Vakgroep Organische Chemie Onderzoeksgroep Scheidingstechnieken Ontwikkeling van een HPLC-MS methode voor de bepaling van ceramiden in de huid Proefschrift voorgelegd tot het behalen van de graad van Master in de Chemie door Barbara DHOOP Academiejaar 2009-2010 Promotor: prof. dr. P. Sandra Copromotor: dr. F. Lynen Begeleider: dr. B. Bicalho
Dankwoord Ik wil graag alle mensen bedanken die rechtstreeks of onrechtstreeks hebben meegeholpen aan het tot stand brengen van deze thesis. Op de eerste plaats wil ik graag prof. dr. Sandra bedanken om mij de kans te geven mijn thesis uit te voeren in zijn onderzoeksgroep en wil ik hem daarbij ook danken voor het grondig nalezen van mij thesis. In het bijzonder wil ik dr. Bicalho bedanken voor alle steun en hulp die zij verleend heeft gedurende dit jaar. Ook de mensen van het RIC in Kortrijk wil ik bedanken, voor het aanbieden van de instrumentatie die een gedetailleerde analyse mogelijk maakte, waarvan de resultaten in het addendum aanwezig zijn. Daarnaast wil ik in dit dankwoord zowel Seppe als Peejay vermelden die tijdens dit thesisjaar steeds voor een vrolijke noot zorgden en steeds paraat stonden als proefkonijn. Ook alle andere personen van het PARC wil ik graag danken voor de aangename sfeer op het vierde verdiep in S4bis. Alle vrienden: Annelies, Liselotte, Lin, Hanne, Jos, Maarten, Sander,... en familieleden wil graag bedanken voor de nodige steun en ontspanning. Tot slot wil ik mijn ouders speciaal bedanken omdat ze mij de kans hebben gegeven te studeren wat ik graag wou. En als allerlaatste wil ik mijn vriend Jan-Baptist bedanken voor zijn hulp, onvoorwaardelijke steun en vertrouwen.
Inhoudsopgave 1 Inleiding... 1 2 Geschiedenis van de chromatografie... 2 2.1 Beginselen van chromatografie... 2 2.2 Verdelingschromatografie... 2 2.3 Papierchromatografie... 3 2.4 Dunlaagchromatografie... 4 2.5 Vloeistofchromatografie (HPLC)... 4 3 Fundamentele aspecten van de vloeistofchromatografie... 6 3.1 HPLC-modes... 6 3.2 Theoretische aspecten van een HPLC-systeem... 7 3.3 Instrumentatie van een HPLC-systeem... 17 3.3.1 Mobiele fase... 18 3.3.2 Injector... 19 3.3.3 Kolom... 19 3.3.4 Detector... 20 3.3.4.1 Corona-ontladingsdetector... 20 3.3.4.2 Massaspectrometrie... 20 4 Fundamentele aspecten van de massaspectrometrie... 21 4.1 LC-MS... 21 4.1.1 Electrospray ionisatie... 21 4.1.2 Massaspectrometer: quadrupool... 23 4.1.3 Detector : elektronenmultiplicator... 24 4.2 MS-modes... 24 4.3 Tandem massaspectrometrie (MS/MS)... 25 4.4 MS/MS modes... 25 5 Ceramiden... 27 5.1 Structuur en voorkomen in de huid... 27 5.2 Overzicht van onderzoek van ceramiden in de huid... 28 6 Experimenteel gedeelte... 32 6.1 Algemene aspecten... 32 6.1.1 Chemicaliën... 32 6.1.2 Instrumentatie... 32
6.2 Ontwikkeling en optimalisatie van een NPLC-methode voor analyse van ceramiden... 32 6.3 Karakterisatie van ceramiden door MS-analyse... 36 6.4 Monstervoorbereiding... 38 6.4.1 Tape stripping-techniek en tape-extractie... 38 6.4.2 Vaste fase extractie... 40 6.5 NPLC-analyse van ceramiden in de huid... 48 6.6 Ontwikkeling van een RPLC-methode voor analyse van ceramiden... 48 6.7 RPLC-analyse van ceramiden in de huid... 51 7 Conclusie... 55 8 Referenties... 56
Inleiding 1 Inleiding De hoornlaag van de menselijke huid (stratum corneum) zorgt voor bescherming van het lichaam tegen waterverlies en schadelijke stoffen uit de omgeving dankzij een unieke structuur, bestaande uit keratinocyten en intercelullaire lipide lamellen. De huidlipiden, voornamelijk bestaande uit vrije vetzuren, cholesterol en ceramiden, vormen samen als het ware het cement die de bakstenen (de keratinocyten) samenhouden (Elias 1983). De ceramiden spelen een cruciale rol bij allerlei functies van de huid; een gewijzigde ceramide-samenstelling is reeds gelinkt aan bepaalde huidziektes zoals psoriasis en atopische dermatitis (eczeem) (Di Nardo, Wertz et al. 1998; Holleran, Takagi et al. 2006). In tegenstelling tot de ceramiden die te vinden zijn binnenin cellen, bezitten ceramiden in de hoornlaag een grote variabiliteit in structuur wat onderzoek en analyse van deze ceramiden een uitdaging maakt. In dit werk wordt een methode ontwikkeld om ceramiden in de huid te analyseren, er wordt tevens gezocht naar een vaste fase extractie (SPE) om ceramiden aanwezig in de huid selectief te extraheren uit de complexe hoornlaagmatrix. Hierbij is het echter niet realiseerbaar alle interferenties te verwijderen, maar wordt gezocht naar een methode die de ceramiden van cruciale interferenties afzondert. De componenten worden gescheiden met behulp van hoge performantie vloeistofchromatografie (HPLC) in de omkeerfase mode en in de normaalfase mode. Detectie van de componenten gebeurt door tandemmassaspectrometrie (MS/MS). Daar de fractionatie van de hoornlaag ceramiden van de cholesterylesters en triglyceriden succesvol was, werden extracten onderzocht in samenwerking met Metablys, een afdeling van het Research Institute for Chromatography, Kortrijk, België met behulp van een recent ontwikkeld lipodomic platform bestaande uit HPLC bij hoge resolutie en een Q-TOFMS apparaat dat tevens hoge resolutie spectra oplevert (K.Sandra et al. 2010). 1
Geschiedenis van de chromatografie 2 Geschiedenis van de chromatografie 2.1 Beginselen van chromatografie Chromatografie vindt reeds in het begin van de 20e eeuw zijn oorsprong. Het was Mikhail Semyonovich Tswett (1872-1919) die een nieuwe categorie van adsorptieanalyses ontwikkelde en voor het eerst het begrip chromatografie gebruikte. In 1903 wist Tswett plantpigmenten te scheiden met behulp van een calcium carbonaat kolom. In zijn werk Adsorptionanalyse und Chromatographische Methode. Anwendungen auf die Chemie des Chlorophylls beschreef hij hoe eerst pigmenten op de kolom werden gebracht, solvent over de kolom gegoten werd en er zo verschillende zones ontstaan in de kolom. Pigmenten die minder sterk aangetrokken worden zullen zich makkelijker en dus verder in de kolom kunnen verplaatsen dan een sterk aangetrokken pigment. De kolom vertoonde hierdoor verschillende gescheiden en gekleurde zones: een gele zone werd toegekend aan de carotinoïden uit het extract en twee groene zones werden aan chlorofylen a en b toegeschreven. Uit deze observaties leidde hij de naam chromatografie af uit de twee griekse woorden chroma en graphien, wat letterlijk vertaald kan worden als in kleur schrijven. Willstätter, tevens actief in chlorofylonderzoek, concludeerde uit eigen onderzoek dat de twee verschillende chlorofyl-zones bij Tswett, toe te kennen waren aan decompositie van het chlorofyl en de chromatografische methode bijgevolg geen goed procedé kon zijn. Hoewel Tswett het bij het recht eind had, werd zijn theorie hierdoor voor een lange tijd uit het oog verloren. Het is pas rond 1930 dat chromatografie herondekt werd, verschillende organische chemisten gebruikten de methode toen voornamelijk bij onderzoek en opzuiveren van natuurproducten zoals bijvoorbeeld carotenen (Ettre 2000; Ardrey 2003; Engelhardt 2004). 2.2 Verdelingschromatografie De volgende mijlpaal in de geschiedenis van chromatografie volgde ongeveer 10 jaar later. De ontwikkeling van een nieuwe techniek door A. J. P. Martin en R. M. L. Synge kreeg de naam verdelingschromatografie (ook vloeistof-vloeistof chromatografie genoemd). Hierbij werd getracht aminozuren te scheiden door twee vloeistoffen in tegengestelde richting te laten stromen. Deze methode bracht echter weinig resultaten op en werd aangepast: één van de twee vloeibare fasen werd stationair gemaakt door 2
Geschiedenis van de chromatografie silicagel als ondersteuning te gebruiken en de andere, mobiele fase werd door deze stilstaande fase heen gelopen. Hierna kon de keuze gemaakt worden ofwel de verschillende gescheiden zones te visualiseren door een geschikte indicator toe te voegen, ofwel een flow through chromatogram ( Durchflusschromatogramm ) te genereren waarbij de verschillende zones geëlueerd en apart gecollecteerd kunnen worden. Martin en Synge benadrukten dat de verdeling van een component over de twee fasen, de cruciale parameter is en dat deze techniek niet enkel toepasbaar is op aminozuren. Verder is ook naast een vloeibare mobiele fase ook een gas te gebruiken als mobiele fase. Deze vaststelling zal later ook de aanleiding blijken tot de ontwikkeling van gaschromatografie. Eén van de belangrijkste vaststellingen die bij verdelingschromatografie gemaakt werd, is dat het concept van theoretische schotels bij destillatieprocessen eveneens toepasbaar kon gemaakt worden voor chromatografische processen. Door opdelen van de kolom in denkbeeldige segmenten die de naam theoretische schotels kreeg, werd gepostuleerd dat net zoals bij een destillatieproces het mogelijk was in ieder segment een evenwicht te vormen tussen stationaire en mobiele fase. Deze hypothese gaf voornamelijk een idee over het scheidend vermogen van een kolom: hoe meer schotels een kolom bezit, hoe beter de scheiding. In het theoretische aspect van HPLC wordt dit model verder uitgewerkt. Vloeistof-vloeistof chromatografie werd evenwel weinig in gebruik genomen door gebrek aan robuustheid. De stationaire fase werd namelijk gaandeweg door de mobiele fase weggespoeld waardoor resultaten niet reproduceerbaar waren (Ettre 2000; Engelhardt 2004). 2.3 Papierchromatografie Een techniek die aantrekkelijker en voornamelijk in de praktijk eenvoudiger bleek, werd eveneens door Martin ontwikkeld, namelijk papierchromatografie. Een monster werd gespot onderaan het filterpapier waarna het papier in een vat geplaatst werd. Het vat werd voorzien van een solvent, bijvoorbeeld water, dat door capillaire krachten door het filterpapier werd opgenomen. Met behulp van een kleurreactie konden de gescheiden componenten uit het monster gevisualiseerd worden op het filterpapier. Dit werd de eerste chromatografische methode op micro-analytischniveau. Hierbij werd de retardation factor of R F -waarde gedefinieerd als de verhouding tussen de afgelegde afstand op het papier door een component gedeeld door de afstand afgelegd 3
Geschiedenis van de chromatografie door het solvent. Daarnaast gaf Martin ook aan dat het mogelijk was het scheidend vermogen te vergroten door een 2D-analyse uit te voeren, waarbij twee verschillende fase-systemen na elkaar worden gebruikt en het tweede eluent het filterpapier doorloopt 90 ten opzichte van de richting van het eerste eluent. De opkomst van een andere planaire chromatografische methode, namelijk dunlaagchromatografie of Thin Layer Chromatography (TLC) zorgde ervoor dat ook op zijn beurt populariteit en gebruik van papierchromatografie afnam (Ettre 2000; Engelhardt 2004). 2.4 Dunlaagchromatografie Het principe van TLC is analoog aan dit van papierchromatografie: het monster wordt onderaan de plaat gespot en daarna in een vat met solvent geplaatst. In tegenstelling tot bij papierchromatografie, kon bij dunlaagchromatografie de stationaire fase aangepast worden. Daarnaast werd ook de snelheid van een analyse verhoogd doordat de stationaire fase nu een poreuze laag is, voornamelijk silicagel, in plaats van een celluloselaag bij papierchromatografie. Dankzij de eenvoud en snelheid van TLC wordt ze tot op de dag van vandaag nog steeds in gebruik genomen om bijvoorbeeld een chemische reactie op te volgen of als kwalitatieve of semi-kwantitatieve analyse (Ettre 2000; Engelhardt 2004). 2.5 Vloeistofchromatografie (HPLC) Eind jaren 50 had vloeistofchromatografie reeds een aanzienlijke achterstand ten opzichte van gaschromatografie. Vloeistofchromatografie verliep nog steeds manueel terwijl bij gaschromatografie reeds vrij gesofisticeerde toestellen werden gebruikt. Door de kennis verworven voor gaschromatografie toe te passen op vloeistofchromatografie werd duidelijk dat vooral een trager diffusie-proces een nadeel is indien een vloeistof als mobiele fase gekozen wordt. Dit probleem kon deels omzeild worden door niet voor een open capillair te kiezen, maar de kolom te pakken met kleine deeltjes. Om de snelheid waarmee de mobiele fase de kolom doorloopt te optimaliseren dienden hoge drukken gebruikt te worden, vandaar werd de term High Pressure Liquid Chromatography geïntroduceerd. Deze naam werd niet veel later gewijzigd in High Performance Liquid Chromatography. Kolommen die korter gemaakt werden en uitgerust met uniforme en kleinere deeltjes zorgen ervoor dat de prestatie van vloeistofchromatografie aanzienelijk verhoogd werd. 4
Geschiedenis van de chromatografie Een geautomatiseerde aminozuur-analyzer, een toestel dat via ionuitwisselings chromatografie aminozuren kon analyseren en gelpermeatie chromatografie, die scheiding uitvoert van synthetische polymeren op basis van moleculair gewicht, zijn de voorlopers van een HPLC-systeem. Het eluaat loopt bij beide methodes onder hoge druk door een (herbruikbare) kolom die gepakt is met kleine deeltjes. Beiden precursorsystemen waren echter beperkt aangezien ze slechts één soort specimen kunnen scheiden en analyseren. Een HPLC-systeem geschikt om universele monsters te analyseren werd pas enkele jaren later, rond 1965, ontwikkeld door twee onafhankelijke onderzoeksgroepen in Europa en de Verenigde Staten (Ettre 2000; Engelhardt 2004; Dolan, Kirkland et al. 2010). 5
Fundamentele aspecten van de vloeistofchromatografie 3 Fundamentele aspecten van de vloeistofchromatografie 3.1 HPLC-modes De analysemethode HPLC bestaat uit een aantal modes die gekarakteriseerd worden naargelang de eigenschappen van mobiele en stationaire fase: omkeerfase vloestofchromatografie (Reverse Phase Liquid Chromatography: RPLC), normaalfase vloeistofchromatografie (Normal Phase Liquid Chromatography: NPLC), hydrofiele interactie chromatografie (Hydrophilic Interaction Chromatography: HILIC), ionpaarchromatografie (Ion-pair Chromatography: IPC), ionuitwisselings-chromatografie (Ion-exchange Chromatography: IEC), size-exclusion chromatografie of gelchromatografie (Size-exclusion Chromatography: SEC) en chirale chromatografie. Bij omkeerfase wordt gebruik gemaakt van een apolaire kolom, bijvoorbeeld een C18- stationaire fase en een mobiele fase die doorgaans een polair mengsel is van water en organisch solventen, zoals acetonitril of methanol. De scheiding bij RPLC gebeurt op basis van hydrofobiciteit van de componenten. RPLC is de meest gebruikte methode, voornamelijk gebruikt bij analyse van wateroplosbare monsters. De voorkeur om de RPLC-methode te gebruiken, is te verklaren via de vele voordelen tenopzichte van de overige methodes. Zowel robuustheid en veelzijdigheid van de techniek als meer reproduceerbare en efficiëntere analyses dragen bij tot de populariteit van deze methode. Bovendien zijn de gebruikte solventen minder ontvlambaar en toxisch in vergelijking met solventen gebruikt bij bijvoorbeeld normaalfase chromatografie. Bij normaalfase chromatografie wordt gebruik gemaakt van een polaire kolom, zoals nietgebonden silicagel of een diol stationaire fase en een apolaire mobiele fase bestaande uit organische solventen zoals hexaan en isopropanol. De scheiding bij een NPLC-analyse gebeurt op basis van polariteit van de componenten: een polaire component zal een langere retentie ervaren dan een minder polaire component. Ook bijdrage van sterische hinder zal invloed hebben op de retentie, hierdoor is het mogelijk met een NPLC-analyse structurele isomeren te scheiden. HILIC is een methode afgeleid van NPLC. De mobiele fase bestaat uit een mengsel van water en organisch solvent en de kolom is meer polair in vergelijking tot kolommen gebruikt bij NPLC. Ionpaarchromatografie is een aangepaste vorm van RPLC. Door toevoegen van een reagens die ionparing veroorzaakt, kunnen ionaire componenten (zoals zure of basische componenten) in het monster met dit reagens interageren. Bij deze mode is het mogelijk 6
Fundamentele aspecten van de vloeistofchromatografie de retentie van ionaire componenten te wijzigen, zonder de ph van de mobiele fase te veranderen. Gebruik van extreme ph-waarden kan hierdoor vermeden worden. Ionuitwisselingschromatografie maakt gebruik van een kolom voorzien van geioniseerde of ioniseerbare functionele groepen die ionen in het monster met een tegenovergestelde lading binden. De mobiele fase bestaat meestal uit een bufferoplossing. Size-exclusion chromatografie is een scheidingsmethode gebaseerd op moleculaire massa s van de componenten, voornamelijk gebruikt bij synthetische polymeren of grote biomoleculen. De stationaire fase bestaat uit een inerte kolom gepakt met deeltjes met specifieke poriën. De mobiele fase kan zowel een waterige als organische oplossing zijn. Chirale chromatografie zorgt voor een scheiding van enantiomere componenten. De stationaire fase zal hierbij chirale knooppunten bevatten zodat interacties en dus retentietijden van enantiomeren verschillen (Dolan, Kirkland et al. 2010). 3.2 Theoretische aspecten van een HPLC-systeem Een HPLC-kolom is gepakt met poreuze deeltjes met een grootteorde van enkele µm, gemaakt uit silicagel of een polymeer en bij voorkeur sferisch. Het oppervlak van de deeltjes wordt door endcapping voorzien van een gewenste functionele groep die zo de stationaire fase vormt. Vermits de deeltjes klein en poreus zijn, beschikt elk deeltje over een groot oppervlak in verhouding tot zijn volume. Analytmolecules, die door de mobiele fase door de poriën worden gestuurd, kunnen interactie ondergaan met de aanwezige functionele groep. De voorkeur van een component om in de stationaire of mobiele fase te verblijven wordt bepaald door interacties, zijnde specifieke adsorptie veroorzaakt door dipool-dipool of dipool-geïnduceerde dipool interacties en niet-specifieke adsorptie op de stationaire fase, veroorzaakt door van der Waals-krachten. Figuur 1 geeft een voorbeeld weer van elutie van een monster die drie verschillende analyten/componenten bevat. Molecules afkomstig van analyt X worden voorgesteld door symbool, van analyt Y door, van analyt Z door en molecules afkomstig van solvent waarin het monster is opgelost, worden voorgesteld door +. Iedere component die in het systeem wordt geïntroduceerd zal zowel een tijd in de mobiele fase als in de stationaire fase verblijven, enkel de solventmolecules (+) ondergaan weinig tot geen interactie met de stationaire fase en elueren dus meteen uit de kolom. Tijdens de elutie zullen alle andere componenten onder invloed van een continu dynamisch proces zich een aantal maal verplaatsten van mobiele fase naar stationaire fase en vice versa. De totale tijd is de som 7
Fundamentele aspecten van de vloeistofchromatografie van een aantal verblijftijden in iedere fase en zal voor elke component verschillend zijn, aangezien elke component andere interacties ondergaat. Omdat enkel de mobiele fase zich verplaatst zullen componenten slechts in beweging zijn indien ze in mobiele fase vertoeven. Door dit proces kan scheiding van componenten plaatsvinden. Naarmate de molecules in de kolom diffunderen zullen ze zich meer en meer spreiden ten opzichte van elkaar en dus ook een groter volume innemen dan bij aanvang, zoals met een pijl is aangeduid voor component X in figuur 1. Dit bezette volume door analyt X wordt ook aangeduid als een band met een zekere breedte. Bij verlaten van de kolom zal deze band door het detectiesysteem worden geregistreerd en een signaal weergegeven worden verspreid over een welbepaalde tijdsduur in het chromatogram. Figuur 1. Illustratie van een scheidingsproces (boven) en het bijhorende chromatogram van het scheidingsproces (onder) (Dolan, Kirkland et al. 2010). De hoogte of oppervlak van een piek is recht evenredig met de analytconcentratie, met andere woorden hoe meer molecules van analyt X aanwezig in een monster, hoe groter het signaal in het chromatogram. Solventmolecules waarin het monster opgelost werd, zullen zoals reeds vermeld niet weerhouden worden door de kolom. Elutie van dit solvent wordt dus enkel bepaald door 8
Fundamentele aspecten van de vloeistofchromatografie de snelheid waarmee de mobiele fase door de kolom loopt en door de lengte en interne diameter van de kolom. De eerste component die de kolom verlaat, is steeds het monstersolvent, de tijd die nodig is om de kolom te doorlopen en gedetecteerd te worden, wordt de dode tijd t 0 genoemd. Algemeen gezien wordt de tijd verlopen na injectie van een component tot en met de elutie ervan de retentietijd t R genoemd. Dit is dus de som van de tijd doorgebracht in de mobiele fase (t 0 ) en de tijd doorgebracht in de stationaire fase (t R ). (1) Interacties van een component met de stationaire en mobiele fasen, snelheid van mobiele fase, lengte van de kolom en temperatuur spelen elk een rol bij scheiding van de componenten. De snelheid u van de mobiele fase in de kolom wordt berekend door de lengte van de kolom L te delen door de dode tijd t 0. (2) Een andere manier om elke component te karakteriseren dan de retentietijd is via de retentiefactor. Dit is de verhouding van de hoeveelheid component in de stationaire fase tegenover de hoeveelheid component in de mobiele fase. (3) Aangezien (4) waarbij c de concentratie van de component is en V het ingenomen volume in de fase is, volgt hieruit dat: (5) 9
Fundamentele aspecten van de vloeistofchromatografie De distributie tussen twee fasen wordt bepaald door het continu dynamisch evenwicht tussen de fasen. Dit evenwicht is onder invloed van onder andere de moleculaire structuur van de componenten, van de chemische eigenschappen van mobiele en stationaire fase, van de temperatuur en van de druk waarmee de mobiele fase door de kolom wordt gepompt. Dit evenwicht tussen stationaire en mobiele fase kan beschreven worden aan de hand van de verdelingscoëfficiënt K (6) Daarenboven wordt de fase-ratio β gedefinieerd als de verhouding van het volume stationaire fase over het volume mobiele fase in de kolom aanwezig. (7) Deze twee parameters vertegenwoordigen dus de retentiefactor: (8) De retentiefactor kan ook als verhouding van de verblijftijden van de component in de stationaire en mobiele fase geschreven worden. (9) De verblijftijd in de mobiele fase stemt overeen met de dode tijd. Het verschil tussen de retentietijd t R en de dode tijd t 0 stelt de verblijftijd in de stationaire fase voor. Zowel de retentietijd als de retentiefactor kunnen gebruikt worden om de retentie van een component te beschrijven. Het voordeel bij gebruik van de retentiefactor is dat deze waarde dimensieloos is en dus onafhankelijk is van de kolomlengte en van de snelheid van de mobiele fase. De verhouding van retentiefactoren van twee componenten, eveneens te schrijven als de verhouding van retentietijden van de componenten aangezien de dode tijd een constante is, drukt de selectiviteitefficiëntie uit en wordt gedefinieerd als scheidings- of selectiviteitsfactor α. 10
Fundamentele aspecten van de vloeistofchromatografie (10) k 2 is steeds groter dan k 1, anders geformuleerd zal component 1 eerder elueren dan component 2 waardoor deze waarde altijd groter of gelijk is aan 1. Indien α = 1 geeft dit aan dat deze twee componenten niet gescheiden kunnen worden met de gegeven methode. Een groter verschil in retentietijd en dus grotere selectiviteit zal steeds een betere scheiding geven. De selectiviteitsfactor is afhankelijk van de eigenschappen van de componenten, ph, temperatuur, kolomdimensies en -eigenschappen en het type stationare en mobiele fase. Iedere component zal na scheiding door een piek weergegeven worden (figuur 1, onder). Een perfecte chromatografische scheiding zou oneindig smalle pieken genereren zodat geen overlapping van pieken mogelijk zou zijn. Dit zal echter nooit het geval zijn, aangezien processen zoals onder andere moleculaire diffusie de piek steeds een zekere breedte geven. Een chromatografische piek kan het best beschreven worden als een Gaussiaanse curve, ook normaal verdeling genoemd, die in algemene vorm geschreven wordt als (11) De verwachtingswaarde µ en standaardafwijking σ karakteriseren deze functie. Toegepast op een chromatografische piek wordt de retentietijd t R gelijk aan de verwachtigswaarde µ en kan de standaardafwijking σ vervangen worden door breedte w, die ofwel gemeten kan worden aan de basis van de piek w b ofwel op de helft van de maximale piekhoogte w h (figuur 2). Een piek zal echter niet steeds een ideale Gaussiaanse vorm hebben. Dit niet-ideaal gedrag wordt ook soms staartvorming (tailing) genoemd. Dit fenomeen kan uitgedrukt worden aan de hand van de symmetrie- of staartfactor (tailingfactor). 11
Fundamentele aspecten van de vloeistofchromatografie Figuur 2. Een ideale Gaussiaanse piek. Een cruciaal aspect bij de verbreding van een piek is dat de ruimtelijke variantie rechtevenredig is met de migratie-afstand z. (12) De evenredigheidsfactor H wordt de schotelhoogte (hoogte-equivalent van een theoretische schotel, Height Equivalent of a Theoretical Plate: HETP) genoemd en heeft de dimensies van een lengte. Deze kan ook geschreven worden als: (13) waarin D ax : u : axiale dispersiecöeffiënt snelheid van de mobiele fase Analoog met de distillatietheorie kan de HETP vergeleken worden met de schotels in een distillatiekolom waarbij het aantal theoretische schotels N en de schotelhoogte H gerelateerd zijn aan de kolomlengte via: (14) met L de lengte van de kolom. Dit betekent dat de scheiding efficiënter gebeurt indien een langere kolom gebruikt wordt vanwege het groter aantal schotels. 12
Fundamentele aspecten van de vloeistofchromatografie Het schotelgetal N staat in functie van t R en σ (en dus ook w) en kan experimenteel uit het chromatogram afgeleid worden: (15) Een criterium dat wordt gehanteerd om een scheiding in het chromatogram van twee naast elkaar liggende pieken te bepalen is de resolutie R s. Dit is het verschil in retentietijden gedeeld door de gemiddelde breedte van de pieken, gemeten aan de basis van de piek. (16) Een hogere resolutie door een groter verschil in retentietijd en/of smalle pieken manifesteert zich in een betere scheiding van de twee componenten. Indien meerdere componenten aanwezig zijn in een mengsel of monster zullen de twee minst gescheiden componenten in het chromatogram het zogenaamde kritische paar vormen waarvan de resolutie bepaalt of het scheidend vermogen van de kolom voldoende is. Een resolutie R s = 2 zal twee pieken voor 99.99% gescheiden van elkaar geven. Selectiviteit, retentie, performantie en resolutie zijn samen te brengen in één vergelijking die de basisvergelijking van de chromatografie wordt genoemd. R s wordt uitgedrukt in functie van α, k en N waarbij wordt aangenomen dat de breedte van de twee aangrenzende pieken gelijk is. (17) waarbij R s N α k : de resolutie : het schotelgetal : de scheidingsfactor : de retentiefactor De invloed van de verschillende parameters op R s wordt geïllustreerd in figuur 3. 13
Fundamentele aspecten van de vloeistofchromatografie Figuur 3. Invloed van parameters N, k en α op de resolutie (Poole C. F. 1991). Met behulp van de resolutievergelijking kan de invloed van elke parameter op een scheiding verklaard worden. De vergelijking is essentieel bij optimalisatie van een methode. Een scheiding tot aan de basislijn is mogelijk indien de retentiefactor hoog genoeg is, met andere woorden de stationaire fase moet de analyten voldoende weerhouden. Daarnaast moet ook het verschil in retentiefactoren voldoende groot zijn zodat de selectiviteitsfactor α hoog is. Ook de performantie uitgedrukt door N is bij voorkeur zo hoog mogelijk. De factoren die op de scheidingsefficiëntie inwerken zijn onder andere kolomlengte, grootte van de deeltjes in de kolom, kwaliteit van de kolompakking, lineaire snelheid van de mobiele fase, dode tijd van het HPLC-instrument en de retentiefactor (Poole C. F. 1991; Sandra 2007; Dolan, Kirkland et al. 2010). Bijdragen van deze factoren kunnen worden uitgedrukt in een vergelijking die de correlatie tussen schotelhoogte H en snelheid van de mobiele fase u weergeeft, namelijk de van Deemter-vergelijking. In deze vergelijking worden drie parameters gegeven die tot bandverbreding leiden en samen de HETP-waarde bepalen. (18) met A : Eddydiffusieterm B : longitudinale diffusie C : transportweerstand 14
Fundamentele aspecten van de vloeistofchromatografie u : gemiddelde lineaire snelheid van de mobiele fase De Eddydiffusieterm houdt rekening met het feit dat niet elke analytmolecule dezelfde weg zal afleggen in een kolom aangezien niet alle deeltjes in de kolom evengroot of gelijkvormig zullen zijn en de pakking van de kolom niet uniform zal zijn. Omdat elke analytmolecule dus een verschillende weg zal afleggen, zal er een zekere spreiding zijn op de afgelegde weg van de molecules. Daaruit volgende zal dit verschillen in retentie meebrengen. De Eddydiffusieterm is onafhankelijk van de snelheid waarmee de mobiele fase de kolom doorloopt. Enkel parameters zoals vorm en grootte van de deeltjes en van de poriën als ook de kwaliteit van kolompakking zijn hier van belang. Deze term wordt gegeven als: (19) waarbij λ : pakkingsefficiëntie (λ max = 1) d p : diameter van deeltje De B-term stelt de bijdrage van longitudinale diffusie voor. Naast diffusie in axiale richting (loodrecht op de kolomas) is ook longitudinale diffusie of diffusie langsheen de kolomas mogelijk. Dit proces is het resultaat van concentratieverschillen in de mobiele fase. In het centrum van de band van analytmolecules zal de concentratie maximaal zijn, hierdoor zullen molecules, onder invloed van de wetten van Fick, diffunderen en dit zowel in de richting waarin de mobiele fase vloeit als in de tegenovergestelde richting. Deze diffusie zal leiden tot een verbreding van de band en is omgekeerd evenredig met de snelheid van het eluens. Wanneer de snelheid van de mobiele fase verhoogd wordt, zullen de analytmolecules minder tijd in de kolom doorbrengen en daardoor dus minder onderhevig zijn aan deze diffusie. De longitudinale diffusie-term wordt gegeven door (20) met D M de diffusiecoëfficiënt in de mobiele fase. De longitudinale diffusie is gerelateerd aan moleculaire diffusie en wordt dus bepaald door de viscositeit van de mobiele fase, de temperatuur, de diffusiecoëfficiënt en de moleculaire massa van het analyt (Hens 2009). Enkel bij lage snelheid van de mobiele 15
Fundamentele aspecten van de vloeistofchromatografie fase wordt de B-term relevant, aangezien de diffusiecoëficiënt van een component in vloeistof in de meeste gevallen klein zal zijn in vergelijking met de snelheid van de mobiele fase. De transportweerstand geeft aan dat tijdens elutie van analyten de massa van een analyt niet enkel kan worden getransporteerd van mobiele naar stationaire fase maar ook opnieuw van stationaire naar mobiele fase. Analyt molecules aanwezig in mobiele fase zullen diffunderen naar de grens tussen mobiel en stationaire fase en zo overgaan naar de stationaire fase. Om evenwicht te behouden zullen naast overgang van molecules van mobiele naar de stationaire fase ook molecules vanuit de stationaire fase terug naar de de mobiele fase overgaan. Na een zekere tijd zullen alle analytmolecules de stationaire fase verlaten hebben en terug overgegaan zijn in de mobiele fase. Het gehele proces zorgt ervoor dat voortdurend massa uitgewisseld wordt tussen de twee fasen gedurende de analyse. De snelheid waarmee het evenwicht tussen de twee fasen wordt bereikt zal bepalend zijn voor de bijdrage van de transportweerstand. Zoals reeds vermeld bevinden molecules van eenzelfde component zich niet allemaal op dezelfde locatie in de kolom, hierdoor zal ook de transportweerstand voor elke molecule verschillen en dus een piekverbreding als gevolg hebben. De transportweerstand kan worden opgedeeld in twee bijdragen: de bijdrage van de mobiele (C M ) en de bijdrage van de stationaire fase (C S ). De C M -term beschrijft de bijdrage tot band- of piekverbreding in de mobiele fase. Deze verbreding ontstaat door onderscheid in lineaire viscositeit bij de mobiele fase. Mobiele fase die dicht langs deeltjes in de kolom vloeit, zal trager bewegen dan mobiele fase die zich verder van kolomdeeltjes bevindt. Door dit verschil in snelheid van mobiele fase, zullen ook de analyten aanwezig daarin dit onderscheid ondervinden. De C S -term beschrijft de bijdrage tot band- of piekverbreding in de stationaire fase. Deze term wordt onder andere bepaald door de interacties tussen analyt en stationaire fase en de hoeveelheid stationaire fase. De van Deemter-curve stelt grafisch H in functie van de snelheid van de mobiele fase u en wordt gebruikt om de optimale snelheid te achterhalen. Deze optimale waarde u opt komt overeen met de minimale waarde van HETP (figuur 4). 16
Fundamentele aspecten van de vloeistofchromatografie Figuur 4. Invloed op de van Deemter-curve van factoren A, B en C. Zoals vermeld werd en tevens te zien is in figuur 4, is de term A onafhankelijk van de snelheid u, is de B-term enkel van belang bij lage snelheden en staat de C-term lineair in verband met de snelheid. In werkelijkheid zal de piekverbreding echter niet enkel veroorzaakt worden door de factoren in de van Deemter-vergelijking. Een bijkomende piekverbreding wordt steeds door de instrumentatie veroorzaakt. Dit effect van piekverbreding door instrumentatie vergroot als het volume van de kolom relatief kleiner wordt ten opzichte van het volume buiten de kolom. De totale piekbreedte is de som van bandverbreding door injectie 2 bandverbreding binnen de scheidingskolom kol, de bijdrage van dode volumes ² dv, en de bijdrage van de detector ² det. De bandverbreding heeft dus bijdragen van zowel de kolom zelf als bijdragen door externe factoren. 2 inj, (21) 3.3 Instrumentatie van een HPLC-systeem Een HPLC-syteem kan opgedeeld worden in verscheidene onderdelen waarvan een overzicht wordt weergegeven in figuur 5. Linksboven is het reservoir van de mobiele fase te zien. Deze mobiele fase wordt naar een pomp geleid die zorgt dat de mobiele fase onder een gecontroleerde druk en snelheid door de kolom gestuurd wordt. Rechtsboven in de figuur wordt de autosampler weergegeven die het monster in het systeem zal injecteren. Na de introductie van het monster op de kolom zullen de analyten in het monster de kolom doorlopen en gescheiden worden. 17
Fundamentele aspecten van de vloeistofchromatografie Figuur 5. Schematisch overzicht van instrumentatie bij HPLC. Een detector zal analyten die uit de kolom elueren registeren onder de vorm van signalen. De signalen gemeten door de detector corresponderen met de aanwezige analytconcentratie. Een computer die in verbinding staat met de detector zal de output van de detector opslaan zodat dataverwerking mogelijk is (Dolan, Kirkland et al. 2010). 3.3.1 Mobiele fase Solvent gebruikt als mobiele fase wordt in een inert reservoir bewaard, meestal vervaardigd uit bruin glas. De zuiverheid van het solvent bij een analyse is essentieel, dit wil zeggen zonder contaminatie van bijproducten of vaste stof deeltjes. Om deeltjes zoals stof tegen te houden, wordt een filter gekoppeld aan het uiteinde van de verbinding tussen de solventreservoir en pomp. Luchtbellen in de mobiele fase kunnen vermeden worden door ontgassen van de solventen. De ontgassing kan via verschillende technieken gebeuren. Het solvent kan een tijd in een ultrasoonbad geplaatst worden of een inert gas zoals helium kan door het solvent borrelen zodat de opgeloste gassen diffunderen naar de heliumbellen en zo uit het solvent gezuiverd worden. Een derde ontgassingstechniek is vacuümontgassing waarbij het ontgassen online kan gebeuren en voor de pomp zal geplaatst worden (Dolan, Kirkland et al. 2010). Bij een analyse kunnen meerdere solventen (bij meeste HPLC-toestellen tot 4 solventen) gebruikt worden en indien nodig online gemengd worden in een mengkamer. Elutie kan op twee manieren gebeuren: isocratische elutie waarbij een constante compositie van de mobiele fase behouden wordt gedurende de analyse en gradiënt elutie waarbij de compositie in functie van de elutietijd stapsgewijs of continu wordt gewijzigd. 18
Fundamentele aspecten van de vloeistofchromatografie 3.3.2 Injector De injector in de autosampler zorgt dat het monster reproduceerbaar en kwantitatief kan worden toegevoegd aan het systeem. De meest gebruikte injector is de zeswegkraan. Deze kraan bestaat zoals de naam aantoont uit zes poorten. Naargelang de toestand van de zeswegkraan: de laadpositie en de injectiepositie, zijn deze poorten op een andere manier gekoppeld aan elkaar. Zoals schematisch is weergegeven in figuur 6, staat elke poort in verbinding met een onderdeel van het HPLC-systeem. In de laadpositie zal de poort in verbinding met de pomp de mobiele fase aanvoeren naar de poort in verbinding met de kolom. De poort bovenaan, in verbinding met de injectienaald, zal het monster in de zogenaamde sample loop aanbrengen tot deze loop, met een vast volume, helemaal gevuld is. De poort die met het einde van de sample loop verbonden is, gaat naar de afval (waste). Figuur 6. Laadpositie (links) en injectiepositie (rechts) van een zeswegkraan. Nadat de sample loop gevuld is (en dus geen lucht meer aanwezig is in de loop) zal van de laadpositie overgeschakeld worden naar de injectiepositie. Nu zal de poort waar de mobiele fase uit stroomt gekoppeld worden aan de poort van de sample loop, zodanig dat het monster nu in de tegenovergestelde richting stroomt in de sample loop. De poort die in laadpositie de ingang van sample loop aangeeft, zal nu verbonden worden met de poort die naar de kolom loopt zodat het monster geïntroduceerd wordt op de kolom. 3.3.3 Kolom Klassiek worden roestvrije stalen kolommen gebruikt met lengte van 5 tot 25 cm en inwendige diameters van 1 tot 1.6 mm. Deeltjes van 1.8 tot 5 µm met een variëteit van 19
Fundamentele aspecten van de vloeistofchromatografie geometrie of vorm zijn commercieel beschikbaar. Indien een hogere temperatuur gewenst is dan kamertemperatuur, kan gebruik worden gemaakt van een kolomoven. 3.3.4 Detector Direct na de kolom wordt een detector geplaatst. Universele detectoren zoals bijvoorbeeld een brekingsindexdetector of een corona-ontladingsdetector hebben een lage detectorselectiviteit aangezien een eigenschap wordt gemeten die aanwezig is bij alle componenten. Detectoren die componentspecifiek zijn, meten een eigenschap die uniek is voor bepaalde analyten, zoals bijvoorbeeld een UV-detector. Andere methoden maken gebruik van onafhankelijke analytische instrumenten als detector. LC-NMR stuurt het eluens uit de kolom naar een NMR-toestel, LC-MS koppelt een massaspectrometer na de kolom. In dit werk werd gebruik gemaakt van een massaspectrometer en een coronaontladingsdetector. 3.3.4.1 Corona-ontladingsdetector De corona-ontladingsdetector (corona discharge detector of charged aerosol detector, CAD) is een universele detector. Het eluaat dat uit de kolom vloeit, wordt verneveld door een stroom vernevelingsgas, zoals N 2, en wordt verdampt in een verwarmde buis. Door verdamping van de vluchtige mobiele fase blijven analytmolecules over in de gasfase. Een positief geladen dragersgas, geladen door een corona-ontlading, wordt hierna gemengd met de analyten, waarbij de lading overgedragen wordt van dragergas naar analytmolecules. De analytionen worden door een electrometer opgevangen die de elektrisch lading omzet in een signaal (Dolan, Kirkland et al. 2010). 3.3.4.2 Massaspectrometrie Massaspectrometrie (MS) is een methode waarbij gasvormige ionen worden gevormd die kunnen gescheiden worden op basis van verhouding massa tot lading (m/z-ratio). De uitkomst van een analyse is een spectrum waarin relatieve of absolute abundatie wordt geplot in functie van de m/z-verhouding. Uit deze spectra kan het moleculaire gewicht en eventuele informatie over de structuur van een analyt verworven worden. Een massa spectrometer is op te delen in drie onderdelen: een ionenbron, de massaanalysator en een detector. De ionenbron genereert ionen van de componenten in het monster, de massa-analysator scheidt binnenkomende ionen op basis van m/z, waarna het detectiesysteem elke bundel van ionen omzet in een meetbaar signaal. Gezien het belang van massaspectrometrie in dit werk wordt dit in detail besproken in het volgende hoofdstuk met nadruk op de gebruikte opstellingen (Ardrey 2003; Niessen 2006). 20
Fundamentele aspecten van de massaspectrometrie 4 Fundamentele aspecten van de massaspectrometrie 4.1 LC-MS LC-MS is een techniek waarbij een massaspectrometer gekoppeld wordt na een HPLCsysteem. Dit is hedendaags een standaardmethode voor onderzoek van organische en bio-organische monsters. Vermits een MS-detector ionen meet in gasfase, is er nood aan een interface die naast ionizatie van de monsteranalyten ook het vloeibare eluens kan verdampen. De twee meest gebruikte interfaces zijn APCI (Atmospheric Pressure Chemical Ionization) en ESI (Electrospray Ionization). Beide technieken zorgen ervoor dat fragmentatie van de analyten zoveel mogelijk wordt vermeden, APCI en ESI worden daarom soms zachte ionisatietechnieken genoemd. De massa-analysator scheidt de ionen op basis van de massa-ladingverhouding (m/z) en registreert tevens de intensiteit van elk ion. Deze scheiding kan, afhankelijk van de gebruikte massa-analysator, gebeuren op basis van tijd of ruimte. De resolutie en de accuratesse bepalen de prestatie van een massa-analysator. Mogelijke analysatoren zijn onder andere de iontrap, de Time of Flight-analyzer (TOF), een quadrupool of een combinatie van meerdere analysatoren. Indien een koppeling van twee massaspectometers wordt gebruikt, spreekt men van LC-MS/MS of tandemmassaspectrometrie. Een elektronenmultiplicator (electronmultiplier: EM) zet de binnenkomende ionenbundel om in een meetbaar en versterkt signaal. Er wordt dieper ingegaan op de gebruikte technieken. 4.1.1 Electrospray ionisatie Electrospray ionisatie zal achtereenvolgens het eluaat omvormen tot druppels, daarna deze druppels van een lading voorzien en desolvateren en tenslotte zullen ionen gevormd worden van de aanwezige analyten. Het eluaat komende uit de kolom wordt door een capillair gestuurd onder atmosferische druk waarbij rondom het capillair een verstuivergas stroomt. Het uiteinde van het capillair is een fijne tip dat onderheven is aan een hoge potentiaal (ca. 3-4 kv). De vloeistof die door de fijne tip gaat, zal door het elektrisch veld een overmaat lading krijgen en bij verlaten van de tip zal de vloeistof verneveld worden tot geladen deeltjes, ook aerosol genoemd. 21
Fundamentele aspecten van de massaspectrometrie De geladen druppels zullen, onderhevig aan elektrostatische krachten, door een tegenelektrode worden aangetrokken. Naargelang het teken van de aangebrachte spanning zullen de resulterende analytionen ofwel positief of negatief geladen zijn. Eenmaal de druppels gevormd zijn, zal desolvatatie plaatsvinden en solvent uit de druppels verwijderd worden. Dit wordt bevorderd door een drooggas, bijvoorbeeld N 2, in de tegenovergestelde richten te laten stromen. De druppels worden hierdoor steeds kleiner zodanig dat gelijke lading in een druppel steeds meer en meer geconcentreerd wordt. Bij overschrijden van een kritisch punt, de Rayleigh limiet genaamd, zullen de druppels exploderen. Dit kritisch punt wordt bereikt wanneer in een druppel de elektrostatische krachten te groot worden ten opzichte van de oppervlaktespanning (figuur 7). Figuur 7. Desolvatatieproces bij ESI. Nadat desolvatatie heeft plaatsgevonden, zullen de kleine druppels omgevormd worden tot naakte ionen van de analyten. Het mechanisme van vorming van deze ionen is nog steeds omstreden en kan door twee verschillende modellen beschreven worden: het ionevaporatie-model en het ladingresidue-model. Het ionevaporatie-model stelt dat ionen onmiddelijk uit een druppel vrijgesteld kunnen worden en in de gasfase overgaan aangezien, door continue verdamping van solvent, het oppervlak van de druppel voldoende geladen zal zijn. Eenmaal de lading van ionen aan de oppervlakte van de druppel, en zo dus het elektrisch veld aan de oppervlakte, groter wordt dan de oppervlaktespanning kunnen naakte ionen uit de druppel ontsnappen (figuur 8). Het ladingresidue-model neemt aan dat de ionen van analytmolecules reeds gevormd zijn in de vloeibare fase en het proces van desolvatatie doorgaat tot slechts één ion per druppel overblijft. Tot slot zal ook bij deze druppel desolvatatie plaatsvinden zodat het ion over kan gaan naar de gasvormige fase. 22
Fundamentele aspecten van de massaspectrometrie Figuur 8. Ionevaporatie-model bij ESI. De tegenelektrode is voorzien van een spleet waar de gevormde ionen door kunnen gaan en in verschillende zones terecht komen met een steeds verlagende druk, zodat de ionen uiteindelijk in de hoog-vacuüm-zone van de massaspectrometer geïntroduceerd worden. Figuur 9 geeft schematisch een ESI-interface weer (Ardrey 2003; Herbert and Johnstone 2003; Niessen 2006; Dolan, Kirkland et al. 2010). Figuur 9. ESI-interface (Herbert and Johnstone 2003). 4.1.2 Massaspectrometer: quadrupool Een quadrupool bestaat uit vier cilindervormige staven die evenwijdig liggen ten opzichte van elkaar en geplaatst zijn op de hoekpunten van een denkbeeldig vierkant. Een hoge gelijkstroomspanning (DC) en radiofrequentiespanning (RF) worden aangebracht over de staven. Twee tegenover elkaar liggende staven dragen een positieve lading, de overige twee staven dragen een negatieve lading. Een ion dat het gebied tussen de vier staven binnenkomt, zal onder invloed van de DC- en RF-spanning oscilleren via een bepaald traject doorheen de quadrupool. Door instellen van de gelijkstroomspanning en 23
Fundamentele aspecten van de massaspectrometrie radiofrequentie zullen enkel ionen in een specifiek, klein m/z-interval het einde van de quadrupool kunnen bereiken. Ionen met een m/z-verhouding die niet in het ingestelde interval zitten, zullen een onstabiel traject volgen en bijgevolg de detector niet bereiken. Door aanpassen van DC- en RF-spanning kan het gedetecteerde m/z-venster over een gewenst massabereik gescanned worden (figuur 10). Een quadrupool is in staat snel het totale massabereik af te scannen en maakt gebruik van een lage spanning zodat een relatieve hoge druk, zoals bij LC-MS, kan gebruikt worden. Daarnaast is ook de lage kostprijs een voordeel van deze massaspectrometer. Een groot nadeel van de quadrupool is de lage resolutie (Ardrey 2003). Figuur 10. Een quadrupool. 4.1.3 Detector : elektronenmultiplicator De EM bestaat uit een aantal dynodes. Dit zijn metalen platen waarbij elke plaat steeds een hogere potentiaal heeft dan de vorige plaat. Bij invallen van de ionenbundel op de eerste dynode, komen secundaire elektronen vrij die door de hogere potentiaal van de tweede plaat versneld naar deze tweede plaat bewegen. Hierdoor komen opnieuw secundaire elektronen vrij. Dit proces vindt steeds opnieuw plaats bij het bewegen van de elektronen naar de volgende dynode. Aangezien voor elk elektron dat invalt op een dynode telkens meerdere elektronen vrijkomen, wordt een vermenigvuldigingsproces gecreëerd (elektronenlawine) (Herbert and Johnstone 2003). 4.2 MS-modes De massaspectrometer kan in twee verschillende modes gebruikt worden: Total ion current (TIC) of Selected ion monitoring (SIM). 24
Fundamentele aspecten van de massaspectrometrie De scan mode TIC zal het vooraf ingestelde massabereik een aantal maal afscannen, afhankelijk van de resolutie van de massaspectrometer. Een hogere resolutie zal ervoor zorgen dat het bereik een aantal keren meer kan afgescanned worden. Verhogen van de scantijd of verkleinen van het massabereik kan de gevoeligheid verhogen. Dit heeft echter voor beiden nadelen: scantijd verhogen kan ervoor zorgen dat een te klein aantal datapunten gecollecteerd wordt, massabereik verkleinen kan ervoor zorgen dat waardevolle informatie verloren gaat (De Hoffmann E. 1996). In sommige gevallen is het niet nodig het volledige massabereik te scannen. Wanneer bijvoorbeeld de structuur van een component gekend is, kunnen ook eigenschappen en gedrag achterhaald worden. In dit geval zal SIM mode gekozen worden waardoor de gevoeligheid verhoogd wordt. De massaspectrometer wordt als massafilter gebruikt en zal enkel ionen binnen het bepaalde m/z-interval naar de detector doorzenden. De detector zal dus niet een massaspectrum opnemen, maar de intensiteit van de geselecteerde m/zwaarde registreren (Ardrey 2003; Niessen 2006). 4.3 Tandem massaspectrometrie (MS/MS) Door een zachte ionisatietechniek zoals ESI te gebruiken, zal er weinig tot geen fragmentatie van analytionen gebeuren. Soms is echter fragmentatie gewenst om bijkomende structurele informatie van de analyten te achterhalen. Hiervoor kan tandem massaspectrometrie als methode gebruikt worden. Tandem massaspectrometrie (MS/MS) maakt gebruik van een combinatie van massaanalysatoren (meestal twee): bijvoorbeeld een triple quadrupool (QqQ) of een quadrupool- TOF combinatie (Q-TOF). In QqQ worden drie quadrupolen in serie geplaatst. De eerste en derde quadrupool zijn massa-analysatoren terwijl de tweede quadrupool enkel onder invloed is van een radiofrequentie en gebruikt wordt als botsingscel. Deze middenste pool kan ook een hexapool zijn: dit zijn zes parallele staven in plaats van vier. Nadeel van een QqQ is de lage resolutie. Een Q-TOF kan hoge resolutie opleveren zoals in het addendum geïllustreerd wordt (De Hoffmann E. 1996; Ardrey 2003). 4.4 MS/MS modes De MS/MS kan in verschillende modes gebruikt worden: - Product-ion scan - Precursor-ion scan - Constant neutral loss scan - Selected reaction monitoring 25
Fundamentele aspecten van de massaspectrometrie Product-ion scan Bij deze mode, ook daughter ion mode genoemd, zal de eerste quadrupool één of meerdere ionen selecteren op basis van een gedefinieerde m/z-verhouding. De doorgelaten ionen zullen in de botsingscel (Collision Induced Dissociation of CID-cel) gefragmenteerd worden door botsingen met een dragergas, bijvoorbeeld argon. De tweede massa-analysator zal nu alle m/z-waarden (in het opgegeven massabereik) scannen zodat de gevormde fragmenten van deze precursor-ionen in een spectrum worden weergeven. Precursor-ion scan In de precursor-ion scan of parent ion mode zal de eerste quadrupool nu het totale opgegeven massabereik scannen en doorsturen naar de CID-cel. De tweede massaanalysator wordt ingesteld zodat slechts bepaalde fragmentionen van alle gevormde fragementen in de botsingcel worden doorgelaten naar de detector. Constant neutral loss scan Sommige fragmentaties kunnen een herschikking van elektronen in de ionen teweeg brengen zodanig dat een (neutrale) massa vrijkomt. Dit verlies van een neutrale massa kan worden waargenomen voor alle ionen in de constant neutral loss mode. De twee massa-analysatoren scannen nu m/z-waarden, waarbij een massaverschil wordt ingesteld tussen beide (een off-set) zodat enkel wanneer dit massaverschil aanwezig is, een signaal wordt gedetecteerd. Selected/Multiple-reaction monitoring Bij multiple reaction monitoring (MRM) zullen beide massa-analysatoren ingesteld worden zodat enkel specifiek geselecteerde ionen doorgelaten worden. Beide analysatoren zullen dus als massafilter werken. Deze mode wordt enkel gebruikt indien het analyt en de eigenschappen, zoals de fragmentatie, van het analyt gekend zijn. Een voordeel van gebruik van deze mode is de aanzienelijke verhoging van de gevoeligheid. 26