Nieuwe technieken die oude overbodig maken? FES Fyto Symposium 22 juni 21 Dr. Piet M. Boonekamp Plant Research International Voor welke organismen Identificatie/Detectie? Diagnostiek is weten waar het zit Virussen Insecten Schimmels Bacteriën Nematoden Onkruiden Diagnostiek is.technologie Om te zorgen voor de gewenste: Specificiteit (eigenschappen en soorten) Gevoeligheid (maatwerk voor het gewenste doel) Kostenefficiëntie (goede prijs/kwaliteit verhouding) Robuustheid Snelheid (in 1 dag analyse en uitslag?) Betrouwbaarheid en toepasbaarheid (zowel on-site als in high-tech laboratoria) Correcte technologie?? Technieken voor identificatie en detectie: Biologische karakteristieken Morfologische karakteristieken Eiwitkarakteristieken Antisera DNA/RNA-karakteristieken PCR in allerlei vormen
Biologische karakteristieken (1) Biologische karakteristieken (2) Uitplaten van bacteriën op selectieve media Foto PPO Naaldwijk Biologische karakteristieken (3) Morfologische karakteristieken (1) Microscopische karakterisering van typische structuren Morfologische karakteristieken (2) Eiwitkarakteristieken (1) pollen Steve Hurst, USDA-NRCS Ambrosia artemisiifolia Alsemambrosia zaad ELISA van plantenvirussen Immunofluorescentie bacteriën Plantenziektenkundige Dienst
Eiwit karakteristieken (2) Microspheres/beads Luminex multiplex immunoassay: principle Multiplex Elisa in 1 monster Multiplex Luminex assay 5-plex PBS 5-plex Potato Extract DNA/RNA-technologieën 25 25 2 15 1 2 Cms (MFI) 15 Rsol (MFI) PLRV (MFI) PVX (MFI) 1 PVY (MFI) Cms (MFI) Rsol (MFI) PLRV (MFI) PVX (MFI) PVY (MFI) Enkelvoudige PCRdetectiemethoden Kwantitatieve detectie Multiplex detectie 5 Cms AB Rsol AB PLRV AB PVX AB PVY AB All 5 Cms AB Rsol AB PLRV AB PVX AB PVY AB All Kwantitatieve multiplex detectie DNA-detectie Multiplex SCAR-PCR Meloidogyne species
Localisatie/extractie: Nematoden uit grond Localisatie/extractie: Bacteriën in aardappel Probleem: Grond wordt opgespoeld en nematoden worden verzameld in suspensie Directe extractie van nematodensuspensie geeft soms remming in PCR Aanpassen DNA-extractiemethode gewenst Probleem: Erwinia bepalen in naveluiteinden van knollen Ogen worden vermalen in buffer. Rechtstreekse extractie van buffer geeft problemen. Verrijkingsstap is noodzakelijk Verrijking gaat in 1% van de gevallen niet goed Localisatie/extractie: Bacteriën uit zaad Probleem: Extractie vanuit zaden is een probleem voor detectie bacteriën Zaden worden na schoning vermalen Aanwezigheid in vermalen zaad van extreem hoge concentraties van reservestoffen zoals oliën en polysacchariden (waaronder zetmeel), die bekende inhibitoren van PCR zijn Localisatie/extractie: Waar zit het pathogeen? GFP-tagged Dickeya sp. progeny tuber stolon * 2 days after soil infestation Kwantificering over de jaren heen No Source: NAK
.5.45.4.35.3.25.2.15.1.5 44 49 54 59 64 69 74 79 84 89 Wavelength Graan Klei Biet Klei Biet Zand Aardappel Klei Aardappel Zand Kwantificering via AmpliDet Levend/dood-bepalingen PMA-PCR Xanthomonas campestris pv. campestris Fluorescence 2 SCV 3F NT 3F SCV/SVBV/SMYEPV 3F 1.5 SVBV 3TR NT 3TR SCV/SVBV/SMYEPV 3TR 1.5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 -.5 Time Sample: Target Primer mix 1 SCV/SVBV SCV/SVBV 2 SCV/SVBV 3-mix 3 SMYEPV SMYEPV 4 SMYEPV SMYEPV 5 SMYEPV 3-mix 6 SMYEPV 3-mix 7 SCV/SVBV/SMYEPV 3-mix 8 SCV/SVBV/SMYEPV 3-mix 9 SCV/SMYEPV 3-mix 1 SCV/SMYEPV 3-mix 11 SVBV/SMYEPV 3-mix 12 SVBV/SMYEPV 3-mix 13 NT 3-mix 14 SCV/SMYEPV SCV/SMYEPV 15 SCV/SMYEPV SCV/SMYEPV 16 SVBV/SMYEPV SVBV/SMYEPV 17 SVBV/SMYEPV SVBV/SMYEPV 18 SCV 3-mix 19 SVBV 3-mix 2 NT 3-mix 21 NT 3-mix 22 NT 3-mix 1 = Live cells 2 = Live cells + PMA 3 = Dead cells 4 = Dead cells + PMA Viable cells (intact membrane) Soluble, amplifiable DNA + PMA Photoinduced crosslinking Dead cells (comprised membrane) Insoluble DNA, Gets lost with cell debris, not lifi bl Herkenning aardappelplant in bietenperceel Reflection DSS voor Phytophthora Spatial, temporal simulation model Infectiekansen Nederland 26 (mei september) & 27 Survival Infection DCM Zwaagdijk Spore release 27-5-27 29-7-27
Detection of Globodera pallida Reconstruction of infestation Op basis van locale bemonstering Locale genetische diversiteit van de isolaten Mobiel PCR-apparaat Dip stick Lelystad 25 Valthermond 25 Diagnostiek voor nieuwe problemen Diagnostiek is. innoveren Door wereldwijde handelsstromen steeds nieuwe problemen (en oud weer nieuw!) Pepino mozaïekvirus Nieuwe PVY in aardappel Nieuwe Erwinia in aardappel en bollen Zuur in bollen Etc., etc. regelgeving verandert toepassen van de juiste technologie van simplex naar multiplex van separate naar geïntegreerde kennis MAAR: kennis van pathogenen blijft nodig!
Dank u voor de aandacht Science Practice Wageningen UR