Moleculaire Absorptiespectrometrie in UV en zichtbaar licht D.Bax Universiteit Utrecht (2002)
MOLECULAIRE ABSORPTIESPECTROMETRIE IN UV EN ZICHTBAAR LICHT COLOFON Dit dictaat is bestemd voor het praktische en theoretische onderwijs in het kernprogramma voor het doctoraal examen scheikunde. Dit dictaat heeft niet de pretentie dat het de stof uitputtend behandelt. Het gaat voldoende diep op de stof in om na bestudering, praktische spectrofotometrie met inzicht in de gang van zaken te kunnen bedrijven. Het wordt aan de Universiteit Utrecht gebruikt op het tweedejaars practicum van de faculteit scheikunde, onderdeel "Analytisch Chemisch Meten". Utrecht, oktober 1997, mei 2002
I N H O U D S O P G A V E 1 Inleiding 1 1.1 Waarom is een rode oplossing rood gekleurd? 1 1.2 Wat zijn complementaire kleuren? 1 1.3 Wat doet een gekleurde oplossing met het geabsorbeerde licht? 1 2 Wet van Planck 2 3 Interactie tussen straling en materie 2 4 Wet van Lambert en Beer 3 4.1 Afleiding 3 4.2 Afwijkingen van de wet van Lambert en Beer 5 4.2.1 'Echte' afwijkingen van de wet van Lambert en Beer 5 4.2.2 'Schijnbare' afwijkingen van de wet van Lambert en Beer 5 5. Lichtbron 6 5.1 Waterstof- en Deuteriumlamp 6 6 Monochromator 7 6.1 Interferentiefilter monochromator 7 6.2 Prismamonochromator 8 6.3 Roostermonochromator 8 7 Detector 9 8 Spectrometers voor UV- en zichtbaar licht 10 8.1 Enkelstraals spectrometer 10 8.2 Dubbelstraals spectrometer 10 8.3 'Diode array' spectrometer 11 8.4 UV-detectie bij High Performance Liquid Chromatography (HPLC) 11 9 Optimale extinctiewaarden 11 10 Optische doorlaatbaarheid 13 11 Absorptie-spectrometrie in UV- en zichtbaar licht 15 11.1 Organische verbindingen 15 11.2 Anorganische verbindingen 15 11.3 'Charge transfer' complexen 16 11.4 Gewenste eigenschappen van de lichtabsorberende verbinding 16 12 Nomenclatuur 17 13 Literatuur 17
Moleculaire absorptiespectrometrie in UV en zichtbaar licht 1. Inleiding 1.1 Waarom is een rode oplossing rood gekleurd? Een oplossing van Fe(SCN) 2+ -ionen in water is rood gekleurd omdat de ionen vooral groen licht uit het ingestraalde witte licht absorberen. Het overblijvende licht zien wij als rood. De verandering van de doorgelaten lichtintensiteit bij veranderende concentratie van de ionen is in dat geval het grootst bij meting van de intensiteit van het groene licht. In het algemeen geldt dat de meting van de hoeveelheid geabsorbeerd licht het gevoeligst kan indien de kleur van het gemeten licht complementair is aan de kleur van de oplossing waaraan gemeten wordt. TABEL 1 Zichtbare deel van het elektromagnetische spectrum (400-800 nm) Golflengte [nm] Kleur Complementaire kleur 400-435 Violet Geel-groen 435-480 Blauw Geel 480-490 Blauw-groen Oranje 490-500 Groen-blauw Rood 500-560 Groen Purper 560-580 Geel-groen Violet 580-595 Geel Blauw 595-650 Oranje Blauw-groen 650-750 Rood Groen-blauw 1.2 Wat zijn complementaire kleuren? Indien twee kleuren licht in de juiste verhouding worden gemengd, door de twee lichtbundels op één wit vlak te laten vallen en het resultaat is voor de waarnemer wit licht, dan spreekt men van complementaire kleuren. 1.3 Wat doet een gekleurde oplossing met het geabsorbeerde licht? Volgens de kwantumtheorie heeft elk atoom, ion of molecuul een discreet aantal energieniveaus. Het laagste energieniveau noemt men de grondtoestand, bij een hoger energieniveau spreekt men van een aangeslagen toestand. Bij kamertemperatuur zijn vrijwel alle genoemde deeltjes in de grondtoestand. Indien een lichtkwant of foton met een energie die precies gelijk is aan het energieverschil tussen een aangeslagen toestand en de grondtoestand het deeltje treft dan kan dat deeltje het foton absorberen. Daarbij raakt het deeltje in de aangeslagen toestand volgens reactie (1): M + passend foton: M * (1) -1-
Na korte tijd, de relaxatietijd: 10-6 tot 10-9 s, valt het deeltje terug naar de grondtoestand. De energie die daarbij vrijkomt draagt het deeltje over aan andere deeltjes in zijn omgeving. Dit proces veroorzaakt een kleine stijging van de temperatuur in de omgeving van het deeltje: M * M + warmte (2) De relaxatietijd is zó gering, dat op elk moment de concentratie aan aangeslagen deeltjes zeer klein is. De vrijkomende hoeveelheid warmte is zo gering dat een temperatuurstijging niet meetbaar is. 2. Wet van Planck Indien een atoom, ion of molecuul, door het absorberen van een passend foton, overgaat van de ene energietoestand (bijv. de grondtoestand) in een andere (de aangeslagen toestand) dan geldt daarvoor de wet van Planck: waarin ΔE het energie verschil [J] tussen de beide energietoestanden, h de constante van Planck [J s], c de snelheid van het licht [m s -1 ], λ de golflengte [m] en ν de frequentie van de straling [s -1 ]. Omdat de energieniveaus E 1 en E 2 discrete waarden hebben, wordt ook straling met discrete golflengten (of frequenties) geabsorbeerd. 3. Interactie tussen straling en materie UV- en zichtbaar licht zijn beide vormen van elektromagnetische straling. Straling uit een groot deel van het elektromagnetische spectrum kan interactie aangaan met materie. De energie-inhoud van de straling, die afhankelijk is van de golflengte ervan, bepaalt welke soort interactie plaats vindt. Een overzicht van de soort interacties die straling met materie kan aangaan is gegeven in Tabel 2. TABEL 2 Spectrum van elektromagnetische straling straling: golflengte: interactie met: Gamma <0.1 nm kern Röntgen 0.1-5 nm binnenste elektronen UV 50-400 nm bindings- en π-elektronen Zichtbaar licht 400-800 nm bindingselektronen IR + Microgolven 1-500 mm rotatie en vibratie in moleculen Radar ca. 1 cm elektronenspin (ESR ± 3 cm) TV, FM-radio 1-10 m kernspin (NMR) Korte golf radio 10-100 m geen Midden golf radio 100-500 m geen Lange golf radio 500-1500 m geen (3) -2-
Zowel spectrofotometrie d.w.z. een vorm van moleculaire absorptie spectrometrie als atomaire absorptie- en atomaire emissie spectrometrie maken gebruik van interacties in het ultraviolette en het zichtbare deel van het elektromagnetische spectrum. Het verschil is dat bij spectrofotometrie sprake is van interacties met bindingselektronen en π-systemen in moleculen terwijl bij atomaire absorptie- en atomaire emissiespectrometrie sprake is van interacties met elektronen in de buitenste schil van afzonderlijke atomen. Bij AAS vindt de (atomaire) absorptie plaats binnen een zeer nauwe spectrale band. Bij spectrofotometrie daarentegen vindt de moleculaire absorptie plaats in een brede spectrale band. Dit komt omdat bij moleculaire absorptie naast (veel) elektronenovergangen ook vibratie- en rotatie-energieën een rol spelen. Hoewel ook dan in principe slechts discrete golflengten kunnen voorkomen, is het aantal overgangen zó groot dat het spectrum bij waarneming toch continu lijkt te zijn (Fig.1). Daardoor vindt moleculaire absorptie en emissie plaats in (soms brede) banden. Fig.1. Energieniveaus in een molecuul. E = elektronenniveaus, V = vibratieniveaus, r = rotatieniveaus. Zeer veel overgangen ΔE i zijn mogelijk. Bij de overgang van E o naar E 1 hangt het sterk af van V en r wat de exacte waarde van ΔE i is. 4. Wet van Lambert en Beer 4.1. Afleiding We beschouwen de afname van de invallende lichtintensiteit I o ten gevolge van lichtabsorptie na doorgang door een medium waarin een concentratie aan absorberende deeltjes c en met dikte b. Daartoe denken we de absorberende laag opgedeeld in zeer dunne laagjes met dikte db. De afname in de lichtintensiteit di ten gevolge van de doorgang door het laagje is evenredig met de dikte db, met de daarop invallende lichtintensiteit I en met de concentratie aan absorberende deeltjes c. In formule geldt voor een laagje met dikte db: di = -a I c db (4) waarin a een evenredigheidsconstante is. Deze vergelijking kan omgewerkt en geïntegreerd worden: -3-
(5) of: ln I -ln I o = -a c b (6) en: (7) per definitie geldt: dus: A = ε b c (9) Vergelijking (9) heet de Wet van Lambert en Beer. Hierin is A de extinctie, ε de molaire extinctiecoëfficiënt [l mol -1 cm -1 ], een andere evenredigheidsconstante vanwege de omzetting van ln naar log, b de dikte van de lichtabsorberende laag [cm] en c de concentratie van de absorberende stof [mol l -1 ]. I/I o T wordt de transmissie genoemd. Uit vergelijking (9) volgt dat er een lineair verband bestaat tussen A en c mits ε een constante is. Het blijkt dat ε afhankelijk is van de aard van de stof en van de golflengte. Het genoemde lineaire verband bestaat dus alleen bij gebruik van monochromatisch licht. Als A wordt uitgezet tegen c, dan is de helling van de ijklijn, dat is dus de gevoeligheid gelijk aan ε b. Een grote waarde van ε maakt dus een gevoelige bepaling mogelijk. De molaire extinctiecoëfficiënt ε is een maat voor de kans dat een energie-overgang plaats vindt en dat licht dientengevolge wordt geabsorbeerd. De wet van Lambert en Beer is ook toepasbaar op mengsels van absorberende stoffen, mits deze stoffen onderling geen interactie aangaan. Extincties zijn dan additief, d.w.z. dat extincties van verschillende stoffen gewoon bij elkaar kunnen worden opgeteld. Als A i de extinctie is van verbinding "i", dan geldt bij één golflengte de formule: A totaal = A 1 +A 2 +A 3 +... = ε 1 b c 1 + ε 2 b c 2 + ε 3 b c 3 +... (10) Door bij meerdere golflengten de extinctie te bepalen is het soms mogelijk mengsels van meerdere lichtabsorberende stoffen te analyseren. Als er n stoffen in het mengsel aanwezig zijn met een bekende ε i, dan kunnen in principe de concentraties bepaald worden uit n vergelijkingen (= metingen bij verschillende golflengten) met n onbekenden. In de praktijk kan dit lastig of onmogelijk zijn, ook omdat de extinctiecoëfficiënten veelal onbekend zijn. (8) -4-
4.2. Afwijkingen van de wet van Lambert en Beer Afwijkingen van de wet van Lambert en Beer kunnen onderverdeeld worden in 'echte' afwijkingen en 'schijnbare' afwijkingen. Echte afwijkingen komen weinig voor. Schijnbare afwijkingen kunnen veroorzaakt worden door instrumentele of door chemische effecten. Deze afwijkingen leiden in het algemeen tot gekromde ijklijnen. 4.2.1. 'Echte' afwijkingen van de wet van Lambert en Beer Echte afwijkingen kunnen ondermeer voorkomen bij sterk geconcentreerde oplossingen waar de opgeloste lichtabsorberende deeltjes elkaar gaan beïnvloeden. Door deze interactie kan het vermogen om licht te absorberen veranderen. Moleculaire absorptie blijkt ook afhankelijk te zijn van de brekingsindex voor het geabsorbeerde licht. Als verandering van de concentratie leidt tot een verandering van de brekingsindex dan zal dit afwijkingen van de wet van Lambert en Beer tot gevolg hebben. Dit laatste effect treedt zelden op bij concentraties < 10-2 mol l -1. Om voorgaande redenen wordt het gebruik van de wet van Lambert en Beer beperkt tot oplossingen met concentraties <10-2 mol l -1. 4.2.2. 'Schijnbare' afwijkingen van de wet van Lambert en Beer Schijnbare afwijkingen van de wet van Lambert en Beer kunnen voorkomen als gevolg van instrumentele imperfecties of als gevolg van chemische processen. Strooilicht, dat is een teveel aan licht dat ten gevolge van reflecties van ongewenst licht binnen het apparaat en/of door onvolkomenheden van de monochromator de detector bereikt, leidt tot schijnbare afwijkingen. Ook verlies aan (gewenst) licht door reflecties, met name in de meetkuvet kan leiden tot schijnbare afwijkingen. Een andere bron van instrumentele afwijkingen is een niet constante waarde van ε. De extinctiecoëfficiënt ε is een functie van de golflengte λ. Aangezien monochromatisch licht altijd een zekere bandbreedte heeft, neemt men bij voorkeur ε -waarden waarvoor geldt dat dε /dλ = 0, dat zijn dus maxima in de ε vs. λ grafiek, zodat ε binnen de gebruikte bandbreedte zo constant mogelijk is (Fig. 2). Fig.2. Het effect van de bandbreedte op de gemeten extinctie: Binnen band A is de extinctie (eigenlijk ε) constant, terwijl binnen band B de extinctie varieert waardoor het lineaire verband tussen A en c verloren gaat. -5-
Afwijkingen van de wet van Lambert en Beer door chemische processen kunnen optreden als de lichtabsorberende stof deelneemt aan een concentratie-afhankelijk evenwicht zoals een dissociatie of een associatie. Voorbeelden daarvan zijn gekleurde ph-indicator oplossingen waarbij zowel de gedissocieerde als de ongedissocieerde vorm van de indicator licht van de meetgolflengte absorberen. Uitgewerkte voorbeelden zijn te vinden in de literatuur [1,2]. 5. Lichtbron Om de lichtabsorptie als functie van de golflengte te kunnen bepalen, d.w.z. om een absorptiespectrum van een stof te kunnen maken moet men beschikken over een lichtbron met voldoende intensiteit en die in het gewenste spectraalgebied een continuüm uitzendt. Voor spectrofotometrie in zichtbaar licht wordt daarvoor gebruik gemaakt van een (halogeen) gloeilamp met wolfraam gloeispiraal, bruikbaar in het gebied 240-2500 nm. Voor het UV- gebied wordt gebruik gemaakt van een H 2 - of een D 2 -lamp. De laatste zendt een continuüm uit in het gebied 180-300 nm. Voor elke lichtbron geldt dat de intensiteit I o van het uitgezonden licht afhankelijk is van de golflengte λ. 5.1. Waterstof- en Deuteriumlamp Deuterium is een isotoop van waterstof waarvan de kern één proton en één neutron bevat. Een gasontladingsbuis gevuld met deuteriumgas of waterstofgas bij lage druk zendt in het UV-gebied, tussen ca. 180 en 300 nm een continu spectrum uit (Fig.3). Dit continuüm wordt verkregen doordat een geëxciteerd molecuul wordt gevormd dat uiteen valt in twee atomen en een UV-foton. Voor waterstof: H 2 + E el. H 2 * H' + H" + foton (11) Hierin is E el. de elektrische energie die door het waterstofmolecuul geabsorbeerd werd. De energie van het geëxciteerde waterstofmolecuul, H 2 *, is weliswaar gekwantiseerd, en kan dus slechts discrete waarden aannemen, maar E H' en E H" niet. Energetisch geldt dat de som van de kinetische energieën van H' en H" plus de energie van het foton gelijk moet zijn aan de energie van het geëxciteerde waterstofmolecuul. E H2* = E H' + E H" + h ν foton (12) De som van de beide kinetische energieën kan variëren van 0 tot de energie van het geëxciteerde waterstofmolecuul. Als deze som klein is, is h ν groot en omgekeerd. Als consequentie zendt een waterstoflamp een "echt" continu spectrum uit. Voor een deuteriumlamp geldt hetzelfde, het bruikbare werkgebied van de deuteriumlamp is iets groter dan dat van de waterstoflamp. Ook bij dit type lampen geldt dat de intensiteit I o niet bij elke golflengte dezelfde is. -6-
Fig.3. Emissiespectrum (continuüm) van een deuteriumlamp. 6. Monochromator De monochromator dient bij moleculaire absorptie metingen om het gewenste monochromatische licht te verkrijgen. De bandbreedte van absorptiebanden bij moleculaire absorptie is, zoals we eerder zagen groot. Het benodigde oplossend vermogen van de monochromator is dus niet erg groot, nl. ca 10 nm. Dit wil zeggen dat twee spectraallijnen die 10 nm van elkaar liggen moeten nog net als afzonderlijke lijnen herkenbaar zijn. Bij alle monochromatoren is een voorziening (bijv. een lens of een paar spleten) waarmee de intredende lichtbundel evenwijdig gemaakt wordt. Meestal aanwezig zijn een lens om het licht te focusseren en een spleet waarmee een deel van het spectrum kan worden geselecteerd. De breedte van de laatste spleet is mede bepalend voor de resolutie van de monochromator. Gangbare monochromatoren zijn: 6.1. interferentiefilter 6.2. prisma 6.3. rooster 6.1 Interferentiefilter monochromator Een interferentiefilter bestaat uit een plaat van glasachtig materiaal (vaak CaF 2 of MgF 2 ) die aan voor- en achterzijde verspiegeld is. De dikte van de plaat is nauwkeurig constant gemaakt. Wanneer licht op de plaat valt wordt het merendeel aan de voorzijde gereflecteerd, een klein deel van het licht wordt doorgelaten. Een zelfde verschijnsel vindt aan de achterzijde plaats. Het aan de achterzijde gereflecteerde licht wordt voor een deel weer aan de voorzijde gereflecteerd. Indien het twee maal gereflecteerde licht en het niet gereflecteerde licht precies in fase zijn treedt geen uitdoving op. Bij een klein faseverschil zal na vaker herhaalde reflecties een faseverschil van ½ λ ontstaan. In dat geval zal het licht door interferentie gedoofd worden. Naarmate het reflecterende vermogen van voor- en achterzijde groter is zal het licht vaker worden gereflecteerd en zal de spectrale bandbreedte van de filter kleiner zijn, maar de doorgelaten lichtintensiteit ook. Ga zelf na hoeveel licht ongehinderd de interferentiefilter kan passeren bij resp. 90 en 99% reflectie van licht aan voor- en achterzijde van de filter. (Antwoord: resp. 1% en 0.01%) Bij loodrechte inval is de voorwaarde voor niet-uitdoving: 2 n d = k λ (13) -7-
waarin n de brekingsindex van het glasachtige materiaal, d de dikte van de plaat en k het orde getal. Omdat k ieder geheel getal kan zijn is het noodzakelijk een interferentiefilter te combineren met een absorptiefilter (een gekleurd stuk glas). Er bestaan interferentiefilters voor het ultraviolette en het zichtbare deel van het spectrum. De gangbare bandbreedte is ca. 1.5% van de golflengte in het transmissie maximum. Bij spectrofotometrie, d.w.z. moleculaire absorptie in UV- en zichtbaar licht wordt dit type veel gebruikt. De vraag zou kunnen rijzen waarom bij deze techniek bijna geen absorptiefilters gebruikt worden. De reden daarvoor is dat de bandbreedte van dat soort filters te groot is nl. minimaal ca 50 nm. Daardoor is ε binnen de gemeten spectrale band niet meer constant en is de ijklijn sterk gekromd. Alleen voor sommige eenvoudige routine bepalingen kunnen dergelijke, zeer goedkope filters wel worden gebruikt. Een nadeel van interferentiefilters is dat voor elke gewenste golflengte een afzonderlijke filter nodig is. 6.2. Prismamonochromator Een prismamonochromator werkt volgens het principe dat de brekingsindex van glas een functie is van de golflengte van het licht. Blauw licht wordt meer gebroken dan rood licht. De genoemde functie is een zeer grillige, waardoor sommige delen van het spectrum meer opgerekt worden dan andere, m.a.w. de dispersie, dθ/dλ (θ = afbuigingshoek) van een prisma is niet lineair. De dispersie wordt groter bij kleinere golflengten. Glas laat golflengten beneden 400 nm niet voldoende door, kwarts is bruikbaar voor het gebied 200-1000 nm. Prisma's worden soms nog gebruikt bij hoge temperatuur emissie (boog en vonk) waar een grote resolutie vereist is. In de spectrofotometrie worden ze niet gebruikt. 6.3. Roostermonochromator Een roostermonochromator werkt volgens het principe van interferentie (Fig.4). Het roostermateriaal (niet gepolijst, microkristallijn materiaal), waarin 1200-1400 groeven per mm zijn aangebracht reflecteert het licht in alle richtingen. Door middel van een spleet wordt een teruggekaatste bundel geselecteerd. Het weglengteverschil tussen straal 1 en 2 is gelijk aan BC + BD. De invallende bundel en de gereflecteerde bundel maken hoeken van i resp. r [graden] met de normaal (N.B. hoeken i en r -8-
hoeven dus niet aan elkaar gelijk te zijn!). Indien de roosterafstand d bedraagt, dan is BC+BD gelijk aan: d sin i + d sin r. Indien geldt: d sin i + d sin r = k λ (14) treedt geen uitdoving door interferentie op. Het ordegetal k kan ieder geheel getal zijn. Indien λ niet exact aan Verg. (14) voldoet treedt uitdoving op. Roosters hebben de prettige eigenschap dat de dispersie lineair is en dat ze bruikbaar zijn in een groot golflengtegebied. Een lineaire dispersie brengt mee dat de stand van het rooster (hoek θ) via tandwielen gekoppeld kan worden aan een telwerk dat de golflengte λ aangeeft. In spectrofotometers waarbij de lichtabsorptie als functie van λ kan worden bepaald (d.w.z. indien een absorptiespectrum kan worden opgenomen) wordt altijd gebruik gemaakt van een interferentierooster. 7. Detector. Bij eenvoudige spectrofotometers wordt vaak een fotocel als detector gebruikt. Er bestaan fotocellen die alleen gevoelig zijn voor langgolvig zichtbaar licht en die alleen gevoelig zijn voor kortgolvig UV- en zichtbaar licht. Sommige spectrofotometers zijn uitgerust met twee fotocellen. In dat geval wordt, afhankelijk van het spectrale gebied de meest gevoelige fotocel gebruikt. In de wat meer geavanceerde spectrofotometers wordt de fotomultiplicator- of lawinebuis (FMT) als detector gebruikt. Dit is een lichtdetector die over een groot golflengtegebied gevoelig is, zij het niet in gelijke mate. Het licht dat de geëvacueerde FMT binnenkomt valt op een fotokathode, die gemaakt is van een materiaal dat elektronen afgeeft onder invloed van licht. Het aantal afgegeven elektronen per tijdseenheid is evenredig met de intensiteit van het invallende licht. De vrijgekomen elektronen worden aangetrokken door een elektrode (dynode) waarop een positieve spanning staat. Elk inslaand elektron maakt uit de eerste dynode een aantal secundaire elektronen los. Deze elektronen worden weer aangetrokken door een volgende dynode die op een hogere positieve spanning staat. De meeste FMT's hebben tien dynodes (Fig.5). Daarmee kan een stroomversterking gehaald worden van zo'n 10 8 x. De gevoeligheid (stroomversterking) kan worden gevarieerd door de spanning op de dynodes te variëren. Door het instellen van de "nul" van een spectrofotometer met een blanco oplossing wordt de spanning op de FMT zo ingesteld dat de transmissiemeter 100% (extinctie A = 0) aangeeft. Door de aanwezigheid van lichtabsorberende stof wordt de gemeten hoeveelheid licht minder en neemt de transmissie af (de extinctie neemt dan toe). Fig.5: Elektrodeconfiguratie in een fotomultiplicatorbuis -9-
8. Spectrofotometers voor UV- en zichtbaar licht 8.1. Enkelstraals spectrometer Enkelstraals spectrofotometers bestaan uit: 1. een stralingsbron, die een continuüm uitzendt in het gebruikte werkgebied (UV: 160-380 nm, zichtbaar: 380-800 nm), 2. een monochromator voor de golflengte selectie, dit kan een filter- of een roostermonochromator zijn. 3. een sluiter die in de lichtweg geplaatst kan worden en waarmee het mogelijk is de transmissie op 0% in te stellen, 4. twee identieke cellen één voor de analytoplossing en één voor de referentieoplossing met hetzelfde oplosmiddel, die om en om in de lichtweg geplaatst kunnen worden, 5. een detector die gevoelig is in het gebruikte spectrale werkgebied, dat kan een fotocel zijn of een fotomultiplicatorbuis (FMT), 6. een versterker om het signaal te versterken. Een meting van de transmissie verloopt als volgt: 0% T wordt ingesteld door de sluiter in de lichtweg te plaatsen, 100% T wordt ingesteld door de referentiecel in de lichtweg te plaatsen en de transmissie van de analyt kan dan gemeten worden. De extinctie kan uit de verkregen transmissie berekend worden. Bij de meeste apparaten gebeurt dit automatisch. Voor meting van de extinctie bij één golflengte voldoet een enkelstraals spectrometer uitstekend. 8.2. Dubbelstraals spectrometer Indien een absorptiespectrum wordt opgenomen dient bij elke golflengte afzonderlijk zowel I als I o bepaald te worden. Dit is uiteraard veel werk, daarom wordt in dat geval een dubbelstraals spectrometer gebruikt. Moderne spectrofotometers worden vaak uitgevoerd als dubbelstraals instrument. Dit houdt in dat de invallende bundel vóór het absorptiekuvet wordt gesplitst in twee delen. Dit kan op twee manieren: bij de ene manier wordt de lichtstraal door middel van een 'beam splitter' in twee helften gesplitst, bij de andere manier wordt de lichtbundel, door middel van een roterende spiegel alternerend twee verschillende kanten opgestuurd. De ene bundel wordt door de monsterkuvet gestuurd (dit levert I), de andere door een referentiekuvet (dit levert I o ). Beide signalen worden, na versterking gemeten en de extinctie (A = log I o - log I) wordt geregistreerd. Een voordeel van een dubbelstraals instrument is ook dat op deze wijze gecompenseerd wordt voor drift in de stralingsbron en in de signaalversterkers. Een nadeel van een dubbelstraals spectrometer kan zijn dat het niet opvalt als de optische doorlaatbaarheid van de gebruikte optische materialen en/of oplosmiddelen bij de gebruikte golflengte onvoldoende is. Dit onderwerp wordt uitvoeriger in Hoofdstuk 10 behandeld. -10-
8.3. 'Diode array' spectrometers. Bij een 'diode array' spectrometer wordt het licht na doorgang door het absorptiekuvet niet bij één golflengte gemeten maar praktisch gelijktijdig bij een groot aantal golflengten. Het polychromatische (witte) licht dat door de kuvet is gegaan wordt door de monochromator, een 'echellette'-rooster in zijn bestanddelen gesplitst. De detectoren zijn in dit geval een groot aantal dioden die op een rij gemonteerd zijn, zo dat elke diode de lichtabsorptie bij een andere golflengte meet. Op deze wijze kan de lichtabsorptie vlak na elkaar bij enige honderden golflengten worden gemeten. Het hele spectrum wordt zo in minder dan 1 s gemeten. Het oplossend vermogen van dit type van spectrometer is 1 tot 2 nm. Een meer gedetailleerde beschrijving is te vinden in de literatuur [1]. 8.4. UV-detectie bij High Performance Liquid Chromatography (HPLC) UV-spectrometrie is een van de meest gebruikte detectiemethoden bij HPLC. Bij het meest eenvoudige type wordt een kwiklamp gebruikt die sterke emissielijnen heeft bij 254 en 280 nm. Met behulp van een interferentiefilter wordt de gewenste lijn geselecteerd uit het emissiespectrum van de lichtbron. Veel organische functionele groepen absorberen licht bij deze golflengten. De weglengte door de meetkuvet of meetcel is bij deze detectoren vrijwel altijd 1.0 cm. Het volume van de UV-meetcel wordt zo klein mogelijk gemaakt (10-20 µl) om het oplossend vermogen van de HPLC niet nodeloos te verkleinen. De diameter van de cel is dus 1.1-1.6 mm. Een tweede meetcel in de aanvoerleiding van het eluens dient als referentiecel. Bij meer geavanceerde HPLC-apparaten, uitgerust met een roostermonochromator, is een vrijere keuze van de detectiegolflengte mogelijk. De lichtbron voor het UV-gebied is dan een waterstof- of een deuteriumlamp. 9. Optimale extinctiewaarden De nauwkeurigheid van metingen met een spectrofotometer zijn ondermeer afhankelijk van de gemeten extinctie. Dit valt als volgt in te zien: De wet van Lambert en Beer (Vgl. 9) is te herschrijven als: (15) T=10 -A (16) (17) -11-
Fig.6. De relatieve fout in de concentratie c bij een absolute fout dt in het percentage transmissie T (dat is het linker lid van vergelijking (17)) als functie van de extinctie A. De gebruikte "eenheid" voor de fout is de minimale relatieve fout in c. Indien de maximaal aanvaardbare relatieve fout in c, 2 keer de minimale fout is, dan moet voor de extinctie gelden: 0.1<A<1.2. In de grafiek zijn alleen extincties weergegeven waarbij T>1%. De linker term van vergelijking (17) is te interpreteren als de relatieve fout in c bij een gegeven (absolute) fout dt in het percentage transmissie. In eerste benadering is dt onafhankelijk van T. Bij moderne instrumenten is dt = 0.1-0.2%. Tabel 3 geeft dc/c vs. T, waarbij de absolute fout in T, dt = 0.2% is gesteld. Het blijkt dat de relatieve fout in c het kleinst is (< 1.0%) in het gebied A = 0.1 tot 1.2. Het optimum ligt bij A = 0.43 (T = 37%). TABEL 3 Relatieve fout in c (dc/c, volgens de wet van Lambert en Beer gelijk aan da/a) bij verschillende extinctiewaarden indien dt = 0.2%. Hiertoe zijn telkens twee T- waarden 0.2% van elkaar verschillend, de bijbehorende A-waarden en het procentuele verschil tussen beide A-waarden opgenomen. T [%] A da/a =dc/c T [%] A da/a =dc/c 05.0 1.3010 63.1 0.2000 05.2 1.2840 1.3% 63.3 0.1986 0.70% 10.0 1.0000 79.4 0.1000 10.2 0.9914 0.86% 79.6 0.0990 1.0% 15.8 0.8013 90.0 0.04576 16.0 0.7959 0.67% 90.2 0.04479 2.2% 30.0 0.5229 95.0 0.02228 30.2 0.5200 0.56% 95.2 0.02136 4.1% -12-
Het linker lid van vergelijking (17) kan ook grafisch worden uitgezet tegen T of tegen A (Fig.6). Indien aan de fout in de transmissie dt een waarde wordt toegekend kan verticaal worden volstaan met de term dc/c. Men dient zich te realiseren dat de grafiek daarmee apparaatspecifiek is gemaakt en dat eenheden dus vereist zijn. In verband met de optredende fout dt is het meetbereik van een spectrofotometer dus beperkt tot ruim één dekade. (Eén concentratiedekade is een concentratiegebied waarbij de hoogste concentratie gelijk is aan tien maal de laagste concentratie.) Uiteraard kan men wel bij lagere extincties dan ca 0.05 meten, maar dan dient men rekening te houden met een grotere fout in de gemeten concentratie. Voor veel doeleinden is een dergelijke meting, ondanks de grotere fout, toch bruikbaar. 10. Optische doorlaatbaarheid Het is uiteraard belangrijk dat de kuvet waarin de analyt gemeten wordt en de materialen van de monochromator en van de detector het gemeten licht in voldoende mate doorlaten. In Tabel 4 zijn de bruikbare golflengtegebieden voor een aantal optische materialen weergegeven. Voor normale spectrofotometrische bepalingen in het zichtbaar licht wordt 'gewoon' glas gebruikt. Bij golflengten in het UV- gebied worden kwarts kuvetten gebruikt. Kwarts kuvetten zijn op het oog niet te onderscheiden van glazen kuvetten. De prijs van kwarts kuvetten is echter minstens 5x zo hoog als die van glazen kuvetten. TABEL 4 Bruikbare golflengtegebieden [nm] voor optische materialen. Materiaal golflengten [nm] glas (afhankelijk van type) 400-2000 kwarts en "fused silica 200-3300 NaCl 300-15000 LiF 200-5000 CaF 2 200-12000 AgCl 400-25000 KBr 300-30000 CsBr 300-50000 CsI 300.-.70000 Kuvetten voor spectrofotometrie zijn gemerkt met de letters OG (optisch glas), S (Suprasil-glas) of Q (kwarts). -13-
TABEL 5 Ondergrens van het bruikbare golflengtegebied [nm] voor spectrofotometrie in UV- en zichtbaar licht. oplosmiddel golflengte [nm] aceton 330 acetonitril 210 benzeen 285 butylacetaat 260 chloroform 245 cyclohexaan 215 dichloormethaan 235 1,2-dichloorethaan 235 N,N-dimethylformamide 270 dioxaan 225 ethanol 205 diethylether 205 ethylacetaat 260 glycerol 230 n-hexaan 200 iso-octaan 215 iso-propanol 210 methanol 215 methyleenchloride 230 pyridine 305 tetrachloormethaan 265 tetrachlooretheen 290 tolueen 285 water 190 m-xyleen 295 zwavelkoolstof 375 Van de gebruikte oplosmiddelen wordt vereist dat de analyt er in voldoende mate in oplost en dat het licht van de gebruikte golflengten in voldoende mate doorlaat. Voor spectrofotometrie in het UV- en zichtbaar licht zijn een groot aantal oplosmiddelen bruikbaar. In Tabel 5 zijn de ondergrenzen van het bruikbare gebied voor veel gebruikte oplosmiddelen gegeven. Bij meting met een dubbelstraals spectrometer merkt men in het algemeen niet dat de optische doorlaatbaarheid van de gebruikte optische materialen en/of oplosmiddelen bij de gebruikte golflengte onvoldoende is. Dit blijkt alleen uit een toename van het ruisniveau. Het is dus zeer zinvol Tabel 4 en 5 te raadplegen, of in geval van twijfel een controlemeting te doen met een enkelstraals spectrometer. 11. Absorptie-spectrometrie in UV- en zichtbaar licht -14-
11.1. Organische verbindingen Moleculen die voldoende zichtbaar licht (400-800 nm) of licht in het nabije UV (190-400 nm) absorberen kunnen in principe door middel van spectrofotometrie bepaald worden. In organische moleculen zijn twee typen elektronen verantwoordelijk voor absorptie van zichtbaar- en/of UV-licht: gepaarde bindingselektronen en ongepaarde elektronen van atomen als zuurstof, halogenen, zwavel en stikstof. De golflengte waarbij een organisch molecuul absorbeert is afhankelijk van het energieverschil ΔE tussen de aangeslagen toestand en de grondtoestand van het desbetreffende elektron. Dit energieverschil is bij de gepaarde elektronen van de C-C en C-H bindingen zo groot dat alleen straling in het verre UV, met golflengten λ «180 nm wordt geabsorbeerd. Straling met deze golflengten is niet bruikbaar voor normale spectrofotometrie omdat die door lucht en veel materialen (waaronder glas en kwarts van kuvetten) wordt geabsorbeerd. n-alkanen kunnen dus niet spectrofotometrisch worden bepaald, omdat ε in het bruikbare UV-gebied voor dit type verbindingen veel te klein is. Organische verbindingen met dubbele en drievoudige bindingen vertonen absorptiebanden in het bruikbare UV- gebied, omdat ΔE geschikte waarden heeft. Dit geldt met name voor geconjugeerde systemen als bijv. CH 2 =CHCH=CH 2. Onverzadigde groepen in organische verbindingen die zichtbaar- en/of UV-licht absorberen worden chromoforen genoemd. Organische moleculen die zwavel, broom of jodium bevatten absorberen UV- straling uit het nabije UV doordat de ongepaarde elektronen van deze atomen relatief gemakkelijk aangeslagen kunnen worden. 11.2. Anorganische verbindingen De spectra van de meeste lichtabsorberende anorganische verbindingen lijken sterk op die van organische verbindingen in de zin dat de spectra ook uit brede banden bestaan, waar weinig fijnstruktuur in zit. Een uitzondering vormen de spectra van de ionen van de lanthaniden en actiniden (de zeldzame aardmetalen). De elektronen die verantwoordelijk zijn voor de lichtabsorptie, hier de 4f en de 5f elektronen, worden van uitwendige invloeden afgeschermd door elektronen uit hoger gelegen 'orbitals'. Dientengevolge zijn de absorptiebanden relatief smal en onafhankelijk van de aard van de binding met liganden die door elektronen uit hoger gelegen 'orbitals' wordt verzorgd. Vrijwel zonder uitzondering zijn ionen en complexen van de overgangsmetalen gekleurd in ten minste één van de oxydatietoestanden. De absorptie van zichtbaar licht wordt hier veroorzaakt door de overgang van een d-elektron van de grondtoestand naar een aangeslagen toestand. Het energieverschil ΔE tussen de grondtoestand en de aangeslagen toestand en dus de golflengte λ van het absorptiemaximum is in dit geval afhankelijk van de oxydatietoestand, van de plaats in het periodiek systeem en van de aard van het ligand dat aan het overgangsmetaal gebonden is. De waarde van ε is lang niet bij al deze gekleurde verbindingen groot genoeg om een spectrofotometrische bepaling 'zonder meer', d.w.z. zonder er een chromofore groep aan te hangen mogelijk te maken. Zie ook hoofdstuk 11.4. -15-
11.3. Charge transfer complexen Voor het doen van kwantitatieve bepalingen zijn 'charge transfer' complexen van groot belang omdat ze een grote molaire extinctiecoëfficiënt (ε > 10000 [l mol -1 cm -1 ]) hebben, waardoor bepaling van zeer lage concentraties van dit soort complexen mogelijk is. Een charge transfer complex bestaat uit een elektron-donor die gebonden is aan een elektron-acceptor. Bij de absorptie van straling met de juiste energie wordt een elektron van de elektron-donor afgestaan aan de elektron-acceptor. De aangeslagen toestand ontstaat dus door een intramoleculaire redoxreactie. Dit gedrag wijkt duidelijk af van dat van bijv. organische chromofore groepen waar de aangeslagen toestand zich bevindt in een 'molecular orbital' die door twee of meer atomen wordt gedeeld. Voorbeelden van dergelijke charge transfer complexen zijn: Fe(III)- thiocyanaat complex (rood), 1,10-fenanthroline complex met Fe 2+ (oranje-rood), het I 3- -complex met zetmeel (blauw) en het Fe 2+ /Fe(III)cyanide complex (Pruisisch blauw). Bij de meeste charge transfer complexen van metalen vormt het metaal de elektron-acceptor. Een van de weinige uitzonderingen hierop vormt het 1,10- fenanthroline complex met Fe 2+. Een meer exacte uitleg van het mechanisme van de absorptie van UV- en zichtbaar licht is mogelijk met behulp van de 'Molecular Orbital' theorie. Een beschrijving daarvan is in de literatuur [2] te vinden. 11.4. Gewenste eigenschappen van de lichtabsorberende verbinding Eigenschappen van de lichtabsorberende verbinding die gewenst zijn voor het doen van een spectrofotometrische bepaling zijn: a) De lichtabsorberende verbinding moet voldoende tijd stabiel zijn om een bepaling aan te kunnen doen. Veel gekleurde verbindingen zijn in de tijd niet geheel stabiel. b) Voor een gevoelige bepaling moet ε een grote waarde hebben, d.w.z. de lichtabsorptie bij tenminste één golflengte moet groot zijn. c) De lichtabsorptie mag niet al te gevoelig zijn voor omstandigheden als temperatuur, ph en de overmaat van een eventueel kleurreagens. d) De gekleurde verbinding moet bij voorkeur voldoen aan de wet van Lambert en Beer. Ook wanneer deze wet niet geheel opgaat kan een bepaling nog goed mogelijk zijn. Metaalionen die van zichzelf een te kleine waarde van ε vertonen kunnen vaak toch spectrofotometrisch worden bepaald door ze te laten reageren met een (vaak organisch) reagens waardoor de resulterende verbinding wel een voldoende grote waarde van ε vertoont. Dergelijke kleurreagentia moeten aan enige eisen voldoen: e) Het reagens moet voldoende stabiel zijn zodat het niet te vaak opnieuw hoeft te worden gemaakt. f) De kleurreactie moet liefst snel zijn. -16-
g) Het te bepalen metaal moet volledig en volgens een éénduidige (stoichiometrische) reactie met het kleurreagens reageren. Aan deze eis hoeft niet altijd geheel voldaan te zijn. h) Het reagens moet liefst selectief met het te bepalen metaal reageren. De reactie moet zo weinig mogelijk door andere metalen gestoord worden. i) Het reagens zelf mag bij de golflengte van de bepaling geen licht absorberen. 12. Nomenclatuur We kennen de term transmissie, afgekort met T ( I/I o, Engels "transmission"). De transmissie kan worden gegeven in % of als fractie. De extinctie (= -log T) wordt in het Engels "absorbance" genoemd, daarom is het internationaal afgesproken symbool "A". Daarnaast kennen we de (weinig gebruikte) term absorptie (= 100 - T [%], Engels "absorption"). Ten onrechte wordt in plaats van de term "extinctie" soms de term "absorptie" gebruikt. 13. Literatuur: 1. D.A.Skoog, D.M.West en F.J.Holler, "Fundamentals of Analytical Chemistry", 6th Edn. Saunders College Publishing, Fort Worth (1992), Hoofdstuk 20 t/m 22 (blz 508 t/m 603). (Theorie) 2. R.L.Pecsok, L.D.Shields, T.Cairns en I.G.McWilliam, "Modern Methods of Chemical Analysis", 2nd Edn. John Wiley & Sons, New York (1976), Hoofdstuk 8 t/m 10 en 12 (blz 115 t/m 164 en 226 t/m 242). (Theorie) 3. M.G.Mellon, Edt., "Analytical Absorption Spectroscopy, Absorptiometry and Colorimetry", John Wiley & Sons, London (1950). 4. J.Fries en H.Getrost, "Organische Reagenzien für die Spurenanalyse", E.Merk, Darmstadt (1975). 5. O.G.Koch en G.A.Koch-Dedic, "Handbuch der Spurenanalyse, Die Anreicherung und Bestimmung von Spurenelementen unter Anwendung extraktiver, photometischer, spektochemischer mikrobiologischer und anderer Verfahren", Springer Verlag, Berlin, (1964). -17-