University of Groningen Experimental studies on signal transduction pathways in rheumatoid arthritis Bijl-Westra, Johanna IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below. Document Version Publisher's PDF, also known as Version of record Publication date: 2005 Link to publication in University of Groningen/UMCG research database Citation for published version (APA): Bijl-Westra, J. (2005). Experimental studies on signal transduction pathways in rheumatoid arthritis s.n. Copyright Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons). Take-down policy If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim. Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum. Download date: 06-12-2018
10 Nederlandse samenvatting Johanna Westra
Chapter 10 SAMENVATTING (voor niet-ingewijden) Reumatoïde artritis (RA) is een chronische ontstekingsziekte, die met name gelocaliseerd is in de gewrichten. De ziekte komt voor bij 0.5-1% van de bevolking, en komt meer voor bij vrouwen dan bij mannen. Door de ontsteking in de gewrichten raken kraakbeen en bot beschadigd en dit kan leiden tot handicaps en verminderde kwaliteit van leven. De behandeling van RA is er ten eerste op gericht om de verschijnselen van ontsteking (pijn en koorts) te bestrijden en in de tweede plaats om de schade aan de gewrichten te beperken. Uit onderzoek is gebleken dat de zogenaamde cytokines tumor necrosis factor (TNF-α) en interleukine-1 (IL-1β) een centrale rol spelen in het ontstekingsproces. De laatste jaren is gebleken dat het blokkeren van deze cytokines met antilichamen een goede therapie is voor RA. Helaas reageren niet alle patiënten op deze therapie en komen ook incidenteel ernstige bijwerkingen van deze therapie voor. Een andere manier om de produktie en activiteit van deze cytokines te remmen is door het blokkeren van intracellulaire signaal transductieroutes. Deze routes zijn mechanismen waarbij een prikkel buiten de cel omgezet wordt in een reactie in de cel, meestal in de vorm van de produktie van ontstekingseiwitten. In deze signaal transductie routes spelen de zogenaamde kinases een belangrijke rol, doordat ze het signaal in de vorm van een fosfaatgroep aan elkaar doorgeven. In dit proefschrift is onderzocht of het remmen van een belangrijke intracellulaire signaal transductie route (de p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK) route) een goede therapie zou kunnen zijn voor RA. In ons onderzoek is gekeken naar de gevolgen van remming met een specifieke p38 MAPK remmer (RWJ 67657) in cellen, die een rol spelen bij ontsteking. In hoofdstuk 2 is wordt een overzicht gegeven van de intracellulaire signaal transductie routes, die belangrijk zijn in ontsteking. Het is gebleken dat met name de zogenaamde p38 MAPK route van belang is bij RA. De p38 MAPK route wordt geactiveerd in verschillende cellen door cytokines, maar ook door andere stress factoren. Door de activatie van de p38 MAPK route gaan de cellen eiwitten produceren, die het ontstekingsproces in stand houden. Eiwitten die geproduceerd worden zijn bijvoorbeeld de eerdergenoemde TNF-α en IL-1β, maar ook andere cytokines en enzymen, die kraakbeen en bot kunnen beschadigen, de zogenaamde matrix-metalloproteinasen (MMPs). Verschillende p38 MAPK remmers zijn ontwikkeld, maar tot nu toe zijn nog maar twee remmers gebruikt in fase II klinisch onderzoek in RA. In dit hoofdstuk worden ook andere belangrijke routes, de NF-κB (nuclear factor -κb) en de JAK/STAT (Janus kinase/ signal transducer of activation and transcription) routes, besproken. 132
Nederlandse samenvatting De ontsteking bij RA komt voor in de gewrichten en wel in de weefsel bekleding, het synovium. Daar zijn met name drie soorten cellen actief in het ontstekingsproces, de fibroblasten, macrofagen en endotheel cellen. Door de ontsteking gaan de synoviale fibroblasten zich sterk vermeerderen en produceren cytokines zoals IL-6 en IL-8, maar ook de eerder genoemde MMPs. In hoofdstuk 3 is gekeken wat het effect is van behandeling met de p38 MAPK remmer op de eiwitproduktie door synoviale fibroblasten, die geïsoleerd zijn uit synovium van RA patiënten. Wij vonden dat behandeling met RWJ 67657 de productie van IL-6, IL-8 en MMP-3 significant deed afnemen en in mindere mate de productie van MMP-1. Aangezien het MMP-3 een zeer belangrijk enzym is, dat niet alleen in grote hoeveelheden voorkomt in de synoviale vloeistof van RA patiënten, maar ook andere MMPs kan activeren, is deze bevinding van groot belang. In dit onderzoek is niet alleen gekeken naar de eiwit productie door de cel, maar ook naar de voorloper van de eiwitproductie, het zogenaamde mrna in de cel. Gebleken is dat de p38 MAPK remmer het mrna van IL-6, IL-8 en MMP-3 remt, als ook de mrna expressie van cyclo-oxygenase-2 (COX-2). COX-2 is een belangrijke component in ontsteking en het gebruik van specifieke COX-2 remmers is een belangrijk onderdeel van therapie voor RA patiënten. In het bloed circuleren onder andere monocyten, die in weefsels uit kunnen rijpen tot macrofagen. Van deze cellen is bekend dat ze bij ontsteking TNF-α kunnen produceren. Om te onderzoeken wat het effect van p38 MAPK inhibitie is op deze cellen hebben we in hoofdstuk 4 monocyten uit het bloed van gezonde vrijwilligers en RA patiënten laten differentiëren tot macrofagen. Uit dit onderzoek bleek dat RWJ 67657 al bij lage concentraties effectief de productie van TNF-α kon remmen, terwijl ook IL-8 productie werd geremd. Het bleek ook dat de cellen wel veel MMP-9 konden produceren, maar dat deze productie niet geremd werd door p38 MAPK inhibitie. Op het gebied van mrna expressie bleek dat ook het COX-2 mrna in macrofagen sterk geremd werd door p38 MAPK inhibitie. In hoofdstuk 5 wordt nog wat dieper ingegaan op de verschillen tussen monocyten en macrofagen. Met name is gekeken naar de reactiviteit ten opzichte van p38 MAPK remming en ook naar de invloed van p38 MAPK inhibitie op differentiatie. We vonden dat monocyten in staat waren om meer cytokines (TNFα, IL-1β en IL-8) te produceren, terwijl de macrofagen meer MMP-9 konden produceren. Ook bleek dat de remming van cytokine productie door p38 MAPK inhibitie in monocyten veel effectiever was dan in macrofagen. Bij differentiatie van monocyt naar macrofaag in aanwezigheid van RWJ 67657 werd de productie van zowel cytokines als MMP-9 door macrofagen sterk gereduceerd. Om te bepalen of signaal transductie routes veranderen tijdens differentiatie werd de intracellulaire activiteit van kinases als maat voor de activiteit van signaal transductie routes, meten met en kinase array, uitgevoerd op gestimuleerde en 133
Chapter 10 ongestimuleerde monocyten en macrofagen. Een kinase array is een methode waarmee de activiteit van meerdere kinases tegelijkertijd in een monster gemeten kan worden. Uit de array bleek dat alle kinases uit de p38 MAPK route geactiveerd waren in de gestimuleerde monocyten en macrofagen. Ook waren een groot aantal kinases differentieel geactiveerd in monocyten vergeleken met macrofagen. Een andere groep cellen die een rol spelen in ontsteking zijn de endotheelcellen (EC). Dit zijn cellen die bloedvaten bekleden en die een actieve rol spelen bij de migratie van witte bloedcellen (leukocyten) naar een ontstekingplaats. Geactiveerde EC produceren chemokines, die leukocyten aantrekken en ze dragen cel adhesie moleculen (CAM) op hun oppervlak die een interactie aan kunnen gaan met de CAMs op de leukocyten. In hoofdstuk 6 is gekeken naar het effect van p38 MAPK remming op de productie van chemokines en de expressie van CAMs (E-selectin, VCAM-1 en ICAM-1). Wij vonden dat behandeling van deze cellen met de p38 MAPK remmer de productie en mrna expressie van de chemokines IL-8, MCP-1, maar ook van IL-6 sterk deed verminderen. Wat betreft de expressie van de CAMs bleek alleen E-selectin zwak te worden geremd door behandeling met RWJ 67657. Het feit dat de productie van de chemokines wel sterk wordt geremd is echter zeer belangrijk, omdat de chemokines een belangrijke rol spelen bij het in stand houden van de endotheel-leukocyte interactie. Omdat het effect van p38 MAPK remming op de CAM expressie in endotheelcellen zwak was, is de betrokkenheid van een andere signaal transductie route onderzocht in hoofdstuk 7. De stof MOL-294, waarvan bekend is dat het de NF-κB route remt, bleek de CAM expressie in endotheelcellen zeer sterk te verminderen. Gecombineerde behandeling van EC met zowel MOL-294 als RWJ 67657 bleek een sterker remmend effect te hebben op alle chemokines en CAMs die onderzocht waren dan wanneer ze apart gebruikt werden. Dit zou kunnen betekenen dat combinaties van geneesmiddelen, die verschillende routes als target hebben een beter effect hebben op ontsteking dan de geneesmiddelen apart. Tot nu toe zijn effecten van p38 MAPK inhibitie onderzocht op cellen die lokaal in het synovium voorkomen. In hoofdstuk 8 is onderzocht of p38 MAPK remming ook effecten heeft op een ander, systemisch, verschijnsel namelijk de acute fase reactie. Bij deze reactie worden onder invloed van cytokines (met name IL-6) die ontstaan door ontsteking in de lever, eiwitten geproduceerd die een maat zijn voor de ernst van de ontsteking. Deze acute fase eiwitten, met name CRP (Creactive protein) en fibrinogeen, worden gebruikt om de ziekteactiviteit van RA patiënten te bepalen. De signaaltransductie route die IL-6 gebruikt bij het tot stand komen van de acute fase reactie is de JAK/STAT route en uit literatuur is gebleken dat er interactie is tussen de p38 MAPK route en de JAK/STAT route. 134
Nederlandse samenvatting Het effect van p38 MAPK remming op de productie van diverse acute fase eiwitten door hepatoma cellijnen is bestudeerd en tevens de effecten op humane lever slices. De produktie en mrna expressie van CRP en fibrinogeen bleek sterk te worden geremd, maar niet die van een ander acute fase eiwit, het serum amyloïd A (SAA). De conclusie uit deze laatste studie was dat SAA daarom een betere marker voor ziekteactiviteit van RA is in het geval van p38 MAPK inhibitor therapie. CONCLUSIES In dit proefschrift is onderzocht wat de gevolgen zijn van het remmen van signaal transductie routes, die belangrijk zijn in het ontstekingsproces, zoals zich dat afspeelt bij reumatoïde artritis. We vonden dat in cellen, die een cruciale rol hebben in de ontsteking, het remmen van de p38 MAPK route belangrijke gevolgen had. In synoviale fibroblasten werd een significante remming gevonden van de productie en mrna expressie van IL-6, IL-8 en MMP-3. De mrna expressie van COX-2 werd sterk geremd bij zeer lage concentraties van de p38 MAPK remmer. Ook werd de productie van TNF-α, het centrale cytokine in RA, significant geremd in macrofagen door RWJ 67657. Endotheelcellen die actief betrokken zijn bij de aantrekking van leukocyten bleken onder invloed van verschillende routes te staan. De productie van chemokines werd effectief geremd door p38 MAPK inhibitie, terwijl de expressie van adhesie moleculen gereguleerd bleek te zijn door de NF-κB signaal transductie route. Tenslotte werd aangetoond dat er interactie is tussen de p38 MAPK route en de JAK/STAT route, aangezien CRP en fibrinogeen productie gereduceerd werd in hepatoma cellijnen door p38 MAPK remming. Samenvattend concluderen we dat de p38 MAPK route een belangrijke rol speelt in signaal transductie in RA en dat remming van de route belangrijke effecten heeft op ontstekingscellen. Aangezien de NF-κB route ook een belangrijke rol speelt in het ontstekingsproces, zou een combinatie van geneesmiddelen die beide routes remmen heel erg effectief kunnen zijn. TOEKOMSTPLANNEN Het onderzoek beschreven in dit proefschrift bevestigt de belangrijke rol van de p38 MAPK route in het ontstekingsproces. De p38 MAPK route is evenwel niet de enige route. Sterker nog, het lijkt erop dat vele kinases en transcriptiefactoren betrokken zijn bij ontsteking. Vooruitgang in dit onderzoeksveld wordt bemoeilijkt door de complexiteit van de diverse signaal transductie routes. De afgelopen jaren is de interesse voor het bestuderen van synoviaal weefsel toegenomen, aangezien de ontstekingsreactie zich afspeelt in het synovium van RA patiënten. Door het nemen van synoviale biopten is men in staat om het synovium te bestuderen voor diagnostische redenen, maar ook voor onderzoek naar bijvoorbeeld de effectiviteit van therapie. 135
Chapter 10 Een nieuwe benadering om synovium te bestuderen zou zijn door het in kaart brengen van intracellulaire signaal transductie systemen en te onderzoeken of er een verschil is tussen normale en ziekte-gerelateerde processen. Een belangrijke stap in de goede richting is ontstaan door het ontwikkelen van kinase arrays. Door een kinase array is het mogelijk geworden om de activiteit van meerdere kinases in een cel- of weefsellysaat te bestuderen. Deze techniek maakt het mogelijk om het intracellulair signaal transductie (IST) profiel van het synovium van een RApatiënt gedurende verschillende stadia van de ziekte en gedurende verschillende therapieën vast te stellen. Wij denken dat een dergelijk profiel een voorspellende waarde zou kunnen hebben voor individuele respons op een bepaalde therapie. De kinase array is al getest in cellen en diverse weefsels. Wij willen nu deze techniek toe gaan passen op synoviaal weefsel. Vervolgens zullen de bevindingen van de kinase array vergeleken worden met resultaten van reeds bestaande technieken. De verwachting is dat door het vaststellen van de betrokken IST routes in RA, we patiënten met de juiste therapie op het juiste moment kunnen gaan behandelen. Dit zou kunnen betekenen dat combinaties van signaal transductie remmers, maar ook combinaties van signaal transductie remmers met reeds bestaande geneesmiddelen effectieve therapieën zouden kunnen zijn voor RA. 136