Snelle en betrouwbare analyse van de microbiologische zwemwaterkwaliteit met qpcr Bart Wullings, Leo Heijnen en Edwin Kardinaal KWR Watercycle Research Institute, Nieuwegein
Inhoud Microbiologische zwemwaterkwaliteit qpcr voor snelle en betrouwbare analyses E. coli en enterococcen Source tracking: o.a. Bacteroides Cyanobacteriën (vervolg presentatie Miguel Dionisio Pires) Conclusies 2
Europese richtlijn microbiologische zwemwaterkwaliteit 3
Monitoring zwemwaterkwaliteit Reguliere monitoring fecale verontreiniging Gestandaardiseerde ISO kweekmethoden Monstername, analyse en rapportage duurt 2/3 dagen Bij overschrijding opnieuw 2/3 dagen Bij calamiteiten is sneller resultaat gewenst! Monitoring Cyanobacteriën Fluoroproob en microscopische telling Metingen minder betrouwbaar, temperatuurgevoelig (fluoroproob) en subjectief en duur (telling) Foto Waterproef qpcr Snel (<24 uur), betrouwbaar, objectief, reproduceerbaar en goedkoop(er) 4
qpcr Eerste NEN norm voor qpcr Legionella pneumophila 5
qpcr voor monitoring fecale besmetting Onderzoek in opdracht van RWS Waterdienst In 2011 qpcr methoden voor E. coli en enterococcen operationeel gemaakt in laboratorium Eerste veldstudieresultaten zien er goed uit! 6
qpcr voor monitoring fecale besmetting Andijk 2010, enterococcen qpcr kweek grenswaarde 'uitstekend' Concentraties ( KVE+ DNAkopiën/100 ml) 1,0E+06 1,0E+05 1,0E+04 1,0E+03 1,0E+02 1,0E+01 1,0E+00 11-6-2010 1-7-2010 21-7-2010 10-8-2010 30-8-2010 19-9-2010 Datum Kleine Zeetje 2010, E. coli qpcr kweek grenswaarde 'uitstekend' Concentraties( KVE+ DNAkopiën/100ml) 1,0E+06 1,0E+05 1,0E+04 1,0E+03 1,0E+02 1,0E+01 1,0E+00 11-6-2010 1-7-2010 21-7-2010 10-8-2010 30-8-2010 19-9-2010 Datum 7
Bronopsporing fecale verontreiniging Vraag: Welke bronnen van fecale vervuiling? Methode: Aantonen van dier-specifieke darmbacteriën (o.a. Bacteroides): onderzoek 2011/2012 8
Monitoring van potentieel toxische cyanobacteriën met qpcr Opdrachtgever: RWS Waterdienst KWR (fycocyaninegen) Bart Wullings Daniëlle van de Linde Lonneke Hensen Edwin Kardinaal Deltares (toxinegenen) Miguel Dionisio Pires Bas van der Zaan Merel Collenteur Jan Gerritse 9
qpcr voor 4 potentieel toxische geslachten van Cyanobacteriën Microcystis Aphanizomenon Planktothrix Anabaena 10
Ontwikkeling van specifieke primers en probes Onderzoek gestart in 2009 Doelgen is het fycocyanine operon (cpcba) Uniek voor cyanobacteriën en grote collectie van referentie sequenties beschikbaar in databases (totaal 1000 cpcba sequenties) Microcystis en Planktothrix genus specifiek primers en probe ontworpen Geslachten Anabaena en Aphanizomenon zijn niet monofylogenetisch maar vermengd Discrepantie tussen morfologische en fylogenetische classificatie Sequenties kunnen worden geclusterd in 9 (Rajaniemi et al 2005) of 4 grotere clusters (dit onderzoek) Primers en probes ontworpen tegen deze 4 clusters (A,B,C,D) 11
Correctiefactor qpcr naar celdichtheid Genoomcopieen verklaring voor verschil telling versus qpcr In literatuur is beschreven dat in cel van Cyanobacteriën wel 57 kopieën van genoom aanwezig kunnen zijn. qpcr resultaten in literatuur in combinatie met celtelling 12
Veldstudie 2011 35 locaties Ongeveer 7 bemonsteringen Totaal 232 monsters 13
Resultaten veldstudie qpcr (correctie) en celtelling Camping De Watermolen Anabaena C Aphanizomenon D Microcystis Planktotrix Anabaena sp. Aphanizomenon Microcystis sp. Planktothrix sp. 1000000 cellen / DNA ko pie aan tallen per m l 100000 10000 1000 100 10 1 25 27 29 31 33 35 37 39 Weeknummers 14
Resultaten veldstudie qpcr (correctie) en celtelling Bovenwater strand zeilplas Anabaena C Aphanizomenon D Microcystis Planktotrix Anabaena sp. Aphanizomenon Microcystis sp. Planktothrix sp. 1000000 cellen / DNA kopie aantallen per ml 100000 10000 1000 100 10 1 25 27 29 31 33 35 37 39 Weeknummer 15
Discussie en conclusies Q-PCR methoden beschikbaar voor het snel screenen van potentieel toxische cyanobacteriën; Betere en snellere beoordeling van zwemwater op risico cyanobacteriën met qpcr; Betrouwbaardere detectie van afzonderlijke vier genera; Grotere gevoeligheid waardoor proliferatie in vroeger stadium kan worden aangetoond; Prijs per monster is lager dan voor microscopische telling Methoden klaar voor zwemseizoen 2012 Implementatie van methoden in laboratoria gestart, nu het vervolg; Mogelijk uitbreiden van de methoden voor andere genera zoals Woronichinia / Phormidium. 16
Veldstudie 2011 17
Stelling 1. qpcr methoden hebben de toekomst en moeten zo snel mogelijk worden ingevoerd in het waterbeheer 18