Samenvatting en Conclusies

Samenvatting en Conclusies

Samenvatting en conclusies Samenvatting In dit proefschrift worden experimenten beschreven die leiden tot nieuwe inzichten in de cellulaire en moleculaire mechanismen van vasculaire groei. In het bijzonder is gekeken naar de groei van collaterale arteriën (arteriogenese) bij ischemie van het been. Het doel van dit proefschrift is om nieuwe strategieën te ontwikkelen voor therapeutische angiogenese en arteriogenese. Er worden conclusies getrokken uit experimenten in een muismodel dat perifeer vaatlijden nabootst, uit studies in humaan amputatiemateriaal en uit een klinische studie waarin angiogene gentherapie wordt toegepast in patiënten. Hoofdstuk 1 geeft een overzicht van wat op dit moment bekend is over de cellulaire en moleculaire mechanismen van vasculaire groei. Daarbij wordt nadrukkelijk ingegaan op de rol die angiogene factoren, het immuunsysteem en beenmerg daarbij spelen. Verder worden in dit hoofdstuk de resultaten en de beperkingen besproken van voorgaande klinische studies naar therapeutische angiogenese voor de behandeling van perifeer vaatlijden. Geconcludeerd wordt dat de teleurstellende resultaten van recente placebo-gecontroleerde studies de noodzaak aangeven voor meer basaal wetenschappelijk onderzoek in dit veld, waarbij het optimaliseren van de stamceltherapie een prominente plaats inneemt. De grote variëteit aan chirurgische technieken en eindpuntmetingen die wordt toegepast in studies waarin gebruik wordt gemaakt van het zogenaamde achterpoot ischemiemodel worden besproken in hoofdstuk 2. Dit hoofdstuk voorziet in een richtlijn die aangeeft hoe de resultaten van deze studies geïnterpreteerd moeten worden in relatie tot het soort model dat wordt toegepast. Bij de experimenten die in dit proefschrift beschreven worden is een muismodel gekozen dat met name geschikt is om de ontwikkeling van collaterale arteriën te bestuderen door selectie van een geschikte chirurgische techniek, beeldvorming van vascularizatie door middel van gedetailleerde angiografie en bepaling van de hemodynamiek middels perfusiemeting in de achterpoot. In hoofdstuk 3 wordt de bevinding beschreven dat muizenstammen, die verschillen in hun respons van het immuun systeem, tevens een groot verschil vertonen in het vermogen om collaterale vaten te ontwikkelen. Deze bevinding was de aanleiding om de modulerende rol voor lymfocyten bij de vorming van collateralen te bestuderen. Gebleken is dat in muizen zonder natural killer cellen (NK-cellen) de arteriogenese verstoord is, maar dat dit niet het geval is in muizen zonder natural killer T-cellen (een regulerend subtype van T-cellen) (NKT-cellen). In muizen die CD4+ T-cellen missen bleek de arteriogenese verminderd. Deze afname werd zelfs groter als dezelfde muizen ook nog werden gedepleteerd voor NK-cellen. Tevens wordt aangetoond dat T-cellen en NK-cellen accumuleren rond collaterale arteriën, en dat 177

zij een grote variëteit aan inflammatoire cytokines tot expressie brengen. Aan de hand van deze data wordt geconcludeerd dat NK-cellen en CD4+ T-cellen een rol spelen bij de groei van collateralen in de muis. Stimulering van arteriogenese door specifieke activatie van gedefinieerde lymfocytsubtypen is een veelbelovende behandeling voor patiënten met ischemisch lijden. In hoofdstuk 4 wordt aangetoond dat vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) en stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) een rol spelen bij neovascularizatie via retentie van CXCR4-positieve cellen in humaan ischemisch skeletspierweefsel. Bij twee patiënten met acuut-op-chronische ischemie bleken de VEGF, SDF-1 en CXCR4 expressies in ischemische spier verhoogd. Bij 9 van de 13 patiënten met chronische ischemie waren deze expressies echter verlaagd. Een mogelijke verklaring hiervoor is dat bij chronische ischemie de hypoxische weefsels niet in staat zijn voldoende transcriptiefactor hypoxia inducible factor 1 (HIF-1 ) tot expressie te brengen. De resultaten van het onderzoek laten voor het eerst in patiënten zien dat SDF-1 een centrale rol vervult in de retentie van uit beenmerg afkomstige cellen in hypoxische weefsels. Toekomstige experimenten, gericht op verschillen in angiogene expressieprofielen tussen acute en chronische hypoxische condities, kunnen mogelijk leiden tot verbetering van angiogene behandeling van patiënten met chronisch ischemisch lijden. In hoofdstuk 5 laten we zien dat er geen afname van angiografische collateraalvorming optreedt in diabetische of insulineresistente muizen en dat er slechts beperkte afname is van perfusieherstel na occlusie van de arteria femoralis. In hypercholesterolemische muizen op verschillende hoogcholesterol diëten was de collateraalvorming echter ernstig verstoord. Er was sprake van een omgekeerde correlatie tussen perfusieherstel en plasma cholesterolspiegels, terwijl die niet aanwezig was tussen perfusieherstel en plasma spiegels van triglyceride, vrije vetzuren, glucose of insuline. Geconcludeerd wordt dat een verstoorde arteriogenese meer geassocieerd is met hyperlipidemie dan met hyperglycemie of hyperinsulinemie, en dat de verstoring van arteriogenese cholesterol afhankelijk is in het muismodel. Geheel in lijn hiermee komt er steeds meer bewijs dat een verstoord vetmetabolisme een cruciale determinant vormt voor de ontwikkeling van diabetes en de daarmee samenhangende complicaties. Daarom zou een verstoord lipidenprofiel van cruciale betekenis kunnen zijn voor de afgenomen collateraalvorming bij diabetespatiënten. Deze bevindingen benadrukken het belang van lipidenverlagende medicijnen bij diabetespatiënten om complicaties van diabetes te voorkomen. In hoofdstuk 6 wordt aangetoond dat VEGF gentherapie resulteert in toegenomen expressie van myoglobine, een eiwit dat een belangrijke rol speelt in het zuurstofmetabolisme van spiercellen, in ischemische skeletspier in de muis. Verder wordt co-expressie aangetoond van VEGF en myoglobine in spierbioptieën van 178

Samenvatting en conclusies patiënten na amputatie van onder- of bovenbeen in verband met perifeer vaatlijden, die correleert met de mate van ischemie. Voorts wordt een directe regulatie van myoglobine door VEGF in skeletspiercellen van de muis in vitro geconstateerd. Deze data laten zien dat er door VEGF gentherapie niet alleen nieuwe capillairen ontstaan, maar dat ook de eigenschap van skeletspiervezels verandert, resulterend in een verbeterde spieroxygenatie. Dit zou een verklaring kunnen zijn voor de onbegrepen tegenstrijdigheden die worden waargenomen in eerdere klinische studies met VEGF. VEGF-gemedieerde toename van myoglobine in de spier zou, in ieder geval gedeeltelijk, kunnen verklaren waarom klinische verbeteringen, die worden waargenomen in VEGF-behandelde patiënten, niet correleren met een verbeterde vaatstatus. Hoofdstuk 7 beschrijft de resultaten van een dubbelblind gerandomiseerde studie die intramusculaire VEGF 165 plasmide behandeling (N=27) vergelijkt met een placebo behandeling (N=27) in diabetespatiënten met kritieke perifere ischemie. Het primaire eindpunt was het aantal amputaties na 100 dagen. Secundaire eindpunten waren een 15% toename van de enkel-arm index, klinische verbetering en veiligheid. Wanneer de VEGF- met de placebogroep werd vergeleken vond amputatie plaats in respectievelijk 3 versus 6 patiënten (NS), hemodynamiek verbeterde in 7 versus 1 patiënt(en) (P=0.05), ulcera van de huid genazen in 7 versus 0 patiënten (P=0.01), en pijn verminderde in 5 versus 2 patiënten (NS). Er werden geen substantiële zogenaamde adverse events waargenomen. Hoewel deze klinische studie haar primaire doel, namelijk significante reductie van het aantal amputaties, niet heeft gehaald, resulteerde VEGF gentherapie toch in secundaire klinische verbeteringen. Wij hopen dat deze studie kan zorgen voor een hernieuwde interesse in therapeutische angiogenese na de recente teleurstellende resultaten van andere placebogecontroleerde patiëntenstudies. Conclusies In dit proefschrift werd gebruik gemaakt van een muismodel om de cellulaire en moleculaire mechanismen van arteriogenese te bestuderen. Pas recent is begonnen met het ontrafelen van de rol die het immuunsysteem en de cellulaire componenten daarvan bij het vormen van collaterale arteriën speelt. Dit proefschrift draagt bij aan die ontrafeling door bewijs te leveren dat lymfocyten een rol spelen bij arteriogenese. Meer inzichten in welke (andere) celtypen betrokken zijn bij de vorming van collaterale arteriën zal de zogenaamde toolbox voor stimulatie van arteriogenese vergroten. Dit kan mogelijk leiden tot een verfijning van recent in de kliniek toegepaste autologe beenmergtransplantatie, bijvoorbeeld middels toediening van gedefinieerde lymfocytsubtypen of hun specifieke activatie/inhibitie met liganden voor respectievelijk activerende of inhiberende receptoren. Door gebruik te maken van het muismodel is het mogelijk om niet alleen kennis over te brengen van het laboratorium naar de patiënt, maar ook andersom. Zo leidden bijvoorbeeld de 179

onbegrepen gunstige resultaten in VEGF-behandelde patiënten zonder verbeterde vascularizatie tot de hypothese dat VEGF mogelijk niet alleen vaatjes laat groeien, maar ook spieroxygenatie verbetert door het veranderen van spieropbouw. Deze hypothese kon vervolgens worden bevestigd aan de hand van het muismodel. Deze bevinding is veelbelovend voor de ontwikkeling van nieuwe therapieën ter behandeling van een scala aan ziekten. Ondanks deze positieve resultaten uit het laboratorium is het van belang te realiseren dat vasculaire ziekten in patiënten complexer zijn dan in de genetisch gemanipuleerde muizen met dyslipidemie of diabetes. Zo zijn er bij patiënten meerdere vasculaire risicofactoren gelijktijdig aanwezig en zijn endotheel, beenmerg en/of het immuunsysteem mogelijk disfunctioneel wat een verstoorde arteriogenese tot gevolg heeft. Bovendien wordt in dit proefschrift aangetoond dat hypoxische weefsels niet in staat zijn om voldoende angiogene factoren tot expressie te brengen bij patiënten met chronische ischemie. Het is belangrijk om beter te begrijpen waarom vaatgroei in patiënten verstoord kan zijn, met name omdat de meeste placebogecontroleerde klinische studies met angiogene of arteriogene factoren tot op heden negatieve resultaten hebben laten zien. Hiervoor worden verschillende oorzaken aangedragen, variërend van het type angiogene factor tot de gebruikte techniek bij het toedienen van de angiogene factor, tot patiëntenselectie. Het ontwerp van de klinische studie, die wordt beschreven in dit proefschrift, waarbij gebruik werd gemaakt van intramusculaire VEGF plasmide, en waarmee enige gunstige effecten in diabetespatiënten met kritieke perifere ischemie werden behaald, samen met nieuw verworven inzichten in de moleculaire mechanismen die naar aanleiding van de muizenstudies blijken, kunnen een houvast vormen voor de ontwikkeling van nieuwe klinische protocollen. Ten slotte kan vooruitgang in het onderzoeksveld van arteriogenese niet alleen voordelig zijn voor de behandeling van perifeer vaatlijden, hetgeen het doel is van deze dissertatie, maar ook van coronairlijden, de belangrijkste doodsoorzaak van dit moment. Een van de vele uitdagingen is om de overeenkomsten en verschillen in cellulaire en moleculaire mechanismen van vasculaire groei tussen het been en het hart te ontrafelen, wat kan helpen bij het extrapoleren van resultaten van klinische studies uitgevoerd in het veld van de vaatchirurgie naar het veld van de cardiologie, en vice versa. 180