 Gissel H. The role of Ca2+ in muscle cell damage. Ann N Y Acad Sci. 2005;1066:166-80. 15 Spencer MJ, Mellgren RL. Overexpression of a calpastatin transgene in mdx muscle reduces dystrophic pathology. Hum Mol Genet. 2002;11:2645-55. 16 Badalamente MA, Stracher A. Delay of muscle degeneration and necrosis in mdx mice by calpain inhibition. Muscle Nerve. 2000;23:106-11. 17 Hinkle RT, Lefever FR, Dolan ET, Reichart DL, Dietrich JA, Gropp KE, et al. Corticortophin releasing factor 2 receptor agonist treatment significantly slows disease progression in mdx mice. BMC Med. 2007;5:18. 18 Skura CL, Fowler EG, Wetzel GT, Graves M, Spencer MJ. Albuterol increases lean body mass in ambulatory boys with Duchenne or Becker muscular dystrophy. Neurology. 2008;70:137-43. 19 Cohn RD, van Erp C, Habashi JP, Soleimani AA, Klein EC, Lisi MT, et al. Angiotensin II type 1 receptor blockade attenuates TGF-beta-induced failure of muscle regeneration in multiple myopathic states. Nat Med. 2007;13:204-10. 20 Van Erp C, Irwin NG, Hoey AJ. Long-term administration of pirfenidone improves cardiac function in mdx mice. Muscle Nerve. 2006;34:327-34. 21 Wagner KR, Fleckenstein JL, Amato AA, Barohn RJ, Bushby K, Escolar DM, et al. A phase I/IItrial of MYO-029 in adult subjects with muscular dystrophy. Ann Neurol. 2008;63:561-71. 22 Barton ER, Morris L, Musaro A, Rosenthal N, Sweeney HL. Musclespecific expression of insulin-like growth factor I counters muscle decline in mdx mice. J Cell Biol. 2002;157:137-48. 23 Shavlakadze T, White J, Hoh JF, Rosenthal N, Grounds MD. Targeted expression of insulin-like growth factor-i reduces early myofiber necrosis in dystrophic mdx mice. Mol Ther. 2004;10:829-43. 24 Minetti GC, Colussi C, Adami R, Serra C, Mozzetta C, Parente V, et al. Functional and morphological recovery of dystrophic muscles in mice treated with deacetylase inhibitors. Nat Med. 2006;12:1147-50. 25 Brunelli S, Sciorati C, D Antona G, Innocenzi A, Covarello D, Galvez BG, et al. Nitric oxide release combined with nonsteroidal antiinflammatory activity prevents muscular dystrophy pathology and enhances stem cell therapy. Proc Natl Acad Sci USA. 2007;104:264-9. 26 Liu Y, Yan X, Sun Z, Chen B, Han Q, Li J, et al. Flk-1(+) adipose-derived mesenchymal stem cells differentiate into skeletal muscle satellite cells and ameliorate muscular dystrophy in MDX mice. Stem Cells Dev. 2007;16:695-706. 27 Sampaolesi M, Blot S, D Antona G, Granger N, Tonlorenzi R, Innocenzi A, et al. Mesoangioblast stem cells ameliorate muscle function in dystrophic dogs. Nature. 2006;444:574-9. 28 Torrente Y, Belicchi M, Marchesi C, Dantona G, Cogiamanian F, Pisati F, et al. Autologous transplantation of muscle-derived CD133+ stem cells in Duchenne muscle patients. Cell Transplant. 2007;16:563-77. 6 NED TIJDSCHR GENEESKD. 2009;153:B298